JP3269504B2 - Method for producing human serum albumin - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、新規なＡＯＸ１プロモ
ーターを担持するプラスミドを用いるヒト血清アルブミ
ン（以下、ＨＳＡという）の製造方法に関するものであ
る。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for producing human serum albumin (hereinafter referred to as HSA) using a plasmid carrying a novel AOX1 promoter.

【０００２】[0002]

【従来の技術】メタノール資化性酵母はメタノールを炭
素源およびエネルギー源として増殖する。その際、メタ
ノール代謝経路において第１段階でアルコール酸化酵素
（ＡＯＸ、ＥＣ１．１．３．Ｂ）によりメタノールをホ
ルムアルデヒドに酸化する。メタノール資化性酵母の一
種であるピキア酵母（Pichia pastoris ）はゲノム中に
二種のＡＯＸ遺伝子（ＡＯＸ１遺伝子、ＡＯＸ２遺伝
子）を有する。2. Description of the Related Art Methanol-assimilating yeast grows using methanol as a carbon source and an energy source. In this case, methanol is oxidized to formaldehyde by an alcohol oxidase (AOX, EC 1.1.1.3.B) in the first stage in the methanol metabolic pathway. Pichia pastoris, a kind of methanol-assimilating yeast, has two kinds of AOX genes (AOX1 gene and AOX2 gene) in its genome.

【０００３】この内ＡＯＸ１プロモーターとＡＯＸ２プ
ロモーターには活性に大きな差があり、通常ピキア酵母
で発現されているＡＯＸはほとんどＡＯＸ１プロモータ
ーによって転写されたものであることが示されている。
（Molecular and CellularBiology, vol.9, 1316(198
9)）。ＡＯＸはグルコース含有培地ではほとんど発現さ
れないのに対し、メタノール含有培地では細胞中の可溶
化蛋白質の３０％を示すといわれている。ＡＯＸをコー
ドする２種類のＡＯＸ遺伝子のうち、ＡＯＸ１遺伝子の
制御領域であるＡＯＸ１プロモーターは強い活性を持
ち、メタノール資化性酵母の異種蛋白質の発現に用いら
れ、高い産生量を示した。しかしながら、ＡＯＸ２プロ
モーターは活性が弱く、異種蛋白質の発現には適当では
なかった。メタノール資化性酵母の異種蛋白質の発現系
は大量に産物が得られるために、その発現系に強力なプ
ロモーターが求められていた。[0003] Among them, the AOX1 promoter and the AOX2 promoter have a large difference in activity, and it has been shown that AOX usually expressed in Pichia yeast is almost transcribed by the AOX1 promoter.
(Molecular and CellularBiology, vol.9, 1316 (198
9)). AOX is hardly expressed in a glucose-containing medium, whereas it is said that AOX shows 30% of the solubilized protein in cells in a methanol-containing medium. Among the two types of AOX genes encoding AOX, the AOX1 promoter, which is a control region of the AOX1 gene, has strong activity and was used for the expression of a heterologous protein of a methanol-assimilating yeast, and showed high production. However, the AOX2 promoter was weak in activity and was not suitable for expressing heterologous proteins. Since a large amount of products can be obtained from an expression system for a heterologous protein of a methanol-assimilating yeast, a strong promoter has been required for the expression system.

【０００４】最近、そのＡＯＸ遺伝子の調節領域を用い
て異種蛋白質を産生する方法が研究されている（Yeast,
5, 167-177(1989) 、特開平1-128790号公報、同2-1042
90号公報、ヨーロッパ公開公報347928等）。Recently, a method for producing a heterologous protein using the regulatory region of the AOX gene has been studied (Yeast,
5, 167-177 (1989), JP-A-1-128790, 2-1042
No. 90, European Patent Publication 347928, etc.).

【０００５】[0005]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、高レ
ベルにＨＳＡを産生する上で重要な働きを持つ新規なプ
ロモーターを提供すること及びそれを取得する方法を示
すことである。このプロモーターを担持したプラスミド
を用いて形質転換体を取得し、ＨＳＡを産生する系を確
立することにある。An object of the present invention is to provide a novel promoter having an important function in producing HSA at a high level, and to show a method for obtaining the same. It is an object of the present invention to obtain a transformant using a plasmid carrying this promoter and establish a system for producing HSA.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明は、（１）配列番
号１のＤＮＡ配列を有するＡＯＸ１プロモーターおよび
ヒト血清アルブミン遺伝子を担持してなるプラスミドを
構築し、（２）そのプラスミドを宿主に導入して、形質
転換させ、（３）得られた形質転換体を培養して、ヒト
血清アルブミンを産生させること、からなるヒト血清ア
ルブミンの製造方法である。The present invention provides (1) constructing a plasmid carrying the AOX1 promoter having the DNA sequence of SEQ ID NO: 1 and a human serum albumin gene, and (2) introducing the plasmid into a host. And (3) culturing the resulting transformant to produce human serum albumin.

【０００７】（ａ）ＡＯＸ１プロモーター 本発明のプロモーターを取得するための原料細胞として
は、ピキア酵母 ＩＦＯ−１０１３等が例示される。製
法としては、原料細胞から公知の方法（例えば、Ｍａｎ
ｉａｔｉｓ Ｔ．等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉ
ｎｇ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａ
ｂｏｒａｔｏｒｙ ＮＹ（１９８２）等）に準じて染色
体ＤＮＡを抽出し、これを適当な制限酵素（ＥｃｏＲＩ
等に）によって部分消化し、適当なファージベクター
（例えば、λｇｔ１０、ＥＭＢＬ３）に導入した後（図
１にＡＯＸ遺伝子をλｇｔ１０に組み込んだ制限酵素地
図を示す。）、適当な宿主（例えば、大腸菌ＬＥ３９２
株やＷＬ９５株など）を形質転換してヒトジェノミック
ライブラリーを得る。合成プローブによるスクリーニン
グによって陽性クローンを得、目的とするファージＤＮ
Ａを回収する。ファージＤＮＡを適当な制限酵素（Ｂａ
ｍＨＩ、ＨｉｎｄIII 等）によって消化し、適当なプラ
スミドベクター（例えば、ｐＵＣ１９など）に導入して
宿主（例えば大腸菌ＪＭ１０９株）を形質転換し、目的
とするクローンを得る。(A) AOX1 promoter As a raw material cell for obtaining the promoter of the present invention, Pichia yeast IFO-1013 and the like are exemplified. As a production method, a known method (for example, Man
iatis T .; Etc., Molecular cloni
ng, Cold Spring Harbor La
chromosome DNA is extracted according to the method described in “Borory NY (1982)”, and is extracted with an appropriate restriction enzyme (EcoRI).
After partial digestion with an appropriate phage vector (eg, λgt10, EMBL3) (FIG. 1 shows a restriction enzyme map in which the AOX gene has been incorporated into λgt10), an appropriate host (eg, E. coli LE392)
Strain or WL95 strain) to obtain a human genomic library. A positive clone was obtained by screening with a synthetic probe, and the desired phage DN
Collect A. The phage DNA was ligated with an appropriate restriction enzyme (Ba
mHI, HindIII, etc.), and transfected into an appropriate plasmid vector (eg, pUC19) to transform a host (eg, Escherichia coli JM109 strain) to obtain a desired clone.

【０００８】ＤＮＡの塩基配列は公知の方法（例えば、
キロシークエンス法、マキサム・ギルバート法、ダイデ
オキシ法）によって行われる。本発明のプロモーターを
含む塩基配列は、ＡＯＸ１遺伝子転写開始点の５′側上
流域に存在し、約２４０ｂｐを有している。その塩基配
列はキロシークエンス法によれば配列番号１に示す通り
である。[0008] The nucleotide sequence of DNA can be determined by a known method (for example,
Kilosequence method, maxam Gilbert method, dideoxy method). The nucleotide sequence containing the promoter of the present invention exists in the 5 'upstream region of the AOX1 gene transcription initiation site, and has about 240 bp. Its nucleotide sequence is as shown in SEQ ID NO: 1 according to the kilosequence method.

【０００９】尚、特開昭６１−１７３７８１号公報に開
示されたＡＯＸ１プロモーターとはＤＮＡ配列が異な
る。表１にその比較を示す。The DNA sequence is different from that of the AOX1 promoter disclosed in JP-A-61-173781. Table 1 shows the comparison.

