JP3339685B2 - 生物学的人工肝臓 - Google Patents
生物学的人工肝臓Info
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- C12N5/067—Hepatocytes
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
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- A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
- A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
- A61M1/3472—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration with treatment of the filtrate
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Description
【発明の詳細な説明】 発明の背景 発明の技術分野 本発明は人工臓器に関し、さらに詳しくは肝細胞培養
のための肝臓バイオリアクターおよびその使用法に関す
る。
のための肝臓バイオリアクターおよびその使用法に関す
る。
関連技術 もし有効な肝臓援助システムが存在するなら、それは
移植への橋渡しになるであろう。肝臓移植を待っている
多くの患者は慢性肝不全であるが、肝昏睡ショックにお
ちいってはいない。急性肝不全の患者を助けるために種
々の肝臓援助システムが使用されてきたが、これらの試
みの多くはうまく入っていない。
移植への橋渡しになるであろう。肝臓移植を待っている
多くの患者は慢性肝不全であるが、肝昏睡ショックにお
ちいってはいない。急性肝不全の患者を助けるために種
々の肝臓援助システムが使用されてきたが、これらの試
みの多くはうまく入っていない。
過去10年間に肝臓援助の分野に膜型血漿分離技術を用
いる方法が導入され、肝灌流、肝臓濾過、および透析な
どの従来法も改良されてきている。しかし最新の肝臓援
助技術を応用しても急性肝不全の患者の生存率は改善さ
れていない。その原因は多くの場合、肝不全の病理に対
する我々の理解が不充分なためである。
いる方法が導入され、肝灌流、肝臓濾過、および透析な
どの従来法も改良されてきている。しかし最新の肝臓援
助技術を応用しても急性肝不全の患者の生存率は改善さ
れていない。その原因は多くの場合、肝不全の病理に対
する我々の理解が不充分なためである。
一方免疫学や外科技術の進歩により、肝臓移植は致命
的な肝疾患の１つの治療法として確立されてきている。
しかし肝臓の再生力はほとんど無限であることを認識す
る必要がある。肝障害がウイルス、中毒または外傷が原
因であっても、肝臓は普通２週間位で生命が維持できる
程度の充分な機能を回復する。ただし生命を維持するの
に充分に急速に肝臓の再生が起きない劇症肝炎や、肝臓
の再生の起きない末期肝硬変は別である。タカハシ（Ta
kahashi,T）ら、「最新の人工肝臓」（“Artificail l
iver state of the art"）、Digestive Diseases
and sciences、36巻、９号（1991年９月号）、1327
−1340頁を参照。
的な肝疾患の１つの治療法として確立されてきている。
しかし肝臓の再生力はほとんど無限であることを認識す
る必要がある。肝障害がウイルス、中毒または外傷が原
因であっても、肝臓は普通２週間位で生命が維持できる
程度の充分な機能を回復する。ただし生命を維持するの
に充分に急速に肝臓の再生が起きない劇症肝炎や、肝臓
の再生の起きない末期肝硬変は別である。タカハシ（Ta
kahashi,T）ら、「最新の人工肝臓」（“Artificail l
iver state of the art"）、Digestive Diseases
and sciences、36巻、９号（1991年９月号）、1327
−1340頁を参照。
これらの理由のため人工肝臓の利点は、当該分野にお
いて充分認識されている。ジョレグイ（JAUREGUI,H.
O.）ら、「ハイブリッド人工肝臓」（“Hybrid Artifi
cial Liver"）、ジシャー（Szycher、N.）編、Biocomp
atible Polymers,Metals,and Other Composites、ラ
ンカスター（Lancaster）、ペンシルバニア州、テクノ
ミック出版（Technomic Pub.）1983、907−928頁；マ
ツムラ（Matsumura）、米国特許3,734,851号を参照。
いて充分認識されている。ジョレグイ（JAUREGUI,H.
O.）ら、「ハイブリッド人工肝臓」（“Hybrid Artifi
cial Liver"）、ジシャー（Szycher、N.）編、Biocomp
atible Polymers,Metals,and Other Composites、ラ
ンカスター（Lancaster）、ペンシルバニア州、テクノ
ミック出版（Technomic Pub.）1983、907−928頁；マ
ツムラ（Matsumura）、米国特許3,734,851号を参照。
肝臓の機能を果たすいくつかの装置が提唱されてい
る。ハガー（Haggar）ら、「人工毛細管上での新生児肝
細胞の培養、薬物代謝と人工肝臓のモデル」（“Neonat
al Hepatocyte Culture on Artificial Capillari
es.A Model for Drug Metabolism and the Arti
ficial Liver"）アサイオ（ASAIO J.）、6:26−35
（１月号/3月号1983）、ジョレグイ（Jauregui,H.O.）
ら、「人工ハイブリッド肝臓の細胞成分としての成体ラ
ット肝細胞の培養」（“Adult Rat Hepatocyte Cult
ures as the Cellular Component of an Artifi
cial Hybrid Liver"）、およびポール（Paul,J.）
編、Biomaterials in Artificial Organs、マクミラ
ン（MacMillan）、1983、131−140頁は、カートリッジ
中の中空で半透性のファイバーの外表面上およびその壁
中で肝細胞（健康な肝細胞）を増殖させた実験を記載し
ている。後者の実験は、肝細胞の接種の前にファイバー
をコラーゲンで処理することにより接着が改良されるこ
とを示唆している。ジョレグ（Jauregu）の米国特許5,0
43,260号は、肝細胞を増殖させ維持するための灌流装置
を開示している。これは肝細胞コンパートメントから灌
流コンパートメントを分離するための多孔膜を含み、肝
細胞コンパートメント中でバイオポリマー支持体に肝細
胞を結合させるためにオリゴサッカライドレクチン認識
結合を使用している。デメトリオウ（Demetriou）ら、
「肝細胞移植と体外肝臓支持の新しい方法」（“New M
ethod of Hepatocyte Transplantation and Extra
corporeal Liver Support"）、Ann.Surg.Sep.、259−
271頁;1986は、コラーゲン被覆マイクロキャリアーに肝
細胞を結合させ、これをクロマトグラフィーカラムに入
れ、次に灌流するという技術を示している。
る。ハガー（Haggar）ら、「人工毛細管上での新生児肝
細胞の培養、薬物代謝と人工肝臓のモデル」（“Neonat
al Hepatocyte Culture on Artificial Capillari
es.A Model for Drug Metabolism and the Arti
ficial Liver"）アサイオ（ASAIO J.）、6:26−35
（１月号/3月号1983）、ジョレグイ（Jauregui,H.O.）
ら、「人工ハイブリッド肝臓の細胞成分としての成体ラ
ット肝細胞の培養」（“Adult Rat Hepatocyte Cult
ures as the Cellular Component of an Artifi
cial Hybrid Liver"）、およびポール（Paul,J.）
編、Biomaterials in Artificial Organs、マクミラ
ン（MacMillan）、1983、131−140頁は、カートリッジ
中の中空で半透性のファイバーの外表面上およびその壁
中で肝細胞（健康な肝細胞）を増殖させた実験を記載し
ている。後者の実験は、肝細胞の接種の前にファイバー
をコラーゲンで処理することにより接着が改良されるこ
とを示唆している。ジョレグ（Jauregu）の米国特許5,0
43,260号は、肝細胞を増殖させ維持するための灌流装置
を開示している。これは肝細胞コンパートメントから灌
流コンパートメントを分離するための多孔膜を含み、肝
細胞コンパートメント中でバイオポリマー支持体に肝細
胞を結合させるためにオリゴサッカライドレクチン認識
結合を使用している。デメトリオウ（Demetriou）ら、
「肝細胞移植と体外肝臓支持の新しい方法」（“New M
ethod of Hepatocyte Transplantation and Extra
corporeal Liver Support"）、Ann.Surg.Sep.、259−
271頁;1986は、コラーゲン被覆マイクロキャリアーに肝
細胞を結合させ、これをクロマトグラフィーカラムに入
れ、次に灌流するという技術を示している。
ヨーロッパ特許出願9040158号は、肝細胞と合成高分
子膜の層との間の接着を引き起こすために細胞培養基質
を用いる方法を開示している。リー（Lie）ら、「ブタ
における新しい人工肝臓装置による肝細胞昏睡の治療の
成功」（“Successful Treatment at Hepatocyte C
oma by ａ New Artificial Liver Device in t
he Pic"）、Res.Exp.Med.（1985）185、483−492は、
灌流チャンバー中の多孔膜により支持される肝臓片また
は肝臓キューブの使用について記載している。
子膜の層との間の接着を引き起こすために細胞培養基質
を用いる方法を開示している。リー（Lie）ら、「ブタ
における新しい人工肝臓装置による肝細胞昏睡の治療の
成功」（“Successful Treatment at Hepatocyte C
oma by ａ New Artificial Liver Device in t
he Pic"）、Res.Exp.Med.（1985）185、483−492は、
灌流チャンバー中の多孔膜により支持される肝臓片また
は肝臓キューブの使用について記載している。
ウルフとムンケルト（Wolf,F.W.,and Munkelt,B.
