JP3322687B2 - 細胞の分離方法、分離した細胞（ｄｓｍ ６３１４とｄｓｍ ６４１８）、及び分離した細胞の多糖類生産への使用 - Google Patents
細胞の分離方法、分離した細胞（ｄｓｍ ６３１４とｄｓｍ ６４１８）、及び分離した細胞の多糖類生産への使用Info
- Publication number
- JP3322687B2 JP3322687B2 JP10023592A JP10023592A JP3322687B2 JP 3322687 B2 JP3322687 B2 JP 3322687B2 JP 10023592 A JP10023592 A JP 10023592A JP 10023592 A JP10023592 A JP 10023592A JP 3322687 B2 JP3322687 B2 JP 3322687B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- cells
- sphingomonas
- gellan
- polysaccharide
- dsm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
- C12N1/205—Bacterial isolates
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/04—Polysaccharides, i.e. compounds containing more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic bonds
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/38—Pseudomonas
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/822—Microorganisms using bacteria or actinomycetales
- Y10S435/874—Pseudomonas
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Virology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、細胞を分離する方法、
本方法により得られた細胞系列、並びに分離した細胞を
使用して多糖類を効率よく生産することを目的とする方
法に関する。
本方法により得られた細胞系列、並びに分離した細胞を
使用して多糖類を効率よく生産することを目的とする方
法に関する。
【０００２】
【従来の技術】多糖類の生物工学的生産に関する技術水
準の改良が要望されている。
準の改良が要望されている。
【０００３】例えばジェラン（Gellan）は四糖類を構成
単位とする陰イオン性微生物由来ヘテロ多糖類で、オウ
ロモナス エロデアATCC 31461により形成される。野性
のジェランはアセチル残基、及びL-グリセリン酸残基で
置換されている。この置換基はアルカリ処理により容易
に解離できる。こうして得られた置換基のないジェラン
（以下ジェラン/uと称する）は技術的に興味のある生産
物で、水溶液中で熱可逆的にゲルを生成するという物理
的性質を有する。ジェラン/uは既に寒天の代替品として
市販されている（米国ローウェイ ケルコ社のジェルラ
イト）。食品工業に対して広い応用分野が考えられる。
食品添加剤としての認可が米国及びヨーロッパで既に申
請されており〔１〕、日本では1988年以来食品添加剤と
して認可されている〔１〕。
単位とする陰イオン性微生物由来ヘテロ多糖類で、オウ
ロモナス エロデアATCC 31461により形成される。野性
のジェランはアセチル残基、及びL-グリセリン酸残基で
置換されている。この置換基はアルカリ処理により容易
に解離できる。こうして得られた置換基のないジェラン
（以下ジェラン/uと称する）は技術的に興味のある生産
物で、水溶液中で熱可逆的にゲルを生成するという物理
的性質を有する。ジェラン/uは既に寒天の代替品として
市販されている（米国ローウェイ ケルコ社のジェルラ
イト）。食品工業に対して広い応用分野が考えられる。
食品添加剤としての認可が米国及びヨーロッパで既に申
請されており〔１〕、日本では1988年以来食品添加剤と
して認可されている〔１〕。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】多糖類、例えばジェラ
ンの生成が認められる細菌種は公知である。この種の菌
種を多糖類の生産に利用する場合の難点は、目的とする
多糖類を細胞外で効率良く生産するこの菌種の菌株、ク
ローン又は細胞が得られていないと言う点にある。
ンの生成が認められる細菌種は公知である。この種の菌
種を多糖類の生産に利用する場合の難点は、目的とする
多糖類を細胞外で効率良く生産するこの菌種の菌株、ク
ローン又は細胞が得られていないと言う点にある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】ところが意外にも、ジェ
ランを細胞外で生産する細胞はジェランマトリックス中
に沈下せず、一方ジェランを細胞外で生産しない細胞は
ジェランマトリックス中に沈むことが見い出された。こ
の得られた知見を基にして目的とする多糖類、例えばジ
ェランを細胞外で効率よく生産する細胞又はクローンを
分離する方法を開発した。
ランを細胞外で生産する細胞はジェランマトリックス中
に沈下せず、一方ジェランを細胞外で生産しない細胞は
ジェランマトリックス中に沈むことが見い出された。こ
の得られた知見を基にして目的とする多糖類、例えばジ
ェランを細胞外で効率よく生産する細胞又はクローンを
分離する方法を開発した。
【０００６】本発明の根底となる課題を解決するための
本発明の一つの実施態様によれば、一種の多糖類の生成
が認められる一種の細菌種の細胞を分離する方法が提案
され、その場合分離しようとする細胞は多糖類を細胞外
で生成するものであり、この方法は、（ａ）ゲル化剤と
して未置換のジェランを含む培地を使用し、（ｂ）原料
となる前記菌種の細胞を希釈塗抹法により個別化し、且
つ（ｃ）前記培地のマトリックス中に沈下しない細胞又
はクローンを分離することを特徴とする。
本発明の一つの実施態様によれば、一種の多糖類の生成
が認められる一種の細菌種の細胞を分離する方法が提案
され、その場合分離しようとする細胞は多糖類を細胞外
で生成するものであり、この方法は、（ａ）ゲル化剤と
して未置換のジェランを含む培地を使用し、（ｂ）原料
となる前記菌種の細胞を希釈塗抹法により個別化し、且
つ（ｃ）前記培地のマトリックス中に沈下しない細胞又
はクローンを分離することを特徴とする。
【０００７】本発明の方法によれば、一種の多糖類の生
成が認められる一種の細菌種の細胞を原料として、原料
の細胞よりも更に有効な方法でこの多糖類を細胞外で生
成する細胞又はクローンを分離することができる。
成が認められる一種の細菌種の細胞を原料として、原料
の細胞よりも更に有効な方法でこの多糖類を細胞外で生
成する細胞又はクローンを分離することができる。
【０００８】更に本発明の方法によれば、ジェランの生
成が認められる一種の細菌種の細胞を原料として、ジェ
ランを細胞外で生成する細胞又はクローンを分離するこ
とができる。
成が認められる一種の細菌種の細胞を原料として、ジェ
ランを細胞外で生成する細胞又はクローンを分離するこ
とができる。
【０００９】その場合、オウロモナス属又はスフィンゴ
モナス属の一種の菌種の細胞、特に菌種オウロモナス
エロデア又はスフィンゴモナス パウシモビリスの細
胞、例えばオウロモナス エロデアATCC 31461の細胞を
原料とすることができる。この培養基から、本発明の方
法によりジェランを有効に生成するスフィンゴモナスパ
ウシモビリスDSM 6314を得ることができた。
モナス属の一種の菌種の細胞、特に菌種オウロモナス
エロデア又はスフィンゴモナス パウシモビリスの細
胞、例えばオウロモナス エロデアATCC 31461の細胞を
原料とすることができる。この培養基から、本発明の方
法によりジェランを有効に生成するスフィンゴモナスパ
ウシモビリスDSM 6314を得ることができた。
【００１０】又本発明の方法によれば、エキソ多糖類P4
の生成が認められる一種の細菌種の細胞を原料として、
多糖類P4を細胞外で生成する細胞又はクローンを分離す
ることができる。
の生成が認められる一種の細菌種の細胞を原料として、
多糖類P4を細胞外で生成する細胞又はクローンを分離す
ることができる。
【００１１】エキソ多糖類P4は最初の分析（糖配列決
定）によれば、グリコース２分子とラムノース１分子と
から構成されている。水溶液ではP4は粘度を高くする性
