JP3317983B2 - Unnatural amino acid-incorporating protein, method for producing the same, and reagent kit - Google Patents
Unnatural amino acid-incorporating protein, method for producing the same, and reagent kitInfo
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Description
【０００１】[0001]
【産業上の利用分野】本発明は、分子生物学および蛋白
質工業の分野等で使用される標識蛋白質に係わり、より
詳細には、蛋白質中のある特定のアミノ酸残基のみに非
天然型アミノ酸を組み込んだ非天然型アミノ酸組み込み
蛋白質とその製造法および試薬キットに関する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a labeled protein used in the fields of molecular biology and protein industry, and more particularly to non-natural amino acids only at specific amino acid residues in proteins. The present invention relates to an incorporated non-natural amino acid-incorporating protein, a method for producing the same, and a reagent kit.
【０００２】[0002]
【従来の技術】現在、ＤＮＡ組み換え技術を用いて目的
の蛋白質を大量に発現させることは広く行なわれてい
る。また、外来性の遺伝子の一部に手を加えることによ
り、蛋白質中の任意のアミノ酸を他の蛋白質構成アミノ
酸に置換可能なことも知られている。これらの技術によ
って、有用な蛋白質を得、それをさらに改良することが
可能となっただけではなく、蛋白質の構造解析や、機能
解析など産業分野のみならず学問分野にも大きな貢献を
してきた。しかし、この方法で置換できるアミノ酸の種
類は、天然の蛋白質構成アミノ酸２０種に限られてお
り、非天然型アミノ酸の組み込みは不可能である。2. Description of the Related Art At present, expression of a target protein in a large amount using a DNA recombination technique is widely performed. It is also known that an arbitrary amino acid in a protein can be replaced with another protein constituent amino acid by modifying a part of the exogenous gene. These techniques have not only made it possible to obtain useful proteins and to further improve them, but also have made a significant contribution not only to industrial fields such as protein structural analysis and functional analysis but also to academic fields. However, the types of amino acids that can be substituted by this method are limited to 20 natural protein-constituting amino acids, and the incorporation of non-natural amino acids is not possible.
【０００３】一方、化学合成法によるペプチド鎖の合成
も進歩している。この方法によれば非天然型アミノ酸の
組み込みも可能であり、かなり長鎖のペプチド鎖の合成
も可能になっているが、ペプチド鎖が長鎖になればなる
ほど目的の蛋白質の収量は少なくなり、分子量が１万を
超えるような蛋白質への適用は難しい。On the other hand, the synthesis of peptide chains by chemical synthesis has also been advanced. According to this method, the incorporation of unnatural amino acids is possible, and the synthesis of a considerably long peptide chain is also possible.However, the longer the peptide chain is, the lower the yield of the target protein is, It is difficult to apply to a protein having a molecular weight exceeding 10,000.
【０００４】また、別法として、非天然型アミノ酸を含
む栄養源を培地として生物体に与え、非天然型アミノ酸
を含む蛋白質を合成させる方法がある（特開昭６４−２
７４９３号公報）。この方法では細胞の正常な増殖とそ
れに伴う生物体本来の蛋白質合成を抑制した条件下で、
非天然型アミノ酸を含む目的蛋白質を合成させ、その蛋
白質を細胞質外へ分泌させることにより非天然型アミノ
酸を組み込んだ蛋白質を合成させることが可能になっ
た。[0004] As another method, there is a method in which a nutrient source containing an unnatural amino acid is supplied to an organism as a medium to synthesize a protein containing an unnatural amino acid (Japanese Patent Laid-Open No. 64-2).
No. 7493). In this method, under the condition that normal growth of cells and the accompanying natural protein synthesis of the organism are suppressed,
By synthesizing a target protein containing an unnatural amino acid and secreting the protein out of the cytoplasm, it has become possible to synthesize a protein incorporating an unnatural amino acid.
【０００５】[0005]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、前述し
た非天然型アミノ酸を含む栄養源を培地として生物体に
与え、非天然型アミノ酸を含む蛋白質を合成させる方法
では、組み込める非天然型アミノ酸の種類は、生物体が
本来持っているアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の基質と
して認識されるものに限られており、得られる非天然型
アミノ酸組み込み蛋白質が天然型アミノ酸に構造が類似
したものになってしまう。However, according to the above-described method of synthesizing a protein containing an unnatural amino acid by providing a nutrient source containing the unnatural amino acid to a living organism as a medium, the type of non-natural amino acid that can be incorporated is However, it is limited to those that are recognized as the substrate of the aminoacyl-tRNA synthetase originally possessed by the organism, and the resulting unnatural amino acid-incorporated protein has a structure similar to that of the natural amino acid.
【０００６】さらに別な方法として、無細胞蛋白質合成
系においてサプレッサーｔＲＮＡを用い、本来３つある
終始コドンの１つを非天然型アミノ酸コドンとして、位
置特異的に非天然型アミノ酸を組み込む方法がある（Ｎ
ｏｒｅｎ Ｃ．Ｊ．,Ａｎｔｈｏｎｙ−Ｃａｈｉｌｌ
Ｓ．Ｊ．，Ｇｒｉｆｆｉｔｈ Ｍ．Ｃ．ａｎｄ Ｓｃｈ
ｕｌｔｚ Ｐ．Ｇ．：Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４，１８２
−１８８（１９８９））。この方法ではサプレッサーｔ
ＲＮＡと非天然型アミノ酸を化学的に結合したものを用
いているため、非天然型アミノ酸の種類には多くの自由
度がある。しかしこの方法では、終始コドンの１つを非
天然型アミノ酸のコドンとして用いているため翻訳の効
率が悪く、１つの蛋白質の複数箇所に非天然型アミノ酸
を組み込もうとすると収率が著しく悪くなり、実施が不
可能となる。さらにこの方法では、無細胞蛋白質合成系
として、従来よりあるバッチ式の無細胞蛋白質合成系を
用いているため、収量が非常に少なく、産業や学問分野
へ充分量供給することは不可能である。これはｔＲＮＡ
の構造や修飾に関して全てが明らかではなかったため、
ｔＲＮＡとコドンの対応が完全には明確ではなかった。
このためサプレッサーｔＲＮＡを使用する方法しかな
く、非天然型アミノ酸をコドングループ別に組み込むこ
とができなかった。[0006] Still another method is to use a suppressor tRNA in a cell-free protein synthesis system and use one of the three stop codons originally as a non-natural amino acid codon to incorporate a non-natural amino acid in a position-specific manner. (N
oren C.I. J. , Anthony-Cahill
S. J. , Griffith M .; C. and Sch
ultz P.U. G. FIG. : Science, 244, 182
-188 (1989)). In this method, the suppressor t
Since RNA and a non-natural amino acid chemically bonded are used, there are many degrees of freedom in the type of the non-natural amino acid. However, in this method, one of the stop codons is used as a codon for an unnatural amino acid, so that the translation efficiency is low, and the yield is extremely poor when the unnatural amino acid is incorporated into a plurality of positions of one protein. And implementation becomes impossible. Furthermore, in this method, since a conventional batch-type cell-free protein synthesis system is used as the cell-free protein synthesis system, the yield is extremely low, and it is impossible to supply a sufficient amount to industry and academic fields. . This is tRNA
Not all were clear about the structure and modification of
The correspondence between tRNA and codons was not completely clear.
For this reason, there is no other way but to use a suppressor tRNA, and it was not possible to incorporate unnatural amino acids into codon groups.