【００１０】[0010]

【表１】 [Table 1]

【００１１】（ｂ）プラスミド 本発明のプラスミドは（ａ）のＡＯＸ１プロモーターを
担持してなる。また、シグナル配列、ＨＳＡ遺伝子、タ
ーミネーター、相同領域、マーカー遺伝子、宿主中で複
製可能な自律性複製配列等を担持していてもよい。ＨＳ
Ａ遺伝子は公知のものであれば特に制限されない。同一
または相同でもよく、具体的には特開昭５８−５６６８
４号、同６２−２９９８５号の各公報等に開示されてい
る。(B) Plasmid The plasmid of the present invention carries the AOX1 promoter of (a). Further, it may carry a signal sequence, an HSA gene, a terminator, a homologous region, a marker gene, an autonomously replicating sequence capable of replicating in a host, and the like. HS
The A gene is not particularly limited as long as it is known. They may be the same or homologous, and are specifically described in JP-A-58-5668.
No. 4, No. 62-29985, and the like.

【００１２】シグナル遺伝子は、酵母インベルターゼ、
α−ファクター遺伝子のような酵母由来のもの、ＨＳＡ
のシグナル配列またはその誘導体（特開平２−１６７０
９５号）、人工的に創案したシグナル配列（特開平１−
２４０１９１号）等を用いることができる。ターミネー
ターとしてはＡＯＸ１ターミネーター等を用いることが
できる。The signal gene is yeast invertase,
HSA derived from yeast such as α-factor gene
Signal sequence or derivative thereof (JP-A-2-1670)
No. 95), an artificially created signal sequence (Japanese Unexamined Patent Publication No.
240191) can be used. As the terminator, an AOX1 terminator or the like can be used.

【００１３】相同領域はＨＩＳ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ
２、ＡＲＧ４等が例示される。マーカー遺伝子は抗生物
質耐性遺伝子や栄養要求性相補遺伝子等が用いられる。
抗生物質としてはシクロヘキシミド、Ｇ−４１８、クロ
ラムフェニコール、ブレオマイシン、ハイグロマイシン
等が例示される。栄養要求性相補遺伝子としては、ＨＩ
Ｓ４、ＵＲＡ３、ＬＥＵ２、ＡＲＧ４等が挙げられる。The homologous regions are HIS4, URA3, LEU
2, ARG4 and the like. As the marker gene, an antibiotic resistance gene, an auxotrophic complementary gene, or the like is used.
Examples of the antibiotic include cycloheximide, G-418, chloramphenicol, bleomycin, hygromycin and the like. The auxotrophic complement gene includes HI
S4, URA3, LEU2, ARG4 and the like.

【００１４】転写ユニットは５′側から３′側に向かっ
て、ＡＯＸ１プロモーター、シグナルペプチド遺伝子、
ＨＳＡ遺伝子、ターミネーターの順に配置される。本発
明のプラスミドは通常の遺伝子工学技術を用いて調製す
ることができる。 （ｃ）形質転換体 本発明の形質転換体は（ｂ）のプラスミドを導入してな
る。The transcription unit is composed of AOX1 promoter, signal peptide gene,
The HSA gene and the terminator are arranged in this order. The plasmid of the present invention can be prepared using ordinary genetic engineering techniques. (C) Transformant The transformant of the present invention is obtained by introducing the plasmid of (b).

【００１５】本発明の宿主は酵母が好ましく、より好ま
しくはピキア酵母（Pichia pastoris ）である。具体的
にはＧＴＳ１１５（ＮＲＲＬ寄託番号Ｙ−１５８５１）
等が例示される。宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の
方法、例えば、リン酸カルシウム沈殿法、プロトプラス
トポリエチレン融合法、エレクトロポレーション法など
が使用でき、必要な形質転換体を選択する。[0015] The host of the present invention is preferably yeast, and more preferably Pichia pastoris. Specifically, GTS115 (NRRL accession number Y-15851)
Etc. are exemplified. Transformation of a host cell (yeast) can be performed by a known method, for example, a calcium phosphate precipitation method, a protoplast polyethylene fusion method, an electroporation method, etc., and a necessary transformant is selected.

【００１６】プラスミドの宿主細胞中での存在の様式
は、染色体中に挿入されて、あるいは置換されて組み込
まれる。または、プラスミド状態で存在していてもよ
い。宿主に導入される外来遺伝子のコピー数は１コピー
でも複数コピーでもよい。また、他のプロモーターでＨ
ＳＡを発現させるプラスミドと同じ菌株内に存在させて
も構わない。The mode of presence of the plasmid in the host cell may be integrated into the chromosome by insertion or replacement. Alternatively, it may exist in a plasmid state. The copy number of the foreign gene to be introduced into the host may be one copy or plural copies. In addition, H
It may be present in the same strain as the plasmid expressing SA.

【００１７】（ｄ）ＨＳＡの製造方法 （ｃ）で得られた形質転換株は、宿主細胞の自体公知の
培地で培養する。培地としては０．０１〜５％メタノー
ルを含有したＹＮＢ液体培地〔０．７％ YeastNitrogen
Base(Difco 社) 〕、および０．０１〜５％メタノール
を含有したＹＰ培地〔１％イーストエキストラクト（Di
fco 社) 、２％ポリペプトン（大五栄養社）〕などが例
示される。(D) Method for producing HSA The transformant obtained in (c) is cultured in a medium known per se for host cells. As a medium, a YNB liquid medium containing 0.01 to 5% methanol [0.7% YeastNitrogen]
Base (Difco)], and a YP medium containing 0.01 to 5% methanol [1% yeast extract (Di
fco), 2% polypeptone (Daigo Nutrition).

【００１８】培養は、通常１５〜４３℃（好適には３０
℃程度）で２０〜３６０時間程度行い、必要により通気
や攪拌を加えることもできる。培養後、培養上清から、
自体公知の方法、例えば膜濾過、イオン交換法、疎水ク
ロマトグラフィー、アフィニティクロマトグラフィー、
ゲル濾過分画法などによりＨＳＡを精製する。The culture is usually carried out at 15 to 43 ° C. (preferably 30 to
C.) for about 20 to 360 hours, and if necessary, ventilation or stirring may be added. After culturing, from the culture supernatant,
Methods known per se, such as membrane filtration, ion exchange, hydrophobic chromatography, affinity chromatography,
HSA is purified by gel filtration fractionation or the like.

【００１９】[0019]

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定
されるものではない。なお、本発明において多くの技
法、反応および分析方法は当業界においてよく知られて
いる。特に断らない限り、全ての酵素は商業的供給源、
例えば、宝酒造等から入手することができる。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to Examples and Experimental Examples, but the present invention is not limited thereto. In the present invention, many techniques, reactions, and analytical methods are well known in the art. Unless otherwise noted, all enzymes are commercial sources,
For example, it can be obtained from Takara Shuzo.

【００２０】酵素反応のための緩衝液及び反応条件は特
に断らない限り各酵素の製造元の推奨に従って使用し
た。プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、プラーク
ハイブリダイゼーション法、及び電気泳動法は「モレキ
ュラークローニング」コールドスプリングハーバーラボ
ラトリー〔「Moleculer Cloning 」Cold Spring Harbor
Laboratory(1982)〕に記載されている方法により行っ
た。Buffers and reaction conditions for enzyme reactions were used according to the manufacturer's recommendations unless otherwise noted. Transformation, plaque hybridization, and electrophoresis of Escherichia coli using a plasmid are described in "Moleculer Cloning" (Cold Spring Harbor)
Laboratory (1982)].

【００２１】実施例１−１ ピキア酵母ＡＯＸ１遺伝子
のクローニングとそのプロモーターを用いたＨＳＡの生
産 使用した酵母株 ピキア酵母ＩＦＯ−０９４８と同ＩＦＯ−１０１３と
は、（財）発酵研究所より入手した。ピキア酵母ＡＴＣ
Ｃ−２６０４とピキア酵母ＡＴＣＣ−２８４８５とはＡ
ＴＣＣより入手した。ピキア酵母ＧＴＳ１１５（ｈｉｓ
４）はピキア酵母における形質転換用宿主として使用し
た。Example 1-1 Cloning of Pichia yeast AOX1 gene and production of HSA using its promoter The yeast strains Pichia yeast IFO-0948 and IFO-1013 used were obtained from the Fermentation Research Institute. Pichia yeast ATC
What is C-2604 and Pichia yeast ATCC-28485?
Obtained from TCC. Pichia yeast GTS115 (his
4) was used as a host for transformation in Pichia yeast.