質を示す。P4水溶液の粘度はpH２乃至pH10の範囲にあ
り、約80℃までの温度で安定である。塩分が増加するに
つれてP4水溶液の粘度は徐々に低下する。アルカリ性媒
体の中で加熱するとP4は固いゲルを形成する。
定）によれば、グリコース２分子とラムノース１分子と
から構成されている。水溶液ではP4は粘度を高くする性
質を示す。P4水溶液の粘度はpH２乃至pH10の範囲にあ
り、約80℃までの温度で安定である。塩分が増加するに
つれてP4水溶液の粘度は徐々に低下する。アルカリ性媒
体の中で加熱するとP4は固いゲルを形成する。
【００１２】その場合、シュードモナス属又はスフィン
ゴモナス属の一種の菌種の細胞、特に菌種シュードモナ
ス パウシモビリス又はスフィンゴモナス パウシモビ
リスの細胞、特にシュードモナス パウシモビリスNCIM
B 11 942の細胞を原料とすることができる。本発明の方
法によって、この培養基からP4を有効に生成するスフィ
ンゴモナス パウシモビリスDSM 6418（以下これもP4と
称する）を得ることができた。
ゴモナス属の一種の菌種の細胞、特に菌種シュードモナ
ス パウシモビリス又はスフィンゴモナス パウシモビ
リスの細胞、特にシュードモナス パウシモビリスNCIM
B 11 942の細胞を原料とすることができる。本発明の方
法によって、この培養基からP4を有効に生成するスフィ
ンゴモナス パウシモビリスDSM 6418（以下これもP4と
称する）を得ることができた。
【００１３】本発明のもう一つの実施態様の対象はスフ
ィンゴモナス パウシモビリスDSM6314である。これは
本発明の方法により得られる菌株で、細胞外でジェラン
を有効に生成する。
ィンゴモナス パウシモビリスDSM6314である。これは
本発明の方法により得られる菌株で、細胞外でジェラン
を有効に生成する。
【００１４】更に本発明のもう一つの実施態様の対象は
スフィンゴモナス パウシモビリスDSM 6418である。こ
れは本発明の方法により得られる菌株で、細胞外でP4を
有効に生成する。
スフィンゴモナス パウシモビリスDSM 6418である。こ
れは本発明の方法により得られる菌株で、細胞外でP4を
有効に生成する。
【００１５】最後に本発明のもう一つの実施態様の対象
は一種の多糖類をバッチ式又は連続的に生産する方法で
あり、この方法は本発明の方法により得られる細胞又は
この細胞のクローンを用いて多糖類を生産することを特
徴とする。
は一種の多糖類をバッチ式又は連続的に生産する方法で
あり、この方法は本発明の方法により得られる細胞又は
この細胞のクローンを用いて多糖類を生産することを特
徴とする。
【００１６】
【実施例】本発明の実施例はジェラン又はP4の生産に関
する。
する。
【００１７】（研究の背景)新たに開発したスクリーニ
ング技術によって菌株（ATCC 31461）オウロモナスエロ
デア〔２〕（1987年以前はシュードモナス エロデア
〔３〕) の培養基から２種の菌株を分離した。そのキャ
ラクタリゼーションによブラウンシュヴァイクのドイツ
微生物・培養細胞収集機関（DSM)はこれを系統名スフィ
ンゴモナスパウシモビリスの中に組み入れた。これはこ
れまで未知の微生物で幾つかの特徴が菌株 (ATCC 3146
1) とは異なっている。文献にはこの培養基を多態性と
呼んでいる〔３〕。カング等〔３〕によれば、新たにプ
レートアウトした培養基を使用した場合にのみこ植え付
けられた菌株によく成長しジェランをよく生産する
〔４〕。この現象は培養基の加齢と共に生産しない変異
株が優勢になるためと説明できよう。純粋培養で分離さ
れた菌株スフィンゴモナス パウシモビリスの２種の変
異株の内、変異株E2のみが多糖類を細胞外で生産し、変
異株E1の方は生産しない。技術的に興味のあるこの変異
株スフィンゴモナス パウシモビリスE2を凍結乾燥体と
して番号6314でDSM に寄託した。変異体E1とE2の混合培
養基は比較的速やかに多糖類ジェランを生産する能力を
喪失する。このような事情が明らかでなく、植え付ける
菌株の調整ができないため、醗酵の結果が非常にまちま
ちとなる。
ング技術によって菌株（ATCC 31461）オウロモナスエロ
デア〔２〕（1987年以前はシュードモナス エロデア
〔３〕) の培養基から２種の菌株を分離した。そのキャ
ラクタリゼーションによブラウンシュヴァイクのドイツ
微生物・培養細胞収集機関（DSM)はこれを系統名スフィ
ンゴモナスパウシモビリスの中に組み入れた。これはこ
れまで未知の微生物で幾つかの特徴が菌株 (ATCC 3146
1) とは異なっている。文献にはこの培養基を多態性と
呼んでいる〔３〕。カング等〔３〕によれば、新たにプ
レートアウトした培養基を使用した場合にのみこ植え付
けられた菌株によく成長しジェランをよく生産する
〔４〕。この現象は培養基の加齢と共に生産しない変異
株が優勢になるためと説明できよう。純粋培養で分離さ
れた菌株スフィンゴモナス パウシモビリスの２種の変
異株の内、変異株E2のみが多糖類を細胞外で生産し、変
異株E1の方は生産しない。技術的に興味のあるこの変異
株スフィンゴモナス パウシモビリスE2を凍結乾燥体と
して番号6314でDSM に寄託した。変異体E1とE2の混合培
養基は比較的速やかに多糖類ジェランを生産する能力を
喪失する。このような事情が明らかでなく、植え付ける
菌株の調整ができないため、醗酵の結果が非常にまちま
ちとなる。
【００１８】新たに開発したスクリーニング技術のもう
一つの成果として、菌株シュードモナス パウシモビリ
ス（NCIMB 11942)〔５〕から幾つかの異なる菌株を分離
することができた。純粋培養で得られた変異株P4のキャ
ラクタリゼーションによりブラウンシュヴァイクのドイ
ツ微生物・培養細胞収集機関（DSM)はこれを同様に系統
名スフィンゴモナス パウシモビリスの中に組み入れ
た。これはこれまで未知の微生物で幾つかの特徴が菌株
シュードモナス パウシモビリス（NCIMB 11942)とは異
なっている。シュードモナス パウシモビリス (NCIMB
11942)の培養基から分離した変異株の内で、変異株スフ
ィンゴモナス パウシモビリスP4のみが細胞外で多糖類
P4を生産する。技術的に興味のあるこの変異株スフィン
ゴモナスパウシモビリスP4を凍結乾燥体として番号6418
でDSM に寄託した。幾つかの変異体の混合培養基は比較
的速やかにその多糖類P4を生産する能力を喪失する。
一つの成果として、菌株シュードモナス パウシモビリ
ス（NCIMB 11942)〔５〕から幾つかの異なる菌株を分離
することができた。純粋培養で得られた変異株P4のキャ
ラクタリゼーションによりブラウンシュヴァイクのドイ
ツ微生物・培養細胞収集機関（DSM)はこれを同様に系統
名スフィンゴモナス パウシモビリスの中に組み入れ
た。これはこれまで未知の微生物で幾つかの特徴が菌株
シュードモナス パウシモビリス（NCIMB 11942)とは異
なっている。シュードモナス パウシモビリス (NCIMB
11942)の培養基から分離した変異株の内で、変異株スフ
ィンゴモナス パウシモビリスP4のみが細胞外で多糖類
P4を生産する。技術的に興味のあるこの変異株スフィン
ゴモナスパウシモビリスP4を凍結乾燥体として番号6418
でDSM に寄託した。幾つかの変異体の混合培養基は比較
的速やかにその多糖類P4を生産する能力を喪失する。
【００１９】スフィンゴモナス パウシモビリスE2 (DS
M 6314) は好気的醗酵に於いて種々の炭素源例えばグリ
コールから、硝酸アンモニウムなどの窒素源により、無
機塩類と微量元素との存在下で、複合培地あり又はなし
でエキソ多糖類ジェランを生産する。30kg/m3 のグリコ
ースと反応するに要する醗酵期間は46.5時間である。醗
酵ブイヨンはチキソトロピーを示す。せん断力を加えた
後の、擬塑性流動を示すジェラン溶液の流動特性はオス
ワルドとデ・ワーレとの関係によって表すことができ
る。醗酵中に粘度は著しく上昇する。醗酵の終わりには
コンシステンシーファクターは 2000mPa・S n を越え、
フローインデックスｎは0.11の値まで低下する。純ジェ
ランの収率は使用した炭素源に対して28％を越える。従
って従来の方法に比べて収率は明らかに向上している。
カンク等は使用した炭素源に対して50重量％の多糖類と
バイオマスとを得たが、その内約50重量％はタンパク質
と不活性 (細胞) 成分であったと言う。この記述からす
れば純ジェランの収率は使用した炭素源に対して25重量
％となる〔４〕、〔６〕。この場合分析方法が異なれ
ば、その結果が一致しないこともあり得るので、菌株オ
ウロモナス エロデア（ATCC 31461) を用いて発明者自
身で実験を行った。この比較醗酵の結果、オウロモナス
エロデア (ATCC 31461) を用いたカングの醗酵方法に
よるタンパク質を含まない純ジェランの収率は遥かに低
く約６〜10％であった。