【０００７】また、蛋白質工学の分野において、安定同
位体とアミノ酸を用いた核磁気共鳴法（ＮＭＲ）を利用
した溶液中での蛋白質の構造と機能解析の手法がある。
この手法は大きく２つに分けられる。 蛋白質中の炭素原子や窒素原子を全て13Ｃや15Ｎで標
識し、その蛋白質のＮＭＲスペクトルを３次元や４次元
に展開することにより分解能を上げ、蛋白質の溶液中の
立体構造を解析する方法、 蛋白質中の特定の種類のアミノ酸残基のみを安定同位
体（13Ｃや15Ｎ）で標識し、得られたＮＭＲスペクトル
の各ピークを帰属した後、そのスペクトルの変化から蛋
白質分子内の原子の挙動を観察する方法、である。In the field of protein engineering, there is a technique for analyzing the structure and function of a protein in a solution using nuclear magnetic resonance (NMR) using stable isotopes and amino acids.
This method can be roughly divided into two. A method of labeling all the carbon and nitrogen atoms in a protein with 13 C or 15 N and expanding the NMR spectrum of the protein into three or four dimensions to increase the resolution and analyze the three-dimensional structure of the protein in solution. After labeling only a specific type of amino acid residue in a protein with a stable isotope ( 13 C or 15 N) and assigning each peak of the obtained NMR spectrum, the change in the spectrum is used to determine the atom in the protein molecule. To observe the behavior of
【０００８】上記の手法では、分子量が３万から４万
までの蛋白質の溶液中の立体構造が解析できるとされて
いるが、それ以上の大きさの蛋白質については分解能の
点から解析は不可能である。このため、蛋白質中の所定
部分のみを安定同位体で標識し、その部分情報を積み上
げることで全体構造を解析することが必要となる。ま
た、上記の手法においても、解析対象とする蛋白質分
子が巨大になればなるほど同一種類のアミノ酸残基の数
が増え、得られるＭＮＲスペクトルのピークの帰属が難
しくなってくる。これらのことから、蛋白質中の任意の
アミノ酸残基を（同一種類のアミノ酸残基の中でも任意
のアミノ酸残基のみを）安定同位体で標識する技術が求
められている。According to the above-mentioned method, it is said that the three-dimensional structure of a protein having a molecular weight of 30,000 to 40,000 in a solution can be analyzed. However, it is impossible to analyze a protein having a larger molecular weight from the viewpoint of resolution. It is. For this reason, it is necessary to label only a predetermined portion of the protein with a stable isotope and to analyze the entire structure by accumulating the information on the portion. Also in the above-mentioned method, the number of amino acid residues of the same type increases as the size of the protein molecule to be analyzed increases, and it becomes difficult to assign the peak of the obtained MNR spectrum. For these reasons, there is a need for a technique for labeling any amino acid residue in a protein with a stable isotope (only any amino acid residue among the same type of amino acid residues).
【０００９】本発明は上記事情に鑑みてなされたもの
で、任意の位置に１個ないし複数個、また１種から多種
の非天然型アミノ酸を組み込んだ蛋白質の製造法および
それを簡便に行なうための試薬キットの提供を目的とし
ている。The present invention has been made in view of the above circumstances, and is intended to provide a method for producing a protein in which one or more, or one or more unnatural amino acids are incorporated at any position, and to easily carry out the method. The purpose is to provide a reagent kit.
【００１０】[0010]
【課題を解決するための手段】かかる課題は、無細胞蛋
白質合成系下で、特定のアミノ酸に対応するアイソアク
セプティングｔＲＮＡのうち、一部のもののみを非天然
型アミノ酸と結合させたものと、蛋白質構成アミノ酸と
を用いて蛋白質合成を行って、非天然型アミノ酸を特定
のコドングループに組み込むことを特徴とする非天然型
アミノ酸組み込み蛋白質の製造法およびこの製造法によ
って製造された非天然型アミノ酸組み込み蛋白質によっ
て解消される。これは、最近、大腸菌のｔＲＮＡの構造
が全て決定し、またｔＲＮＡの修飾に関する知見などの
蓄積からｔＲＮＡとコドンの対応が完全に判明したこと
から可能になった。Such SUMMARY OF THE INVENTION The problem is under cell-free protein synthesis system, of iso access pudding tRNA that corresponds to a particular amino acid, and those obtained by binding only part of what the non-natural amino acids , With protein constituent amino acids
Identify unnatural amino acids by performing protein synthesis using
It is eliminated by the unnatural amino acid protein produced by unnatural amino acid protein preparation and the production method characterized by incorporating codons groups. This has become possible because the structure of the tRNA of Escherichia coli has recently been completely determined, and the correspondence between the tRNA and the codon has been completely clarified from the accumulation of knowledge on tRNA modification.
【００１１】また、目的蛋白質の遺伝情報を改変するこ
とにより塩基配列中のコドングループを制御し、アイソ
アクセプティングｔＲＮＡにより蛋白質中の任意の位置
に非天然型アミノ酸を組み込むこともできる。また、前
記無細胞蛋白質合成系として、無細胞ポリペプチド合成
系を収容した反応槽内に基質溶液を連続的に供給して目
的蛋白質を合成する連続式無細胞ポリペプチド合成系を
用いることもできる。また、前記非天然型アミノ酸は、 ａ．天然型アミノ酸中の原子を安定同位体で置換した非
天然型アミノ酸、 ｂ．天然型アミノ酸中の原子を放射性同位体で置換した
非天然型アミノ酸、 ｃ．天然型アミノ酸の側鎖の光学異性体、 ｄ．天然型アミノ酸の側鎖に置換基を導入した非天然型
アミノ酸、 ｅ．天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、
蛍光性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能を変化さ
せた非天然型アミノ酸、 ｆ．上記ａ〜ｅの２つ以上を具備した非天然型アミノ
酸、 のうちから選択されたものを用いることができる。Further, by modifying the genetic information of the target protein, the codon group in the base sequence can be controlled, and an unnatural amino acid can be incorporated at any position in the protein by isoaccepting tRNA. In addition, as the cell-free protein synthesis system, a continuous cell-free polypeptide synthesis system that synthesizes a target protein by continuously supplying a substrate solution into a reaction vessel containing the cell-free polypeptide synthesis system can also be used. . The unnatural amino acid comprises: a. A non-natural amino acid in which an atom in a natural amino acid is substituted with a stable isotope; b. A non-natural amino acid in which an atom in the natural amino acid has been substituted with a radioisotope, c. An optical isomer of a side chain of a natural amino acid, d. An unnatural amino acid having a substituent introduced into a side chain of a natural amino acid, e. Hydrophobicity, reactivity, by replacing the side chains of natural amino acids
An unnatural amino acid having altered fluorescence, charge state, molecular size, hydrogen bonding ability, f. An unnatural amino acid having two or more of the above a to e can be used.