【００２２】ＡＯＸ１遺伝子のクローニング Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ等の方法（Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ，
Ｒ．Ｉｎ ”ＤＮＡ ｃｌｏｎｉｎｇ”，３８，６７５
（１９７４））に従って、ピキア酵母ＩＦＯ−１０１３
より染色体ＤＮＡを抽出した。その他のＤＮＡの取り扱
いは、一般的な方法（例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓ Ｔ．
等、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ）に従った。ＡＯＸ１遺
伝子のスクリーニングには、配列番号２及び３の２種類
のオリゴヌクレオチドプローブを使用した。Cloning of AOX1 gene A method such as Rothstein (Rothstein,
R. In "DNA cloning", 38,675.
(1974)) according to Pichia yeast IFO-1013.
Chromosomal DNA was extracted therefrom. Other handling of DNA is performed by a general method (for example, Maniatis T. et al.
Etc., Molecular cloning, a lab
(original manual). For screening of the AOX1 gene, two types of oligonucleotide probes of SEQ ID NOs: 2 and 3 were used.

【００２３】ＡＯＸ１遺伝子欠損株の作製 ピキア酵母ＩＦＯ−１０１３よりクローニングしたＡＯ
Ｘ１遺伝子を用いて、ピキア酵母ＧＴＳ１１５内在性の
ＡＯＸ１遺伝子を破壊した。ＩＦＯ−１０１３由来ＡＯ
Ｘ１遺伝子を制限酵素ＰｓｔＩとＸｂａＩとで消化した
後、約３ｋｂのＤＮＡ断片をプラスミドｐＵＣ１９にサ
ブクローニングした。さらに、このプラスミドのＡＯＸ
１遺伝子上に存在するＳａｌＩ部位に３ｋｂのパン酵母
由来ＳＵＣ２遺伝子を挿入した。得られたプラスミドを
用いてピキア酵母ＧＴＳ１１５を形質転換した。形質転
換体の選択はシュークロース資化能の獲得により行っ
た。Preparation of AOX1 gene-deficient strain AO cloned from Pichia yeast IFO-1013
The AOX1 gene endogenous to the Pichia yeast GTS115 was disrupted using the X1 gene. AO derived from IFO-1013
After digesting the X1 gene with restriction enzymes PstI and XbaI, a DNA fragment of about 3 kb was subcloned into plasmid pUC19. Furthermore, the AOX of this plasmid
A 3 kb baker's yeast-derived SUC2 gene was inserted into the SalI site present on one gene. Using the obtained plasmid, Pichia yeast GTS115 was transformed. Transformants were selected by obtaining sucrose utilization ability.

【００２４】結果 （財）発酵研究所及びＡＴＣＣより入手した各ピキア酵
母、ＩＦＯ−０９４８、ＩＦＯ−１０１３、ＡＴＣＣ−
２６０４、ＡＴＣＣ−２８４８５の４株について、その
メタノール資化能をメタノールを単一炭素源とする最小
培地における増殖度を指標に比較した。これら４株の増
殖はグルコースやエタノールを炭素源とする培地では差
がなかったが、メタノール含有培地ではピキア酵母ＩＦ
Ｏ−１０１３が他の３株より増殖が速く、かつ最終菌体
濃度も最も高かった。この結果よりピキア酵母ＩＦＯ−
１０１３はメタノール資化能が高くアルコールオキシダ
ーゼ発現量が多い株であると判断した。Results Each Pichia yeast obtained from the Fermentation Research Institute and the ATCC, IFO-0948, IFO-1013, ATCC-
For 4 strains 2604 and ATCC-28485, the ability to assimilate methanol was compared with the index of growth in a minimum medium using methanol as a single carbon source as an index. The growth of these four strains was not different in a medium containing glucose or ethanol as a carbon source, but in a medium containing methanol, Pichia yeast IF
O-1013 grew faster than the other three strains, and had the highest final cell concentration. From this result, Pichia yeast IFO-
1013 was determined to be a strain having a high methanol utilization capacity and a high expression level of alcohol oxidase.

【００２５】ピキア酵母ＩＦＯ−１０１３よりＡＯＸ１
遺伝子をクローニングするため、この株より染色体ＤＮ
Ａを抽出した。抽出した染色体ＤＮＡを制限酵素Ｅｃｏ
ＲＩで消化後ファージベクターλｇｔ１０に導入し、ピ
キア酵母の染色体ＤＮＡライブラリーを作製した。ライ
ブラリーの約５×１０⁵ クローンについてプラークハイ
ブリダイゼーションによるＡＯＸ１遺伝子のスクリーニ
ングを行った。ハイブリダイゼーションプローブとして
は、既に報告されているピキア酵母のアルコールオキシ
ダーゼのアミノ酸配列を基に、そのＮ末端領域とＣ末端
領域とにそれぞれ相補する２種類の合成オリゴヌクレオ
チドを使用した（配列番号２及び３）。ハイブリダイゼ
ーションの結果、４個のポジティブクローンが得られ
た。これら４クローンのうち最も大きなＤＮＡインサー
ト（５．７ｋｂ）を有するクローンλＭＲ１０１につい
てより詳細に検討した。上述のハイブリダイゼーション
プローブを用いたサザーンブロット解析とＤＮＡ塩基配
列の決定より、クローンλＭＲ１０１が完全長のＡＯＸ
１遺伝子を含むことが明らかとなった。このＡＯＸ１遺
伝子の塩基配列は配列番号１の３′末端に連結されてい
た。ＩＦＯ−１０１３株のＡＯＸ１遺伝子のＤＮＡ塩基
配列を配列番号２として示す。このＡＯＸ１遺伝子は１
９８９ｂｐのコード領域を有し、５′−非コード領域内
ＡＴＧ上流１５４〜１５９ｂｐの位置（配列番号１の８
５〜９０番目の塩基）にはＴＡＴＡ（ＴＡＴＡＡＡ）ボ
ックス配列が存在した。AOX1 is obtained from Pichia yeast IFO-1013.
To clone the gene, chromosomal DN
A was extracted. The extracted chromosomal DNA was converted to the restriction enzyme Eco.
After digestion with RI, the resultant was introduced into a phage vector λgt10 to prepare a chromosomal DNA library of Pichia yeast. About 5 × 10 ⁵ clones of the library were screened for AOX1 gene by plaque hybridization. As the hybridization probe, two types of synthetic oligonucleotides complementary to the N-terminal region and the C-terminal region based on the previously reported amino acid sequence of Pichia yeast alcohol oxidase were used (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 2). 3). As a result of the hybridization, four positive clones were obtained. The clone λMR101 having the largest DNA insert (5.7 kb) of these four clones was examined in more detail. From the Southern blot analysis using the above-mentioned hybridization probe and the determination of the DNA base sequence, clone λMR101 was found to have a full-length AOX.
It was found to contain one gene. The nucleotide sequence of this AOX1 gene was linked to the 3 ′ end of SEQ ID NO: 1. The DNA base sequence of the AOX1 gene of IFO-1013 strain is shown as SEQ ID NO: 2. This AOX1 gene is 1
It has a coding region of 989 bp and has a position of 154 to 159 bp upstream of ATG in the 5'-noncoding region (8 of SEQ ID NO: 1).
The 5th to 90th bases) had a TATA (TATAAA) box sequence.

【００２６】ピキア酵母でＨＳＡの分泌発現を試みるた
めに、ＡＯＸ１遺伝子のプロモーター領域を含む１．９
ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＡｓｕII断片をピキア酵母形質転換
用プラスミド上にサブクローニングし、さらにＨＳＡｃ
ＤＮＡをＡＯＸ１遺伝子のプロモーターの下流に挿入し
た。このＨＳＡ発現プラスミドを用いてピキア酵母ＧＴ
Ｓ１１５とその内在性ＡＯＸ１遺伝子の欠損株であるピ
キア酵母ＧＴＳ１２０とを形質転換した。形質転換体の
選択は、ＨＳＡ発現用プラスミド内に含まれるＨＩＳ４
遺伝子の導入によるヒスチジン要求性の消失により行っ
た。得られたピキア酵母形質転換体各１０株をメタノー
ル含有培地を用いて３０℃で２日間培養し、その培養上
清をＳＤＳゲル電気泳動分析と抗ＨＳＡ抗体を用いたウ
エスタンブロット分析にかけた。その結果、いずれの株
においても天然型ＨＳＡと同じ分子量である６７ｋＤａ
の大きさのところにメインバンドが観察され、これら形
質転換体であるＨＳＡが発現し、培地中に分泌されてい
ることが示された。一方、グルコースを含む培地で培養
した場合、いずれの形質転換体においてもＨＳＡは全く
検出されず、ＩＦＯ−１０１３株由来ＡＯＸ１プロモー
ター活性はグルコース存在下では抑制されることが判明
した。ピキア酵母ＧＴＳ１１５とＧＴＳ１２０との形質
転換体よりＨＳＡの生産量が最も多いクローンをそれぞ
れ選び、これをピキア酵母ＧＣＰ１０１及びＧＣＰ１０
４と命名した。両株のＨＳＡの生産量はフラスコ培養で
はともに８０ｍｇ／Ｌであり、差は認められなかった。In order to attempt the secretory expression of HSA in Pichia yeast, 1.9 containing the promoter region of the AOX1 gene was used.
The EcoRI-AsuII fragment of kb was subcloned into a plasmid for transforming Pichia yeast, and
DNA was inserted downstream of the promoter of the AOX1 gene. Using this HSA expression plasmid, Pichia yeast GT
S115 and Pichia yeast GTS120, a strain deficient in the endogenous AOX1 gene, were transformed. Transformants were selected using HIS4 contained in the HSA expression plasmid.
Histidine auxotrophy was lost by gene transfer. Each 10 strains of the resulting Pichia yeast transformants were cultured in a medium containing methanol at 30 ° C. for 2 days, and the culture supernatant was subjected to SDS gel electrophoresis analysis and Western blot analysis using an anti-HSA antibody. As a result, in all the strains, the same molecular weight of 67 kDa as that of native HSA
The main band was observed at the size of, indicating that these transformants, HSA, were expressed and secreted into the medium. On the other hand, when cultured in a medium containing glucose, no HSA was detected in any of the transformants, and it was found that the activity of the AOX1 promoter derived from the IFO-1013 strain was suppressed in the presence of glucose. From the transformants of Pichia yeasts GTS115 and GTS120, clones each producing the highest amount of HSA were selected, and the clones were selected from Pichia yeasts GCP101 and GCP10.
No. 4. Both strains produced 80 mg / L of HSA in flask culture, and no difference was observed.