M 6314) は好気的醗酵に於いて種々の炭素源例えばグリ
コールから、硝酸アンモニウムなどの窒素源により、無
機塩類と微量元素との存在下で、複合培地あり又はなし
でエキソ多糖類ジェランを生産する。30kg/m3 のグリコ
ースと反応するに要する醗酵期間は46.5時間である。醗
酵ブイヨンはチキソトロピーを示す。せん断力を加えた
後の、擬塑性流動を示すジェラン溶液の流動特性はオス
ワルドとデ・ワーレとの関係によって表すことができ
る。醗酵中に粘度は著しく上昇する。醗酵の終わりには
コンシステンシーファクターは 2000mPa・S n を越え、
フローインデックスｎは0.11の値まで低下する。純ジェ
ランの収率は使用した炭素源に対して28％を越える。従
って従来の方法に比べて収率は明らかに向上している。
カンク等は使用した炭素源に対して50重量％の多糖類と
バイオマスとを得たが、その内約50重量％はタンパク質
と不活性 (細胞) 成分であったと言う。この記述からす
れば純ジェランの収率は使用した炭素源に対して25重量
％となる〔４〕、〔６〕。この場合分析方法が異なれ
ば、その結果が一致しないこともあり得るので、菌株オ
ウロモナス エロデア（ATCC 31461) を用いて発明者自
身で実験を行った。この比較醗酵の結果、オウロモナス
エロデア (ATCC 31461) を用いたカングの醗酵方法に
よるタンパク質を含まない純ジェランの収率は遥かに低
く約６〜10％であった。
【００２０】（培養基の分離）オウロモナス エロデア
（ATCC 31461) 又はシュードモナス パウシモビリス(N
CIMB 11942)を、寒天の代わりにジェラン/uを用いた固
形培地の上に一様に広げれば (プレートアウト) 、30℃
で約48時間のインキュベーション後にコロニーがマトリ
ックス中に沈下するのが見られる。炭素源を加えない実
験では成長は見られず、ジェラン/uは明らかに基質とし
ては利用されていない。但しゲルは微生物により液状に
なる。生理食塩液の中でオウロモナス エロデア (ATCC
31461)又はシュードモナス パウシモビリス (NCIMB 1
1942)を段階的に希釈し、これを酵母・麦芽・ジェラン/
uのプレート上にプレートアウトすれば、コロニーの一
部はジェラン/uのマトリックス中に沈下しない。この培
養は多糖類の生産に特に適していることが判明した。数
回の接種とこの分離過程の繰り返しによって菌株スフィ
ンゴモナス パウシモビリスE2 (DSM 6314) 又はスフィ
ンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM 6418) の純粋培養
が得られた。生産性のない変異株は沈下したコロニーか
ら分離される。
（ATCC 31461) 又はシュードモナス パウシモビリス(N
CIMB 11942)を、寒天の代わりにジェラン/uを用いた固
形培地の上に一様に広げれば (プレートアウト) 、30℃
で約48時間のインキュベーション後にコロニーがマトリ
ックス中に沈下するのが見られる。炭素源を加えない実
験では成長は見られず、ジェラン/uは明らかに基質とし
ては利用されていない。但しゲルは微生物により液状に
なる。生理食塩液の中でオウロモナス エロデア (ATCC
31461)又はシュードモナス パウシモビリス (NCIMB 1
1942)を段階的に希釈し、これを酵母・麦芽・ジェラン/
uのプレート上にプレートアウトすれば、コロニーの一
部はジェラン/uのマトリックス中に沈下しない。この培
養は多糖類の生産に特に適していることが判明した。数
回の接種とこの分離過程の繰り返しによって菌株スフィ
ンゴモナス パウシモビリスE2 (DSM 6314) 又はスフィ
ンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM 6418) の純粋培養
が得られた。生産性のない変異株は沈下したコロニーか
ら分離される。
【００２１】醗酵の際にできるだけ高い収率を得るに
は、非生産性変異体の混入を防止する必要がある。醗酵
用の最初の一次培養を段階的の希釈から接種すると最も
よい結果が得られる。
は、非生産性変異体の混入を防止する必要がある。醗酵
用の最初の一次培養を段階的の希釈から接種すると最も
よい結果が得られる。
【００２２】（菌株保存と培養技術）スフィンゴモナス
パウシモビリスE2 (DSM 6314) の菌株保存はゲル化剤
として寒天又はジェラン/uを加えた酵母・麦芽プレート
の上で常法通り行うことができ、この上で良好な成長が
見られる。スフィンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM
6418) の菌株保存は常法通りザペック ドックスプレー
ト又は酵母・麦芽プレートの上で行われ、何れの培地で
も良好な成長が見られる。生産性変異株の選択は酵母・
麦芽・ジェラン/uプレート上で行う。プレートは一般に
30℃で１〜２日インキュベートする。
パウシモビリスE2 (DSM 6314) の菌株保存はゲル化剤
として寒天又はジェラン/uを加えた酵母・麦芽プレート
の上で常法通り行うことができ、この上で良好な成長が
見られる。スフィンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM
6418) の菌株保存は常法通りザペック ドックスプレー
ト又は酵母・麦芽プレートの上で行われ、何れの培地で
も良好な成長が見られる。生産性変異株の選択は酵母・
麦芽・ジェラン/uプレート上で行う。プレートは一般に
30℃で１〜２日インキュベートする。
【００２３】この培養基は微生物の活性が低下すること
なく、４℃で１〜２週間は保存可能である。保管のもう
一つの方法として例えば培養基を前処理なしで−20℃で
冷凍することも可能である。しかし、この培養基は使用
する前に一度接種する必要がある。DSM には培養基を凍
結乾燥体として寄託した。
なく、４℃で１〜２週間は保存可能である。保管のもう
一つの方法として例えば培養基を前処理なしで−20℃で
冷凍することも可能である。しかし、この培養基は使用
する前に一度接種する必要がある。DSM には培養基を凍
結乾燥体として寄託した。
【００２４】最初の一次培養には25mlの醗酵培養液を入
れたフラスコを使用した。それに続く各段階に、その10
％の容積のその前の段階からの接種物を接種した。イン
キュベーションは180rpmの振とう器にかけて30℃でそれ
ぞれ24時間行った。
れたフラスコを使用した。それに続く各段階に、その10
％の容積のその前の段階からの接種物を接種した。イン
キュベーションは180rpmの振とう器にかけて30℃でそれ
ぞれ24時間行った。
【００２５】培地のグリコース以外の全ての成分は一緒
に 121℃で滅菌した。グリコースだけは、カラメルの生
成を避けるために別に溶解して滅菌した。グリコース溶
液とその他の成分の溶液とはクリーベンチにより培養液
に合体した。液体培養 (振とうフラスコと醗酵槽) に用
いたクランク〔３〕の培養液の組成は次の通りである。 3.3 ％ グリコースH2O 0.01％ MgSO4 7H2O 0.09％ NH4NO3 0.05％ プロモソイ (モントラック ソヤ オーバーシ
ース ビー. ブイ. ,ケム. ディビ．，ロッテルダム) １ ml 微量元素濃縮溶液 ５ ml リン酸カリウム緩衝液pH７（１モル）
に 121℃で滅菌した。グリコースだけは、カラメルの生
成を避けるために別に溶解して滅菌した。グリコース溶
液とその他の成分の溶液とはクリーベンチにより培養液
に合体した。液体培養 (振とうフラスコと醗酵槽) に用
いたクランク〔３〕の培養液の組成は次の通りである。 3.3 ％ グリコースH2O 0.01％ MgSO4 7H2O 0.09％ NH4NO3 0.05％ プロモソイ (モントラック ソヤ オーバーシ
ース ビー. ブイ. ,ケム. ディビ．，ロッテルダム) １ ml 微量元素濃縮溶液 ５ ml リン酸カリウム緩衝液pH７（１モル）
【００２６】微量元素濃縮溶液の組成は次の通りであ
る。 塩化マンガン 4H2O 1.800 g/l 硫酸鉄 (II) 7H2O 2.488 g/l ホウ酸 0.285 g/l 硫酸銅 5H2O 0.052 g/l 塩化亜鉛 0.021 g/l 塩化コバルト 6H2O 0.074 g/l モリブデン酸マグネシウム 0.023 g/l 硝酸ナトリウム 2H2O 2.1 g/l
る。 塩化マンガン 4H2O 1.800 g/l 硫酸鉄 (II) 7H2O 2.488 g/l ホウ酸 0.285 g/l 硫酸銅 5H2O 0.052 g/l 塩化亜鉛 0.021 g/l 塩化コバルト 6H2O 0.074 g/l モリブデン酸マグネシウム 0.023 g/l 硝酸ナトリウム 2H2O 2.1 g/l
【００２７】上述以外の他の培養液の組成も、ジェラン