E.）、「培養細胞と合成毛細管で構成される人工肝臓に
よるビリルビル結合」“Bilirubin Conjugation by
an Aritificial Liver Composed of Cultured Ce
lls and ａ Synthetic Capillaries"）、21巻、Tra
ns.Amer.Soc.Artif.Int.Organs、1975、16−23は、ラッ
トの肝癌（腫瘍性肝）細胞を中空の半透性ファイバーと
カートリジの間に置き、これらのファイバーに血液を流
し、肝癌細胞により治療した実験について記載してい
る。そのような中空ファイバー装置ではファイバーは患
者の免疫防御システムからこれらの細胞を単離するため
に使用され、毒性物質の輸送を可能にする孔径を有して
いる。カイ（Cai,Z）ら、「生体人工肝臓支持体のため
のマイクロカプセル化物肝細胞」（Microencapsulate
Hepatocyte for Bio−Artificial Liver Suppor
t"）、Artif.Organs、12:388−393、1988は、アルギニ
ン−ポリリジン膜中に肝細胞をカプセル化し肝支持装置
として用いる方法を記載している。
E.）、「培養細胞と合成毛細管で構成される人工肝臓に
よるビリルビル結合」“Bilirubin Conjugation by
an Aritificial Liver Composed of Cultured Ce
lls and ａ Synthetic Capillaries"）、21巻、Tra
ns.Amer.Soc.Artif.Int.Organs、1975、16−23は、ラッ
トの肝癌（腫瘍性肝）細胞を中空の半透性ファイバーと
カートリジの間に置き、これらのファイバーに血液を流
し、肝癌細胞により治療した実験について記載してい
る。そのような中空ファイバー装置ではファイバーは患
者の免疫防御システムからこれらの細胞を単離するため
に使用され、毒性物質の輸送を可能にする孔径を有して
いる。カイ（Cai,Z）ら、「生体人工肝臓支持体のため
のマイクロカプセル化物肝細胞」（Microencapsulate
Hepatocyte for Bio−Artificial Liver Suppor
t"）、Artif.Organs、12:388−393、1988は、アルギニ
ン−ポリリジン膜中に肝細胞をカプセル化し肝支持装置
として用いる方法を記載している。
発明の要約 本発明は、灌流入口手段と灌流出口手段を有する閉じ
込め容器（containment vessel）；マトリックスの灌
流をしながら該閉じ込め容器中に肝細胞凝集物を捕捉す
るための閉じ込め容器内の該マトリックスよりなる、肝
細胞バイオリアクターまたは生体人工肝臓である。
込め容器（containment vessel）；マトリックスの灌
流をしながら該閉じ込め容器中に肝細胞凝集物を捕捉す
るための閉じ込め容器内の該マトリックスよりなる、肝
細胞バイオリアクターまたは生体人工肝臓である。
本発明の目的は、肝細胞バイオリアクターおよびその
作成法を与えることである。
作成法を与えることである。
本発明の別の目的は、肝臓支持体が必要な患者を治療
するための装置と方法を与えることである。
するための装置と方法を与えることである。
本発明のさらに別の目的は、代謝物および他の肝細胞
産生物の産生のための装置と方法を与えることである。
産生物の産生のための装置と方法を与えることである。
本発明の別の目的は、肝細胞との化学的相互作用を研
究するための装置を与えることである。
究するための装置を与えることである。
本発明の利点は、３次元の細胞−細胞接触により細胞
凝集物として肝細胞を培養することにより、先行技術に
比較して細胞の生育活性（viability）と肝細胞分化能
を維持しながら肝細胞濃度を増加させることができるこ
とである。
凝集物として肝細胞を培養することにより、先行技術に
比較して細胞の生育活性（viability）と肝細胞分化能
を維持しながら肝細胞濃度を増加させることができるこ
とである。
本発明のさらに別の利点は、目的の培地に直接および
調節しながら肝細胞を接触させることができることであ
る。
調節しながら肝細胞を接触させることができることであ
る。
本発明のさらに別の利点は、非ヒト肝細胞を用いるヒ
トの治療に体外肝支持体を与えることである。非ヒト肝
細胞と患者の血液細胞との接触を意図的に避けることに
より、非ヒト肝細胞に対する患者の免疫応答の可能性を
最小にすることができる。
トの治療に体外肝支持体を与えることである。非ヒト肝
細胞と患者の血液細胞との接触を意図的に避けることに
より、非ヒト肝細胞に対する患者の免疫応答の可能性を
最小にすることができる。
本発明は必要な肝細胞の量に応じてスケールを変更す
ることができることは、さらに別の利点である。
ることができることは、さらに別の利点である。
本発明の他の目的および利点は、添付の図面とともに
以下の記載を考慮すれば明らかになるであろう。
以下の記載を考慮すれば明らかになるであろう。
図面の簡単な説明 図１は、本発明の肝細胞バイオリアクターの模式図で
ある。
ある。
図２は、代謝物産生のための肝細胞バイオリアクター
の使用法を示すフローダイアグラムである。
の使用法を示すフローダイアグラムである。
図３は、肝補助の必要な患者に接続した図１の肝細胞
バイオリアクターを示すフローダイアグラムである。
バイオリアクターを示すフローダイアグラムである。
好適な実施態様の説明 図１には、肝細胞凝集物を捕捉するための支持体マト
リックス（６）を収容する閉じ込め容器（１）よりなる
肝細胞バイオリアクターを示す。閉じ込め容器（１）
は、ガラス性の底（２）と蓋（３）よりなる。底（２）
には、肝細胞凝集物の捕捉のためのマトリックスとなる
ガラスビーズ（６）を保持する垂直の部分に結合したガ
ラス棒（５）を有する１つのＬ形の灌流出口（４）が付
いている。蓋（３）には、ガラスビーズ（６）を保持す
る垂直の部分に結合したガラス棒（５）を有する１つの
Ｌ形の灌流入口（７）が付いている。さらに蓋（３）に
付いているのは、１つのゴム管（11）を有するガラス管
（９）に付いている金属性のルアーロック部品（luer−
lock fitting）（10）を有する蓋（３）に結合したガ
ラス管（９）よりなる細胞注入口（８）である。注入口
（７）は、ホースの締め具（12）を用いて閉じることが
できる。底（２）と蓋（３）はいっしょに保持され、Ｏ
リング（13）とＯリングガラスジョイント締め具（14）
を用いて密封される。Ｏリングの張力は、張力調製つま
み（15）を回転させることにより上げることができる。
好適な実施態様においては、バイオリアクター、マトリ
ックスおよび他の部分を作成するのにガラスが使用され
るが、材質がバイオリアクターの機能や肝細胞の生育活
性を妨害しない限りは他の材質を使用することもでき
る。
リックス（６）を収容する閉じ込め容器（１）よりなる
肝細胞バイオリアクターを示す。閉じ込め容器（１）
は、ガラス性の底（２）と蓋（３）よりなる。底（２）
には、肝細胞凝集物の捕捉のためのマトリックスとなる
ガラスビーズ（６）を保持する垂直の部分に結合したガ
ラス棒（５）を有する１つのＬ形の灌流出口（４）が付
いている。蓋（３）には、ガラスビーズ（６）を保持す
る垂直の部分に結合したガラス棒（５）を有する１つの