【００２７】実施例１−２（ピキア酵母を用いたＨＳＡ
の高密度菌体培養） 使用菌株 ピキア酵母ＧＣＰ１０４およびピキア酵母ＧＣＰ１０１
を使用した。両者ともＨＳＡ遺伝子のプロモーターとし
てピキア酵母ＩＦＯ−１０１３由来のＡＯＸ１プロモー
ターを使用した。Example 1-2 (HSA using Pichia yeast)
High-density cell culture of Pichia yeast GCP104 and Pichia yeast GCP101
It was used. In both cases, the AOX1 promoter derived from Pichia yeast IFO-1013 was used as the promoter of the HSA gene.

【００２８】培地組成 ＦＭ−２１（Ｓｒｅｅｋｒｉｓｈｎａ，Ｋ．，ｅｔ ａ
ｌ．：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８，４１１７（１
９８９））培地を使用した。本培地の組成を表２及び表
３に示した。Medium composition FM-21 (Sleeklishna, K., et a)
l. : Biochemistry, 28, 4117 (1
989)) The medium was used. The composition of this medium is shown in Tables 2 and 3.

【００２９】[0029]

【表２】 [Table 2]

【００３０】[0030]

【表３】 [Table 3]

【００３１】培養方法 凍結菌株を２％グルコースを炭素源とするＹＮＢ培地
（Ｄｉｆｃｏ社製）１００ｍＬに植菌後、３０℃にて２
４時間培養したものをＦＭ−２１培地１Ｌ（リットル）
を含む３Ｌ容のジャーファーメンター（バイオマスター
Ｄ型、エイブル社製）に植菌し、通気攪拌培養を行っ
た。培養温度は３０℃、通気量を２Ｌ／分に設定し、攪
拌速度の上限は１５００ｒｐｍとした。培養中のｐＨは
５．８５を保持するようアンモニア水にて定値制御し
た。消泡は消泡剤（Ａｄｅｃａｎｏｌ、旭電化工業社
製）を回分培養開始時に０．３０ｍＬ／Ｌ−ｂｒｏｔｈ
添加し、その後は必要に応じて少量添加することで実施
した。ＨＳＡの産生を誘導するため、ＦＭ−２１培地中
のグリセロールが消費された時点よりメタノールを主成
分とするフィード培地の添加を開始した。フィード培地
の添加量は培地中のメタノール濃度が１％を超えない範
囲に調節した。Culture method [0031] After inoculating the frozen strain into 100 mL of a YNB medium (manufactured by Difco) using 2% glucose as a carbon source, the culture was incubated at 30 ° C for 2 hours.
After culturing for 4 hours, 1 liter (liter) of FM-21 medium
Was inoculated into a 3 L-volume jar fermenter (Biomaster D type, manufactured by Able Inc.) and cultured with aeration and stirring. The culture temperature was set at 30 ° C., the aeration rate was set at 2 L / min, and the upper limit of the stirring speed was set at 1500 rpm. The pH during the culture was controlled at a constant value with aqueous ammonia so as to maintain 5.85. The defoaming was performed using an antifoaming agent (Adecanol, manufactured by Asahi Denka Kogyo KK) at the time of starting batch culture at 0.30 mL / L-broth.
This was carried out by adding a small amount as necessary. In order to induce the production of HSA, the addition of a feed medium containing methanol as a main component was started at the time when the glycerol in the FM-21 medium was consumed. The amount of the feed medium was adjusted so that the methanol concentration in the medium did not exceed 1%.

【００３２】菌体濃度の測定 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、蒸留水で適
当に希釈したのち、分光光度計（ＵＶ２４０、島津社
製）を用いて５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。吸
光度から乾燥菌体重量への変換は予め求めておいた較正
曲線により実施した。Measurement of Cell Concentration The culture solution was sampled at an arbitrary culturing time and diluted appropriately with distilled water, and the absorbance at 540 nm was measured using a spectrophotometer (UV240, manufactured by Shimadzu Corporation). The conversion from the absorbance to the dry cell weight was performed using a calibration curve determined in advance.

【００３３】分泌されたＨＳＡの定量 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、１５０００
ｒｐｍ、５分間遠心後、得られた上清を用いてマンシー
ニ法（ＬＣパルチゲン・アルブミン、ベーリングベルケ
社製）により測定した。 培地中のメタノール濃度の定量 任意の培養時間で培養液をサンプリングし、１５０００
ｒｐｍ、５分間遠心後、得られた上清をウルトラフリー
Ｃ３ＨＶにより清澄濾過後ＨＰＬＣによる定量分析を実
施した。Quantification of secreted HSA The culture solution was sampled at an arbitrary culture time, and 15,000
After centrifugation at 5 rpm for 5 minutes, the obtained supernatant was measured by the Mancini method (LC Partigin albumin, manufactured by Behringberge). Determination of methanol concentration in culture medium
After centrifugation at 5 rpm for 5 minutes, the obtained supernatant was clarified and filtered by Ultrafree C3HV, and then quantitative analysis by HPLC was performed.

【００３４】 カラム：ＷＡＴＥＲＳ Ｓｕｇａｒ ｐａｋ−Ｃａ カラム温度：８０℃ 移動相：０．０２％ ＮａＮ₃ 検出：示差屈折計 結果 ＦＭ−２１培地を使用したピキア酵母ＧＣＰ１０４の培
養結果を図２に示した。○は、該培地におけるメタノー
ル濃度（ｖ／ｖ）を示し、□は、該培地中に分泌された
ＨＳＡ濃度であって、マンシーニ法により求めた値であ
る。●（ＤＣＷ）は、培地１Ｌ当たりの乾燥細胞重量を
示す。Column: WATERS Sugar pak-Ca Column temperature: 80 ° C. Mobile phase: 0.02% NaN ₃ detection: Differential refractometer Results The results of culturing Pichia yeast GCP104 using FM-21 medium are shown in FIG. ○ indicates the concentration of methanol (v / v) in the medium, and □ indicates the concentration of HSA secreted into the medium, which was determined by the Mancini method. ● (DCW) indicates the dry cell weight per 1 L of the medium.

【００３５】この時、ＨＳＡ産生量は約１．４ｇ／Ｌで
あった。同じ条件にてピキア酵母ＧＣＰ１０１を培養し
た結果を図３に示した。本菌株は、メタノール消費速度
が高いため、培地中へのメタノールの蓄積はほとんど認
められなかった。また、菌体増殖も極めて良好であり、
ＤＣＷが１１０ｇ／Ｌ以上の高密度培養が可能であっ
た。しかし、ＨＳＡ産生量は約１．２ｇ／Ｌにとどまっ
た。ＧＣＰ１０１の場合、ＧＣＰ１０４に比べて菌体濃
度は１．５倍に上昇しているにもかかわらず、ＨＳＡ産
生量は低迷した。At this time, the amount of HSA produced was about 1.4 g / L. The result of culturing Pichia yeast GCP101 under the same conditions is shown in FIG. Since this strain had a high methanol consumption rate, almost no methanol was accumulated in the medium. In addition, bacterial growth is extremely good,
High-density culture with a DCW of 110 g / L or more was possible. However, HSA production was only about 1.2 g / L. In the case of GCP101, the production of HSA was sluggish despite the fact that the bacterial cell concentration was 1.5 times higher than that of GCP104.