の生産及び多糖類P4の生産に使用して効果があった。
の生産及び多糖類P4の生産に使用して効果があった。
【００２８】（スフィンゴモナス パウシモビリスE2
(DSM 6314) 株のキャラクタリゼーション−形態学）細
菌スフィンゴモナス パウシモビリスE2 (DSM 6314) は
グラム陰性の短い棒状の細胞で、その幅は 0.6〜0.8 μ
m 、長さは 1.5〜4.0 μm である。新しい培養基中の細
胞はよく動くが、培養の加齢と共に生成する多糖類によ
りその動きが著しく妨げられる。この微生物は好気的条
件でのみ発育する。
(DSM 6314) 株のキャラクタリゼーション−形態学）細
菌スフィンゴモナス パウシモビリスE2 (DSM 6314) は
グラム陰性の短い棒状の細胞で、その幅は 0.6〜0.8 μ
m 、長さは 1.5〜4.0 μm である。新しい培養基中の細
胞はよく動くが、培養の加齢と共に生成する多糖類によ
りその動きが著しく妨げられる。この微生物は好気的条
件でのみ発育する。
【００２９】この細菌は酵母・麦芽・寒天培地の上で48
時間のインキュベーション後、直径約２〜３mmのコロニ
ーを形成する。このコロニーは非拡散性色素で黄色に染
まる。変異菌株E1は濃い黄色で固形培地の上で粘性のな
い固いコロニーを作る。変異株E2の方は固形培地の上で
は変異株E1よりも幾つかくすんだ黄色に見える。生成し
た多糖類のため変異株E2は粘性である。かなりの時間イ
ンキュベートしたE2のプレートには黄色の細胞の集積を
含む透明のコロニーが認められ、明らかに多量の多糖類
が析出している。
時間のインキュベーション後、直径約２〜３mmのコロニ
ーを形成する。このコロニーは非拡散性色素で黄色に染
まる。変異菌株E1は濃い黄色で固形培地の上で粘性のな
い固いコロニーを作る。変異株E2の方は固形培地の上で
は変異株E1よりも幾つかくすんだ黄色に見える。生成し
た多糖類のため変異株E2は粘性である。かなりの時間イ
ンキュベートしたE2のプレートには黄色の細胞の集積を
含む透明のコロニーが認められ、明らかに多量の多糖類
が析出している。
【００３０】（スフィンゴモナス パウシモビリスE2
(DSM 6314) 株のキャラクタリゼーション−生理学と生
化学的性質）本培養基の生化学的キャラクタリゼーショ
ンは発明者の申請によりブラウンシュヴァイクのドイツ
微生物・培養細胞収集機関（DSM)が実施した。この試験
の結果スフィンゴモナス パウシモビリスE2 (DSM 631
4) はこれまでには未知の菌種であることが判明した。
平行して試験したオウロモナス エロデア (ATCC 3146
1) とは明らかな相違が見られた。培養細菌スフィンゴ
モナス パウシモビリスE2(DSM 6314) は次のような生
理学的、生化学的性質を有する。
(DSM 6314) 株のキャラクタリゼーション−生理学と生
化学的性質）本培養基の生化学的キャラクタリゼーショ
ンは発明者の申請によりブラウンシュヴァイクのドイツ
微生物・培養細胞収集機関（DSM)が実施した。この試験
の結果スフィンゴモナス パウシモビリスE2 (DSM 631
4) はこれまでには未知の菌種であることが判明した。
平行して試験したオウロモナス エロデア (ATCC 3146
1) とは明らかな相違が見られた。培養細菌スフィンゴ
モナス パウシモビリスE2(DSM 6314) は次のような生
理学的、生化学的性質を有する。
【００３１】
【表１】
【００３２】（スフィンゴモナス パウシモビリスP4
(DSM 6418) 株のキャラクタリゼーション−形態学）細
菌スフィンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM 6418) は
グラム陰性の短い棒状の細胞で、その幅は 0.6〜0.8 μ
m 、長さは 1.5〜4.0 μm である。新しい培養基中の細
胞はよく動くが、培養基の加齢と共に生成する多糖類に
よりその動きが著しく妨げられる。この微生物は好気的
の条件でのみ発育する。
(DSM 6418) 株のキャラクタリゼーション−形態学）細
菌スフィンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM 6418) は
グラム陰性の短い棒状の細胞で、その幅は 0.6〜0.8 μ
m 、長さは 1.5〜4.0 μm である。新しい培養基中の細
胞はよく動くが、培養基の加齢と共に生成する多糖類に
よりその動きが著しく妨げられる。この微生物は好気的
の条件でのみ発育する。
【００３３】この細菌は酵母・麦芽・寒天培地の上で48
時間のインキュベーション後直径約１〜２mmのコロニー
を形成する。このコロニーは非拡散性色素で黄色に染ま
る。変異菌株P4は濃い黄色で固形培地の上で粘性のない
固いコロニーを作る。セパック ドックス寒天の上では
コロニーは輝かしい黄色でいくらか透明であり、この培
地の上のコロニーは特に固く強靭である。
時間のインキュベーション後直径約１〜２mmのコロニー
を形成する。このコロニーは非拡散性色素で黄色に染ま
る。変異菌株P4は濃い黄色で固形培地の上で粘性のない
固いコロニーを作る。セパック ドックス寒天の上では
コロニーは輝かしい黄色でいくらか透明であり、この培
地の上のコロニーは特に固く強靭である。
【００３４】（スフィンゴモナス パウシモビリスP4
(DSM 6418) 株のキャラクタリゼーション−生理学と生
化学的性質）本培養基の生化学的キャラクタリゼーショ
ンは発明者の申請によりブラウンシュヴァイクのドイツ
微生物・培養細胞収集機関（DSM)が実施した。この試験
の結果スフィンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM 641
8) はこれまでには未知の菌種であることが判明した。
平行して試験したシュードモナス パウシモビリス (NC
IMB 11942)とは明らかな相違が見られた。培養細菌スフ
ィンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM 6418) は次のよ
うな生理学的、生化学的性質を有する。
(DSM 6418) 株のキャラクタリゼーション−生理学と生
化学的性質）本培養基の生化学的キャラクタリゼーショ
ンは発明者の申請によりブラウンシュヴァイクのドイツ
微生物・培養細胞収集機関（DSM)が実施した。この試験
の結果スフィンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM 641
8) はこれまでには未知の菌種であることが判明した。
平行して試験したシュードモナス パウシモビリス (NC
IMB 11942)とは明らかな相違が見られた。培養細菌スフ
ィンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM 6418) は次のよ
うな生理学的、生化学的性質を有する。
【００３５】
【表２】
【００３６】（スフィンゴモナス パウシモビリスE2及
びP4とオウロモナス エロデア (ATCC 31461) 及びシュ
ードモナス パウシモビリス (NCIMB 11942)との比較）
菌株スフィンゴモナス パウシモビリスE2及びP4はその
原料菌種であるオウロモナス エロデア (ATCC 31461)
及びシュードモナス パウシモビリス (NCIMB11942)と
はその本質的な特徴が相違している。次の表に相違して
いる特徴を示す。
びP4とオウロモナス エロデア (ATCC 31461) 及びシュ
ードモナス パウシモビリス (NCIMB 11942)との比較）
菌株スフィンゴモナス パウシモビリスE2及びP4はその
原料菌種であるオウロモナス エロデア (ATCC 31461)
及びシュードモナス パウシモビリス (NCIMB11942)と
はその本質的な特徴が相違している。次の表に相違して
いる特徴を示す。
【００３７】
【表３】 スフィンゴモナス パウシモビリスの変異株E2及びP4とオウロモナス エロデ ア (ATCC 31461) 及びシュードモナス パウシモビリス (NCIMB 11942)との相違 点 菌株の性質 DSM 6314(E2) ATCC 31461 DSM 6418(P4) NCIMB 11942 ──────────────────────────────────── 細胞の形状： 長さμm 1.5〜4.0 1.5〜5.0 1.5〜4.0 1.5〜4.0 37℃での成長 ＋ − ＋ ＋ (ASS) からの酸 フコース − − ＋ ＋ メレチトース ＋ − ＋ − N-アセチルグルコサミン ＋ ＋ − ＋ ジェラン/uゲルの液状化 − ＋ − ＋ 基質利用 L-アラビノース ＋ 僅か ＋ 僅か 2-ケトグルコン酸塩 − ＋ − ＋ L-セリン − − ＋ ＋
【００３８】
【実施例１】 （比較醗酵）次に菌株スフィンゴモナス パウシモビリ