Ｌ形の灌流入口（７）が付いている。さらに蓋（３）に
付いているのは、１つのゴム管（11）を有するガラス管
（９）に付いている金属性のルアーロック部品（luer−
lock fitting）（10）を有する蓋（３）に結合したガ
ラス管（９）よりなる細胞注入口（８）である。注入口
（７）は、ホースの締め具（12）を用いて閉じることが
できる。底（２）と蓋（３）はいっしょに保持され、Ｏ
リング（13）とＯリングガラスジョイント締め具（14）
を用いて密封される。Ｏリングの張力は、張力調製つま
み（15）を回転させることにより上げることができる。
好適な実施態様においては、バイオリアクター、マトリ
ックスおよび他の部分を作成するのにガラスが使用され
るが、材質がバイオリアクターの機能や肝細胞の生育活
性を妨害しない限りは他の材質を使用することもでき
る。
製造方法と使用法 閉じ込め容器（１）は、標準適合性のＯリングガラス
ジョイントから作成された底（２）と蓋（３）を有す
る。Ｏリングガラスジョイントの内径は任意である。底
半分は、ガラスビーズまたは選択された内径を有するマ
トリックス（６）の容積を保持するのに充分な長さであ
る必要がある。支持体マトリックスの容積は、添加され
る肝細胞またはその凝集物の数に依存する。肝細胞の密
度は、少なくとも３×106細胞/mlであるが、最適に近い
のは6.70×106細胞/mlマトリックスである。灌流入口
（７）と灌流出口（４）は、パイレックスガラス管より
作成される。ガラスビーズが、ガラス棒（５）とガラス
管（４）またはガラス管（７）の間の角張ったスペース
に入らないように、ガラス棒保持容器（５）は充分な径
を有していなければならない。肝細胞注入口（８）のル
アーロック部品（10）は、フレーム滅菌を可能にするた
めにステンレススチールで作成される。ルアーロック部
品（10）は、標準プラスチックルアーロック部品に適合
するように作成される。マトリックスまたはビーズ
（６）はパイレックスガラスで作成され、１から3mlの
間の任意の大きさであり、肝細胞凝集物の捕捉にはサイ
ズの範囲1.4から1.7mm（No.14とNo.12メッシュの間）が
好ましい。ガラスビーズの間に肝細胞凝集物を捕捉する
のに他のタイプのマトリックスを使用することもでき
る。好適なマトリックスは、灌流しながら肝細胞または
凝集物の捕捉を可能にするものであろう。
ジョイントから作成された底（２）と蓋（３）を有す
る。Ｏリングガラスジョイントの内径は任意である。底
半分は、ガラスビーズまたは選択された内径を有するマ
トリックス（６）の容積を保持するのに充分な長さであ
る必要がある。支持体マトリックスの容積は、添加され
る肝細胞またはその凝集物の数に依存する。肝細胞の密
度は、少なくとも３×106細胞/mlであるが、最適に近い
のは6.70×106細胞/mlマトリックスである。灌流入口
（７）と灌流出口（４）は、パイレックスガラス管より
作成される。ガラスビーズが、ガラス棒（５）とガラス
管（４）またはガラス管（７）の間の角張ったスペース
に入らないように、ガラス棒保持容器（５）は充分な径
を有していなければならない。肝細胞注入口（８）のル
アーロック部品（10）は、フレーム滅菌を可能にするた
めにステンレススチールで作成される。ルアーロック部
品（10）は、標準プラスチックルアーロック部品に適合
するように作成される。マトリックスまたはビーズ
（６）はパイレックスガラスで作成され、１から3mlの
間の任意の大きさであり、肝細胞凝集物の捕捉にはサイ
ズの範囲1.4から1.7mm（No.14とNo.12メッシュの間）が
好ましい。ガラスビーズの間に肝細胞凝集物を捕捉する
のに他のタイプのマトリックスを使用することもでき
る。好適なマトリックスは、灌流しながら肝細胞または
凝集物の捕捉を可能にするものであろう。
あるいは閉じ込め容器の底（２）は、標準のガラス管
から作成される。前述した他の特徴は同様に製造して、
蓋（３）としてゴム栓（３）を使用することもできる。
から作成される。前述した他の特徴は同様に製造して、
蓋（３）としてゴム栓（３）を使用することもできる。
前述したバイオリアクター（図（１））は、図２の回
路中にある時肝細胞代謝リアクターとして使用すること
もできる。その構成物は、再循環ペリスタポンプ（19）
と酸素供給装置（20）、ガス排出容器（21）、pH検出器
（22）、溶存酸素検出器（23）、および注入／サンプリ
ング口（24）である。これらすべての構成物は、所期の
温度（好ましくは37℃）でインキュベーター（25）中に
入れられる。新鮮な培地ビン（26）、供給ポンプ（2
7）、生成物分離容器（28）、および生成物補集ビン（2
9）は、インキュベーター（25）の外に置かれる。
路中にある時肝細胞代謝リアクターとして使用すること
もできる。その構成物は、再循環ペリスタポンプ（19）
と酸素供給装置（20）、ガス排出容器（21）、pH検出器
（22）、溶存酸素検出器（23）、および注入／サンプリ
ング口（24）である。これらすべての構成物は、所期の
温度（好ましくは37℃）でインキュベーター（25）中に
入れられる。新鮮な培地ビン（26）、供給ポンプ（2
7）、生成物分離容器（28）、および生成物補集ビン（2
9）は、インキュベーター（25）の外に置かれる。
この装置は、まず供給ポンプ（27）を用いてビン（2
6）からライン（30）を通して新鮮な培地が充填され
る。培地は、液体レベルが再循環返却ライン（31）より
上になるまで、ガス排出容器（21）中に流れる。液体の
流れがライン（31）、検出器（23）と（22）の通過口
（24）を通り、底から閉じ込め容器（１）を満たすよう
に、再循環ポンプは活性化される。空気は入口（７）、
酸素供給装置（20）を介して強制的に追い出され、ライ
ン（32）を通って容器（21）中に入れられる。空気はラ
イン（33）から容器（28）に入る。装置が完全に液体で
満たされるまで新鮮な培地が供給され、培地が入口
（７）から閉じ込め容器（１）に入ると、培地再循環の
方向が逆転する。空気は環状酸素供給装置（20）を通し
て液体の流れと逆の方向に流される。最初の酸素組成は
空気に近い。溶存酸素濃度が空気の酸素濃度と平衡化す
ると、再循環ポンプ（19）が停止し、肝細胞または肝細
胞凝集物はシリンジで装置の注入口（８）に注入され
る。置換された容量はライン（33）を通って装置から出
て容器（28）に入る。細胞が注入されてから、定常状態
の再循環流速より少し遅い速度で再循環ポンプ（19）が
作動される。こうして肝細胞またはその凝集物の大部分
がガラスビーズ内に捕捉されるまで、装置に培地および
細胞が再循環される。次に捕捉された100万の細胞当り
１日当り1mlの培地に等しい速度で、ライン（30）を介
して容器（26）から装置に新鮮な培地が添加される。
6）からライン（30）を通して新鮮な培地が充填され
る。培地は、液体レベルが再循環返却ライン（31）より
上になるまで、ガス排出容器（21）中に流れる。液体の
流れがライン（31）、検出器（23）と（22）の通過口
（24）を通り、底から閉じ込め容器（１）を満たすよう
に、再循環ポンプは活性化される。空気は入口（７）、
酸素供給装置（20）を介して強制的に追い出され、ライ
ン（32）を通って容器（21）中に入れられる。空気はラ