【００３６】そこで、ＧＣＰ１０１を使用し、グリセロ
ールが消費された以降の酸素供給速度を低下させること
で、培地中のメタノール濃度を１％程度に保持しながら
培養した。結果を図４に示した。ＧＣＰ１０１を使用し
ているにもかかわらず、菌体量は、ＤＣＷで７５ｇ／Ｌ
程度までしか増加しなかったが、ＨＳＡ産生量は１．４
ｇ／Ｌに上昇することが観察された。Therefore, the culture was carried out using GCP101 while maintaining the methanol concentration in the medium at about 1% by decreasing the oxygen supply rate after glycerol was consumed. The results are shown in FIG. Despite the use of GCP101, the bacterial mass was 75 g / L in DCW.
HSA production increased to 1.4
g / L was observed.

【００３７】実施例１−３ 粗精製法のスケールアップ
検討 粗精製法に用いる培養液の規模は１００Ｌに相当する量
とした。検討を重ねた結果、以下に示した粗精製工程が
最適であると考えられた。 圧搾工程 圧搾工程に関しては培養液の圧入、圧搾時の圧力に注意
を払って培養上清をできるだけ多く回収し、なおかつ透
明性の良い濾過液を効率良く得られる条件を検討した。Example 1-3 Examination of Scale-Up of Rough Purification Method The scale of the culture solution used for the rough purification method was set to an amount corresponding to 100 L. As a result of repeated studies, the following crude purification process was considered to be optimal. Squeezing Step In the squeezing step, the conditions under which the culture supernatant was collected as much as possible while paying attention to the pressurization of the culture solution and the pressure at the time of squeezing, and the efficiency of obtaining a highly transparent filtrate were examined.

【００３８】膜処理工程−１ ０．２２μｍのフィルターを用いた検討を行った。さら
にこの工程において同時に分画分子量が３０万の限外濾
過膜を用いた検討を行った。濾過方法はタンジェンシャ
ルフロー法を用い、処理容量の増加に応じて膜面積は平
膜を積み重ねることで１．８４ｍ² とした。濃縮は分画
分子量が１万の限外濾過膜を用いて膜面積２．３ｍ² の
タンジェンシャルフロー法で行った。Membrane treatment step-1 A study was performed using a 0.22 μm filter. Further, in this step, the use of an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 300,000 was examined simultaneously. The filtration method used was a tangential flow method, and the membrane area was 1.84 m ² by stacking flat membranes in accordance with the increase in the processing capacity. Concentration was performed by a tangential flow method with a membrane area of 2.3 m ² using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 10,000.

【００３９】加熱処理工程 培養上清中に６０℃、３時間の加熱処理を行った。加熱
処理時のボリュームは培養上清の約１０〜１５倍濃縮し
た値に相当する約５Ｌとした。 膜処理工程−２ 膜処理の条件は膜処理工程−１と同じとした。即ち、分
画分子量３０万の限外濾過膜を用いて高分子物質を除去
し、ダイヤフィルトレーションを行ってＨＳＡを回収し
た後、通過したＨＳＡを分画分子量１万の限外濾過膜を
用いて濃縮を行った。用いた限外濾過膜の膜面積も膜処
理工程−１と同じとした。Heat Treatment Step The culture supernatant was subjected to a heat treatment at 60 ° C. for 3 hours. The volume at the time of the heat treatment was about 5 L corresponding to a value obtained by concentrating the culture supernatant about 10 to 15 times. Membrane treatment step-2 The conditions of the film treatment were the same as in the membrane treatment step-1. That is, the high molecular substance is removed using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 300,000, and HSA is recovered by performing a diafiltration. And concentrated. The membrane area of the ultrafiltration membrane used was also the same as in the membrane treatment step-1.

【００４０】陽イオン交換クロマトグラフィー ＨＳＡをゲルに吸着させ、洗浄して不純物を除去した
後、ＨＳＡを溶出する手法を用いた。そのため、ＨＳＡ
の等電点以下のかなり低いｐＨ領域（ｐＨ４〜４．６）
で処理する必要があり、Ｓタイプ（強酸系でイオン交換
基がスルフォ基であるもの）の交換体を用いて陽イオン
クロマトグラフィーの検討を行った。交換体のベッドボ
リュームは５Ｌとした。Cation Exchange Chromatography A method was employed in which HSA was adsorbed on a gel and washed to remove impurities, and then HSA was eluted. Therefore, HSA
PH range considerably lower than the isoelectric point of (pH 4-4.6)
The cation chromatography was examined using an S-type (strong acid-based ion exchange group having a sulfo group) exchanger. The bed volume of the exchanger was 5 L.

【００４１】結果 圧搾工程 圧入は経時的に圧力を上昇させて最終的に２．０Ｋｇ／
ｍ² まで圧力を上昇させた。圧入後の圧搾は経時的に圧
力を上昇させて、最終的に５．０Ｋｇ／ｍ² の圧力で行
うことで良好な結果がえられた。圧搾された酵母のフィ
ルターケーキは含水率も低く、濾布からの剥がれも良好
であった。この条件下での圧搾により培養液の約６０〜
６５％が濾過液として回収できた。圧入に要する時間は
約１時間であり、圧搾に関しても約１〜２時間程度が良
かった。Results Pressing Step Pressing increased the pressure over time and finally 2.0 kg /
The pressure was raised up to m ^2. Good results were obtained by performing squeezing after press-fitting by increasing the pressure over time and finally performing the pressing at a pressure of 5.0 kg / m ² . The pressed yeast filter cake had a low water content and good peeling from the filter cloth. By pressing under these conditions, about 60 to
65% could be recovered as a filtrate. The time required for press-fitting was about 1 hour, and about 1 to 2 hours for squeezing was good.

【００４２】膜処理工程−１ ＨＰＬＣ分析の結果から、分画分子量が３０万の限外濾
過膜で高分子物質が大部分除去されており、また、分画
分子量が１万の限外濾過膜を用いて濃縮する過程で、大
部分の低分子物質も除去されていることが判った。 加熱処理工程 安定化剤（ＨＳＡの８倍量の長鎖脂肪酸、例えば、オレ
イン酸あるいはパルミチン酸等）を添加すること、およ
び設定温度（６０℃）への到達に要する時間をできるだ
け短時間とすることで（３０分以内）、ＨＳＡの回収率
に関しては良好な結果が得られた。また、プロテアーゼ
も完全に不活性化されることが確認され、ＨＰＬＣ分析
の結果を見ても以降の工程においてＨＳＡの分解物が増
加する傾向は認められず、ＨＳＡは加熱処理に対して安
定であった。Membrane treatment step-1 From the result of HPLC analysis, it was found that most of the high molecular substances were removed by the ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 300,000 and that the ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 10,000 was It was found that most of the low molecular weight substances were also removed in the process of concentrating using. Heat treatment step Add a stabilizer (8 times longer chain fatty acid than HSA, for example, oleic acid or palmitic acid) and minimize the time required to reach the set temperature (60 ° C.). Thus (within 30 minutes), good results were obtained with respect to the recovery rate of HSA. In addition, it was confirmed that the protease was completely inactivated, and the results of HPLC analysis did not show a tendency for HSA degradation products to increase in the subsequent steps, indicating that HSA was stable to heat treatment. there were.

【００４３】膜処理工程−２ 再度分画分子量が３０万の限外濾過膜を用いた高分子物
質の除去を行った。この工程で高分子物質は大部分が除
去された。ダイヤフィルトレーションを行った後の溶液
の濃縮は、分画分子量が１万の限外濾過膜を用いて行っ
たが、最終的なＨＳＡ回収率もほぼ１００％と良好であ
った。Membrane treatment step-2 The high molecular substance was removed again using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut off of 300,000. Most of the polymer material was removed in this step. The concentration of the solution after the diamond filtration was performed using an ultrafiltration membrane having a molecular weight cut-off of 10,000, and the final HSA recovery was as good as almost 100%.

【００４４】陽イオン交換クロマトグラフィー 培養終了後の培養上清の分析結果から、培養上清中には
酵母が産生、分泌したと思われる糖質が含まれているこ
とが、判明した。酵母が産生する糖質の量は、産生され
るＨＳＡの量と同等かそれ以上であることも判明した。
この糖質の分析を行ったところ、大部分は多糖の形で存
在しており、さらに、多糖の大部分はマンナンまたはホ
スホマンナンであろうと推定される中性糖及び酸性糖で
あった。これらの多糖を分離する目的でＨＳＡの等電点
以下（ｐＨ４．０〜４．６）でクロマト処理を行った。
即ち、陽イオン交換体にＨＳＡを吸着させて、酸性糖お
よび中性糖は陽イオン交換体に吸着しないことを利用し
て多糖の洗浄除去を行った。From the results of analysis of the culture supernatant after the completion of the cation exchange chromatography culture, it was found that the culture supernatant contained carbohydrates which are considered to be produced and secreted by yeast. It was also found that the amount of carbohydrate produced by yeast was equal to or more than the amount of HSA produced.
Analysis of this carbohydrate showed that most of it was in the form of polysaccharides, and that most of the polysaccharides were neutral sugars and acidic sugars that were presumed to be mannan or phosphomannan. For the purpose of separating these polysaccharides, a chromatographic treatment was performed below the isoelectric point of HSA (pH 4.0 to 4.6).
That is, HSA was adsorbed to the cation exchanger, and the polysaccharide was washed and removed by utilizing the fact that acidic sugars and neutral sugars did not adsorb to the cation exchanger.

【００４５】以上の各工程の収率等の精製結果の一例を
表４に示した。Table 4 shows an example of the purification results such as the yield in each of the above steps.

【００４６】[0046]

【表４】 [Table 4]

【００４７】実施例１−４ 高度精製法の検討 １−３で検討した粗精製が終了した段階では、ＨＰＬＣ
分析からＨＳＡ以外の酵母由来不純物はかなり除去され
ていることが判るが、ＨＳＡのダイマーおよび分解物が
認められる。これらの中で、特にＨＳＡの分解物を除去
する目的で疎水結合クロマトグラフィー（フェニルセル
ロファインゲル使用）を検討した。Example 1-4 Examination of Advanced Purification Method At the stage where the crude purification examined in 1-3 was completed, HPLC
Analysis shows that yeast-derived impurities other than HSA are considerably removed, but HSA dimers and degradation products are observed. Among these, hydrophobic binding chromatography (using phenylcellulofine gel) was studied, particularly for the purpose of removing HSA degradation products.

【００４８】ＨＳＡモノマーおよび分解物を一度ゲルに
吸着させて、溶出条件の差で分解物を除去する吸着法
と、ＨＳＡの分解物のみをゲルに吸着させてＨＳＡのモ
ノマーと分離させる方法（素通し法）を検討した。疎水
クロマトグラフィーの結果を表５に示した。条件は以下
によった。 素通し法(Pass-Throught Method) ゲルに通過させる試料をNaClで26mS(pH は6.7)に調整
し、ゲルを緩衝液(0.15MNaCl,0.05M 燐酸塩 pH6.3) で
平衡化した。ゲルに通過させた試料を保管した。An adsorption method in which the HSA monomer and the decomposed product are once adsorbed on the gel and the decomposed product is removed depending on the elution conditions, and a method in which only the HSA decomposed product is adsorbed on the gel and separated from the HSA monomer (through Method) was considered. The results of the hydrophobic chromatography are shown in Table 5. The conditions were as follows. Pass-Throught Method The sample passed through the gel was adjusted to 26 mS (pH 6.7) with NaCl and the gel was equilibrated with buffer (0.15 M NaCl, 0.05 M phosphate pH 6.3). The sample passed through the gel was stored.

【００４９】吸着法 硫酸アンモニウムを添加し最終濃度を1.8M(pH を6.7 に
調整) とした。ゲルを緩衝液(1.8M 硫酸アンモニウム,
0.15M NaCl,0.05M 燐酸塩 pH6.3)で平衡化した。試料を
ゲルにかけて吸着させた。洗浄後、溶出液(0.15M NaCl,
0.05M 燐酸塩 pH6.3) でＨＳＡモノマーを溶出した。Adsorption method Ammonium sulfate was added to make the final concentration 1.8 M (pH was adjusted to 6.7). Gel was buffered (1.8M ammonium sulfate,
Equilibrated with 0.15M NaCl, 0.05M phosphate pH6.3). The sample was run on a gel and adsorbed. After washing, eluate (0.15M NaCl,
The HSA monomer was eluted with 0.05M phosphate pH 6.3).

【００５０】[0050]

【表５】 [Table 5]

【００５１】実施例１−５ 不純物の高感度測定系の検
討 上記の方法で精製した高度精製ＨＳＡ溶液（素通し法に
よる疎水クロマトグラフィー終了後のもの）中に存在す
る酵母由来成分を検出するために、ＥＩＡ法による高感
度測定法を検討した。ＨＳＡ非産生酵母上清濃縮液をフ
ロイントのコンプリートアジュバンドと共にウサギに免
疫し、得られた抗血清を用いたＥＩＡ法を行った。測定
は競合反応によるインヒビション法で行った。Example 1-5 Examination of Highly Sensitive Measuring System for Impurities In order to detect yeast-derived components present in a highly purified HSA solution purified by the above-described method (after completion of hydrophobic chromatography by a permeation method). And high sensitivity measurement by the EIA method were studied. Rabbits were immunized with a HSA non-producing yeast supernatant concentrate together with Freund's complete adjuvant, and EIA was performed using the obtained antiserum. The measurement was performed by the inhibition method using a competitive reaction.

【００５２】結果 酵母成分の検出用に用いた標準品の組成は、蛋白質含量
として１７６μｇ／ｍＬ（ローリー法）、多糖含量とし
ては６８ｍｇ／ｍＬ（フェノール−硫酸法）であった。
これらの数値を基に酵母由来成分のＥＩＡ法による測定
用の標準線を作成した（図５）。その結果、不純物の検
出限界として蛋白質濃度で２１５ｐｇ／ｍＬ、糖濃度で
８３ｎｇ／ｍＬの高感度な測定系が開発できた。この測
定系を用いて、精製ＨＳＡ溶液（疎水クロマトグラフィ
ー処理液）中の酵母由来成分の含量を測定したところ、
２５％濃度まで濃縮した精製ＨＳＡ中に検出される酵母
由来成分の含量は、蛋白質濃度換算で４９．５ｎｇ／ｍ
Ｌ（純度９９．９９９９８％）、糖濃度換算で１９．１
μｇ／ｍＬ（純度９９．９９２％）であった（表６）。
コントロールとして、２５％血漿由来アルブミン溶液に
ついて測定したころ、酵母由来成分は検出されなかっ
た。Results The composition of the standard product used for the detection of yeast components was 176 μg / mL (Lowry method) in terms of protein content and 68 mg / mL (phenol-sulfuric acid method) in terms of polysaccharide content.
Based on these values, a standard line for measuring yeast-derived components by the EIA method was created (FIG. 5). As a result, a high-sensitivity measurement system with a protein concentration of 215 pg / mL and a sugar concentration of 83 ng / mL as detection limits for impurities could be developed. Using this measurement system, the content of yeast-derived components in the purified HSA solution (hydrophobic chromatography-treated solution) was measured.
The content of yeast-derived components detected in purified HSA concentrated to a concentration of 25% was 49.5 ng / m 2 in terms of protein concentration.
L (purity 99.99998%), 19.1 in terms of sugar concentration
It was μg / mL (purity 99.992%) (Table 6).
As a control, when a 25% plasma-derived albumin solution was measured, no yeast-derived component was detected.

【００５３】[0053]

【表６】 [Table 6]

【００５４】[0054]

【発明の効果】本発明は、ＡＯＸ１プロモーターの下流
にヒト血清アルブミン遺伝子を担持してなるプラスミド
を例えばピキア酵母に導入して、形質転換させると共に
これを培地におけるメタノール濃度を制御して培養する
ことにより、非常に高効率にヒト血清アルブミンを培地
中に分泌させることができ、この培養液を限外濾過膜、
加熱処理、陽イオン交換クロマトグラフィー及び疎水ク
ロマトグラフィー等を組み合わせることにより高度に精
製されたＨＳＡを提供することができる。According to the present invention, a plasmid carrying the human serum albumin gene downstream of the AOX1 promoter is introduced into, for example, Pichia yeast, transformed and cultured by controlling the methanol concentration in the medium. Thereby, human serum albumin can be secreted into the medium with very high efficiency, and this culture solution is subjected to an ultrafiltration membrane,
Highly purified HSA can be provided by combining heat treatment, cation exchange chromatography, hydrophobic chromatography, and the like.

【００５５】[0055]

【配列表】[Sequence list]

配列番号：１ 配列の長さ：２４３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プラスミドＤＮＡ 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 CCAGATTCTG GTGGGAATAC TGCTGATAGC CTAACGTTCA TGATCATAAT CTAACTGTTC 60 TAACCCCTAC TTGGACTGGC AATATATAAA CAGGAGGAAA CTGCCCAGTC GAAAACCTTC 120 TTCCTTATCA TCATTATTAG CTTACTTTCA TAATTGTGAC TGGTTCCAAT TGACAAGCTT 180 TTGATTCTAA CGACTTTTAA CGACAATTTG AGAAGATCAA AAAACAACTA ATTATTCGAA 240 ACG 243 配列番号：２ 配列の長さ：５０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プローブＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA 50 配列番号：３ 配列の長さ：４６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 プローブＤＮＡ 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 TCAAGAGGAT GTCAGAATGC CATTTGCCTG AGAGATGCAG GCTTCA 46 配列番号：４ 配列の長さ：２２６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：Genomic DNA 配列の特徴 特徴を決定した方法：Ｅ 配列 ATG GCT ATC CCT GAA GAG TTT GAT ATC CTT GTT TTA GGT GGT GGA 45 TCC AGT GGA TCC TGT ATT GCC GGA AGA TTG GCC AAC TTG GAC CAC 90 TCC TTG AAA GTT GGT CTT ATC GAG GCA GGT GAG AAC AAC CTC AAC 135 AAC CCA TGG GTT TAC CTT CCA GGT ATT TAC CCA AGA AAC ATG AAG 180 TTG GAC TCC AAG ACT GCA TCC TTC TAC ACT TCT AAC CCT TCT CCT 225 CAC TTG AAC GGT AGA AGA GCT ATT GTT CCA TGT GCT AAC GTC TTG 270 GGT GGT GGT TCT TCC ATT AAC TTC ATG ATG TAG ACC AGA GGT TCT 315 GCT TCT GAT TAT GAC GAC TTC CAA GCC GAG GGC TGG AAA ACC AAG 360 GAC TTG CTT CCA TTG ATG AAA AAG ACC GAG ACC TAC CAA AGA GCT 405 TGC AAC AAC CCT GAC ATT CAC GGG TTC GAA GGT CCA ATC AAG GTT 450 TCT TTG GGT AAC TAC ACC TAC CCA GTT TGC CAG GAC TTC TTG AGA 495 GCT TCT GAA TCC CAA GGT ATT CCA TAC GTT GAC GAC TTG GAA GAC 540 TTG GTT ACT GCT CAC GGT GCT GAA CAC TGG CTG AAA TGG ATC AAC 585 AGA GAC ACT GGT CGT CGT TCC GAC TCC GCT CAT GCA TTT GTC CAC 630 TCT ACT ATG AGA AAC CAC GAC AAC TTG TAC TTG ATT TGT AAC ACA 675 AAG GTT GAC AAG ATA ATT GTC GAA GAC GGA AGA GCT GCT GCT GTT 720 AGA ACT GTT CCA AGC AAG CCT TTG AAC CCA AAG AAG CCA AGT CAC 765 AAG ATC TAC CGT GCT AGA AAG CAA ATC GTT TTG TCT TGT GGT ACC 810 ATC TCA TCT CCT TTG GTT CTG CAA AGA TCC GGT TTC GGT GAC CCA 855 ATC AAG TTG AGA GCC GCT GGT GTT AAG CCT TTG GTC AAC TTG CCT 900 GGT GTC GGA AGA AAC TTC CAA GAC CAC TAC TGT TTC TTC AGT CCT 945 TAC AGA ATC AAG CCT CAG TAC GAA TCT TTC GAT GAC TTC GTG CGT 990 GGT GAT GCT GAG ATC CAA AAG AGA CTT TTC GAC CAA TGG TAC GCC 1035 AAT GGT ACT GGT CCT CTT GCC ACT AAC GGT ATC GAA GCC GGT GTC 1080 AAG ATT AGA CCA ACA CCA GAG GAA CTG TCT CAA ATG GAC GAA TCT 1125 TTC CAA GAG GGT TAC AGA GAA TAC TTT GAG GAC AAG CCA GAC AAG 1170 CCA GTT ATG CAC TAC TCC ATT ATT GCT GGT TTC TTC GGT GAC CAC 1215 ACC AAG ATT CCT CCT GGA AAG TAC ATG ACC ATG TTC CAC TTT TTG 1260 GAA TAC CCA TTC TCC AGA GGT TCC ATT CAC ATT ACC TCT CCA GAT 1305 CCA TAC GCA GCT CCA GAC TTC GAC CCA GGT TTC ATG AAC GAT GAA 1350 AGA GAC ATG GCT CCT CTG GTC TGG GCC TAC AAG AAG TCT AGA GAG 1395 ACA GCT AGA AGA ATG GAC CAC TTT GCC GGT GAG GTT ACT TCT CAC 1440 CAC CCA TTG TTC CCA TAC TCA TCC GAG GCC AGA GCT TTG GAG ATG 1485 GAT TTG GAG ACC TCC AAT GCC TAC GGT GGA CCT TTG AAC TTG TCT 1530 GCT GGT CTT GCC CAC GGT TCT TGG ACT CAA CCT TTG AAG AAG CCA 1575 ACT GCA AAG AAC GAA GGC CAT GTT ACC TCC AAC CAA GTC GAG CTT 1620 CAT CCA GAC ATC GAG TAC GAC GAG GAG GAC GAC AAG GCC ATT GAA 1665 AAC TAC ATC CGT GAG CAC ACT GAG ACC ACA TGG CAC TGT CTG GGA 1710 ACC TGT TCC ATG GGT CCA AGA GAG GGT TCC AAC ATC GTC AAA TGG 1755 GGT GGT GTT TTG GAC CAC AGA TCC AAC GTT TAC GGA GTC AAG GGC 1800 CTG AAG GTT GGT GAC TTG TCT GTC TGT CCA GAC AAT GTT GGT TGT 1845 AAC ACC TAC ACC ACC GCT CTT TTG ATC GGT AGG AAG ACT GCC ACT 1890 TTG GTT GGA GAA GAC TTA GGA TAC ACC GGT GAA GCC TTA GAC ATG 1935 ACT GTT CCT CAG TTC AAG TTG GGC ACT TAC GAG AAG ACC GGT CTT 1980 GCT AGA TTC TAACCAATGA GGATGTCAAT GACATTTGTC TGAGAGATAGC 2029 AGGCTTCATA TTTTTGATAA TTTTTTATTT GTAACCTATA TAGTATAGGA GATTTTTTTT 2089 GTCATTTTGT TTCTTCTGCT ACGAGCTTGC TTCTGATCAA CCTATCTCTA AGCTGATGCA 2149 TATCTTGTGG TAGGGGTTTG GGAAAATCGT TTGAGTTGGA TGTTTTACTT GGTACATGCC 2209 ACCTTCTTCG AAGTACAGAA GATTAAGTGA GACACTCATT TGTGCAAGCT T 2260 SEQ ID NO: 1 Sequence length: 243 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double stranded Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Plasmid DNA Sequence characteristics Characteristic symbol: promoter Method for determining characteristics : E SEQ CCAGATTCTG GTGGGAATAC TGCTGATAGC CTAACGTTCA TGATCATAAT CTAACTGTTC 60 TAACCCCTAC TTGGACTGGC AATATATAAA CAGGAGGAAA CTGCCCAGTC GAAAACCTTC 120 TTCCTTATCA TCATTATTAG CTTACTTTCA TAATTGTGAC TGGTTCCAAT TGACAAGCTT 180 TTGATTCTAA CGACTTTTAA CGACAATTTG AGAAGATCAA AAAACAACTA ATTATTCGAA 240 ACG 243 SEQ ID NO: 2 sequence length: 50 sequence types: of a nucleic acid strand Number: Single-stranded Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Probe DNA Sequence characteristics Characteristics determined method: E sequence ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA 50 SEQ ID NO: 3 Sequence length: 46 Sequence type: Number of nucleic acid strands: single strand Topology: linear Sequence type: other nucleic acid Probe D A Sequence characteristics Characterization method: E sequence TCAAGAGGAT GTCAGAATGC CATTTGCCTG AGAGATGCAG GCTTCA 46 SEQ ID NO: 4 Sequence length: 2260 Sequence type: Nucleic acid Number of strands: Double strand Topology: Linear Sequence type: Genomic Characteristics of DNA sequence Method for determining characteristics: E sequence ATG GCT ATC CCT GAA GAG TTT GAT ATC CTT GTT TTA GGT GGT GGA 45 TCC AGT GGA TCC TGT ATT GCC GGA AGA TTG GCC AAC TTG GAC CAC 90 TCC TTG AAA GTT GGT CTT ATC GAG GCA GGT GAG AAC AAC CTC AAC 135 AAC CCA TGG GTT TAC CTT CCA GGT ATT TAC CCA AGA AAC ATG AAG 180 TTG GAC TCC AAG ACT GCA TCC TTC TAC ACT TCT AAC CCT TCT CCT 225 CAC TTG AAC GGT AGA AGA GATT GTT CCA TGT GCT AAC GTC TTG 270 GGT GGT GGT TCT TCC ATT AAC TTC ATG ATG TAG ACC AGA GGT TCT 315 GCT TCT GAT TAT GAC GAC TTC CAA GCC GAG GGC TGG AAA ACC AAG 360 GAC TTG CTT CCA TTG ATG AAA AAG ACC GAG ACC TAC CAA AGA GCT 405 TGC AAC AAC CCT GAC ATT CAC GGG TTC GAA GGT CCA ATC AAG GTT 450 TCT TTG GGT AAC TAC ACC TAC CCA GTT T GC CAG GAC TTC TTG AGA 495 GCT TCT GAA TCC CAA GGT ATT CCA TAC GTT GAC GAC TTG GAA GAC 540 TTG GTT ACT GCT CAC GGT GCT GAA CAC TGG CTG AAA TGG ATC AAC 585 AGA GAC ACT GGT CGT CGT TCC GAC TCC CAT GCA TTT GTC CAC 630 TCT ACT ATG AGA AAC CAC GAC AAC TTG TAC TTG ATT TGT AAC ACA 675 AAG GTT GAC AAG ATA ATT GTC GAA GAC GGA AGA GCT GCT GCT GTT 720 AGA ACT GTT CCA AGC AAG CCT TTG AAC CCA AAG AAG AGT CAC 765 AAG ATC TAC CGT GCT AGA AAG CAA ATC GTT TTG TCT TGT GGT ACC 810 ATC TCA TCT CCT TTG GTT CTG CAA AGA TCC GGT TTC GGT GAC CCA 855 ATC AAG TTG AGA GCC GCT GGT GTT AAG CCT TTG GTC ATG 900 GGT GTC GGA AGA AAC TTC CAA GAC CAC TAC TGT TTC TTC AGT CCT 945 TAC AGA ATC AAG CCT CAG TAC GAA TCT TTC GAT GAC TTC GTG CGT 990 GGT GAT GCT GAG ATC CAA AAG AGA CTT TTC GAC CAA TGG TAC GCC 10 A GGT ACT GGT CCT CTT GCC ACT AAC GGT ATC GAA GCC GGT GTC 1080 AAG ATT AGA CCA ACA CCA GAG GAA CTG TCT CAA ATG GAC GAA TCT 1125 TTC CAA GAG GGT TAC AGA GAA TAC TTT GAG GAC AAG CCA GAC AAG 1170 CCA GTT TG CAC TAC TCC ATT ATT GCT GGT TTC TTC GGT GAC CAC 1215 ACC AAG ATT CCT CCT GGA AAG TAC ATG ACC ATG TTC CAC TTT TTG 1260 GAA TAC CCA TTC TCC AGA GGT TCC ATT CAC ATT ACC TCT CCA GAT 1305 GCA TAC G CCA GAC TTC GAC CCA GGT TTC ATG AAC GAT GAA 1350 AGA GAC ATG GCT CCT CTG GTC TGG GCC TAC AAG AAG TCT AGA GAG 1395 ACA GCT AGA AGA ATG GAC CAC TTT GCC GGT GAG GTT ACT TCT CAC 1440 CAC CCA TTG TTC CTC TCA TCC GAG GCC AGA GCT TTG GAG ATG 1485 GAT TTG GAG ACC TCC AAT GCC TAC GGT GGA CCT TTG AAC TTG TCT 1530 GCT GGT CTT GCC CAC GGT TCT TGG ACT CAA CCT TTG AAG AAG CCA 1575 ACT GCA AAG AAC GAA GCAT CAT ACC TCC AAC CAA GTC GAG CTT 1620 CAT CCA GAC ATC GAG TAC GAC GAG GAG GAC GAC AAG GCC ATT GAA 1665 AAC TAC ATC CGT GAG CAC ACT GAG ACC ACA TGG CAC TGT CTG GGA 1710 ACC TGT TCC ATG GGT CCA AGA GGT AAC ATC GTC AAA TGG 1755 GGT GGT GTT TTG GAC CAC AGA TCC AAC GTT TAC GGA GTC AAG GGC 1800 CTG AAG GTT GGT GAC TTG TCT GTC TGT CCA GAC AAT GTT GGT TGT 1845 AAC ACC TAC ACC ACC ACC GCT CTT TTG AT C GGT AGG AAG ACT GCC ACT 1890 TTG GTT GGA GAA GAC TTA GGA TAC ACC GGT GAA GCC TTA GAC ATG 1935 ACT GTT CCT CAG TTC AAG TTG GGC ACT TAC GAG AAG ACC GGT CTT 1980 GCT AGA TTC TAACCAATGA GGATGTCTCATGA TGA TGA TGA TGA TGA TGA TGA GATC TTTTTTATTT GTAACCTATA TAGTATAGGA GATTTTTTTT 2089 GTCATTTTGT TTCTTCTGCT ACGAGCTTGC TTCTGATCAA CCTATCTCTA AGCTGATGCA2149 TATCTTGTGG TAGGGGTTTG GGAAAATCGT TTGAGTTGGA TGTTTTTTT GGTACATGTCAGTCAGCATGATTAGATTGATTACGATTAGCATGATTACGATTAGCATGATTGATTACGATTACGTTAGTTCATT

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】ＡＯＸ遺伝子をλｇｔ１０に組み込んだ制限酵
素地図を示す。FIG. 1 shows a restriction map in which the AOX gene has been incorporated into λgt10.

【図２】ＦＭ−２１培地を使用したピキア酵母ＧＣＰ１
０４の培養結果を示す。FIG. 2. Pichia yeast GCP1 using FM-21 medium
4 shows the results of culture.

【図３】ＦＭ−２１培地を使用したピキア酵母ＧＣＰ１
０１の培養結果を示す。FIG. 3. Pichia yeast GCP1 using FM-21 medium
01 shows the results of the culture.

【図４】ＦＭ−２１培地を使用したピキア酵母ＧＣＰ１
０１の他の培養結果を示す。FIG. 4. Pichia yeast GCP1 using FM-21 medium
01 shows other culture results.

【図５】酵母由来成分のＥＩＡ法による測定用の標準線
を示す。FIG. 5 shows a standard line for measurement of yeast-derived components by the EIA method.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 川辺 晴英 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株式会社ミドリ十字 中央研究所内 (56)参考文献 特開 平２−104290（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−164891（ＪＰ，Ａ) 特開 昭58−56684（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−29985（ＪＰ，Ａ) Ｙｅａｓｔ，５，167−177 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅＳｅｑ Ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ／ＰＩＲ／ＧｅｎｅＳ ｅｑ ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (72) Inventor Haruhide Kawabe 2-25-1, Shodai Otani, Hirakata-shi, Osaka Midori Cross Co., Ltd. Central Research Laboratory (56) References JP-A-2-104290 (JP, A) JP-A-63-164891 (JP, A) JP-A-58-56684 (JP, A) JP-A-62-29985 (JP, A) Yeast, 5,167-177 (58) Fields investigated (Int. . ^7, DB name) C12N 15/00 - 15/90 BIOSIS (DIALOG ) GenBank / EMBL / DDBJ / G eneSeq Swissprot / PIR / GeneS eq WPI (DIALOG)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】（１）配列番号１のＤＮＡ配列を有するＡ
ＯＸ１プロモーターおよびヒト血清アルブミン遺伝子を
担持してなるプラスミドを構築し、 （２）そのプラスミドを宿主に導入して、形質転換さ
せ、 （３）得られた形質転換体を培養して、ヒト血清アルブ
ミンを産生させること、からなるヒト血清アルブミンの
製造方法。(1) A having the DNA sequence of SEQ ID NO: 1
Constructing a plasmid carrying the OX1 promoter and the human serum albumin gene, (2) introducing the plasmid into a host and transforming it, and (3) culturing the resulting transformant to obtain human serum albumin. And a method for producing human serum albumin. 【請求項２】 宿主がピキア酵母である請求項１記載の
ヒト血清アルブミンの製造方法。 2. The method according to claim 1, wherein the host is Pichia yeast.
A method for producing human serum albumin.