スE2 (DSM 6314) とオウロモナスエロデア (ATCC 3146
1) とを典型的な組醗酵により両者を比較する。両方の
醗酵はバイオスタット ファーメンター (ビー．ブラウ
ン，メルスンゲン) を用い10ｌの基準で同一条件で実施
した。最初の一次培養として上述の培養基の各25mlを入
れた４個のフラスコに、３日経過した酵母・麦芽、ジェ
ラン/uプレートを接種した。２回目の一次培養（各 250
ml入りのフラスコ) には24時間後の最初の一次段階の全
量を接種した。この２回目の一次段階を更に24時間後に
醗酵槽の接種用に使用した。
スE2 (DSM 6314) とオウロモナスエロデア (ATCC 3146
1) とを典型的な組醗酵により両者を比較する。両方の
醗酵はバイオスタット ファーメンター (ビー．ブラウ
ン，メルスンゲン) を用い10ｌの基準で同一条件で実施
した。最初の一次培養として上述の培養基の各25mlを入
れた４個のフラスコに、３日経過した酵母・麦芽、ジェ
ラン/uプレートを接種した。２回目の一次培養（各 250
ml入りのフラスコ) には24時間後の最初の一次段階の全
量を接種した。この２回目の一次段階を更に24時間後に
醗酵槽の接種用に使用した。
【００３９】醗酵槽に0.33vvm の速度で通気した。温度
は30℃であった。醗酵槽の中での停滞ゾーンを避け良い
混合を確保するために、培養液を800rpmの４段のインタ
ーミクスターラー（直径は容器直径の63％) で撹拌し
た。培養液のpHを７に調節し、1Nの苛性ソーダと1Nのリ
ン酸を用い調節装置によりこのpH値を一定に保った。
は30℃であった。醗酵槽の中での停滞ゾーンを避け良い
混合を確保するために、培養液を800rpmの４段のインタ
ーミクスターラー（直径は容器直径の63％) で撹拌し
た。培養液のpHを７に調節し、1Nの苛性ソーダと1Nのリ
ン酸を用い調節装置によりこのpH値を一定に保った。
【００４０】ジェランの醗酵終了時の濃度はスフィンゴ
モナス パウシモビリスE2 (DSM 6314) ではオウロモナ
ス エロデア (ATCC 31461) による醗酵の場合の約４倍
であった（図１）。最大のジェラン濃度はスフィンゴモ
ナス パウシモビリスE2 (DSM 6314) の場合８kg/m3 、
オウロモナス エロデア (ATCC 31461) の場合２kg/m3
であった。又この醗酵の容積・時間収率はスフィンゴモ
ナス パウシモビリスE2 (DSM 6314) の場合17.2kg/m
3h、オウロモナス エロデア (ATCC 31461) の場合４kg
/m3hであった。
モナス パウシモビリスE2 (DSM 6314) ではオウロモナ
ス エロデア (ATCC 31461) による醗酵の場合の約４倍
であった（図１）。最大のジェラン濃度はスフィンゴモ
ナス パウシモビリスE2 (DSM 6314) の場合８kg/m3 、
オウロモナス エロデア (ATCC 31461) の場合２kg/m3
であった。又この醗酵の容積・時間収率はスフィンゴモ
ナス パウシモビリスE2 (DSM 6314) の場合17.2kg/m
3h、オウロモナス エロデア (ATCC 31461) の場合４kg
/m3hであった。
【００４１】ジェランとバイオマスの全含有量は、２容
のイソプロパノールを加えて遠心し、上清を捨て、乾燥
（80℃で48時間) して測定した。乾燥バイオマス含有量
は、試料を蒸留水で希釈し、細胞を遠心、上清を傾斜
し、沈澱を水に分散し、遠心とデカンテーションとを繰
り返した後で沈澱を乾燥する。ジェラン濃度はこの測定
結果を差し引いて求めた。
のイソプロパノールを加えて遠心し、上清を捨て、乾燥
（80℃で48時間) して測定した。乾燥バイオマス含有量
は、試料を蒸留水で希釈し、細胞を遠心、上清を傾斜
し、沈澱を水に分散し、遠心とデカンテーションとを繰
り返した後で沈澱を乾燥する。ジェラン濃度はこの測定
結果を差し引いて求めた。
【００４２】スフィンゴモナス パウシモビリスE2 (DS
M 6314) の場合、醗酵ブイヨンの粘度が高いので、試料
を遠心の前にかなり希釈する必要があった。そのため測
定値はオウロモナス エロデア (ATCC 31461) による醗
酵の場合よりもばらつく。最小の誤差は希釈しない醗酵
ブイヨンからのジェラン含有量とバイオマス含有量との
合計の測定の際に得られる（図２）。
M 6314) の場合、醗酵ブイヨンの粘度が高いので、試料
を遠心の前にかなり希釈する必要があった。そのため測
定値はオウロモナス エロデア (ATCC 31461) による醗
酵の場合よりもばらつく。最小の誤差は希釈しない醗酵
ブイヨンからのジェラン含有量とバイオマス含有量との
合計の測定の際に得られる（図２）。
【００４３】両方の醗酵に於いてほぼ同程度のバイオマ
ス含有量（BTM)が得られた。バイオマス含有量は成長段
階の最後で最高値約４kg/m3 に達した。その後で微生物
は一部死滅し、バイオマス含有量は低下した。スフィン
ゴモナス パウシモビリスE2(DSM 6314) の場合46.5時
間後にグリコースが完全に消費され、醗酵が終了した。
オウロモナス エロデア (ATCC 31461) の場合には46.5
時間後に尚2.3kg/m3のグリコースが存在し、50時間後に
も尚0.42kg/m3 残った。
ス含有量（BTM)が得られた。バイオマス含有量は成長段
階の最後で最高値約４kg/m3 に達した。その後で微生物
は一部死滅し、バイオマス含有量は低下した。スフィン
ゴモナス パウシモビリスE2(DSM 6314) の場合46.5時
間後にグリコースが完全に消費され、醗酵が終了した。
オウロモナス エロデア (ATCC 31461) の場合には46.5
時間後に尚2.3kg/m3のグリコースが存在し、50時間後に
も尚0.42kg/m3 残った。
【００４４】
【実施例２】菌株スフィンゴモナス パウシモビリスP4
(DSM 6418) の醗酵は前述の場合とほぼ同様に経過し
た。醗酵はバイオスタット イー ファーメンター（ビ
ー．ブラウン，メルスンゲン) を用い10ｌの基準で同一
条件で実施した。最初の一次培養として３日経過したカ
ペック ドックス・ジェラン/uプレートの上述の培養基
の各25mlを入れた４個のフラスコに接種した。２回目の
一次培養（各 250ml入りのフラスコ) には24時間後の最
初の前段階の全量を接種した。この２回目の前段階を更
に24時間後に醗酵槽の接種用に使用した。
(DSM 6418) の醗酵は前述の場合とほぼ同様に経過し
た。醗酵はバイオスタット イー ファーメンター（ビ
ー．ブラウン，メルスンゲン) を用い10ｌの基準で同一
条件で実施した。最初の一次培養として３日経過したカ
ペック ドックス・ジェラン/uプレートの上述の培養基
の各25mlを入れた４個のフラスコに接種した。２回目の
一次培養（各 250ml入りのフラスコ) には24時間後の最
初の前段階の全量を接種した。この２回目の前段階を更
に24時間後に醗酵槽の接種用に使用した。
【００４５】醗酵槽に0.33vvm の速度で通気した。温度
は30℃であった。醗酵槽の中での停滞ゾーンを避け良い
混合を確保するために、培養液を800rpmの４段のインタ
ーミグスターラー（直径は容器直径の63％) で撹拌し
た。培養液のpHを７に調節し、1Nの苛性ソーダと1Nのリ
ン酸を用い調節装置によりこのpH値を一定に保った。
は30℃であった。醗酵槽の中での停滞ゾーンを避け良い
混合を確保するために、培養液を800rpmの４段のインタ
ーミグスターラー（直径は容器直径の63％) で撹拌し
た。培養液のpHを７に調節し、1Nの苛性ソーダと1Nのリ
ン酸を用い調節装置によりこのpH値を一定に保った。
【００４６】P4とバイオマスの全含有量は、２容のイソ
プロパノールを加えて遠心し、上清を捨て、乾燥（80℃
で48時間) して測定した。乾燥ドイオマス含有量は、試
料を蒸留水で希釈し、細胞を遠心し、上清を傾斜し、沈
澱を水に分散し、遠心とデカンテーションとを繰り返し
た後で沈澱を乾燥した。多糖類濃度はこの測定結果を差
し引いて求めた。醗酵終了時のP4濃度は約10kg/m3 であ
った（図４）。
プロパノールを加えて遠心し、上清を捨て、乾燥（80℃
で48時間) して測定した。乾燥ドイオマス含有量は、試
料を蒸留水で希釈し、細胞を遠心し、上清を傾斜し、沈
澱を水に分散し、遠心とデカンテーションとを繰り返し
た後で沈澱を乾燥した。多糖類濃度はこの測定結果を差
し引いて求めた。醗酵終了時のP4濃度は約10kg/m3 であ
った（図４）。
【００４７】
【実施例３】次の菌株を使用した。 ロイコノストック メセンテロイデス DSM 20187 エンテロバクター サガザキイ DSM 4485 キサントモナス カンペストリス NRRL B-1459 S4L-II オウレオバシディウム プルランス DSM 2404