【００１２】さらに、本発明は、上記非天然型アミノ酸
組み込み蛋白質の製造法を簡便に実施するために、リ
ボゾーム、ｔＲＮＡや蛋白質合成に必要な酵素等を含む
無細胞蛋白質合成系、任意のアイソアクセプティング
ｔＲＮＡに非天然型アミノ酸を結合させた非天然型アミ
ノアシルｔＲＮＡ、前記でのアイソアクセプティン
グｔＲＮＡに対するアイソアクセプティングｔＲＮＡに
天然型アミノ酸を結合させた天然型アミノアシルｔＲＮ
Ａ、前記での天然型アミノ酸以外の蛋白質構成アミ
ノ酸混合物、ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰなどの
リボヌクレオチド、の〜を具備した非天然型アミノ
酸組み込み蛋白質製造用試薬キットも提供する。Further, the present invention relates to a cell-free protein synthesis system containing ribosomes, tRNAs, enzymes necessary for protein synthesis, etc., Non-natural aminoacyl tRNA in which a non-natural amino acid is bonded to a putting tRNA, natural aminoacyl tRN in which a natural amino acid is bonded to an isoaccepting tRNA for the above-described isoaccepting tRNA
A: A reagent kit for the production of a protein incorporating a non-natural amino acid, comprising: a mixture of amino acids constituting the protein other than the above-mentioned natural amino acid, and ribonucleotides such as ATP, GTP, CTP and UTP.
【００１３】また、この試薬キットとしては、任意の
アイソアクセプティングｔＲＮＡに非天然型アミノ酸を
結合させた非天然型アミノアシルｔＲＮＡ、前記アイ
ソアクセプティングｔＲＮＡに対するアイソアクセプテ
ィングｔＲＮＡに天然型アミノ酸を結合させた天然型ア
ミノアシルｔＲＮＡ、リボゾーム、ｔＲＮＡや蛋白質
合成に必要な酵素等を含み、かつでのｔＲＮＡに対す
るアミノアシル合成酵素活性を低下させた無細胞蛋白質
合成系、前記での天然型アミノ酸以外の蛋白質構成
アミノ酸混合物、ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰな
どのリボヌクレオチド、を具備した構成としても良い。The reagent kit includes a non-natural aminoacyl-tRNA in which an unnatural amino acid is bound to an arbitrary iso-accepting tRNA, and a natural-type amino acid bound to an isoaccepting tRNA corresponding to the iso-accepting tRNA. Cell-free protein synthesis system containing natural aminoacyl tRNAs, ribosomes, enzymes necessary for tRNA and protein synthesis, and reduced aminoacyl synthase activity on tRNA, a mixture of protein-constituting amino acids other than the above-mentioned natural amino acids , ATP, GTP, CTP, UTP and other ribonucleotides.
【００１４】これら試薬キットにおける非天然型アミノ
酸としては、安定同位体標識アミノ酸、放射性同位体標
識アミノ酸、天然型アミノ酸の光学異性体、置換基導入
アミノ酸などの各種の非天然型アミノ酸を用いることが
できる。As the non-natural amino acids in these reagent kits, various non-natural amino acids such as stable isotope-labeled amino acids, radioactive isotope-labeled amino acids, optical isomers of natural amino acids, and amino acids with substituents may be used. it can.
【００１５】以下、本発明を詳細に説明する。本発明に
おいて使用される無細胞蛋白質合成系としては、ウサギ
網状赤血球の溶血系、小麦胚芽抽出物などの無細胞翻訳
系や、大腸菌Ｓ３０抽出物のような無細胞転写翻訳共役
系などである。これらは主としてリボゾーム、ｔＲＮＡ
や蛋白質合成に必要な酵素等であり、２０種類のアミノ
酸を基質として蛋白質を合成するものである。Hereinafter, the present invention will be described in detail. Examples of the cell-free protein synthesis system used in the present invention include a cell-free translation system such as a rabbit reticulocyte hemolysis system, a wheat germ extract, and a cell-free transcription-translation conjugate system such as an Escherichia coli S30 extract. These are mainly ribosomes, tRNAs
And enzymes required for protein synthesis, which synthesize proteins using 20 types of amino acids as substrates.
【００１６】また、無細胞蛋白質合成系として従来のバ
ッチ式の他に、特許出願公表平１−５０３１１９号公報
や特願平２−３３４１０３号などの連続式の無細胞ペプ
チド合成系があるが、収量の点から本発明では連続式無
細胞ポリペプチド合成系が適している。As a cell-free protein synthesis system, in addition to the conventional batch system, there is a continuous cell-free peptide synthesis system such as Japanese Patent Application Publication No. 1-503119 and Japanese Patent Application No. 2-334103. From the viewpoint of yield, a continuous cell-free polypeptide synthesis system is suitable in the present invention.
【００１７】図１は、本発明に係わる非天然型アミノ酸
組み込み蛋白質の製造法を実施するのに好適な製造装置
の一例を示す図であって、符号１は反応槽、２は基質溶
液タンク、３は流出液である。反応槽１内には、無細胞
蛋白質合成系が収容されている。この反応槽１の下方側
からは基質溶液タンク２から圧送された基質溶液が連続
的に供給され、反応槽１の上部に取り付けられた限外ろ
過器４を通して、反応槽１内で生成した標識蛋白質を含
む流出液３が流出するようになっている。FIG. 1 is a diagram showing an example of a production apparatus suitable for carrying out the method for producing a non-natural amino acid-incorporated protein according to the present invention, wherein reference numeral 1 denotes a reaction tank, 2 denotes a substrate solution tank, 3 is the effluent. The reaction tank 1 contains a cell-free protein synthesis system. The substrate solution pumped from the substrate solution tank 2 is continuously supplied from the lower side of the reaction tank 1, and the label generated in the reaction tank 1 is passed through the ultrafilter 4 attached to the upper part of the reaction tank 1. The effluent 3 containing the protein flows out.
【００１８】この装置を用いて連続的に標識蛋白質を製
造するには、反応槽１内に、目的蛋白質を合成するため
の無細胞蛋白質合成系を含む溶液を収容し、この反応槽
１内に標識アミノ酸を含む基質溶液を連続的に圧送す
る。基質溶液を反応槽１内に圧送するには、系内に気相
を含むことがなく、脈流が少なく、圧力と流量の制御が
可能なポンプ、例えば高速液体クロマトグラフィー用ポ
ンプ、中圧液体クロマトグラフィー用ポンプ、低圧液体
クロマトグラフィー用ポンプなどを用いて圧送すること
が望ましい。この基質溶液の圧送量は、通常は一定に設
定されるが、反応時間の経過とともに圧送量を増加させ
あるいは減少させても良い。In order to continuously produce a labeled protein using this apparatus, a solution containing a cell-free protein synthesis system for synthesizing a target protein is accommodated in the reaction tank 1. The substrate solution containing the labeled amino acid is continuously pumped. In order to pump the substrate solution into the reaction tank 1, a pump that does not contain a gas phase in the system, has a small pulsating flow, and can control the pressure and the flow rate, for example, a high-performance liquid chromatography pump, a medium-pressure liquid It is desirable to pump using a pump for chromatography, a pump for low pressure liquid chromatography, or the like. The pumping amount of the substrate solution is usually set to be constant, but the pumping amount may be increased or decreased as the reaction time elapses.