イン（33）から容器（28）に入る。装置が完全に液体で
満たされるまで新鮮な培地が供給され、培地が入口
（７）から閉じ込め容器（１）に入ると、培地再循環の
方向が逆転する。空気は環状酸素供給装置（20）を通し
て液体の流れと逆の方向に流される。最初の酸素組成は
空気に近い。溶存酸素濃度が空気の酸素濃度と平衡化す
ると、再循環ポンプ（19）が停止し、肝細胞または肝細
胞凝集物はシリンジで装置の注入口（８）に注入され
る。置換された容量はライン（33）を通って装置から出
て容器（28）に入る。細胞が注入されてから、定常状態
の再循環流速より少し遅い速度で再循環ポンプ（19）が
作動される。こうして肝細胞またはその凝集物の大部分
がガラスビーズ内に捕捉されるまで、装置に培地および
細胞が再循環される。次に捕捉された100万の細胞当り
１日当り1mlの培地に等しい速度で、ライン（30）を介
して容器（26）から装置に新鮮な培地が添加される。
化合物はいろいろな方法で導入される。１つの方法で
は、ビン（26）の新鮮な培地中の一定組成の供給物とし
て導入することができる。あるいは注入口（26）を介し
て小塊として導入することもできる。代謝生成物はビン
（29）に捕捉されるか、または注入口（24）から試料を
取って反応動力学を研究することもできる。化合物を肝
細胞バイオリアクターに導入するのに当業者は多くの異
なる方法を使用することができる。導入される化合物は
肝細胞との相互作用（例えば最終代謝物または毒性）に
関して研究されるか、または代謝物として他の化合物の
合成の基質として使用される。
は、ビン（26）の新鮮な培地中の一定組成の供給物とし
て導入することができる。あるいは注入口（26）を介し
て小塊として導入することもできる。代謝生成物はビン
（29）に捕捉されるか、または注入口（24）から試料を
取って反応動力学を研究することもできる。化合物を肝
細胞バイオリアクターに導入するのに当業者は多くの異
なる方法を使用することができる。導入される化合物は
肝細胞との相互作用（例えば最終代謝物または毒性）に
関して研究されるか、または代謝物として他の化合物の
合成の基質として使用される。
肝細胞バイオリアクター（１）はまた、人工臓器供給
補助肝臓として必要な患者に使用することができる。こ
の場合肝細胞バイオリアクターは図３に示すように配置
され、肝臓補助の必要な哺乳動物を治療するための肝臓
補助システムを構成する。
補助肝臓として必要な患者に使用することができる。こ
の場合肝細胞バイオリアクターは図３に示すように配置
され、肝臓補助の必要な哺乳動物を治療するための肝臓
補助システムを構成する。
肝細胞バイオリアクター（１）はモジュール装置とし
て考えることもでき、性能を増加させるための同様の装
置とともに使用される。この方法で灌流リアクターを使
用するための必要な構成物は、以下の変更がある以外は
前述したものと同様である： 再循環ポンプ（19）は、個々の灌流リアクター（１）
からの培地の流れを等しくするために、複数ヘッドのペ
リスタポンプでなければならない；ガス排出容器（37）
はまた、受け器として機能する；液が容器（28）中に出
るのを防ぐためにライン（33）に締め具（34）を加え
る；ガス排出ビン（37）中ではなく注入ライン（36）に
供給ライン（35）が導入される。この装置は最初、ライ
ン（30）を介してビン（26）からの培地で満たされる。
この充填時間の間、締め具（34）は開いており、締め具
（38）は閉じている。ビン（37）が再循環返却ライン
（31）より上まで培地で満たされると、再循環ポンプ
（19）が活性化され、ライン（31）を介して装置が充填
され、ポンプ（19）を介してリアクター（19）の上部か
ら空気が排出されて、ライン（36）を介してガス排出ビ
ン（37）中にはいる。システムが培地で完全に充填され
てから、培地供給ポンプ（27）は停止されポンプ（19）
を用いて培地再循環の方向が逆転される。酸素供給装置
（20）の環状側に大気と同じ組成の空気が添加される。
培地が空気で飽和されたら再循環ポンプが停止され、肝
細胞または溶液中のあらかじめ形成されたその凝集物が
シリンジを用いて注入口（８）を介してリアクター
（１）に添加される。再循環ポンプが再び活性化され、
生育している肝細胞凝集物のほとんどがマトリックスま
たはビーズ中に捕捉されるまで、細胞および溶液が装置
内を再循環される。
て考えることもでき、性能を増加させるための同様の装
置とともに使用される。この方法で灌流リアクターを使
用するための必要な構成物は、以下の変更がある以外は
前述したものと同様である： 再循環ポンプ（19）は、個々の灌流リアクター（１）
からの培地の流れを等しくするために、複数ヘッドのペ
リスタポンプでなければならない；ガス排出容器（37）
はまた、受け器として機能する；液が容器（28）中に出
るのを防ぐためにライン（33）に締め具（34）を加え
る；ガス排出ビン（37）中ではなく注入ライン（36）に
供給ライン（35）が導入される。この装置は最初、ライ
ン（30）を介してビン（26）からの培地で満たされる。
この充填時間の間、締め具（34）は開いており、締め具
（38）は閉じている。ビン（37）が再循環返却ライン
（31）より上まで培地で満たされると、再循環ポンプ
（19）が活性化され、ライン（31）を介して装置が充填
され、ポンプ（19）を介してリアクター（19）の上部か
ら空気が排出されて、ライン（36）を介してガス排出ビ
ン（37）中にはいる。システムが培地で完全に充填され
てから、培地供給ポンプ（27）は停止されポンプ（19）
を用いて培地再循環の方向が逆転される。酸素供給装置
（20）の環状側に大気と同じ組成の空気が添加される。
培地が空気で飽和されたら再循環ポンプが停止され、肝
細胞または溶液中のあらかじめ形成されたその凝集物が
シリンジを用いて注入口（８）を介してリアクター
（１）に添加される。再循環ポンプが再び活性化され、
生育している肝細胞凝集物のほとんどがマトリックスま
たはビーズ中に捕捉されるまで、細胞および溶液が装置
内を再循環される。
肝細胞凝集物が捕捉されるまでの間、装置にビン（2
6）から新鮮な培地を流し込み生育していない細胞や他
の破片を除去する。流し込みが完了してから締め具（3
4）を閉じ、締め具（38）を開く。血液が患者（39）か
ら血液濃縮器を介して流れ、この血液濃縮器中では、液
体すなわち血漿（血液の非細胞成分または濾液と呼ばれ
る）が血液から除去される。これは肝細胞またはその凝
集物に対する患者の免疫応答を最小にするために行われ
る。濃縮された血液または血液細胞は血液濃縮器を出て
血液混合容器（41）に戻り、ここで濾液と再混合されて
バイオリアクター装置から出るか、または直接患者に再
導入される。濾液はライン（42）を介して血液濃縮器
（40）を出て、濾液受け器／ガス排出ビン（43）に入
る。ポンプ（44）を用いて、濾液はライン（35）を介し
てビン（43）からライン（36）を介して装置に入る。濾
液は装置の中を流れ、まず酸素供給装置（20）を通過し
て上から閉じ込め容器に入り、底からリアクターを出て
受け器（37）に戻る。再循環濾液の一部はライン（35）
を介して濾液入口流に等しい容量で受け器（37）に流
れ、次にライン（45）を介してバイオリアクター回路を
出て血液フィルター（46）を通過し、容器（41）中で濃