【００４８】培地としては菌株の成長要求度に応じてDS
M が提案した標準培地を使用した。これはDSM-カタログ
『菌株のカタログ1989』４版に記載してある。但し、こ
のDSM-カタログとは相違して本発明の方法に準じて、全
ての培地に対して寒天の代わりにジェラン/uを使用し
た。段階的に希釈した菌種の塗抹、インキュベーション
及び後処理は、ジェランとP4を形成する菌種に対する本
発明の方法に就いて記載した通りに実施した。
M が提案した標準培地を使用した。これはDSM-カタログ
『菌株のカタログ1989』４版に記載してある。但し、こ
のDSM-カタログとは相違して本発明の方法に準じて、全
ての培地に対して寒天の代わりにジェラン/uを使用し
た。段階的に希釈した菌種の塗抹、インキュベーション
及び後処理は、ジェランとP4を形成する菌種に対する本
発明の方法に就いて記載した通りに実施した。
【００４９】
【表４】 使用した培地 菌 株 培 地 DSM-菌株のカタログ1989 ──────────────────────────────────── ロイコノストック メセンテロイデス MRS 培地11、279 頁 (DSM 20187) エンテロバクター サガザキイ 栄養素 培地 1、279 頁 (DSM 4485) キサントモナス カンペストリス 酵母・麦芽 菌株保存と培養技術参照 (NRRL B-1459 S4L-II) オウレオバシディウム プルランス ジャガイモ・ 培地 129、290 頁 (DSM 2404) グルコース
【００５０】エンテロバクター サガザキイDSM 4485、
キサントモナス カンペストリスNRRL B-1459 S4L-II、
ロイコノストック メセンテロイデスDSM 20187 、オウ
レオバシディウム プルランスDSM 2404は使用した細胞
集団の内部で沈下する細胞を示さず、むしろ全ての細胞
がジェラン/uプレート上で成長した。このことから使用
した細胞集団が、多糖類生成の高い可能性を有する純粋
培養であることを示している。
キサントモナス カンペストリスNRRL B-1459 S4L-II、
ロイコノストック メセンテロイデスDSM 20187 、オウ
レオバシディウム プルランスDSM 2404は使用した細胞
集団の内部で沈下する細胞を示さず、むしろ全ての細胞
がジェラン/uプレート上で成長した。このことから使用
した細胞集団が、多糖類生成の高い可能性を有する純粋
培養であることを示している。
【００５１】（参考文献） 〔１〕V. J. Morris, Food Biotechnology 4 (1990) N
o. 1, P.45-57 〔２〕R. Moorhouse, Structure/property relationshi
ps of a family of mic-robial polysacchrides （微生
物的多糖類の構造と性質との関係）in:M.Yalpani 編、I
ndustrial Polysaccharides:Genetic Engineering, Str
uc-ture/property Relations and Application, 3巻, E
lsevier Sclence Pu-blishers, Amsterdam 1987, P.187
-205 〔３〕K. S. Kang, G. T. Veeder, P. J. Mirrasoul,
T. Kaneko and I. W. Co-ttrell, Applled and Environ
mental Microbiology 43 (1982) No. 5, P.1086-1091 〔４〕K. S. Kang, G. T. Colegrove and G. T. Veede
r, Deacetylated Polysa-ccharide s-60 （脱アセチル
化した多糖 S-60), 米国特許 4,326,052, 1982 〔５〕A. Anson, P. J. Fisher, A. F. D. Kennedy and
I. W. Sutherland, Jo-urnal of Applied Bacteriolog
h (1987) No.62, P.147-150 〔６〕K. S. Kang and G. T. Veeder, Polysaccaride S
-60 and bacterial fer-mentation process for its pr
eparation （多糖S-60とその生産のための細菌醗酵
法）、米国特許 4,326,053, 1982
o. 1, P.45-57 〔２〕R. Moorhouse, Structure/property relationshi
ps of a family of mic-robial polysacchrides （微生
物的多糖類の構造と性質との関係）in:M.Yalpani 編、I
ndustrial Polysaccharides:Genetic Engineering, Str
uc-ture/property Relations and Application, 3巻, E
lsevier Sclence Pu-blishers, Amsterdam 1987, P.187
-205 〔３〕K. S. Kang, G. T. Veeder, P. J. Mirrasoul,
T. Kaneko and I. W. Co-ttrell, Applled and Environ
mental Microbiology 43 (1982) No. 5, P.1086-1091 〔４〕K. S. Kang, G. T. Colegrove and G. T. Veede
r, Deacetylated Polysa-ccharide s-60 （脱アセチル
化した多糖 S-60), 米国特許 4,326,052, 1982 〔５〕A. Anson, P. J. Fisher, A. F. D. Kennedy and
I. W. Sutherland, Jo-urnal of Applied Bacteriolog
h (1987) No.62, P.147-150 〔６〕K. S. Kang and G. T. Veeder, Polysaccaride S
-60 and bacterial fer-mentation process for its pr
eparation （多糖S-60とその生産のための細菌醗酵
法）、米国特許 4,326,053, 1982
【図１】スフィンゴモナス パウシモビリスE2 (DSM 63
14）とオウロモナス エロデア(ATCC 31461) とによる
醗酵に於けるジェラン濃度の時間的変化を示したグラフ
である。
14）とオウロモナス エロデア(ATCC 31461) とによる
醗酵に於けるジェラン濃度の時間的変化を示したグラフ
である。
【図２】スフィンゴモナス パウシモビリスE2 (DSM 63
14) とオウロモナス エロデア(ATCC 31461) とによる
醗酵に於けるジェラン＋バイオマスの時間的変化を示し
たグラフである。
14) とオウロモナス エロデア(ATCC 31461) とによる
醗酵に於けるジェラン＋バイオマスの時間的変化を示し
たグラフである。
【図３】スフィンゴモナス パウシモビリスE2 (DSM 63
14) とオウロモナス エロデア(ATCC 31461) とによる
醗酵に於けるバイオマス含有量の時間的変化を示したグ
ラフである。
14) とオウロモナス エロデア(ATCC 31461) とによる
醗酵に於けるバイオマス含有量の時間的変化を示したグ
ラフである。
【図４】スフィンゴモナス パウシモビリスP4 (DSM 64
18) による醗酵に於ける多糖類P4とバイオマス含有量
(BTM)との時間的変化を示したグラフである。
18) による醗酵に於ける多糖類P4とバイオマス含有量
(BTM)との時間的変化を示したグラフである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/20 (Ｃ１２Ｎ 1/20 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (Ｃ１２Ｐ 19/04 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:01） Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 19/04 (Ｃ１２Ｐ 19/04 Ｃ１２Ｒ 1:38） Ｃ１２Ｒ 1:38） (72)発明者 デトゥレフ ロバス ドイツ連邦共和国 ダヴリュー3300 ブ ラウンシュヴァイグ マッシャーオーダ ー ヴェグ １ (72)発明者 アドリアン シュンムペ ドイツ連邦共和国 ダヴリュー3300 ブ ラウンシュヴァイグ マッシャーオーダ ー ヴェグ １ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 1/00 - 1/38 C12P 19/04 C12Q 1/00 - 1/66 ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】 一種の多糖類の生成が認められる一種