【００１９】本発明で使用される非天然型アミノ酸と
は、天然型蛋白質を構成する天然型アミノ酸２０種類
（グリシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシ
ン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、
Ｌ−アスパラギン酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラ
ギン、Ｌ−グルタミン、Ｌ−リシン、Ｌ−アルギニン、
Ｌ−シスチン、Ｌ−メチオニン、Ｌ−フェニルアラニ
ン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−ヒスチジ
ン、Ｌ−プロリン）を除く全てのアミノ酸を意味し、具
体的には、 ａ．天然型アミノ酸中の原子を安定同位体で置換した非
天然型アミノ酸、 ｂ．天然型アミノ酸中の原子を放射性同位体で置換した
非天然型アミノ酸、 ｃ．天然型アミノ酸の側鎖の光学異性体、 ｄ．天然型アミノ酸の側鎖に置換基を導入した非天然型
アミノ酸、 ｅ．天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、
蛍光性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能を変化さ
せた非天然型アミノ酸、 ｆ．上記ａ〜ｅの２つ以上を具備した非天然型アミノ
酸、 のうちから選択されるものである。The non-natural amino acids used in the present invention include 20 natural amino acids that constitute natural proteins (glycine, L-alanine, L-valine, L-leucine, L-isoleucine, L-serine, L-threonine,
L-aspartic acid, L-glutamic acid, L-asparagine, L-glutamine, L-lysine, L-arginine,
L-cystine, L-methionine, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-tryptophan, L-histidine, L-proline), and specifically means a. A non-natural amino acid in which an atom in a natural amino acid is substituted with a stable isotope; b. A non-natural amino acid in which an atom in the natural amino acid has been substituted with a radioisotope, c. An optical isomer of a side chain of a natural amino acid, d. An unnatural amino acid having a substituent introduced into a side chain of a natural amino acid, e. Hydrophobicity, reactivity, by replacing the side chains of natural amino acids
An unnatural amino acid having altered fluorescence, charge state, molecular size, hydrogen bonding ability, f. A non-natural amino acid comprising two or more of the above a to e.
【００２０】また、ここで言う蛋白質とは、通常の定義
に含まれる全てのものが含まれ、糖鎖と結合した糖蛋白
質もこれに含まれるものとする。さらに、アミノ酸残基
数が約１０個から５０個のいわゆるポリペプチドも含
む。The term "protein" as used herein includes all proteins included in the ordinary definition, and includes a glycoprotein bound to a sugar chain. Further, a so-called polypeptide having about 10 to 50 amino acid residues is also included.
【００２１】ここで、本発明に係わる非天然型アミノ酸
組み込み蛋白質の製造法の基本原理を説明する。Here, the basic principle of the method for producing the unnatural amino acid-incorporating protein according to the present invention will be described.
【００２２】蛋白質のアミノ酸配列は、その蛋白質を合
成する蛋白質合成系の核酸の配列によって規定されてい
る。４種の塩基の３つの組み合わせ連鎖、すなわちコド
ンが各アミノ酸に対応している。そのコドンとアミノ酸
の対応は遺伝暗号として解読されており、それはごく少
数の例外を除いて全生物を通じて共通である。コドンは
全部で６４種類あり、その内の３つは終始コドンとして
働く。残りの６１種類のコドンが２０種類のアミノ酸に
それぞれ対応している。表１にコドン表を示した。The amino acid sequence of a protein is defined by the sequence of a nucleic acid in a protein synthesis system that synthesizes the protein. Three combinatorial sequences of the four bases, codons, correspond to each amino acid. The codon and amino acid correspondence has been deciphered as the genetic code, which is common across all organisms with very few exceptions. There are a total of 64 codons, three of which serve as codons throughout. The remaining 61 codons correspond to the 20 amino acids, respectively. Table 1 shows the codon table.
【００２３】[0023]
【表１】 [Table 1]
【００２４】遺伝暗号は縮重しており、メチオニンとト
リプトファンを除くアミノ酸は１つのアミノ酸に対して
複数のコドン（同義コドン）によって規定されている。
しかし、全て異なる種類のｔＲＮＡが対応している訳で
はない。ｍＲＮＡ上のコドンとｔＲＮＡ上のアンチコド
ンの結合は完全なワトソン−クリック型の結合ではなく
ｔＲＮＡの種類によってはアンチコドンの５’の位置の
塩基がコドンの３’の位置の複数の塩基と結合すること
が可能な場合がある。そのアンチコドンの５’の位置と
コドンの３’の位置との塩基対合を、表２に示した。The genetic code is degenerate, and amino acids other than methionine and tryptophan are defined by a plurality of codons (synonymous codons) for one amino acid.
However, not all different types of tRNAs correspond. The binding of the codon on the mRNA to the anticodon on the tRNA is not complete Watson-Crick type binding, but depending on the type of tRNA, the base at the 5 'position of the anticodon binds to multiple bases at the 3' position of the codon. May be possible. Table 2 shows the base pairing between the 5 'position of the anticodon and the 3' position of the codon.
【００２５】[0025]
【表２】 [Table 2]
【００２６】このように１種類のｔＲＮＡが複数のコド
ンを読むことが可能であるが、それでもなお１種類のア
ミノ酸に複数のｔＲＮＡ分子が存在している。そしてこ
の異なるアンチコドンを持つが、同じアミノ酸と結合す
るｔＲＮＡ分子を、アイソアクセプティングｔＲＮＡと
呼ぶ。例として大腸菌における各ｔＲＮＡがどのコドン
を認識するかを表３に示した。As described above, one type of tRNA can read a plurality of codons, but nevertheless, there are a plurality of tRNA molecules in one type of amino acid. A tRNA molecule having this different anticodon but binding to the same amino acid is called an isoaccepting tRNA. As an example, Table 3 shows which codons each tRNA in Escherichia coli recognizes.
【００２７】[0027]
【表３】 [Table 3]
【００２８】本発明においては、このアイソアクセプテ
ィングｔＲＮＡを利用し、コドングループ別に非天然型
アミノ酸を導入する。目的の蛋白質をコードする遺伝子
の塩基配列が、あるアミノ酸の各アイソアクセプティン
グｔＲＮＡのアンチコドンに対するコドンをそれぞれ持
っていれば、そのアミノ酸はそのアイソアクセプティン
グｔＲＮＡ毎に標識することが可能となる。In the present invention, an unnatural amino acid is introduced for each codon group using this isoaccepting tRNA. If the nucleotide sequence of the gene encoding the target protein has a codon for the anticodon of each isoaccepting tRNA of a certain amino acid, the amino acid can be labeled for each isoaccepting tRNA.
【００２９】蛋白質中のあるアミノ酸残基をコドングル
ープ別に天然型アミノ酸と非天然型アミノ酸とに標識す
る方法としては、次のやなどの方法が用いられる。 目的のアミノ酸のアイソアクセプティングｔＲＮＡ分
子をそれぞれ単離し、そのそれぞれのアイソアクセプテ
ィングｔＲＮＡに天然型アミノ酸と非天然型アミノ酸を
ｉｎ ｖｉｔｒｏで結合させ、天然型アミノアシルｔＲ
ＮＡと非天然型アミノアシルｔＲＮＡを得る。 無細胞蛋白質合成系の基質として目的のアミノ酸を除
いた蛋白質構成アミノ酸混合液、およびで得られた天
然型アミノアシルｔＲＮＡと非天然型アミノアシルｔＲ
ＮＡを用い、無細胞蛋白質合成を行なわせ、目的の蛋白
質を得る。As a method of labeling a certain amino acid residue in a protein into a natural amino acid and a non-natural amino acid for each codon group, the following methods are used. Isolating each of the isoaccepting tRNA molecules of the target amino acid, binding a natural amino acid and an unnatural amino acid to each of the isoaccepting tRNAs in vitro, and obtaining a natural aminoacyl tR
Obtain NA and unnatural aminoacyl-tRNA. As a substrate for a cell-free protein synthesis system, a mixed solution of amino acids constituting a protein from which the desired amino acid has been removed, and the natural aminoacyl-tRNA and non-natural aminoacyl-tR obtained from
Using NA, cell-free protein synthesis is performed to obtain the target protein.
【００３０】また、目的の蛋白質の遺伝子の所定のアミ
ノ酸に対するコドンを全て１種類のアイソアクセプティ
ングｔＲＮＡに対するコドンに置換し、その中にある望
みの箇所のコドンのみを他のアイソアクセプティングｔ
ＲＮＡに置換しておき、上記の方法にて蛋白質合成を行
なえば、任意の位置のみを特異的に非天然型アミノ酸に
置換した蛋白質を得ることができる。Further, all codons for predetermined amino acids of the gene of the target protein are replaced with codons for one type of isoaccepting tRNA, and only the codon at a desired position in the gene is replaced with another isoaccepting tRNA.
By substituting RNA and synthesizing the protein by the above method, a protein in which only an arbitrary position is specifically substituted with a non-natural amino acid can be obtained.
【００３１】アイソアクセプティングｔＲＮＡの分離精
製法および非天然型アミノ酸とｔＲＮＡの結合法は、従
来より知られている方法を用いて行なうことができる。
例えば、アイソアクセプティングｔＲＮＡの分離精製法
については、日本生化学会編「生化学実験講座 ７ 核
酸の化学Ｉ」第５章に記載されている。また、未分画ｔ
ＲＮＡの調製法は、日本生化学会編「生化学実験講座
７ 蛋白質の生合成（下）」第２５章に記載されてい
る。The method for separating and purifying the isoaccepting tRNA and the method for binding the unnatural amino acid to the tRNA can be carried out by using a conventionally known method.
For example, a method for separating and purifying isoaccepting tRNA is described in Chapter 5 of "Biochemical Experiment Course 7 Nucleic Acid Chemistry I" edited by The Biochemical Society of Japan. In addition, unfractionated t
The method for preparing RNA is described in the Biochemical Society of Japan
7 Protein Biosynthesis (Bottom) "in Chapter 25.
【００３２】天然型アミノ酸とｔＲＮＡは、アミノアシ
ルｔＲＮＡ合成酵素を用いて結合させる。この詳細な方
法については日本生化学会編「生化学実験講座 ７ 蛋
白質の生合成（下）」第２６章に記載されている。The natural amino acid and tRNA are bound using an aminoacyl-tRNA synthetase. This detailed method is described in Chapter 26 of "Biochemical Experiment Course 7 Protein Biosynthesis (Lower)" edited by The Biochemical Society of Japan.
【００３３】非天然型アミノ酸とｔＲＮＡの結合方法と
しては、 安定同位体標識アミノ酸、放射性同位体標識アミノ酸
および、アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素によって誤って
認識される非天然型アミノ酸に関しては、上記の天然型
アミノ酸の場合と同様の方法が適用できる。 それ以外の非天然型アミノ酸に関しては、バージニア
大のＳ.Ｍ.Ｈｅｃｈｔらのグループが開発した方法によ
り結合させる。( Heckler T.G.,Zama Y.,NakaT.and Hec
ht S.M.,Biochemistry,23,1468-1473(1984))The method for binding the unnatural amino acid to the tRNA includes the following: stable isotope-labeled amino acids, radioisotope-labeled amino acids, and non-natural amino acids erroneously recognized by aminoacyl-tRNA synthetase. The same method as in the case of can be applied. Other unnatural amino acids are coupled by methods developed by the group of SM Hecht et al. At Virginia University. (Heckler TG, Zama Y., NakaT. And Hec
ht SM, Biochemistry, 23, 1468-1473 (1984))
【００３４】なお、本発明に用いる無細胞蛋白質合成系
は、使用するアイソアクセプティングｔＲＮＡに対する
アミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の活性が低いものが適す
る。このような無細胞蛋白質合成系を得るためには以下
の方法が考えられる。 ａ．目的のアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の温度感受性
変異株の無細胞抽出液を用いる方法。 ｂ．無細胞蛋白質合成系に目的のアミノアシルｔＲＮＡ
合成酵素に対する抗体を添加し、酵素活性を低下させ
る。The cell-free protein synthesis system used in the present invention preferably has a low activity of aminoacyl-tRNA synthetase against the isoaccepting tRNA used. The following methods are conceivable for obtaining such a cell-free protein synthesis system. a. A method using a cell-free extract of a temperature-sensitive mutant of an aminoacyl-tRNA synthetase of interest. b. Aminoacyl-tRNA for cell-free protein synthesis
An antibody against the synthetic enzyme is added to reduce the enzyme activity.
【００３５】本発明による非天然型アミノ酸組み込み蛋
白質の製造法では、無細胞蛋白質合成系、好ましくは連
続式無細胞蛋白質合成系を用い、この合成系の特定のコ
ドンに対応するアイソアクセプティングｔＲＮＡと非天
然型アミノ酸とを結合させたものと、それ以外の種類の
蛋白質構成アミノ酸（天然型アミノ酸）を基質として非
天然型アミノ酸組み込み蛋白質を合成する方法である。
従って非天然型アミノ酸を組み込む位置をコドングルー
プ別に制御して非天然型アミノ酸を蛋白質中にコドング
ループ別に組み込むことができる。In the method for producing a protein incorporating an unnatural amino acid according to the present invention, a cell-free protein synthesis system, preferably a continuous cell-free protein synthesis system, is used, and an isoaccepting tRNA corresponding to a specific codon of this synthesis system is used. This is a method of synthesizing a non-natural amino acid-incorporating protein using a non-natural amino acid bonded to a non-natural amino acid and a protein-constituting amino acid (natural amino acid) of another type as a substrate.
Therefore, the position at which the unnatural amino acid is incorporated can be controlled for each codon group, and the unnatural amino acid can be incorporated into the protein for each codon group.
【００３６】また、サイトダイレクテッドミュータジェ
ネシスなどの遺伝子組み換え手法を用い、目的蛋白質の
遺伝情報を改変することにより塩基配列中のコドングル
ープを制御し、アイソアクセプティングｔＲＮＡにより
蛋白質中の任意の位置に非天然型アミノ酸を組み込むこ
とによって蛋白質の任意の位置に非天然型アミノ酸を正
確に組み込むことができる。Also, by using a genetic recombination technique such as site-directed mutagenesis, the genetic information of the target protein is modified to control the codon group in the base sequence, and it is possible to control the codon group at an arbitrary position in the protein by isoaccepting tRNA. By incorporating the unnatural amino acid, the unnatural amino acid can be accurately incorporated at any position in the protein.
【００３７】また、本発明は、原理的に非天然型アミノ
酸組み込み蛋白質合成法における従来の技術的制限を完
全に取り除いたものであり、使用者の要求どおりの非天
然型蛋白質を必要充分な量、提供することが可能となっ
た。特に蛋白質を安定同位体で標識する場合には、蛋白
質中の同一種類のアミノ酸残基を区別して任意のアミノ
酸残基のみを標識することが可能となった。The present invention, in principle, completely eliminates the conventional technical limitations in the method for synthesizing a protein incorporating an unnatural amino acid, and provides a necessary and sufficient amount of the non-natural protein as required by the user. It became possible to provide. In particular, when labeling a protein with a stable isotope, it became possible to distinguish only the same type of amino acid residue in the protein and label only an arbitrary amino acid residue.
【００３８】[0038]
【実施例】本発明に係わる非天然型アミノ酸組み込み蛋
白質用試薬キットを調製し、それを用いて非天然型蛋白
質の製造を実施した。試薬キットとして、大腸菌Ｓ３０
抽出液を用いた転写翻訳共役系によりクロラムフェニコ
ールアセチルトランスフェラーゼ（以下、ＣＡＴとい
う）のアルギニン残基を安定同位体15Ｎで標識した非天
然型アルギニンと、天然型アルギニンに標識分けした標
識蛋白製造用キットを試作して用いた。EXAMPLE A reagent kit for an unnatural amino acid-incorporating protein according to the present invention was prepared and used to produce a non-natural protein. E. coli S30 as a reagent kit
Extract transcription translation conjugated chloramphenicol acetyltransferase was used (hereinafter, referred to as CAT) and non-natural arginine labeled with an arginine residue stable isotope 15 N, the labeled protein labeled divided into natural arginine A production kit was prototyped and used.
【００３９】１．キット内容 Ａ液 大腸菌Ｓ３０抽出液：大腸菌（アルギニンｔＲＮＡ合成
酵素温度感受性変異株）からＺｕｂａｙの方法（Ｚｕｂ
ａｙ Ｇ．（１９７３）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅ
ｔ．７，２６７−２８７）に基づいて得られた抽出液、
１７０μｌ。 Ｂ液 ｔＲＮＡ混合液（１７４μｇ／ｍｌ） Ｃ液 ５５．０ミリモル・トリス酢酸溶液（ｐＨ８．２） １．６５ミリモル・ＤＴＴ（ジチオスレイトール） １．２２ミリモルＡＴＰ ０．８４ミリモル・ＣＴＰ・ＧＴＰ・ＵＴＰ ２７．０ミリモル・ホスホエノールピルビン酸エステル １．９％ポリエチレングリコール-6000 ３４．４μｇ／ｍｌフォリン酸 ０．６４ミリモル・3',5'-サイクリックＡＭＰ ３６．０ミリモル酢酸アンモニウム ７２．０ミリモル酢酸カリウム ９．７ミリモル酢酸カルシウム １０．０ミリモル酢酸マグネシウム Ｄ液 アルギニン以外の蛋白質構成アミノ酸１９種類（各０．
３５ミリモル） Ｅ液 天然型アルギニルｔＲＮＡ１溶液と天然型アルギニルｔ
ＲＮＡ２or３（表３中のＡｒｇに対応するｔＲＮＡ１，
ｔＲＮＡ２or３，ｔＲＮＡ４のうち、ｔＲＮＡ１，ｔＲ
ＮＡ２or３にそれぞれ天然型アルギニンを結合させたも
の）溶液 Ｆ液15 Ｎ標識アルギニルｔＲＮＡ４（表３中のＡｒｇに対応
するｔＲＮＡ１，ｔＲＮＡ２or３，ｔＲＮＡ４のうち、
ｔＲＮＡ４に15Ｎ標識アルギニンを結合させたもの）溶
液 なお、各溶液に記載した濃度は反応液中の最終濃度であ
る。1. Kit contents Solution A E. coli S30 extract: E. coli (arginine tRNA synthetase temperature-sensitive mutant) and Zubay's method (Zub
ay G. (1973) Annu. Rev .. Gene
t. 7, 267-287),
170 μl. Solution B tRNA mixed solution (174 μg / ml) Solution C 55.0 mmol Tris acetic acid solution (pH 8.2) 1.65 mmol DTT (dithiothreitol) 1.22 mmol ATP 0.84 mmol CTP GTP UTP 27.0 mmol phosphoenolpyruvate 1.9% polyethylene glycol-6000 34.4 μg / ml folinic acid 0.64 mmol 3 ′, 5′-cyclic AMP 36.0 mmol ammonium acetate 72.0 mmol Potassium acetate 9.7 mmol Calcium acetate 10.0 mmol Magnesium acetate D solution 19 types of protein-constituting amino acids other than arginine (each 0.
E-solution Natural arginyl-tRNA1 solution and natural arginyl-t
RNA2 or 3 (tRNA1 corresponding to Arg in Table 3)
Of tRNA2or3 and tRNA4, tRNA1 and tR
Solution in which natural arginine is bound to NA2 or 3 respectively. Solution F Solution 15 N-labeled arginyl tRNA4 (tRNA1, tRNA2or3, and tRNA4 corresponding to Arg in Table 3)
tRNA4 bound to 15 N-labeled arginine) Solutions The concentrations described in each solution are the final concentrations in the reaction solution.
【００４０】２．実験操作 Ａ液、Ｂ液にＣ液、Ｄ液、Ｅ液、Ｆ液の一部を添加
し、それにＣＡＴのＤＮＡ（約１００μｇ）を加え、１
ｍｌの反応槽１に充填する。この反応槽は３０℃に加温
しておく。 基質溶液タンク２にＣ液、Ｄ液、Ｅ液、Ｆ液の混合溶
液（基質溶液）を入れる。 基質溶液を反応槽１に連続的に供給し、蛋白質合成を
行なわせる。 合成された蛋白質は反応槽の限外ろ過器４を透過し、
採取容器５に採集される。2. Experimental operation To solution A and solution B, a part of solution C, solution D, solution E and solution F was added, and CAT DNA (about 100 μg) was added thereto.
Fill the reaction tank 1 with a capacity of 1 ml. The reactor is heated to 30 ° C. A mixed solution (substrate solution) of solution C, solution D, solution E, and solution F is put into the substrate solution tank 2. The substrate solution is continuously supplied to the reaction tank 1 to perform protein synthesis. The synthesized protein passes through the ultrafilter 4 of the reaction tank,
Collected in the collection container 5.
【００４１】採集された蛋白質を含む流出液を、アフィ
ニティクロマトグラフィーによって精製し、安定同位体
（15Ｎ）により標識したアルギニンが組み込まれたＣＡ
Ｔを得た。ＣＡＴ合成系の遺伝子配列を、配列表に示し
た。ＣＡＴ中のアルギニン残基は全部で５個あり、Ａｒ
ｇ・ｔＲＮＡ１に対応するコドンＣＧＵ（ＤＮＡ配列で
ＣＧＴ）１８残基目，７４残基目（４種類の塩基の３つ
の組み合わせ連鎖であるコドンの１８番目と７４番
目）、ＣＧＣは６５残基目、またＡｒｇ・ｔＲＮＡ２or
３に対応するコドンＣＧＧは１２４残基目に存在してい
る。一方、Ａｒｇ・ｔＲＮＡ４ に対応するコドンＡＧ
Ａは２１３残基目に存在している。したがって、本試験
では、２１３残基目のアルギニン残基のみが安定同位体
15Ｎで標識され、他のアルギニン残基は標識されないＣ
ＡＴ）が得られる。The effluent containing the collected protein was purified by affinity chromatography, and CA, into which arginine labeled with a stable isotope ( 15 N) was incorporated.
T was obtained. The gene sequence of the CAT synthesis system is shown in the sequence listing. There are a total of 5 arginine residues in the CAT,
Codon CGU (CGT in the DNA sequence) corresponding to g · tRNA1 Residues 18 and 74 (codons 18 and 74, which are a combination of three bases of four kinds of bases), and CGC at residue 65 And Arg · tRNA2or
The codon CGG corresponding to 3 is located at residue 124. On the other hand, the codon AG corresponding to Arg-tRNA4
A is at residue 213. Therefore, in this test, only the 213rd arginine residue was a stable isotope
C labeled with 15 N and no other arginine residues
AT) is obtained.
【００４２】また、サイトダイレクテッドミュータジェ
ネシスなどの遺伝子組み換え手法を用い、２１３残基に
対応するコドンＡＧＡを、ＣＧＴ，ＣＧＣ又はＣＧＧに
変換し、特定の位置をＡＧＡに変えれば、その特定位置
のみを安定同位体標識アルギニン残基とすることができ
る。Further, by using a gene recombination technique such as site-directed mutagenesis, the codon AGA corresponding to 213 residues is converted to CGT, CGC or CGG, and a specific position is changed to AGA. Can be a stable isotope-labeled arginine residue.
【００４３】[0043]
【発明の効果】以上説明したように、本発明により、非
天然型アミノ酸を蛋白質中にコドングループ別に組み込
むことや、蛋白質の任意の位置に正確に組み込むことを
コントロールすることが可能となった。これは最近ｔＲ
ＮＡの全構造や修飾に関する知見の集積からｔＲＮＡと
コドンの対応が明確になったことから可能になった。本
発明は原理的に非天然型アミノ酸組み込み蛋白質合成法
における従来の技術的制限を完全に取り除いたものであ
り、使用者の要求どおりの非天然型蛋白質を必要充分な
量、提供することが可能となった。特に蛋白質を安定同
位体で標識する場合には、蛋白質中の同一種類のアミノ
酸残基を区別して任意のアミノ酸残基のみを標識するこ
とが可能となった。As described above, according to the present invention, it is possible to control the incorporation of unnatural amino acids into proteins by codon groups and to control the accurate incorporation at any desired position in proteins. This is recently tR
This became possible because the correspondence between tRNAs and codons was clarified from the accumulation of knowledge on the entire structure and modification of NA. The present invention, in principle, completely eliminates the conventional technical limitations in the method for synthesizing a protein incorporating an unnatural amino acid, and can provide a necessary and sufficient amount of a non-natural protein as required by the user. It became. In particular, when labeling a protein with a stable isotope, it became possible to distinguish only the same type of amino acid residue in the protein and label only an arbitrary amino acid residue.
【００４４】[0044]
配列の長さ：６５７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 配列の種類：プラスミドＤＮＡの一部 起源：プラスミドｐＢＲ３２５由来 配列 ATGGAGAAAA AAATCACTGG ATATACCACC GTTGATATAT CCCAATGGCA TCGTAAAGAA 60 CATTTTGAGG CATTTCAGTC AGTTGCTCAA TGTACCTATA ACCAGACCGT TCAGCTGGAT 120 ATTACGGCCT TTTTAAAGAC CGTAAAGAAA AATAAGCACA AGTTTTATCC GGCCTTTATT 180 CACATTCTTG CCCGCCTGAT GAATGCTCAT CCGGAATTCC GTATGGCAAT GAAAGACGGT 240 GAGCTGGTGA TATGGGATAG TGTTCACCCT TGTTACACCG TTTTCCATGA GCAAACTGAA 300 ACGTTTTCAT CGCTCTGGAG TGAATACCAC GACGATTTCC GGCAGTTTCT ACACATATAT 360 TCGCAAGATG TGGCGTGTTA CGGTGAAAAC CTGGCCTATT TCCCTAAAGG GTTTATTGAG 420 AATATGTTTT TCGTCTCAGC CAATCCCTGG GTGAGTTTCA CCAGTTTTGA TTTAAACGTG 480 GCCAATATGG ACAACTTCTT CGCCCCCGTT TTCACCATGG GCAAATATTA TACGCAAGGC 540 GACAAGGTGC TGATGCCGCT GGCGATTCAG GTTCATCATG CCGTTTGTGA TGGCTTCCAT 600 GTCGGCAGAA TGCTTAATGA ATTACAACAG TACTGCGATG AGTGGCAGGG CGGGGCG 657 Sequence length: 657 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Single strand Type of sequence: Part of plasmid DNA Origin: Derived from plasmid pBR325 Sequence ATGGAGAAAA AAATCACTGG ATATACCACC GTTGATATAT CCCAATGGCA TCGTAAAGAA 60 CATTTTGAGG CATTTCAGTC AGTTGCTCAA TGTACCTAG TAG AATAAGCACA AGTTTTATCC GGCCTTTATT 180 CACATTCTTG CCCGCCTGAT GAATGCTCAT CCGGAATTCC GTATGGCAAT GAAAGACGGT 240 GAGCTGGTGA TATGGGATAG TGTTCACCCT TGTTACACCG TTTTCCATGA GCAAACTGAA 300 ACGTTTTCAT CGCTCTGGAG TGAATACCAC GACGATTTCC GGCAGTTTCT ACACATATAT 360 TCGCAAGATG TGGCGTGTTA CGGTGAAAAC CTGGCCTATT TCCCTAAAGG GTTTATTGAG 420 AATATGTTTT TCGTCTCAGC CAATCCCTGG GTGAGTTTCA CCAGTTTTGA TTTAAACGTG 480 GCCAATATGG ACAACTTCTT CGCCCCCGTT TTCACCATGG GCAAATATTA TACGCAAGGC 540 GACAAGGTGC TGATGCCGCT GGCGATTCAG GTTCATCATG CCGTTTGTGA TGGCTTCCAT 600 GTCGGCAGAA TGCTTAATGA ATTACAACAG TACTGCGATG AGTGGCAGGG CGGGGCG 657
【図１】本発明の非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製
造法を説明するための製造装置の概略構成図である。FIG. 1 is a schematic configuration diagram of a production apparatus for explaining a method for producing a non-natural amino acid-incorporated protein of the present invention.
【符号の説明】 １ 反応槽 ２ 基質溶液タンク ３ 流出液 ４ 限外ろ過器[Description of Signs] 1 Reaction tank 2 Substrate solution tank 3 Effluent 4 Ultrafilter
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，253 （1978），ｐ．1773−1779 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，265 （1990），ｐ．6931−6935 Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．, 42（1978），ｐ．753−756 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 21/00 ZNA C12N 15/09 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (56) References Biol. Chem. , 253 (1978), p. 1773-1779 J.C. Biol. Chem. , 265 (1990), p. 6931-6935 Agric. Biol. Chem. , 42 (1978), p. 753-756 (58) Fields surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) C12P 21/00 ZNA C12N 15/09 BIOSIS (DIALOG) MEDLINE (STN)
Claims (9)
酸に対応するアイソアクセプティングｔＲＮＡのうち、
一部のもののみを非天然型アミノ酸と結合させたもの
と、蛋白質構成アミノ酸とを用いて蛋白質合成を行っ
て、非天然型アミノ酸を特定のコドングループに組み込
むことを特徴とする非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の
製造法。1. A under cell-free protein synthesis system, specific amino
Of the isoaccepting tRNAs corresponding to acids ,
Only some of them combined with unnatural amino acids
And protein synthesis using protein-constituting amino acids
Te, write sets a non-natural amino acids to a specific codon group
No preparation of unnatural amino acid protein, characterized in that.
ものであることを特徴とする請求項１記載の非天然型ア
ミノ酸組み込み蛋白質の製造法。2. The specific codon group has been modified.
The method for producing an unnatural amino acid-incorporating protein according to claim 1, wherein the protein is a non-natural amino acid-incorporating protein.
ポリペプチド合成系を収容した反応糟内に基質溶液を連
続的に供給して目的蛋白質を合成する連続式無細胞ポリ
ペプチド合成系を用いることを特徴とする請求項１また
は２記載の非天然型アミノ酸組み込み蛋白質の製造法。3. A continuous cell-free polypeptide synthesis system for continuously synthesizing a target protein by continuously supplying a substrate solution into a reaction vessel containing the cell-free polypeptide synthesis system as the cell-free protein synthesis system. The method for producing a non-naturally-occurring amino acid-incorporating protein according to claim 1 or 2, wherein:
天然型アミノ酸、 ｂ．天然型アミノ酸中の原子を放射性同位体で置換した
非天然型アミノ酸、 ｃ．天然型アミノ酸の側鎖の光学異性体、 ｄ．天然型アミノ酸の側鎖に置換基を導入した非天然型
アミノ酸、 ｅ．天然型アミノ酸の側鎖を置換して疎水性、反応性、
蛍光性、荷電状態、分子の大きさ、水素結合能を変化さ
せた非天然型アミノ酸、 ｆ．上記ａ〜ｅの２つ以上を具備した非天然型アミノ
酸、 のうちから選択されたものを用いることを特徴とする請
求項１，２または３記載の非天然型アミノ酸組み込み蛋
白質の製造法。4. The method of claim 1, wherein the unnatural amino acid comprises: a. A non-natural amino acid in which an atom in a natural amino acid is substituted with a stable isotope; b. A non-natural amino acid in which an atom in the natural amino acid has been substituted with a radioisotope, c. An optical isomer of a side chain of a natural amino acid, d. An unnatural amino acid having a substituent introduced into a side chain of a natural amino acid, e. Hydrophobicity, reactivity, by replacing the side chains of natural amino acids
An unnatural amino acid having altered fluorescence, charge state, molecular size, hydrogen bonding ability, f. The method for producing an unnatural amino acid-incorporated protein according to claim 1, 2, or 3, wherein a non-natural amino acid having two or more of the above a to e is used.
により製造された、蛋白質を構成するアミノ酸残基の少
なくとも１つを非天然型アミノ酸残基で置換してなるこ
とを特徴とする非天然型アミノ酸組み込み蛋白質。5. The production method according to claim 1,
Unnatural amino acid protein characterized by comprising substituted manufactured, at least one of the amino acid residues constituting the protein with an unnatural amino acid residue by.
必要な酵素等を含む無細胞蛋白質合成系、 任意のアイソアクセプティングｔＲＮＡに非天然型ア
ミノ酸を結合させた非天然型アミノアシルｔＲＮＡ、 前記でのアイソアクセプティングｔＲＮＡに対する
アイソアクセプティングｔＲＮＡに天然型アミノ酸を結
合させた天然型アミノアシルｔＲＮＡ、 前記での天然型アミノ酸以外の蛋白質構成アミノ酸
混合物、 ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰなどのリボヌクレオ
チド、 とを具備した請求項５記載の非天然型アミノ酸組み込み
蛋白質製造用試薬キット。6. A cell-free protein synthesis system containing ribosomes, tRNAs, enzymes necessary for protein synthesis, etc., a non-natural aminoacyl-tRNA in which a non-natural amino acid is bound to an arbitrary iso-accepting tRNA, natural aminoacyl tRNA bound with natural amino acids to iso access pudding tRNA for pudding tRNA claims, protein constituent amino acid mixture other than natural amino acids in the, equipped ATP, GTP, CTP, ribonucleotides, such as UTP, the city Item 6. The reagent kit for producing a protein containing an unnatural amino acid according to Item 5 .
Ａに非天然型アミノ酸を結合させた非天然型アミノアシ
ルｔＲＮＡ、 前記アイソアクセプティングｔＲＮＡに対するアイソ
アクセプティングｔＲＮＡに天然型アミノ酸を結合させ
た天然型アミノアシルｔＲＮＡ、 リボゾーム、ｔＲＮＡや蛋白質合成に必要な酵素等を
含み、かつでのｔＲＮＡに対するアミノアシル合成酵
素活性を低下させた無細胞蛋白質合成系、 前記での天然型アミノ酸以外の蛋白質構成アミノ酸
混合物、 ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰなどのリボヌクレオ
チド、 とを具備した請求項５記載の非天然型アミノ酸組み込み
蛋白質製造用試薬キット。7. Any isoaccepting tRN
A non-natural aminoacyl tRNA in which non-natural amino acid is bonded to A, natural aminoacyl tRNA in which natural amino acid is bonded to isoaccepting tRNA to the isoaccepting tRNA, ribosome, enzymes required for tRNA and protein synthesis, etc. And a cell-free protein synthesis system having reduced aminoacyl synthase activity on tRNA, a mixture of amino acids constituting proteins other than natural amino acids, and ribonucleotides such as ATP, GTP, CTP, and UTP. The reagent kit for producing a non-natural amino acid-incorporating protein according to claim 5 .
必要な酵素等を含む無細胞蛋白質合成系、 任意のアイソアクセプティングｔＲＮＡに安定同位体
アミノ酸を結合させた安定同位体標識アミノアシルｔＲ
ＮＡ、 前記でのアイソアクセプティングｔＲＮＡに対する
アイソアクセプティングｔＲＮＡに天然型アミノ酸を結
合させた天然型アミノアシルｔＲＮＡ、 前記での天然型アミノ酸以外の蛋白質構成アミノ酸
混合物、 ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰなどのリボヌクレオ
チド、 とを具備した請求項５記載の非天然型アミノ酸組み込み
蛋白質製造用試薬キット。8. A cell-free protein synthesis system containing ribosomes, tRNAs and enzymes necessary for protein synthesis, and a stable isotope-labeled aminoacyl-tR in which a stable isotope amino acid is bound to any isoaccepting tRNA.
NA, natural aminoacyl-tRNA obtained by binding a natural amino acid to the above-described isoaccepting tRNA, a mixture of amino acids constituting a protein other than the above-mentioned natural amino acid, ribosomes such as ATP, GTP, CTP, and UTP. The reagent kit for producing an unnatural amino acid-incorporated protein according to claim 5 , comprising a nucleotide.
Ａに安定同位体アミノ酸を結合させた安定同位体標識ア
ミノアシルｔＲＮＡ、 前記アイソアクセプティングｔＲＮＡに対するアイソ
アクセプティングｔＲＮＡに天然型アミノ酸を結合させ
た天然型アミノアシルｔＲＮＡ、 リボゾーム、ｔＲＮＡや蛋白質合成に必要な酵素等を
含み、かつでのｔＲＮＡに対するアミノアシル合成酵
素活性を低下させた無細胞蛋白質合成系、 前記での天然型アミノ酸以外の蛋白質構成アミノ酸
混合物、 ＡＴＰ，ＧＴＰ，ＣＴＰ，ＵＴＰなどのリボヌクレオ
チド、 とを具備した請求項５記載の非天然型アミノ酸組み込み
蛋白質製造用試薬キット。9. Any isoaccepting tRN
A stable isotope-labeled aminoacyl-tRNA in which a stable isotope amino acid is bonded to A, natural aminoacyl-tRNA in which a natural amino acid is bonded to an isoaccepting tRNA for the isoaccepting tRNA, a ribosome, an enzyme required for tRNA and protein synthesis A cell-free protein synthesis system having reduced aminoacyl synthase activity for tRNA, a mixture of amino acids constituting proteins other than natural amino acids, and ribonucleotides such as ATP, GTP, CTP, and UTP. The reagent kit for producing a non-natural amino acid-incorporating protein according to claim 5, which is provided .
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６５（１９９０），ｐ．６９３１−６９３５ |
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