縮血液と再混合されるか、または直接患者に再導入され
る。
6）から新鮮な培地を流し込み生育していない細胞や他
の破片を除去する。流し込みが完了してから締め具（3
4）を閉じ、締め具（38）を開く。血液が患者（39）か
ら血液濃縮器を介して流れ、この血液濃縮器中では、液
体すなわち血漿（血液の非細胞成分または濾液と呼ばれ
る）が血液から除去される。これは肝細胞またはその凝
集物に対する患者の免疫応答を最小にするために行われ
る。濃縮された血液または血液細胞は血液濃縮器を出て
血液混合容器（41）に戻り、ここで濾液と再混合されて
バイオリアクター装置から出るか、または直接患者に再
導入される。濾液はライン（42）を介して血液濃縮器
（40）を出て、濾液受け器／ガス排出ビン（43）に入
る。ポンプ（44）を用いて、濾液はライン（35）を介し
てビン（43）からライン（36）を介して装置に入る。濾
液は装置の中を流れ、まず酸素供給装置（20）を通過し
て上から閉じ込め容器に入り、底からリアクターを出て
受け器（37）に戻る。再循環濾液の一部はライン（35）
を介して濾液入口流に等しい容量で受け器（37）に流
れ、次にライン（45）を介してバイオリアクター回路を
出て血液フィルター（46）を通過し、容器（41）中で濃
縮血液と再混合されるか、または直接患者に再導入され
る。
この装置は一般的に２つの回路（肝細胞バイオリアク
ター回路と患者側の回路）からなると考えることができ
る。さらに２つの回路は受け器（37）で接続され、これ
はライン（31）を介して肝細胞バイオリアクターから処
理された非細胞性血液成分を受け取る。これはライン
（45）を介して、処理された非細胞性血液成分の一部の
患者への流れを可能にし、またライン（36）を介して肝
細胞バイオリアクターへ一部が戻るのを可能にする。こ
うして受け器（37）は哺乳動物の内または外への血液の
流速と、肝細胞バイオリアクターの内または外への非細
胞性血液成分の流速を独立に制御することを可能にす
る。異なる流速は各回路の最適性能を与えるため、この
２つの流速の制御は好ましい。肝細胞バイオリアクター
は、肝細胞に対する剪断力の障害を最小にして充分な酸
素と栄養物を与えることができる流速が必要である。こ
の流速は哺乳動物の血液の流速と同じであってもまたは
異なってもよい。これ以上説明しなくても当業者は、前
記の記載から本発明を最大に利用することができる。従
って以下の説明は単に例示のためのみであり、本発明を
限定するものではないことを理解すべきである。
ター回路と患者側の回路）からなると考えることができ
る。さらに２つの回路は受け器（37）で接続され、これ
はライン（31）を介して肝細胞バイオリアクターから処
理された非細胞性血液成分を受け取る。これはライン
（45）を介して、処理された非細胞性血液成分の一部の
患者への流れを可能にし、またライン（36）を介して肝
細胞バイオリアクターへ一部が戻るのを可能にする。こ
うして受け器（37）は哺乳動物の内または外への血液の
流速と、肝細胞バイオリアクターの内または外への非細
胞性血液成分の流速を独立に制御することを可能にす
る。異なる流速は各回路の最適性能を与えるため、この
２つの流速の制御は好ましい。肝細胞バイオリアクター
は、肝細胞に対する剪断力の障害を最小にして充分な酸
素と栄養物を与えることができる流速が必要である。こ
の流速は哺乳動物の血液の流速と同じであってもまたは
異なってもよい。これ以上説明しなくても当業者は、前
記の記載から本発明を最大に利用することができる。従
って以下の説明は単に例示のためのみであり、本発明を
限定するものではないことを理解すべきである。
細胞凝集物の作成 肝細胞凝集物は２つの一般的な方法で作成することが
できる。培地（培地組成については実施例１を参照）中
の肝細胞をバイオリアクターを介して再循環することに
より、肝細胞は互いに接触し凝集物を形成し、最終的に
マトリックスに捕捉されるサイズになる。約２−５時間
で約50％の肝細胞が捕捉されるのが観察された。約６−
24時間で約100％の細胞が凝集物として捕捉されるであ
ろう。
できる。培地（培地組成については実施例１を参照）中
の肝細胞をバイオリアクターを介して再循環することに
より、肝細胞は互いに接触し凝集物を形成し、最終的に
マトリックスに捕捉されるサイズになる。約２−５時間
で約50％の肝細胞が捕捉されるのが観察された。約６−
24時間で約100％の細胞が凝集物として捕捉されるであ
ろう。
肝細胞凝集物を作成する別の方法は、バイオリアクタ
ーの外に肝細胞「球状物質」（spheroids）を作成する
ことである。肝細胞を、炭酸ガスインキュベーター（５
％炭酸ガス、95％の湿気を有する空気）中で回転台上の
プラスチックまたはガラスシャーレ中に入れる。１分間
30サイクルの回転が効果的であった。肝細胞は約24時間
で凝集した。そのような凝集物または球状物質はバイオ
リアクターを通過し、マトリックスに捕捉される。
ーの外に肝細胞「球状物質」（spheroids）を作成する
ことである。肝細胞を、炭酸ガスインキュベーター（５
％炭酸ガス、95％の湿気を有する空気）中で回転台上の
プラスチックまたはガラスシャーレ中に入れる。１分間
30サイクルの回転が効果的であった。肝細胞は約24時間
で凝集した。そのような凝集物または球状物質はバイオ
リアクターを通過し、マトリックスに捕捉される。
いずれかの方法で肝細胞を捕捉してからは、肝細胞は
長時間（実施例１を参照）高い生育活性を維持する。本
発明の重要な利点は、凝集物は互いに結合部分を形成し
互いに連結されて、複数の肝細胞凝集物の間の細胞−細
胞の連絡または接触が可能になることである。この３次
元の細胞−細胞接触と細胞間の連絡はインビボの肝臓に
類似している。
長時間（実施例１を参照）高い生育活性を維持する。本
発明の重要な利点は、凝集物は互いに結合部分を形成し
互いに連結されて、複数の肝細胞凝集物の間の細胞−細
胞の連絡または接触が可能になることである。この３次
元の細胞−細胞接触と細胞間の連絡はインビボの肝臓に
類似している。
本発明においてはヒト肝細胞も使用することができ、
ある場合（例えば治療に対する患者の免疫応答をさらに
減少させる必要がある場合）にはヒト肝細胞の方が好ま
しい。しかし肝細胞凝集物として非ヒト肝細胞を使用す
ることができる。患者の血液細胞は肝細胞と接触しない
ようになっているため、免疫応答は限定されるであろ
う。従って非ヒト肝細胞は入手しやすいことから好まし
く、さらに好ましくはウシ、ヤギなどがあり、最も好ま
しくはブタである。
ある場合（例えば治療に対する患者の免疫応答をさらに
減少させる必要がある場合）にはヒト肝細胞の方が好ま
しい。しかし肝細胞凝集物として非ヒト肝細胞を使用す
ることができる。患者の血液細胞は肝細胞と接触しない
ようになっているため、免疫応答は限定されるであろ
う。従って非ヒト肝細胞は入手しやすいことから好まし
く、さらに好ましくはウシ、ヤギなどがあり、最も好ま
しくはブタである。
肝細胞バイオリアクターを維持するのに使用する培地
は、肝細胞またはその凝集物の生育活性を維持するのに
必要な栄養物を含有する必要がある。培地は、基質と呼
ばれる化学物質、または代謝物と呼ばれる基質の代謝に
より形成される化学物質を含有する。肝細胞バイオリア
クターを体外支持装置として使用する時、肝細胞凝集物
を支持するのに必要な栄養物を供給するのに培地の代わ
りに哺乳動物の非細胞性血液成分が使用することもでき
る。
は、肝細胞またはその凝集物の生育活性を維持するのに
必要な栄養物を含有する必要がある。培地は、基質と呼
ばれる化学物質、または代謝物と呼ばれる基質の代謝に
より形成される化学物質を含有する。肝細胞バイオリア
クターを体外支持装置として使用する時、肝細胞凝集物
を支持するのに必要な栄養物を供給するのに培地の代わ
りに哺乳動物の非細胞性血液成分が使用することもでき
る。
以下の例は本発明を例示するための方法であり、決し
て本発明の限定するものではない。本発明を実施するの
に、以下の条件や方法の変法が可能であることは当業者
には容易に理解できるであろう。
て本発明の限定するものではない。本発明を実施するの
に、以下の条件や方法の変法が可能であることは当業者
には容易に理解できるであろう。
例１ 肝細胞バイオリアクターでの肝細胞の培養（図１）： ベリーとフレンド（Berry and Friend）、1969、
「単離したラットの肝実質細胞の高収率の調製」（“Hi
gh−yield preparatiion of isolated rat liver
parenchymal cells"）、J.Cell Biol.,43,506−520
のバイオプシーの方法に、変更（ロレッツ（Loretz）
ら、「新たに調製した肝細胞および低温保存したラット
の肝細胞によるプロ変異原活性化」（“Promutagen ac
tivation by freshly isolated and cryopreserve
d rat hapatocytes"）Environ.Mol.Mutag.12:335−34
1;1988;「ラットおよびヒト肝細胞の低温保存法の最適
化」（“Optimization of cryopreservation proced
ures for rat and human hepatocytes"）、Xenobi
otica、19;489−198;1989）を加えて、スプレーグ−ド
ーレイ（Sprague−Dawley）ラットから肝細胞を単離し
た。これらの方法は参考のため本明細書中に引用されて
いる。この方法は２段階のコラゲナーゼ（0.5％W/V、タ
イプＩ）灌流法である。単離した細胞集団はルーチンに
は、トリプシンブルー排除法により評価すると80％以上
の生育活性を有していた。単離後、11.2mg/lのアラニ
ン、12.8mg/lのセリン、24mg/lのアスパラギン、2g/lの
乏脂肪酸ウシ血清アルブミン、0.168mg/mlのアミノレブ
リン酸、5mg/lのオレイン酸、5mg/lのd,1−トコレロー
ル、0.393mg/lのデキサメタソン、7.9mg/lのｄ−サイロ
キシン、0.03mg/lのグルカゴン、20U./lのインスリンお
よび84mg/lのゲンタマイシンを補足したウェイマウス
（Waymouth）752/L培地中に再懸濁させた（グリーン（G
reen）ら、グリーン（Green、C.E.）、セゴール（Segal
l,H.J.）およびビアド（Byard,J.L.）、176−185（198
1）、ラットの肝細胞の一次培養物のピロリジジンアル
カロイドセネシオニンの代謝、細胞毒性および遺伝毒性
（Metabolism,cytotoxicity,and genotoxicity of t
he pyrrolizidine alkaloid senecionine in prim
ary cultures of rat hepatocytes）、Toxicol.App
l.Pharmacol.60,176）。細胞密度は約５×106細胞/mlに
調整した。全部で約200×106細胞をバイオリアクターに
接種した。この数の細胞に対して、バイオリアクターの
大きさは内径22mm、高さ83mmであり、約30mlの径1.5mm
のパイレックスガラスビーズを含有していた。バイオリ
アクターは前述したように接種前にあらかじめ少なくと
も24時間培地と平衡化させた。培地は40ml/分の速度で
再循環させた。装置中の総培地量は150mlであった。新
しい培地は１日当り約200mlの速度で加えた。装置は温
度調節インキュベーター中で37℃で維持した。バイオリ
アクター中で培養した肝細胞の高い生育活性は、安定な
酸素消費、尿素産生およびアルブミン合成により証明さ
れた。これらの生育活性の代表的な数字は表１に示す。
化学的基質である７−エトキシクマリンを７−OH−クマ
リンへ変換する能力により測定したいくつかの実験で
の、薬剤代謝の主要な酵素系であるＰ−450混合機能オ
キシゲナーゼ活性は、表２に記載されている。電子顕微
鏡による試験は、凝集物中の細胞はインビボでの肝細胞
の形態的特徴（小管（canaliculi）、ペルオキシゾーム
（peroxisomes）、広範な小胞体、細胞の密な接合およ
び健常なミトコンドリア）を有していることを示してい
た。さらにマトリックス中の凝集物は細胞−細胞接触に
より連結されていた。従ってこうしてバイオリアクター
中で培養された肝細胞は、異種生物物質（例えば薬剤）
の代謝的運命または代謝物の大量産生の評価のいずれに
も、異種生物代謝の研究に適している。ここに記載した
装置はまた、肝細胞により産生されることが公知である
生物分子の産生に使用することもできる。本装置はま
た、化学毒性または薬剤毒性の研究に使用することがで
きる。
「単離したラットの肝実質細胞の高収率の調製」（“Hi
gh−yield preparatiion of isolated rat liver
parenchymal cells"）、J.Cell Biol.,43,506−520
のバイオプシーの方法に、変更（ロレッツ（Loretz）
ら、「新たに調製した肝細胞および低温保存したラット
の肝細胞によるプロ変異原活性化」（“Promutagen ac
tivation by freshly isolated and cryopreserve
d rat hapatocytes"）Environ.Mol.Mutag.12:335−34
1;1988;「ラットおよびヒト肝細胞の低温保存法の最適
化」（“Optimization of cryopreservation proced
ures for rat and human hepatocytes"）、Xenobi
otica、19;489−198;1989）を加えて、スプレーグ−ド
ーレイ（Sprague−Dawley）ラットから肝細胞を単離し
た。これらの方法は参考のため本明細書中に引用されて
いる。この方法は２段階のコラゲナーゼ（0.5％W/V、タ
イプＩ）灌流法である。単離した細胞集団はルーチンに
は、トリプシンブルー排除法により評価すると80％以上
の生育活性を有していた。単離後、11.2mg/lのアラニ
ン、12.8mg/lのセリン、24mg/lのアスパラギン、2g/lの
乏脂肪酸ウシ血清アルブミン、0.168mg/mlのアミノレブ
リン酸、5mg/lのオレイン酸、5mg/lのd,1−トコレロー
ル、0.393mg/lのデキサメタソン、7.9mg/lのｄ−サイロ
キシン、0.03mg/lのグルカゴン、20U./lのインスリンお
よび84mg/lのゲンタマイシンを補足したウェイマウス
（Waymouth）752/L培地中に再懸濁させた（グリーン（G
reen）ら、グリーン（Green、C.E.）、セゴール（Segal
l,H.J.）およびビアド（Byard,J.L.）、176−185（198
1）、ラットの肝細胞の一次培養物のピロリジジンアル
カロイドセネシオニンの代謝、細胞毒性および遺伝毒性
（Metabolism,cytotoxicity,and genotoxicity of t
he pyrrolizidine alkaloid senecionine in prim
ary cultures of rat hepatocytes）、Toxicol.App
l.Pharmacol.60,176）。細胞密度は約５×106細胞/mlに
調整した。全部で約200×106細胞をバイオリアクターに
接種した。この数の細胞に対して、バイオリアクターの
大きさは内径22mm、高さ83mmであり、約30mlの径1.5mm
のパイレックスガラスビーズを含有していた。バイオリ
アクターは前述したように接種前にあらかじめ少なくと
も24時間培地と平衡化させた。培地は40ml/分の速度で
再循環させた。装置中の総培地量は150mlであった。新
しい培地は１日当り約200mlの速度で加えた。装置は温
度調節インキュベーター中で37℃で維持した。バイオリ
アクター中で培養した肝細胞の高い生育活性は、安定な
酸素消費、尿素産生およびアルブミン合成により証明さ
れた。これらの生育活性の代表的な数字は表１に示す。
化学的基質である７−エトキシクマリンを７−OH−クマ
リンへ変換する能力により測定したいくつかの実験で
の、薬剤代謝の主要な酵素系であるＰ−450混合機能オ
キシゲナーゼ活性は、表２に記載されている。電子顕微
鏡による試験は、凝集物中の細胞はインビボでの肝細胞
の形態的特徴（小管（canaliculi）、ペルオキシゾーム
（peroxisomes）、広範な小胞体、細胞の密な接合およ
び健常なミトコンドリア）を有していることを示してい
た。さらにマトリックス中の凝集物は細胞−細胞接触に
より連結されていた。従ってこうしてバイオリアクター
中で培養された肝細胞は、異種生物物質（例えば薬剤）
の代謝的運命または代謝物の大量産生の評価のいずれに
も、異種生物代謝の研究に適している。ここに記載した
装置はまた、肝細胞により産生されることが公知である
生物分子の産生に使用することもできる。本装置はま
た、化学毒性または薬剤毒性の研究に使用することがで
きる。
例２ 体外肝支持装置としてのバイオリアクターの応用 例１の方法を使用して非近交系のヨークシャー／ホワ
イトのブタから取り出した肝臓の肝細胞を培養した。１
匹の肝臓から、高い（約80％以上）生育活性を有する20
億から50億の細胞がルーチンに得られる。使用した培地
は、実施例１に記載のホルモンを補足したウェイマウス
（Waymoouth）培地である。20億から50億の細胞を入れ
るために、バイオリアクターを２つの閉じ込め容器にス
ケールアップした。各閉じ込め容器の内径は40mmであ
り、高さは10mmである。直径約2mmのガラスビーズと、
閉じ込め容器につき全部で250mlのガラスビーズを使用
した。肝細胞の高い生育活性は安定な酸素消費速度（36
0ml/分）により証明された（表３）。肝細胞接種約２時
間後に、肝臓を除いたブタ（完全な肝不全を模倣するた
めに手術により肝臓を除去した）にバイオリアクターを
取り付けた。体外肝支持装置としてのバイオリアクター
の応用を示す模式図を図３に示す。左の大腿の動脈の血
液をミンテック（Mintech）の血液濃縮器に導いた。12
個のフリンジエレカス（fringe elecath）カニューレ
を大腿動脈に挿入し、1/4インチのPVC管で血液濃縮器に
接続した。血液濃縮器により、血液は細胞を含まない限
外濾過部分と血液細胞部分に分離された。血液細胞画分
は同様の管により大腿静脈に戻した。限外濾液は、ロー
ラーポンプを用いて40ml/分の調整した速度で、1/4イン
チ管により血液濃縮器より出て肝細胞バイオリアクター
装置に入った。バイオリアクターで灌流した後、限外濾
液は左の頚静脈を介して動物に戻した。体外肝代謝シス
テムを証明するために、肝臓で代謝されることが公知の
２つの化学物質（７−エトキシクマリンとリドカイン）
を、バイオリアクターの注入口で限外濾液に添加した。
限外濾液を動物に戻す前に、バイオリアクターの出口で
各代謝物（７−OHクマリンとモノエチルグリシンキシリ
ダイド（MEGX））を測定した。７−エトキシクマリンと
リドカインが両方ともかなり代謝されることが観察され
た（表４と５）。従ってこの結果は、バイオリアクター
の支持装置としての応用性を示し、体外肝代謝を提供す
ることを示している。この装置は肝不全を有するヒトの
患者の灌流に使用することができる。血液細胞と血漿の
分離は、肝細胞に対して受容者の免疫応答を少なくする
であろう。ヒトのドナー（例えば死体から得られた移植
可能な肝臓）および非ヒトソース（例えばブタ）からの
肝細胞は、体外肝支持を提供するためのバイオリアクタ
ーに使用することができる。
イトのブタから取り出した肝臓の肝細胞を培養した。１
匹の肝臓から、高い（約80％以上）生育活性を有する20
億から50億の細胞がルーチンに得られる。使用した培地
は、実施例１に記載のホルモンを補足したウェイマウス
（Waymoouth）培地である。20億から50億の細胞を入れ
るために、バイオリアクターを２つの閉じ込め容器にス
ケールアップした。各閉じ込め容器の内径は40mmであ
り、高さは10mmである。直径約2mmのガラスビーズと、
閉じ込め容器につき全部で250mlのガラスビーズを使用
した。肝細胞の高い生育活性は安定な酸素消費速度（36
0ml/分）により証明された（表３）。肝細胞接種約２時
間後に、肝臓を除いたブタ（完全な肝不全を模倣するた
めに手術により肝臓を除去した）にバイオリアクターを
取り付けた。体外肝支持装置としてのバイオリアクター
の応用を示す模式図を図３に示す。左の大腿の動脈の血
液をミンテック（Mintech）の血液濃縮器に導いた。12
個のフリンジエレカス（fringe elecath）カニューレ
を大腿動脈に挿入し、1/4インチのPVC管で血液濃縮器に
接続した。血液濃縮器により、血液は細胞を含まない限
外濾過部分と血液細胞部分に分離された。血液細胞画分
は同様の管により大腿静脈に戻した。限外濾液は、ロー
ラーポンプを用いて40ml/分の調整した速度で、1/4イン
チ管により血液濃縮器より出て肝細胞バイオリアクター
装置に入った。バイオリアクターで灌流した後、限外濾
液は左の頚静脈を介して動物に戻した。体外肝代謝シス
テムを証明するために、肝臓で代謝されることが公知の
２つの化学物質（７−エトキシクマリンとリドカイン）
を、バイオリアクターの注入口で限外濾液に添加した。
限外濾液を動物に戻す前に、バイオリアクターの出口で
各代謝物（７−OHクマリンとモノエチルグリシンキシリ
ダイド（MEGX））を測定した。７−エトキシクマリンと
リドカインが両方ともかなり代謝されることが観察され
た（表４と５）。従ってこの結果は、バイオリアクター
の支持装置としての応用性を示し、体外肝代謝を提供す
ることを示している。この装置は肝不全を有するヒトの
患者の灌流に使用することができる。血液細胞と血漿の
分離は、肝細胞に対して受容者の免疫応答を少なくする
であろう。ヒトのドナー（例えば死体から得られた移植
可能な肝臓）および非ヒトソース（例えばブタ）からの
肝細胞は、体外肝支持を提供するためのバイオリアクタ
ーに使用することができる。
当業者には前記の装置の変更や修飾に加えて、他の変
更や修飾が可能であろう。従って本発明の範囲は前記の
各実施態様に限定されるものではなく、請求の範囲によ
り限定されるものである。
更や修飾が可能であろう。従って本発明の範囲は前記の
各実施態様に限定されるものではなく、請求の範囲によ
り限定されるものである。
フロントページの続き (72)発明者 リ，アルバート パック − ハング アメリカ合衆国63021 ミズーリ州セン ト ルイス，オーク リーフ マノー コート 525 (72)発明者 ホワイトヘッド，ティモシー ダニエル アメリカ合衆国63143 ミズーリ州セン ト ルイス，ベレビュー アベニュー 1935 (56)参考文献 特開 平３−15382（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12M 3/00 - 3/08 A61M 1/36 C12N 5/06
Claims (24)
- 【請求項１】肝細胞バイオリアクターであって、肝細胞
またはその凝集物を閉じ込め容器（containment vesse
l）に入れることを可能にする入口および肝細胞または
その凝集物を出すことを可能にする出口を有する閉じ込
め容器；上記肝細胞またはその凝集物が入ることができ
る上記閉じ込め容器中のマトリックスであって、上記入
口から出口まで通じている流体中に存在するマトリック
ス；および該マトリックス内に捕捉された複数の肝細胞
凝集物であって、細胞−細胞接触により上記マトリック
ス内で相互に連結した肝細胞凝集物からなる、肝細胞バ
イオリアクター。 - 【請求項２】肝細胞凝集物は球状（spheroid）である、
請求の範囲第１項に記載の肝細胞バイオリアクター。 - 【請求項３】マトリックスはガラスビーズである、請求
の範囲第１項に記載のバイオリアクター。 - 【請求項４】肝細胞凝集物は本質的に結合組織を含まな
い、請求の範囲第１項に記載のバイオリアクター。 - 【請求項５】マトリックスはマトリックス1ml当り少な
くとも約3.00×106細胞の密度の肝細胞を有する、請求
の範囲第１項に記載のバイオリアクター。 - 【請求項６】バイオリアクターを作成する方法であっ
て、 肝細胞またはその凝集物を閉じ込め容器に入れることを
可能にする入口および肝細胞またはその凝集物を出すこ
とを可能にする出口を有する閉じ込め容器を供給し、 上記肝細胞またはその凝集物が入ることができる上記閉
じ込め容器内にマトリックスを供給し、同マトリックス
は上記入口から出口まで通じている流体中に存在し、そ
して、 マトリックス内に複数の肝細胞凝集物を捕捉する、ここ
で、上記肝細胞凝集物は細胞−細胞接触により上記マト
リックス内で相互に連結されている、工程よりなる上記
方法。 - 【請求項７】肝細胞凝集物は球状である、請求の範囲第
６項に記載のバイオリアクターの作成方法。 - 【請求項８】マトリックスはガラスビーズである、請求
の範囲第６項に記載の肝細胞バイオリアクターの作成方
法。 - 【請求項９】肝細胞凝集物は本質的に結合組織を含まな
い、請求の範囲第６項に記載の肝細胞バイオリアクター
の作成方法。 - 【請求項１０】マトリックスはマトリックス1ml当り少
なくとも約3.00×106細胞の密度の肝細胞を有する、請
求の範囲第６項に記載の肝細胞バイオリアクターの作成
方法。 - 【請求項１１】肝細胞凝集物はマトリックスを介した肝
細胞の灌流により形成される、請求の範囲第６項に記載
の肝細胞バイオリアクターの作成方法。 - 【請求項１２】肝細胞バイオリアクターの使用方法であ
って、 肝細胞またはその凝集物を閉じ込め容器に入れることを
可能にする入口および肝細胞またはその凝集物を出すこ
とを可能にする出口を有する閉じ込め容器を供給し、 上記肝細胞またはその凝集物が入ることができる上記閉
じ込め容器中のマトリックスを供給し、同マトリックス
は上記入口から出口まで通じている流体中に存在し、 上記閉じ込め容器内に複数の肝細胞凝集物を捕捉し、こ
こで、上記肝細胞凝集物は細胞−細胞接触により上記マ
トリックス内で相互に連結されており、そして、 培地を上記入口、上記閉じ込め容器および上記出口を介
して灌流させる工程よりなる、上記方法。 - 【請求項１３】複数の肝細胞凝集物は球状である、請求
の範囲第12項に記載の肝細胞バイオリアクターの使用方
法。 - 【請求項１４】肝細胞凝集物はマトリックスを介した肝
細胞の灌流により形成される、請求の範囲第12項に記載
の肝細胞バイオリアクターの使用方法。 - 【請求項１５】培地は代謝物を含む、請求の範囲第12項
に記載の肝細胞バイオリアクターの使用方法。 - 【請求項１６】マトリックスはガラスビーズである、請
求の範囲第12項に記載の肝細胞バイオリアクターの使用
方法。 - 【請求項１７】肝細胞凝集物は本質的に結合組織を含ま
ない、請求の範囲第12項に記載の肝細胞バイオリアクタ
ーの使用方法。 - 【請求項１８】マトリックスはマトリックス1ml当り少
なくとも約3.00×106細胞の密度の肝細胞を有する、請
求の範囲第12項に記載の肝細胞バイオリアクターの使用
方法。 - 【請求項１９】肝臓補助の必要がある哺乳動物を治療す
るための肝細胞バイオリアクター肝臓補助システムであ
って、 肝臓補助の必要のある哺乳動物から血液を採取する手
段； 治療される哺乳動物の血液を細胞性成分と非細胞性成分
に分離する手段； 肝細胞またはその凝集物を閉じ込め容器に入れることを
可能にする入口および肝細胞またはその凝集物を出すこ
とを可能にする出口を有する閉じ込め容器、 上記肝細胞またはその凝集物が入ることができる上記閉
じ込め容器中のマトリックスであって、上記入口から出
口まで通じている流体中に存在するマトリックス、およ
び該マトリックス内に捕捉された複数の肝細胞凝集物で
あって、細胞−細胞接触により上記マトリックス内で相
互に連結した肝細胞凝集物からなる、肝細胞バイオリア
クター； 治療される哺乳動物の非細胞性血液成分を上記入口、上
記マトリックスおよび上記出口を介して灌流する手段；
および 上記処理した非細胞性血液成分と細胞性血液成分を上記
哺乳動物に戻す手段よりなる、上記システム。 - 【請求項２０】哺乳動物とは独立に、肝細胞バイオリア
クターを介して培地の流速を維持する手段をさらに含有
する、請求の範囲第19項に記載の肝細胞バイオリアクタ
ー肝臓補助システム。 - 【請求項２１】肝細胞凝集物は球状である、請求の範囲
第19項に記載の肝細胞バイオリアクター肝臓補助システ
ム。 - 【請求項２２】マトリックスはガラスビーズである、請
求の範囲第19項に記載の肝細胞バイオリアクター肝臓補
助システム。 - 【請求項２３】肝細胞凝集物は本質的に結合組織を含ま
ない、請求の範囲第19項に記載の肝細胞バイオリアクタ
ー肝臓補助システム。 - 【請求項２４】マトリックスはマトリックス1ml当り少
なくとも約3.00×106細胞の密度の肝細胞を有する、請
求の範囲第19項に記載の肝細胞バイオリアクター肝臓補
助システム。
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