の細菌種の細胞を分離する方法にして、分離しようとす
る細胞は該多糖類を細胞外で生成する場合に於いて、 （ａ）ゲル化剤として未置換のジェラン（Gellan）を含
む培地を使用し、 （ｂ）原料となる菌種の細胞を希釈塗抹法により個別化
し、且つ （ｃ）前記培地のマトリックス中に沈下しない細胞又は
クローンを分離することを特徴とする細胞の分離方法。 - 【請求項２】 ジェランの生成が認められる一種の細
菌種の細胞を原料として、Gellanを細胞外で生成する細
胞又はクローンを分離することを特徴とする請求項１の
方法。 - 【請求項３】 オウロモナス（Auromonas）属又はス
フィンゴモナス（Sphingomonas）属の一種の菌種の細
胞、特に菌種オウロモナス エロデア（Auromonas elod
ea）又はスフィンゴモナス パウシモビリス（Sphingom
onasPaucimobilis）の細胞を原料とすることを特徴とす
る請求項２の方法。 - 【請求項４】 スフィンゴモナス パウシモビリス
（Sphingomonas Paucimobilis）DSM6418によって産出さ
れ得る多糖類P4の生成が認められる一種の細菌種の細胞
を原料として、多糖類P4を細胞外で生成する細胞又はク
ローンを分離することを特徴とする請求項１の方法。 - 【請求項５】 シュードモナス（Pseudomonas）属又
はスフィンゴモナス（Sphingomonas）属の一種の菌種の
細胞、特に菌種シュードモナス パウシモビリス（Pseu
domonas Paucimobilis）又はスフィンゴモナス パウシ
モビリス（SphingomonasPaucimobilis）の細胞を原料と
することを特徴とする請求項４の方法。 - 【請求項６】 細胞外にジェラン生産能を有するスフ
ィンゴモナス パウシモビリス（Sphingomonas Paucimo
bilis）DSM6314 - 【請求項７】 細胞外に多糖類、P4生産能を有するス
フィンゴモナス パウシモビリス（SphingomonasPaucim
obilis）DSM6418 - 【請求項８】 請求項１乃至５の何れか１項の方法に
より得られる細胞又はこの細胞のクローンを用いて多糖
類を生産することを特徴とする一種の多糖類をバッチ式
又は連続的に生産する方法。 - 【請求項９】 ジェランを生産することを特徴とする
請求項８の方法。 - 【請求項１０】 スフィンゴモナス パウシモビリス
（Sphingomonas Paucimobilis）DSM6418 によって産出
され得る多糖類、P4を生産することを特徴とする請求項
８の方法。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE4110549A DE4110549C1 (ja) | 1991-03-30 | 1991-03-30 | |
| DE4110549.4 | 1991-03-30 | ||
| US07/858,114 US5338681A (en) | 1991-03-30 | 1992-03-26 | Method of isolating polysaccharide producing bacteria from non-polysaccharide producing bacteria with gellan |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05236946A JPH05236946A (ja) | 1993-09-17 |
| JP3322687B2 true JP3322687B2 (ja) | 2002-09-09 |
Family
ID=25902438
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP10023592A Expired - Fee Related JP3322687B2 (ja) | 1991-03-30 | 1992-03-27 | 細胞の分離方法、分離した細胞（ｄｓｍ ６３１４とｄｓｍ ６４１８）、及び分離した細胞の多糖類生産への使用 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5338681A (ja) |
| EP (1) | EP0507234B1 (ja) |
| JP (1) | JP3322687B2 (ja) |
| AT (1) | ATE204323T1 (ja) |
| DE (2) | DE4110549C1 (ja) |
| DK (1) | DK0507234T3 (ja) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20010022434A1 (en) * | 1993-07-19 | 2001-09-20 | Sauter Thomas M. | In-line roller skate with internal support and external ankle cuff |
| FR2728586A1 (fr) * | 1994-12-26 | 1996-06-28 | Inst Francais Du Petrole | Procede et milieu de culture pour la production du gellane |
| FR2735497B1 (fr) * | 1995-06-13 | 1997-07-25 | Inst Francais Du Petrole | Procede et milieu de production de gellane en presence de manganese |
| CA2351233C (en) * | 2000-07-24 | 2010-10-19 | Shin-Etsu Chemical Co., Ltd. | Production of exopolysaccharides unattached to the surface of bacterial cells |
| DE10120061A1 (de) * | 2001-04-24 | 2002-10-31 | Werner Lubitz | Exopolysaccharidproduktion |
| DE10301907A1 (de) * | 2003-01-17 | 2004-08-05 | Westfälische Wilhelms-Universität Münster | Verfahren zur Herstellung eines Exopolymers und dessen Verwendung |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PT70476A (en) | 1978-12-04 | 1979-12-01 | Merck & Co Inc | Process for preparing polysaccharide s-60 |
| US4326053A (en) | 1978-12-04 | 1982-04-20 | Merck & Co., Inc. | Polysaccharide S-60 and bacterial fermentation process for its preparation |
| US4535153A (en) * | 1979-09-07 | 1985-08-13 | Merck & Co., Inc. | Heteropolysaccharide S-88 |
| DE3214953A1 (de) * | 1982-04-22 | 1983-10-27 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Mikrobielle polysaccharide, verfahren zu ihrer herstellung, dafuer geeignete mikroorganismen und verwendung der polysaccharide |
| DE3445302A1 (de) | 1984-12-12 | 1986-06-12 | Hoechst Ag, 6230 Frankfurt | Extrazellulaeres polysaccharid, verfahren und stamm zu seiner herstellung und seine verwendung |
| EP0231585B1 (en) * | 1986-02-06 | 1992-07-08 | Celgene Corporation | Biosynthesis of heteropolysaccharides |
| EP0232582A3 (en) * | 1986-02-06 | 1988-03-02 | Celgene Corporation | Novel species of facultative methylotrophic bacterium |
| GB8811365D0 (en) * | 1988-05-13 | 1988-06-15 | Shell Int Research | Process for preparing heteropolysaccharide & microorganisms for use in such process |
| FR2634496B1 (fr) * | 1988-07-25 | 1992-06-19 | Centre Nat Rech Scient | Polysaccharides, procede pour leur preparation par culture de pseudomonas paucimobilis et application des souches en agriculture |
| AT392083B (de) * | 1989-05-12 | 1991-01-25 | Jungbunzlauer Ag | Verfahren zur gewinnung von durch bakterien der gattung xanthomonas bzw. arthrobacter gebildeten polysacchariden |
| US5093253A (en) * | 1989-11-06 | 1992-03-03 | Monsanto Company | Method for microbial immobilization by entrapment in gellan gum |
| US5130249A (en) * | 1990-05-21 | 1992-07-14 | Wisconsin Alumni Research Foundation | Galactomannan polysaccharide producing organism |
-
1991
- 1991-03-30 DE DE4110549A patent/DE4110549C1/de not_active Expired - Lifetime
-
1992
- 1992-03-26 US US07/858,114 patent/US5338681A/en not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-27 JP JP10023592A patent/JP3322687B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1992-03-30 EP EP92105464A patent/EP0507234B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1992-03-30 DK DK92105464T patent/DK0507234T3/da active
- 1992-03-30 AT AT92105464T patent/ATE204323T1/de not_active IP Right Cessation
- 1992-03-30 DE DE59209916T patent/DE59209916D1/de not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5338681A (en) | 1994-08-16 |
| EP0507234A3 (en) | 1993-09-01 |
| EP0507234B1 (de) | 2001-08-16 |
| DE59209916D1 (de) | 2001-09-20 |
| JPH05236946A (ja) | 1993-09-17 |
| ATE204323T1 (de) | 2001-09-15 |
| DE4110549C1 (ja) | 1992-12-03 |
| DK0507234T3 (da) | 2001-10-08 |
| EP0507234A2 (de) | 1992-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Cadmus et al. | Colonial variation in Xanthomonas campestris NRRL B-1459 and characterization of the polysaccharide from a variant strain | |
| EP0077680B1 (en) | Heteropolysaccharide s-194, a process for producing it, and compositions containing it | |
| US4529797A (en) | Heteropolysaccharide S-198 | |
| JPH0239523B2 (ja) | ||
| Lobas et al. | The production of gellan exopolysaccharide with Sphingomonas paucimobilis E2 (DSM 6314) | |
| EP2360238A1 (en) | A yellow pigments generation deficient sphingomonas strain and its application in the production of gellan gum | |
| US7883895B2 (en) | Methods for enhanced bacterial exopolysaccharide production | |
| US3391060A (en) | Process for producing a polysaccharide | |
| JP3322687B2 (ja) | 細胞の分離方法、分離した細胞（ｄｓｍ ６３１４とｄｓｍ ６４１８）、及び分離した細胞の多糖類生産への使用 | |
| EP0001895A1 (en) | Heteropolysaccharide, its preparation by fermentation, and compositions and complexes containing it | |
| JPH0239521B2 (ja) | ||
| KR100771745B1 (ko) | 박테리아 세포 표면에 부착되지 않은엑소폴리사카라이드의 생산방법 | |
| US4104123A (en) | Process of producing a "xanthemonas-type" polysaccharide | |
| AU8070898A (en) | Production of non-native bacterial exopolysaccharide in a recombinant bacteri al host | |
| Mikolajczak et al. | Sphinganase, a new endoglycanase that cleaves specific members of the gellan family of polysaccharides | |
| CA2089837C (en) | Method for digesting polysaccharides and products therefrom | |
| US5401659A (en) | Biologically pure culture of bacillus ATCC 55294 that produces an endoglycanase | |
| CN117286082B (zh) | 野油菜黄单胞菌及发酵产低粘度黄原胶的方法 | |
| KR100352651B1 (ko) | 신규 패니바실러스 속 균주, 그로부터 생산되는 균체외 다당및이를 포함하는 시멘트 혼합물용 첨가제 | |
| WO1998056895A2 (en) | Production of non-native bacterial exopolysaccharide in a recombinant bacterial host | |
| EP0211506B1 (en) | Heteropolysaccharide and its production and use | |
| JPH08149985A (ja) | 新規微生物および微生物によるヘテロ多糖類の製造方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |