JP3266967B2 - Novel oligosaccharide derivative, method for producing the same, and method for measuring α-amylase activity using the same as a substrate - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【産業上の利用分野】本発明は、α−アミラーゼ活性測
定用基質として有用な新規非還元末端修飾オリゴサッカ
ライド誘導体と、その製造方法、並びに、これを基質と
して用いるα−アミラーゼ活性測定法に関する。The present invention relates to a novel non-reducing terminal-modified oligosaccharide derivative useful as a substrate for measuring .alpha.-amylase activity, a method for producing the same, and a method for measuring .alpha.-amylase activity using the derivative as a substrate.

【０００２】[0002]

【発明の背景】試料、特にヒト生体内の唾液、膵液、血
液、尿中のα−アミラーゼ活性の測定は、医学上の診断
において重要である。例えば、膵炎、膵臓癌、耳下腺炎
においては、血液や尿中のα−アミラーゼ活性は通常の
値に比べて著しい上昇を示す。BACKGROUND OF THE INVENTION The measurement of α-amylase activity in samples, particularly saliva, pancreatic juice, blood and urine in human organisms, is important in medical diagnosis. For example, in pancreatitis, pancreatic cancer, and parotitis, the α-amylase activity in blood and urine shows a marked increase compared to normal values.

【０００３】α−アミラーゼ活性の測定方法について
は、これまで種々の方法が発表されているが、大別する
と、でんぷん、アミロース、アミロペクチン等の長鎖の
天然物及びその修飾物を使用する方法と、グルコース残
基数が３〜７個のオリゴサッカライド及びその誘導体を
使用する方法の２種に分けられる。[0003] Various methods for measuring α-amylase activity have been published so far. The method can be roughly classified into a method using a long-chain natural product such as starch, amylose and amylopectin and a modified product thereof. And oligosaccharides having 3 to 7 glucose residues and derivatives thereof.

【０００４】これらの方法のうち、最近では、均一で構
造の明確な基質、すなわち、還元末端に発色基を有し、
非還元末端グルコースの６位または４，６位を修飾した
マルトオリゴサッカライド誘導体を基質として用いる共
役酵素法が汎用されている。これらの基質は、α-グル
コシダーゼ、β-グルコシダーゼ、グルコアミラーゼ等
の共役酵素の基質とならず、しかも、検出を遊離してく
る発色物質の量を測定することにより行うことができる
ので、α−アミラーゼ活性測定用基質としての有意性が
特に高い。特に特開昭63-170393号公報，特開昭61-8319
5号公報等に記載された非還元末端グルコースの６位の
みを修飾したマルトオリゴサッカライド誘導体はα−ア
ミラーゼの基質としての反応性が高く、しかも保存安定
性が優れている等、きわめて完成度の高いα−アミラー
ゼ活性測定用基質であるが、用いる基質の合成収率がい
ずれも低いという点で実用化（企業化）に際し問題が残
る。従って、α−アミラーゼ活性測定用の優れた基質と
なり得、且つ、既存のものよりも高収率で合成すること
ができる新規な非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導
体とその効果的な製造法の出現が待ち望まれている現状
にある。Of these methods, recently, a substrate having a uniform and well-defined structure, ie, having a chromophore at the reducing end,
A conjugate enzyme method using a maltooligosaccharide derivative modified at the 6-position or 4,6-position of non-reducing terminal glucose as a substrate is widely used. These substrates do not serve as substrates for conjugate enzymes such as α-glucosidase, β-glucosidase, and glucoamylase, and can be detected by measuring the amount of a coloring substance that releases detection. The significance as a substrate for measuring amylase activity is particularly high. In particular, JP-A-63-170393, JP-A-61-8319
The maltooligosaccharide derivative modified only at the 6-position of the non-reducing terminal glucose described in No. 5, etc. has high reactivity as a substrate of α-amylase and has excellent storage stability, and is extremely highly completed. Although it is a substrate for α-amylase activity measurement, there remains a problem in practical use (commercialization) in that the synthesis yield of each substrate used is low. Therefore, the emergence of a novel non-reducing terminal-modified oligosaccharide derivative which can be an excellent substrate for measuring α-amylase activity and can be synthesized in higher yield than existing ones, and an effective production method thereof. There is a long-awaited situation.

【０００５】[0005]

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑みなさ
れたもので、α−アミラーゼ活性測定用の優れた基質と
なり得、且つ既存のものよりも高収率で合成することが
できる新規な非還元末端修飾オリゴサッカライド誘導体
と、その製造方法、並びにこれを基質として用いるα−
アミラーゼ活性測定法を提供することをその目的とす
る。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above situation, and provides a novel substrate which can be used as an excellent substrate for measuring α-amylase activity and which can be synthesized in a higher yield than existing ones. Non-reducing terminal-modified oligosaccharide derivative, method for producing the same, and α-
It is an object of the present invention to provide a method for measuring amylase activity.

【０００６】[0006]

【発明の構成】本発明は、下記一般式[I]The present invention provides a compound represented by the following general formula [I]

【化１７】 Embedded image

【０００７】［式中、Ｒは−ＳＲ ^2’ ，[ Wherein , R is -SR ^{2 '} ,

【化１８】 Embedded image

【０００８】又は[0008] or

【化１９】 を表わし（但し、Ｒ ² ’はアルキル基、又はフェニル
基、置換フェニル基（置換基は炭素数１〜５のアルキル
基，炭素数１〜５のアルコキシ基等）、アミノ基、置換
アミノ基（置換基は炭素数１〜５のアルキル基，炭素数
２〜５のヒドロキシアルキル基，炭素数２〜５のスルホ
アルキル基，炭素数３〜５のヒドロキシスルホアルキル
基等）、及びピリジル基，置換ピリジル基（置換基は炭
素数１〜５のアルキル基，炭素数１〜５のアルコキシ
基，アミノ基等），ピペリジル基，ピペラジル基及びモ
ルホリニル基から選ばれる置換基を有するアルキル基を
表し、Ｒ ² はアルキル基又は置換アルキル基を表わ
す。）、Ｒ ^１ は光学的に検出可能な基又は水素原子を表
し、ｎは０〜５の整数を表わす。尚、前記光学的に検出
可能な基は、グルコアミラーゼ[E.C.3.2.1.3.]、α−グ
ルコシダーゼ[E.C.3.2.1.20]、β−グルコシダーゼ[E.
C.3.2.1.21.]、イソマルターゼ[E.C.3.2.1.10.]または
β−アミラーゼ[E.C.3.2.1.2.]等の共役酵素の作用を受
けて加水分解されるものであり、且つ、加水分解後に
（Ａ）それ自体可視部や紫外部に吸収を有するもの、
（Ｂ）それ自体蛍光を有するもの、（Ｃ）酸化酵素の作
用を受けてカプラーと結合して色素を生ずるもの、
（Ｄ）酸化剤によりカプラーと結合して色素を生ずるも
の、又は（Ｅ）フルクトースを生ずるもの、である。］
で示されるオリゴサッカライド誘導体の発明である。Embedded image (Where R ² ′ is an alkyl group or phenyl
Group, substituted phenyl group (substituent is alkyl having 1 to 5 carbon atoms)
Group, alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, etc.), amino group, substitution
Amino group (substituent is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms,
2-5 hydroxyalkyl group, 2-5 carbon sulfo
Alkyl group, hydroxysulfoalkyl having 3 to 5 carbon atoms
Group), pyridyl group, substituted pyridyl group (substituent is charcoal
Alkyl group of 1 to 5 carbon atoms, alkoxy of 1 to 5 carbon atoms
Group, amino group, etc.), piperidyl group, piperazyl group and
An alkyl group having a substituent selected from a rufolinyl group;
And R ² represents an alkyl group or a substituted alkyl group
You. ) , R ¹ represents an optically detectable group or a hydrogen atom.
And n represents an integer of 0 to 5. In addition, the optical detection
Possible groups include glucoamylase [EC 3.2.1.3.], Α-group
Lucosidase [EC3.2.1.20], β-glucosidase [E.
C.3.2.1.21.], Isomaltase [EC3.2.1.10.] Or
Being affected by the action of conjugate enzymes such as β-amylase [EC3.2.1.2.]
And after hydrolysis,
(A) itself having absorption in the visible or ultraviolet region,
(B) a substance having fluorescence itself, (C) production of oxidase
A dye that combines with a coupler to produce a dye,
(D) a dye is formed by bonding to a coupler by an oxidizing agent;
Or (E) produces fructose. ]
The invention of an oligosaccharide derivative represented by the formula:

【０００９】また、本発明は、下記一般式[V]Further, the present invention provides a compound represented by the following general formula [V]:

【化２０】 （式中、Ｘはハロゲン原子を表わし、Ｒ³は水素原子又
はアシル基を表わし、Ｒ ¹ 及びｎは前記と同じ。）で示
されるオリゴサッカライド誘導体を、一般式Ｒ⁴ＣＯＳ
Ｈ（式中、Ｒ⁴はアルキル基又はフェニル基を表わ
す。）で示されるチオカルボン酸又はその塩と反応させ
て、非還元末端グルコースの６位にアシルチオ基（−Ｓ
ＣＯＲ⁴基）を導入し、次いで、要すれば脱アシル保護
した後、これに、一般式Ｒ²Ｘ²（式中、Ｘ²はハロゲン
原子を表わし、Ｒ²は前記と同じ。）で示されるハロゲ
ン化アルキル又はハロゲン化置換アルキルを作用させる
か、或は一般式Ｒ²ＯＲ_S（式中、Ｒ_Sはトシル基、ブロ
シル基、トリフルオロメタンスルホニル基又はメシル基
を表わし、Ｒ²は前記と同じ。）で示される化合物を作
用させることを特徴とする、一般式[II]Embedded image (Wherein, X represents a halogen atom, R ³ represents a hydrogen atom or an acyl group, and R ¹ and n are the same as those described above), and an oligosaccharide derivative represented by the general formula R ⁴ COS
H (wherein R ⁴ represents an alkyl group or a phenyl group) or a salt thereof, and an acylthio group (—S
Introducing a COR ⁴ group), then, after deacylated protected if necessary, to the general formula R ² X ² (wherein, X ² represents a halogen atom, R ² is represented by the same.) And the Or a halogenated substituted alkyl, or a compound of the general formula R ² OR _S , wherein R _S represents a tosyl group, a brosyl group, a trifluoromethanesulfonyl group or a mesyl group, and R ² is as defined above. The same applies to the compound represented by the general formula [II]

【００１０】[0010]

【化２１】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは前記と同じ。）で示されるオ
リゴサッカライド誘導体の製造法の発明である。Embedded image (Wherein, R ¹ , R ² and n are the same as described above).

【００１１】更に、本発明は、一般式[II]Further, the present invention provides a compound represented by the general formula [II]:

【化２２】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは前記と同じ。）で示されるオ
リゴサッカライド誘導体を酸化することを特徴とする、
一般式[III]Embedded image (Wherein R ¹ , R ² and n are the same as described above), characterized by oxidizing an oligosaccharide derivative represented by the formula:
General formula [III]

【００１２】[0012]

【化２３】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは前記と同じ。）Embedded image (In the formula, R ¹ , R ² and n are the same as described above.)

【００１３】又は、一般式[IV]Or the general formula [IV]

【化２４】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは前記と同じ。）で示されるオ
リゴサッカライド誘導体の製造法の発明である。Embedded image (Wherein, R ¹ , R ² and n are the same as described above).

【００１４】また、本発明は、一般式[I]Further, the present invention provides a compound represented by the general formula [I]:

【化２５】 （式中、Ｒ，Ｒ¹及びｎは前記と同じ。）で示されるオ
リゴサッカライド誘導体を基質として用いることを特徴
とする、α−アミラーゼ活性測定法の発明である。Embedded image (Wherein, R, R ¹ and n are the same as those described above), characterized by using an oligosaccharide derivative represented by the formula ( ¹ ) as a substrate.

【００１５】更にまた、本発明は、一般式[I]Further, the present invention provides a compound represented by the general formula [I]:

【化２６】 （式中、Ｒ，Ｒ¹及びｎは前記と同じ。）で示されるオ
リゴサッカライド誘導体を基質として用いることを特徴
とする、α−アミラーゼ活性分別測定法の発明である。Embedded image (Wherein, R, R ¹ and n are the same as described above), characterized by using an oligosaccharide derivative represented by the formula ( ¹ ) as a substrate.

【００１６】そして、本発明は一般式[I]The present invention relates to a compound represented by the general formula [I]:

【化２７】 （式中、Ｒ，Ｒ¹及びｎは前記と同じ。）で示されるオ
リゴサッカライド誘導体を基質として用い、ヒト唾液腺
由来のα−アミラーゼ活性を抑制する物質の存在下に測
定を行なうことを特徴とする、ヒト膵由来のα−アミラ
ーゼ活性の特異的測定法の発明でもある。Embedded image (Wherein, R, R ¹ and n are the same as those described above), and the measurement is carried out in the presence of a substance that inhibits α-amylase activity derived from human salivary glands, using the oligosaccharide derivative represented by the formula ( ¹ ) as a substrate. The present invention also relates to a method for specifically measuring human pancreatic α-amylase activity.

【００１７】即ち、本発明者らは、α−アミラーゼ活性
測定用の基質となり得るオリゴサッカライド誘導体であ
って、既存のものよりも収率良く合成することが出来る
新規なオリゴサッカライド誘導体を求めて鋭意研究を重
ねた結果、非還元末端グルコースの６位にＳ原子を介し
てアルキル基又は置換アルキル基が導入された上記一般
式[I]で示されるオリゴサッカライド誘導体が該目的に
適うものであることを見出し、本発明を完成するに至っ
た。尚、既存の同種オリゴサッカライド誘導体は何れも
非還元末端グルコースの６位にＯ原子を介して各種の置
換基が導入されているものばかりであり、本発明のオリ
ゴサッカライド誘導体の如く非還元末端グルコースの６
位にＳ原子を介して各種置換基が導入されている非還元
末端修飾オリゴサッカライド誘導体は、これまで皆無で
あった。一般式[I]で示される本発明のオリゴサッカラ
イド誘導体において、Ｒで示される−ＳＲ²，That is, the present inventors have enthusiastically searched for a novel oligosaccharide derivative which can be used as a substrate for measuring α-amylase activity and which can be synthesized with higher yield than existing ones. As a result of repeated studies, the oligosaccharide derivative represented by the above general formula [I] in which an alkyl group or a substituted alkyl group is introduced via an S atom at the 6-position of non-reducing terminal glucose is suitable for the purpose. And completed the present invention. In addition, all the existing oligosaccharide derivatives of the same kind have only various substituents introduced at the 6-position of the non-reducing terminal glucose via an O atom. 6 of
Until now, there has been no non-reducing terminal-modified oligosaccharide derivative having various substituents introduced at the position via an S atom. In the oligosaccharide derivative of the present invention represented by the general formula [I], -SR ² ,

【００１８】[0018]

【化２８】 Embedded image

【００１９】及びAnd

【化２９】 のＲ²はアルキル基又は置換アルキル基を表わすが、ア
ルキル基としては、例えばメチル基，エチル基，プロピ
ル基，ブチル基，アミル基，ヘキシル基，ヘプチル基，
オクチル基，ノニル基，デシル基，ウンデシル基，ドデ
シル基，ペンタデシル基，ヘプタデシル基，オクタデシ
ル基，イコシル基等、炭素数１〜20のアルキル基が挙げ
られ、直鎖状，分枝状何れにても良く、置換アルキル基
のアルキル基としては、例えばメチル基，エチル基，プ
ロピル基，ブチル基，アミル基等、炭素数１〜５のアル
キル基が挙げられ、直鎖状，分枝状何れにても良い。ま
た置換アルキル基の置換基としては、例えば、フェニル
基、置換フェニル基（置換基は炭素数１〜５のアルキル
基、炭素数１〜５のアルコキシ基等）、アミノ基、置換
アミノ基（置換基は炭素数１〜５のアルキル基，炭素数
２〜５のヒドロキシアルキル基，炭素数２〜５のスルホ
アルキル基，炭素数３〜５のヒドロキシスルホアルキル
基等）、又はピリジル基，置換ピリジル基（置換基は炭
素数１〜５のアルキル基，炭素数１〜５のアルコキシ
基，アミノ基等），ピペリジル基、ピペラジル基，モル
ホリノ基等の複素環基等が挙げられる。一般式[I]に於
けるＲ¹は光学的に検出可能な基又は水素原子を表わす
が、光学的に検出可能な基としては、グルコアミラーゼ
[E.C.3.2.1.3.]、α−グルコシダーゼ[E.C.3.2.1.20]、
β−グルコシダーゼ[E.C.3.2.1.21.]、イソマルターゼ
[E.C.3.2.1.10.]またはβ−アミラーゼ[E.C.3.2.1.2.]
等の共役酵素の作用を受けて加水分解され得るものであ
り、さらに、加水分解後はニトロフェノール類のように
それ自体可視部や紫外部に吸収を有するものか、ウンベ
リフェニル類のようにそれ自体蛍光を有するものか、カ
テコールオキシダーゼ、ラッカーゼ、チロシナーゼまた
はモノフェノールオキシダーゼ等の酸化酵素の作用を受
けてカプラーと結合して色素を生ずるものか、或は酸化
剤によりカプラーと結合して色素を生ずるものであれば
いずれであってもよい。このような光学的に測定可能な
基は既に当業者においては明らかであり、特に詳説は不
要であるが、例えばフェニル基，1-ナフチル基，2-メチ
ルフェニル基，2-メチル-1-ナフチル基等のアリール
基、例えば4-ニトロフェニル基，3-ニトロフェニル基，
2-クロロフェニル基，4-クロロフェニル基，2,6-ジクロ
ロフェニル基，2-クロロ-4-ニトロフェニル基，2-メト
キシフェニル基，4-メトキシフェニル基，2-カルボキシ
フェニル基，2-スルホフェニル基，2-スルホ-1-ナフチ
ル基，2-カルボキシ-1-ナフチル基等の置換アリール
基、ウンベリフェリル基、例えば4-メチルウンベリフェ
リル基、4-トリフルオロメチルウンベリフェリル基等の
置換ウンベリフェリル基、インドキシル基、例えば5-ブ
ロモインドキシル基，4-クロロ-3-ブロモインドキシル
基等の置換インドキシル基等が代表的なものとして挙げ
られる。また、光学的に検出可能な基としては、これら
の他に、Embedded image R ² represents an alkyl group or a substituted alkyl group, and examples of the alkyl group include a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group, an amyl group, a hexyl group, a heptyl group,
Alkyl groups having 1 to 20 carbon atoms, such as octyl group, nonyl group, decyl group, undecyl group, dodecyl group, pentadecyl group, heptadecyl group, octadecyl group, icosyl group, etc., may be linear or branched. Examples of the alkyl group of the substituted alkyl group include an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms such as a methyl group, an ethyl group, a propyl group, a butyl group and an amyl group. May be. Examples of the substituent of the substituted alkyl group include a phenyl group, a substituted phenyl group (the substituent is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, etc.), an amino group, a substituted amino group (substituted The group is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, a hydroxyalkyl group having 2 to 5 carbon atoms, a sulfoalkyl group having 2 to 5 carbon atoms, a hydroxysulfoalkyl group having 3 to 5 carbon atoms, etc.), a pyridyl group, or a substituted pyridyl Groups (substituents are alkyl groups having 1 to 5 carbon atoms, alkoxy groups having 1 to 5 carbon atoms, amino groups and the like), and heterocyclic groups such as piperidyl group, piperazyl group and morpholino group. R ¹ in the general formula [I] represents an optically detectable group or a hydrogen atom. Examples of the optically detectable group include glucoamylase.
[EC3.2.1.3.], Α-glucosidase [EC3.2.1.20],
β-glucosidase [EC3.2.1.21.], isomaltase
[EC3.2.1.10.] Or β-amylase [EC3.2.1.2.]
It can be hydrolyzed by the action of a conjugate enzyme such as nitrophenols, and after hydrolysis, itself has absorption in the visible or ultraviolet region, such as nitrophenols, or umbelliphenyls A substance which itself has fluorescence, a substance which binds to a coupler under the action of an oxidase such as catechol oxidase, laccase, tyrosinase or monophenol oxidase to produce a dye, or a substance which binds to a coupler by an oxidizing agent to form a dye. Any one that occurs can be used. Such optically measurable groups are already obvious to those skilled in the art, and need not be described in detail, for example, phenyl, 1-naphthyl, 2-methylphenyl, 2-methyl-1-naphthyl Aryl groups such as 4-nitrophenyl group, 3-nitrophenyl group,
2-chlorophenyl, 4-chlorophenyl, 2,6-dichlorophenyl, 2-chloro-4-nitrophenyl, 2-methoxyphenyl, 4-methoxyphenyl, 2-carboxyphenyl, 2-sulfophenyl , 2-sulfo-1-naphthyl, 2-carboxy-1-naphthyl and other substituted aryl groups, umbelliferyl groups such as 4-methylumbelliferyl group, 4-trifluoromethylumbelliferyl group and the like Representative examples include an umbelliferyl group and an indoxyl group, for example, a substituted indoxyl group such as a 5-bromoindoxyl group and a 4-chloro-3-bromoindoxyl group. In addition, optically detectable groups, in addition to these,

【００２０】[0020]

【化３０】 で表わされるフルクトース残基も挙げられるが、この場
合は共役酵素による加水分解後、マンニトールデヒドロ
ゲナーゼとＮＡＤＨを作用させたときに生ずるＮＡＤＨ
の減少の度合を光学的に測定することによりα−アミラ
ーゼ活性の測定を行なうことができる。Embedded image In this case, NADH generated when mannitol dehydrogenase is reacted with NADH after hydrolysis with a conjugating enzyme is also exemplified.
The α-amylase activity can be measured by optically measuring the degree of decrease in α-amylase activity.

【００２１】一般式[I]で示される本発明のオリゴサッ
カライド誘導体には、下記一般式[II]〜[IV]で示される
オリゴサッカライド誘導体が含まれる。The oligosaccharide derivatives of the present invention represented by the general formula [I] include the oligosaccharide derivatives represented by the following general formulas [II] to [IV].

【００２２】[0022]

【化３１】 （式中、Ｒ¹，Ｒ ^２’ 及びｎは前記と同じ。）Embedded image (Where R¹,R ^{2 '} And n are the same as above. )

【００２３】[0023]

【化３２】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは前記と同じ。）Embedded image (In the formula, R ¹ , R ² and n are the same as described above.)

【００２４】[0024]

【化３３】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは前記と同じ。）Embedded image (In the formula, R ¹ , R ² and n are the same as described above.)

【００２５】一般式[II]，[III]及び[IV]で示されるオ
リゴサッカライド誘導体は何れも文献未載の新規化合物
である。The oligosaccharide derivatives represented by the general formulas [II], [III] and [IV] are all novel compounds which have not been described in any literature.

【００２６】一般式[II]で示されるオリゴサッカライド
誘導体（以下、化合物[II]と略記する。）は、下記一般
式[V]The oligosaccharide derivative represented by the general formula [II] (hereinafter abbreviated as compound [II]) is represented by the following general formula [V]

【００２７】[0027]

【化３４】 （式中、Ｘ、Ｒ¹、Ｒ^３及びｎは前記と同じ。）で示さ
れるオリゴサッカライド誘導体（以下、化合物［Ｖ］と
略記する。）を原料として、例えば下記の方法により容
易に且つ収率良く合成することができる。Embedded image (In the formula, X, R ¹ , R ³ and n are the same as those described above.) An oligosaccharide derivative (hereinafter abbreviated as compound [V]) represented by the following formula is used as a raw material, for example, easily and easily by the following method. It can be synthesized efficiently.

【００２８】尚、ここでＲ³は水素原子又はアシル基
（例えばアセチル基，プロピオニル基，ベンゾイル基
等）の何れにても良いが、以下の工程での反応溶媒に対
する溶解度を高める点で、アシル基の方がより好まし
い。Here, R ³ may be any of a hydrogen atom or an acyl group (eg, acetyl, propionyl, benzoyl, etc.), but from the viewpoint of increasing the solubility in the reaction solvent in the following steps, Groups are more preferred.

【００２９】合成法としては、先ず化合物[V]を一般式
Ｒ⁴ＣＯＳＨ（式中、Ｒ⁴は前記と同じ。）で示されるチ
オカルボン酸又はその塩（以下、化合物[VI]と略記す
る。）と反応させて、化合物[V]の非還元末端グルコー
スの６位にアシルチオ基（−ＳＣＯＲ⁴基）を導入す
る。化合物[VI]の具体例としては、例えばチオ酢酸、チ
オ酢酸カリウム、チオ安息香酸、チオ安息香酸ナトリウ
ム等が挙げられる。化合物[VI]の使用量は、化合物[V]
に対し通常１〜10倍モル、好ましくは４〜６倍モルであ
り、反応は、通常、アセトン、ジオキサン、N,N-ジメチ
ルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジメチルアセトアミド、ジ
メチルスルホキシド、ジクロロメタン、ジクロロエタン
等の有機溶媒中、要すれば（化合物[VI]として、酸の形
のものを用いた場合）化合物[VI]に対し１〜２倍当量の
塩基（例えばＮａＯＨ，ＫＯＨ，Ｎａ₂ＣＯ₃，Ｋ₂Ｃ
Ｏ₃，ナトリウムメトキシド，ナトリウムエトキシド
等）の存在下に行なわれる。反応温度は、氷冷下、室温
下、若干加温下何れにてもよく、反応時間は、反応温
度、溶媒その他の条件により自ら異なるが、通常、数時
間乃至数十時間を要し、反応の進行はＴＬＣ等で追跡す
れば良い。尚、反応時、モレキュラーシーブス、drieri
te（ＣａＳＯ₄）等の脱水剤を併用すると効果的であ
る。この反応の収率は通常90％以上と極めて高い。As a synthesis method, first, the compound [V] is abbreviated as a thiocarboxylic acid represented by the general formula R ⁴ COSH (where R ⁴ is the same as described above) or a salt thereof (hereinafter, compound [VI]). ) To introduce an acylthio group (—SCOR ⁴ group) at position 6 of the non-reducing terminal glucose of compound [V]. Specific examples of compound [VI] include, for example, thioacetic acid, potassium thioacetate, thiobenzoic acid, sodium thiobenzoate and the like. The amount of compound [VI] used is the same as that of compound [V]
The reaction is usually 1 to 10 moles, preferably 4 to 6 moles, and the reaction is usually performed with an organic compound such as acetone, dioxane, N, N-dimethylformamide (DMF), dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, dichloromethane, dichloroethane or the like. In a solvent, if necessary (when the compound in the form of an acid is used as compound [VI]), 1 to 2 equivalents of a base (for example, NaOH, KOH, Na ₂ CO ₃ , K ₂ C) is added to compound [VI].
O ₃ , sodium methoxide, sodium ethoxide, etc.). The reaction temperature may be any of ice cooling, room temperature, slightly heating, and the reaction time varies depending on the reaction temperature, solvent and other conditions, but usually takes several hours to several tens of hours. May be tracked by TLC or the like. During the reaction, molecular sieves, drieri
It is effective to use a dehydrating agent such as te (CaSO ₄ ) in combination. The yield of this reaction is extremely high, usually 90% or more.

【００３０】かくして得られた６位アシルチオ体は、他
の水酸基がアシル保護されている場合（一般式[V]に於
てＲ³がアシル基である化合物[V]を原料とした場合）に
はここで脱アシル保護することも可能である。The 6-position acylthio form thus obtained is obtained when another hydroxyl group is acyl-protected (when the compound [V] in which R ³ is an acyl group in the general formula [V] is used as a raw material). Can also be deacylated protected here.

【００３１】脱アシル保護反応は、常法に従い、例えば
0.01〜1.0Ｎナトリウムメトキシド・メタノール溶液等
のアルカリ溶液で数時間乃至数十時間、室温乃至若干加
温下（もしくは氷冷下）処理する等すれば良い。The deacyl protection reaction is carried out according to a conventional method, for example,
It may be treated with an alkaline solution such as a 0.01 to 1.0 N sodium methoxide / methanol solution for several hours to several tens of hours at room temperature to slightly heated (or under ice cooling).

【００３２】次いで、該６位アシルチオ体（アシル保護
体又は脱アシル保護体）に、一般式Ｒ²Ｘ²（式中Ｒ²、
Ｘ²は前記と同じ。）で示されるハロゲン化アルキル又
はハロゲン化置換アルキル（即ち、一般式[V]で示され
るオリゴサッカライド誘導体の非還元末端グルコースの
６位に導入せんとする置換基のハロゲン体）を作用させ
るか、或は一般式Ｒ²ＯＲ_S（式中、Ｒ_S、Ｒ²は前記と同
じ。）で示される化合物を作用させれば、非還元末端グ
ルコースの６位に目的とする置換基を有する一般式[II]
で示される本発明化合物が容易に得られる。Next, the 6-position acylthio form (acyl protected form or deacylated protected form) is added to the general formula R ² X ² (wherein R ² ,
X ² is the same as above. Or a substituted alkyl halide (ie, a halogenated form of a substituent to be introduced into the 6-position of the non-reducing terminal glucose of the oligosaccharide derivative represented by the general formula [V]), Alternatively, when a compound represented by the general formula R ² OR _S (where R _S and R ² are the same as described above) is reacted, a general formula having a target substituent at the 6-position of the non-reducing terminal glucose is obtained. [II]
The compound of the present invention represented by is easily obtained.

【００３３】一般式Ｒ²Ｘ²で示されるハロゲン体の使用
量は、６位アシルチオ体に対し通常１〜10倍モル、好ま
しくは１〜２倍モルで、反応は通常メタノール、ＤＭＦ
等の溶媒中、窒素気流下で行なわれる。反応温度は通常
-20〜25℃、好ましくは-5〜10℃で、反応時間は反応温
度、溶媒その他の条件により自ら異なるが、通常、数時
間乃至数十時間を要す。反応の進行はＴＬＣ等で追跡す
れば良い。The amount of the halogen compound represented by the general formula R ² X ² is usually 1 to 10 times, preferably 1 to 2 times the mol of the 6-position acylthio compound, and the reaction is usually carried out with methanol or DMF.
And the like, under a nitrogen stream. Reaction temperature is usually
At -20 to 25 ° C, preferably -5 to 10 ° C, the reaction time varies depending on the reaction temperature, solvent and other conditions, but usually takes several hours to several tens of hours. The progress of the reaction may be monitored by TLC or the like.

【００３４】また、Ｒ²ＯＲ_Sで示される化合物の使用量
は、６位アシルチオ体に対し通常１〜10倍モル、好まし
くは１〜６倍モルで、反応は通常メタノール、ＤＭＦ等
の溶媒中、窒素気流下で行なわれる。反応温度は通常−
10〜30℃、好ましくは０〜10℃で、反応時間は反応温
度、溶媒その他の条件により自ら異なるが、通常、数時
間乃至数十時間を要す。反応の進行はＴＬＣ等で追跡す
れば良い。The amount of the compound represented by R ² OR _S is usually 1 to 10 moles, preferably 1 to 6 moles, per mole of the acylthio compound at the 6-position. The reaction is usually carried out in a solvent such as methanol or DMF. And under a nitrogen stream. The reaction temperature is usually
The reaction time is 10 to 30 ° C., preferably 0 to 10 ° C. The reaction time varies depending on the reaction temperature, solvent and other conditions, but usually takes several hours to several tens of hours. The progress of the reaction may be monitored by TLC or the like.

【００３５】尚、アシル保護基がついたままで上記一般
式Ｒ²Ｘ²又はＲ²ＯＲ_Sで示される化合物との反応を行な
った場合には、反応後に脱アシル保護反応を行なう必要
があることは言うまでもない（脱アシル保護反応の条
件、方法等は先に述べた通りである。）。It should be noted, that while with an acyl protecting group in the case of performing the reaction of the compound represented by the general formula R ² X ² or R ² OR _S, it is necessary to deacylation protection reaction after the reaction Needless to say (the conditions and method of the deacyl protection reaction are as described above).

【００３６】脱アシル保護反応と、一般式Ｒ²Ｘ²又はＲ
²ＯＲ_Sで示される化合物を作用させる反応とはどちらを
先にした場合でも、二つの反応を１ポットで行なうこと
が可能である。The deacyl protection reaction and the general formula R ² X ² or R
The reaction to the action of the compound represented by ² OR _S even when either earlier, it is possible to perform the two reactions in one pot.

【００３７】各工程に於ける反応後の後処理等は常法に
従ってこれを行なえばよく、また、最終生成物の精製も
カラムクロマトグラフィー等常法に従ってこれを行なえ
ば足りる。The post-treatment after the reaction in each step may be carried out according to a conventional method, and the purification of the final product may be carried out according to a conventional method such as column chromatography.

【００３８】尚、一般式Ｒ²ＯＲ_Sで示される化合物は、
例えばＲ²ＯＨで示されるアルコール類とＲ_SＸ²で示さ
れるハロゲン化物とをピリジン等の塩基の存在下反応さ
せることにより容易に得られるのでこのようにして得ら
れたものを用いることで足りるが、一般式Ｒ²ＯＲ_Sで示
される化合物の中には不安定なものが多いので、通常は
これを単離、精製せず、次の反応に支障のある未反応の
Ｒ_SＸ²のみを抽出操作等により除去し、粗製のままで次
工程に使用する。The compound represented by the general formula R ² OR _S
For example, it can be easily obtained by reacting an alcohol represented by R ² OH with a halide represented by R _SX ² in the presence of a base such as pyridine. Therefore, it is sufficient to use one obtained in this manner. However, since many compounds represented by the general formula R ² OR _S are unstable, they are not usually isolated and purified, and only unreacted R _S X ² which hinders the next reaction is obtained. Is removed by an extraction operation or the like, and used crude in the next step.

【００３９】一般式[II]で示される本発明のオリゴサッ
カライド誘導体の製造法において、原料として用いられ
る上記化合物[V]は例えば、特開昭63−170393号公報に
記載の方法、即ちハロ修飾シクロデキストリンにグルコ
ース、マルトース、マルトトリオース又はこれらの誘導
体等のアクセプターの存在下、シクロマルトデキストリ
ングルカノトランスフェラーゼを作用させ、然る後、こ
れにグルコアミラーゼ又はα−グルコシダーゼを作用さ
せる方法や、特願平2−276934号明細書に記載の非還元
末端グルコースの６位水酸基のみを残したポリアシルオ
リゴ糖誘導体を中間体とする方法、或は特開平2−49796
号公報及び特願平3−131880号明細書等に記載の非還元
末端グルコースの４，６位水酸基を残したポリアシルマ
ルトオリゴ糖誘導体を中間体とする方法、更には、特公
昭62−51960号公報に記載の非還元末端グルコースの
４，６位がベンジリデン架橋されているオリゴグルコシ
ド誘導体を経由する方法等により容易に合成することが
できるので、そのようにして合成したものを用いること
で足りる。In the method for producing the oligosaccharide derivative of the present invention represented by the general formula [II], the compound [V] used as a starting material is, for example, a method described in JP-A-63-170393, A method in which cyclodextrin is allowed to act with cyclomaltodextrin glucanotransferase in the presence of an acceptor such as glucose, maltose, maltotriose or a derivative thereof, and thereafter, glucoamylase or α-glucosidase is caused to act on the cyclodextrin. Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-276934 discloses a method using a polyacyl oligosaccharide derivative leaving only the hydroxyl group at the 6-position of the non-reducing terminal glucose as an intermediate, or JP-A-2-49796.
JP-A-62-51960, a method using a polyacylmaltooligosaccharide derivative leaving a hydroxyl group at the 4,6-position of non-reducing terminal glucose as an intermediate described in Japanese Patent Application Publication No. 3-131880 and Japanese Patent Application No. 3-131880. It can be easily synthesized by a method via an oligoglucoside derivative in which the 4- and 6-positions of the non-reducing terminal glucose are benzylidene-crosslinked, as described in the gazette, and it is sufficient to use such synthesized one.

【００４０】一般式[III]で示されるオリゴサッカライ
ド誘導体（以下、化合物[III]と略記する。）及び一般
式[IV]で示されるオリゴサッカライド誘導体（以下、化
合物[IV]と略記する。）は、化合物[II]を酸化すること
により容易に得られる。酸化剤としてはＳ原子をスルホ
キシド又はスルホンに酸化し得るものであれば何れにて
も良いが、例えばｍ−クロロ過安息香酸や過酸化水素、
過酢酸、過安息香酸等が好ましく挙げられる。反応は通
常、酢酸、ギ酸、プロピオン酸等の酸性溶媒中、或はジ
クロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等の有機
溶媒中、若しくはこれらの有機溶媒と上記酸性溶媒との
混合溶媒中で行なわれ、反応温度は比較的低温が望まし
いが、通常10〜25℃程度が好ましく用いられる。反応時
間は反応温度、溶媒その他の条件により自ら異なるが、
通常、数分乃至数時間程度で十分であり、反応の進行は
ＴＬＣ等で追跡すれば良い。また、酸化剤の添加は冷却
下で行なうことが望ましく、反応は暗所で行なうことが
より好ましい。尚、化合物[II]を上記酸化剤で酸化した
場合、生成物は通常、スルホキシド（化合物[III]）と
スルホン（化合物[IV]）の混合物として得られるが、加
える酸化剤の量を調節することにより、生成するスルホ
キシド並びにスルホンの生成比率を調節することができ
る。The oligosaccharide derivative represented by the general formula [III] (hereinafter abbreviated as compound [III]) and the oligosaccharide derivative represented by the general formula [IV] (hereinafter abbreviated as compound [IV]). Can be easily obtained by oxidizing compound [II]. The oxidizing agent may be any as long as it can oxidize the S atom to sulfoxide or sulfone. For example, m-chloroperbenzoic acid, hydrogen peroxide,
Preferred are peracetic acid, perbenzoic acid and the like. The reaction is usually performed in an acidic solvent such as acetic acid, formic acid, or propionic acid, or in an organic solvent such as dichloromethane, dichloroethane, or chloroform, or in a mixed solvent of these organic solvents and the above-mentioned acidic solvent. A relatively low temperature is desirable, but usually about 10 to 25 ° C. is preferably used. The reaction time varies depending on the reaction temperature, solvent and other conditions.
Usually, several minutes to several hours are sufficient, and the progress of the reaction may be monitored by TLC or the like. The addition of the oxidizing agent is preferably performed under cooling, and the reaction is more preferably performed in a dark place. When compound [II] is oxidized with the above oxidizing agent, the product is usually obtained as a mixture of a sulfoxide (compound [III]) and a sulfone (compound [IV]), and the amount of the oxidizing agent to be added is adjusted. This makes it possible to adjust the ratio of the generated sulfoxide and sulfone.

【００４１】即ち、化合物[II]に対し、１倍当量以下の
酸化剤の添加でスルホキシド体を、また、２倍当量以上
の添加でスルホン体を夫々優位に合成できる。反応後
は、例えば水等の極性溶媒で生成物を抽出し、酸性条件
下でジクロロメタン、ジクロロエタン、クロロホルム等
の有機溶媒にて洗浄した後、カラムクロマトグラフィ等
常法により精製を行なえば足りる。尚、スルホキシドの
場合は一般にＳ体とＲ体の異性体混合物として得られる
が該異性体の分離については逆相カラム等を用いた高速
液体クロマトグラフィを用いる方法がより効果的であ
る。That is, the sulfoxide form can be synthesized by adding less than 1 equivalent of the oxidizing agent, and the sulfone form can be synthesized by adding 2 times or more of the compound [II]. After the reaction, the product may be extracted with a polar solvent such as water, washed with an organic solvent such as dichloromethane, dichloroethane and chloroform under acidic conditions, and then purified by a conventional method such as column chromatography. In the case of sulfoxide, it is generally obtained as a mixture of isomers of the S-form and the R-form, but for the separation of the isomers, a method using high-performance liquid chromatography using a reversed-phase column or the like is more effective.

【００４２】従来、オリゴ等の１位にＳ原子を介してア
ルキル基等を導入する方法については知られていたが、
本発明の如く、非還元末端グルコースの６位にＳ原子を
介してアルキル基等を導入する方法についてはこれまで
文献等に一切記載がなく、本発明者らが鋭意研究の結果
初めて見出したものである。Conventionally, a method of introducing an alkyl group or the like at the 1-position of an oligo or the like via an S atom has been known.
The method of introducing an alkyl group or the like via the S atom at the 6-position of the non-reducing terminal glucose as in the present invention has not been described in any literature, and the present inventors have found for the first time as a result of earnest research. It is.

【００４３】本発明の製造方法によれば、α−アミラー
ゼ活性測定用基質として、或はヒトα−アミラーゼの各
アイソザイム分別測定用基質として有用な非還元末端修
飾オリゴサッカライド誘導体を簡単な操作で収率良く得
ることができるので斯業に寄与するところ甚だ大であ
る。According to the production method of the present invention, a non-reducing terminal-modified oligosaccharide derivative useful as a substrate for measuring α-amylase activity or as a substrate for separating and measuring each isozyme of human α-amylase is obtained by a simple operation. Since it can be obtained efficiently, it greatly contributes to the industry.

【００４４】本発明のオリゴサッカライド誘導体を基質
として用いるα−アミラーゼ活性測定法の測定原理の一
例を示すと、概略以下の通りである。An example of the measurement principle of the α-amylase activity measurement method using the oligosaccharide derivative of the present invention as a substrate is as follows.

【００４５】[0045]

【式１】 （式中、Ｇはグルコース単位を表わし、Ｒは非還元末端
グルコースの６位の置換基を表わし、ｍ¹とｍ²はその和
が１から６である０以上の整数を表わし、Ｒ'は還元末
端グルコースの１位に置換された、光学的に検出可能な
基を表わす。）(Equation 1) (Wherein G represents a glucose unit, R represents a substituent at the 6-position of the non-reducing terminal glucose, m ¹ and m ² represent an integer of 0 or more whose sum is 1 to 6, and R ′ represents Represents an optically detectable group substituted at the 1-position of the reducing terminal glucose.)

【００４６】即ち、先ず始めに、本発明のオリゴサッカ
ライド誘導体に試料中のα−アミラーゼが作用して、非
還元末端グルコースの６位の水酸基がＲなる基で置換さ
れた上記化合物[Ａ]と、還元末端グルコースの１位に光
学的に検出可能な基がついた上記化合物[Ｂ]が生成し、
次いで、この化合物[Ｂ]にグルコアミラーゼ、α−グル
コシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はイソマルターゼ等
の共役酵素が１〜３種作用して、ｍ²ＧとＲ'−ＯＨが生
成する。このＲ'−ＯＨを、例えばＲ'−ＯＨがp-ニトロ
フェノールの如きニトロフェノール類の場合には、直接
その吸収スペクトルを（例えば405nmに於ける吸光度
を）測定することにより、また、Ｒ'−ＯＨが、例えば
フェノール、o-クロロフェノール、2,6-ジクロロフェノ
ール、p-メトキシフェノール等の如きニトロ基をもたな
い（ニトロ基をもっていても良いが）フェノール類或は
ナフトール類の場合には、カテコールオキシダーゼ、ラ
ッカーゼ、チロシナーゼ又はモノフェノールオキシダー
ゼの如き酸化酵素類又はヨウ素酸、過ヨウ素酸の如き酸
化剤又はパーオキシダーゼと過酸化水素を作用させて、
4-アミノアンチピリン、3-メチル-2-ベンゾチアゾリノ
ンヒドラゾン(MBTH)等のカプラーとカップリング（酸化
縮合）させ、生成する色素の吸収スペクトルを測定する
ことにより、或はＲ'−ＯＨがウンベリフェロン、4-メ
チルウンベリフェロンの如く蛍光を有する化合物の場合
には、その蛍光強度を測定することにより、更にはＲ'
−ＯＨがインドキシルの場合には、酸化されて生成する
インジゴ色素の吸収スペクトルを測定することにより、
夫々試料中のα−アミラーゼ活性を求めることができ
る。That is, first, the α-amylase in the sample acts on the oligosaccharide derivative of the present invention, and the above-mentioned compound [A] in which the hydroxyl group at the 6-position of the non-reducing terminal glucose is substituted with a group R. The above compound [B] having an optically detectable group at position 1 of the reducing terminal glucose is produced,
Next, 1 to 3 kinds of conjugate enzymes such as glucoamylase, α-glucosidase, β-glucosidase or isomaltase act on this compound [B] to generate m ² G and R′-OH. For example, when R'-OH is a nitrophenol such as p-nitrophenol, the absorption spectrum (for example, the absorbance at 405 nm) of the R'-OH is measured. -OH is a phenol or naphthol having no nitro group (although it may have a nitro group) such as phenol, o-chlorophenol, 2,6-dichlorophenol, p-methoxyphenol, etc. Oxidases such as catechol oxidase, laccase, tyrosinase or monophenol oxidase or iodic acid, an oxidizing agent such as periodic acid or peroxidase and hydrogen peroxide,
By coupling (oxidative condensation) with a coupler such as 4-aminoantipyrine or 3-methyl-2-benzothiazolinone hydrazone (MBTH) and measuring the absorption spectrum of the resulting dye, In the case of a compound having fluorescence such as umbelliferone and 4-methylumbelliferone, the fluorescence intensity is measured to further determine R ′.
When -OH is indoxyl, by measuring the absorption spectrum of the indigo dye generated by oxidation,
The α-amylase activity in each sample can be determined.

【００４７】また、本発明のオリゴサッカライド誘導体
を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定法の他の例
としては、特開昭63−183595号公報等に記載のようにア
ジ化水素やアジ化物（アジ化水素のアルカリ金属塩，ア
ルカリ土類金属塩等）等の活性化剤の存在下で、共役酵
素を介せずに直接色素を生成させる方法が挙げられる。
尚、活性化剤としてはこの他にチオシアン酸塩（例えば
KSCN，NaSCN等）やシアン酸塩（例えばKCNO等）等も効
果的に使用し得る。As another example of the method for measuring α-amylase activity using the oligosaccharide derivative of the present invention as a substrate, as described in JP-A-63-183595, hydrogen azide and azide are used. A method of directly producing a dye in the presence of an activator such as an alkali metal salt or an alkaline earth metal salt of hydrogen hydride without using a conjugate enzyme.
In addition, as the activator, thiocyanate (for example,
KSCN, NaSCN, etc.) and cyanate (eg, KCNO) can also be used effectively.

【００４８】特開昭63-183595号公報に記載のように非
還元末端グルコースに修飾基が導入されていないオリゴ
サッカライド誘導体を基質として用いるとα−アミラー
ゼによる糖転移反応がおこり、種々のグルコース数の基
質が生成し、α−アミラーゼの加水分解反応の一部しか
測定できず、また、種々の基質が生成し、反応系が複雑
になる等の問題があったが、本発明のオリゴサッカライ
ド誘導体を基質として用いた場合にはこのような問題点
は全て解消される。As described in JP-A-63-183595, when an oligosaccharide derivative in which a modifying group is not introduced into the non-reducing terminal glucose is used as a substrate, a transglycosylation reaction by α-amylase occurs and various glucose Of the α-amylase hydrolysis reaction, and only a part of the hydrolysis reaction of α-amylase could be measured.Moreover, various substrates were formed and the reaction system became complicated. When is used as a substrate, all of these problems are solved.

【００４９】本発明のオリゴサッカライド誘導体を基質
として用いるα−アミラーゼ活性測定法に於て、基質と
して用いるオリゴサッカライド誘導体の濃度は特に限定
されるものではないが、通常約0.1〜30mMが好ましく用
いられる。In the α-amylase activity measuring method using the oligosaccharide derivative of the present invention as a substrate, the concentration of the oligosaccharide derivative used as a substrate is not particularly limited, but usually about 0.1 to 30 mM is preferably used. .

【００５０】本発明のオリゴサッカライド誘導体を基質
として用いるα−アミラーゼ活性測定法に於て測定対象
となる試料は、α−アミラーゼを含有する検体なら何れ
にてもよく、例えば生体成分として唾液、膵液、血液、
血清、尿等が挙げられる。共役酵素のグルコアミラー
ゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ又はイソ
マルターゼとしては、特に限定されないが例えば動物、
植物、微生物由来のものが利用でき、夫々単独で、或は
組み合わせて用いられる。これら共役酵素の使用量は通
常0.5〜1000U/ml、好ましくは2〜500U/mlである。The sample to be measured in the α-amylase activity measuring method using the oligosaccharide derivative of the present invention as a substrate may be any sample containing α-amylase, for example, saliva, pancreatic juice as a biological component ,blood,
Serum, urine and the like. Conjugate enzymes glucoamylase, α-glucosidase, β-glucosidase or isomaltase are not particularly limited, for example, animals,
Those derived from plants and microorganisms can be used, and each is used alone or in combination. The amount of these conjugate enzymes to be used is generally 0.5 to 1000 U / ml, preferably 2 to 500 U / ml.

【００５１】共役酵素を使用しない測定法を実施する場
合に用いる本発明のオリゴサッカライド誘導体として
は、一般式[I]に於けるｎが０から２のものが好まし
く、中でもｎ＝１又は２がより好ましい。この場合、通
常、α−アミラーゼの活性化剤として公知であるアジ化
物やチオシアン酸塩等を添加するのが常法であるが、本
発明者らはこれらの他に塩化ナトリウムや塩化カリウム
等のアルカリ金属塩やシアン酸塩（例えばKCNO等）を加
えても同様の効果を示すことを見出している。これら活
性化剤の使用濃度は、その種類により自ら異なるが、通
常50mmol/l〜10mol/l程度が好ましく用いられる。The oligosaccharide derivative of the present invention used in the case of carrying out the assay method without using a conjugated enzyme is preferably one in which n in the general formula [I] is 0 to 2, and among them, n = 1 or 2 is preferable. More preferred. In this case, it is customary to add an azide or a thiocyanate, which is known as an activator of α-amylase, but the present inventors additionally use sodium chloride, potassium chloride, etc. It has been found that the same effect can be obtained by adding an alkali metal salt or a cyanate (for example, KCNO). The concentration of these activators varies depending on the type of the activators themselves, but usually about 50 mmol / l to 10 mol / l is preferably used.

【００５２】本発明に係るアミラーゼ活性測定法を実施
する測定条件としては、反応温度は特に限定されない
が、好ましくは約25〜40℃であり、反応時間は目的によ
り自由に選択できる。The measurement conditions for carrying out the amylase activity measurement method according to the present invention are not particularly limited, but are preferably about 25 to 40 ° C., and the reaction time can be freely selected depending on the purpose.

【００５３】至適pHとしては特に限定されないが、pH約
６〜８が好ましい例である。至適pHを維持する緩衝剤は
自由に選択でき、例えば、リン酸塩、トリスハイドロキ
シメチルアミノメタン−塩酸、グッドの緩衝剤などが任
意に選ばれる。The optimum pH is not particularly limited, but a preferable pH is about 6 to 8. The buffer for maintaining the optimum pH can be freely selected, and for example, phosphate, trishydroxymethylaminomethane-hydrochloric acid, Good's buffer and the like are arbitrarily selected.

【００５４】さらにα−アミラーゼの活性化剤として
は、基質として一般式[I]においてｎが３以上のオリゴ
サッカライド誘導体を用いる場合には例えば塩化ナトリ
ウム、塩化カルシウム、塩化カリウム等が使用され、基
質としてｎが２以下のオリゴサッカライド誘導体を用い
る場合には、先に述べたように、アジ化物やチオシアン
酸塩、シアン酸塩等、或は塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム等のアルカリ金属塩若しくは前者の何れかと後者の何
れかとの併用等が挙げられる。Further, as an activator of α-amylase, when an oligosaccharide derivative having n of 3 or more in the general formula [I] is used as a substrate, for example, sodium chloride, calcium chloride, potassium chloride or the like is used. When an oligosaccharide derivative having n of 2 or less is used as described above, as described above, azide, thiocyanate, cyanate or the like, or an alkali metal salt such as sodium chloride or potassium chloride, or the former And the combination of any of the latter.

【００５５】共役酵素の作用により遊離したフェノール
類又はナフトール類とカップリング（酸化縮合）させる
カプラーとしては4-アミノアンチピリン、3-メチル-2-
ベンゾチアゾリノンヒドラゾン(MBTH)、p-アミノ-N,N-
ジエチルアニリン等が挙げられるが、これらに限定され
るものではない。フェノール類又はナフトール類とカプ
ラーとをカップリング（酸化縮合）させるための酸化酵
素としては、ラッカーゼ、カテコールオキシダーゼ、チ
ロシナーゼ又はモノフェノールオキシダーゼ等が挙げら
れるが、これらは例えば、動物、植物、微生物由来のも
のが何れも利用でき、通常0.2〜10U/ml、好ましくは0.5
〜4U/mlの範囲で使用される。また、カップリング（酸
化縮合）させる為の酸化剤としては、ヨウ素酸又は／及
びその塩、過ヨウ素酸又は／及びその塩、過酸化水素等
が挙げられるが、これらに限定されない。Examples of couplers to be coupled (oxidatively condensed) with phenols or naphthols released by the action of a conjugate enzyme include 4-aminoantipyrine and 3-methyl-2-
Benzothiazolinone hydrazone (MBTH), p-amino-N, N-
Examples include, but are not limited to, diethylaniline. Examples of oxidases for coupling (oxidative condensation) between phenols or naphthols and couplers include laccase, catechol oxidase, tyrosinase, and monophenol oxidase, and these include, for example, those derived from animals, plants, and microorganisms. Any of them can be used, usually 0.2 to 10 U / ml, preferably 0.5
Used in the range of ~ 4U / ml. Examples of the oxidizing agent for coupling (oxidative condensation) include iodic acid and / or a salt thereof, periodic acid or / and a salt thereof, and hydrogen peroxide, but are not limited thereto.

【００５６】本発明のオリゴサッカライド誘導体は、そ
の非還元末端グルコースの６位の水酸基がＲなる基に置
換されている為、そのままではグルコアミラーゼ，α−
グルコシダーゼ，β−グルコシダーゼ又はイソマルター
ゼの基質とはならず、しかも水に易溶なものが多く、α
−アミラーゼとの親和性に優れているので、α−アミラ
ーゼの良好な特異基質となる。従って、本発明のオリゴ
サッカライド誘導体を基質として用いる測定法に於て
は、副反応が起こらず試薬盲検値は極めて小さく、測定
用試液が極めて安定である。また、単一の化合物を基質
とすることから、反応の化学量論が成立し、α−アミラ
ーゼの動力学的検知が可能となる。In the oligosaccharide derivative of the present invention, since the hydroxyl group at the 6-position of the non-reducing terminal glucose is substituted with a group R, glucoamylase, α-
It does not serve as a substrate for glucosidase, β-glucosidase or isomaltase, and is often easily soluble in water.
-It is a good specific substrate for α-amylase because of its excellent affinity for amylase. Accordingly, in the assay method using the oligosaccharide derivative of the present invention as a substrate, no side reaction occurs, the reagent blank value is extremely small, and the assay reagent solution is extremely stable. Further, since a single compound is used as a substrate, the stoichiometry of the reaction is established, and the kinetic detection of α-amylase becomes possible.

【００５７】また、本発明のオリゴサッカライド誘導体
を基質として用いるα−アミラーゼ活性測定法に於て
は、グルコアミラーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グル
コシダーゼ又はイソマルターゼ等の共役酵素を充分に使
用することができるので、α−アミラーゼ反応以降の反
応速度が速く、より正確で感度のよいα−アミラーゼ活
性の測定を行なうことができる。In the method for measuring α-amylase activity using the oligosaccharide derivative of the present invention as a substrate, a conjugate enzyme such as glucoamylase, α-glucosidase, β-glucosidase or isomaltase may be sufficiently used. As a result, the reaction rate after the α-amylase reaction is fast, and more accurate and sensitive measurement of α-amylase activity can be performed.

【００５８】更に、本発明に係る測定法に於ては、検出
遊離してくるニトロフェノール類若しくはインジゴ色素
類の吸収スペクトルを測定するか、若しくは遊離してく
るフェノール類又はナフトール類を4-アミノアンチピリ
ン、MBTH等と酸化カップリングし、その色素の吸収スペ
クトルを測定するか、又は遊離してくるウンベリフェロ
ン類の蛍光強度を測定する等により行なうので、検体中
に共存するグルコース、マルトース等の糖類や、アスコ
ルビン酸、ビリルビン等の還元性物質の影響をほとんど
受けない。 ＄ 本発明に係るアミラーゼ活性の測定方法は、一定条
件での反応速度を測定するレイトアッセイでも、あるい
は反応停止剤を使用するエンドポイントアッセイとして
もよく、いずれの測定方法も実施可能である。Further, in the measuring method according to the present invention, the absorption spectrum of nitrophenols or indigo dyes which are detected and detected is measured, or the phenols or naphthols which are released are converted into 4-aminophenols. Oxidative coupling with antipyrine, MBTH, etc., and measuring the absorption spectrum of the dye or measuring the fluorescence intensity of the released umbelliferones, etc., such as glucose, maltose, etc. coexisting in the sample It is hardly affected by saccharides and reducing substances such as ascorbic acid and bilirubin. The method for measuring amylase activity according to the present invention may be a late assay for measuring the reaction rate under a certain condition, or an endpoint assay using a reaction terminator, and any of the measuring methods can be performed.

【００５９】また、本発明に係る測定法は自動分析装置
への適応性も良く、必要に応じて用手法、自動分析の何
れにて行なうも可である。Further, the measuring method according to the present invention has good adaptability to an automatic analyzer, and can be carried out by any of a method and an automatic analysis as required.

【００６０】更にまた、本発明のオリゴサッカライド誘
導体を基質として用いた場合には、色素の呈色を測定す
る、所謂比色法で測定を行なうことができるので、簡便
な試験紙法や反応試薬を含有させた多層分析シート（多
層一体型定量分析フィルム）を使用する所謂乾式定量法
にも応用することができる。Furthermore, when the oligosaccharide derivative of the present invention is used as a substrate, the measurement can be carried out by a so-called colorimetric method, which measures the coloration of the dye. Can be applied to a so-called dry quantification method using a multi-layer analysis sheet (a multi-layer integrated quantitative analysis film) containing the same.

【００６１】本発明のオリゴサッカライド誘導体は、ま
た、例えば特開昭63−39600号公報に記載のヒト唾液腺
由来のα−アミラーゼとヒト膵由来のα−アミラーゼの
分別測定法、即ち、α−アミラーゼの加水分解作用を受
けて生じる分解生成物に、基質特異性の異なる２種以上
の共役酵素を作用させ、生じる成績体を測定することに
よって、ヒト膵由来のα−アミラーゼとヒト唾液腺由来
のα−アミラーゼの分別測定を行なう、α−アミラーゼ
アイソザイムの分別測定法等にも効果的な基質として充
分使用可能である。The oligosaccharide derivative of the present invention can also be prepared by, for example, a method for differentially measuring α-amylase derived from human salivary gland and α-amylase derived from human pancreas described in JP-A-63-39600, ie, α-amylase. By reacting two or more types of conjugate enzymes having different substrate specificities on the degradation products produced by the hydrolysis of α-amylase derived from human pancreas and α-amylase derived from human salivary glands, -It can be sufficiently used as an effective substrate also in a method for differential measurement of α-amylase isozyme, which performs differential measurement of amylase.

【００６２】また、一般式[I]に於てｎが１又は２のオ
リゴサッカライド誘導体を基質として用いた場合には共
役酵素が１種でもα−アミラーゼアイソザイムの分別測
定を行なうことができる。When an oligosaccharide derivative having n of 1 or 2 in the general formula [I] is used as a substrate, the α-amylase isozyme can be fractionated and measured even with one kind of conjugated enzyme.

【００６３】即ち、例えばｎが１の場合を例に挙げて説
明すると、測定原理は概略以下の通りである。That is, for example, the case where n is 1 will be described as an example. The principle of measurement is roughly as follows.

【００６４】[0064]

【式２】 （式中、Ｇ，Ｒ及びＲ'は前記と同じ。）(Equation 2) (In the formula, G, R and R ′ are the same as described above.)

【００６５】即ち、一般式[I]に於てｎ＝１の本発明の
オリゴサッカライド誘導体に試料中のα−アミラーゼが
作用すると上記２種の反応（反応(1)及び反応(2)）がＲ
基の種類に従って、ある割合で起こり、反応(2)によっ
てＲ'ＯＨが生成する。次いで反応(1)の生成物にα−グ
ルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、イソマルターゼ等
の共役酵素が１種以上作用すると反応(3)によりＧ−Ｏ
Ｒ'からＲ'ＯＨが生成する。That is, when the α-amylase in the sample acts on the oligosaccharide derivative of the present invention in which n = 1 in the general formula [I], the above two reactions (reaction (1) and reaction (2)) occur. R
It occurs at a certain ratio according to the type of the group, and the reaction (2) generates R′OH. Next, when one or more conjugate enzymes such as α-glucosidase, β-glucosidase and isomaltase act on the product of reaction (1), GO
R'OH is generated from R '.

【００６６】そこで、反応(2)により生成したＲ'ＯＨ量
（単位時間当りの）と反応(2)及び反応(3)により生成し
たＲ'ＯＨの総量（単位時間当りの）との比を求め、そ
の比率を基に、特開昭61−181564号公報に記載の方法に
準じてα−アミラーゼアイソザイムの分別測定を行なえ
ば良い。Therefore, the ratio of the amount of R'OH generated per reaction (2) (per unit time) to the total amount of R'OH generated per reaction (2) and reaction (3) (per unit time) is calculated as follows: Then, based on the ratio, the fractionation measurement of α-amylase isozyme may be performed according to the method described in JP-A-61-181564.

【００６７】尚、その場合には前述したアジ化物、チオ
シアン酸塩、シアン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリウ
ム等のα−アミラーゼ活性化剤を添加することが望まし
い。In this case, it is desirable to add an α-amylase activator such as the above-mentioned azide, thiocyanate, cyanate, sodium chloride or potassium chloride.

【００６８】本発明のオリゴサッカライド誘導体は、更
に、ヒト唾液腺由来のα−アミラーゼ（唾液型α−アミ
ラーゼ）抑制物質の共存下ヒト膵由来のα−アミラーゼ
（膵型α−アミラーゼ）活性を特異的に測定する膵型α
−アミラーゼ活性測定用基質としても用いることができ
る。この際、必要に応じて前述したような共役酵素を１
〜３種用い、また、必要に応じて上述したアジ化物、チ
オシアン酸塩、シアン酸塩、塩化ナトリウム、塩化カリ
ウム等のα−アミラーゼ活性化剤を添加する等は常法の
通りである。The oligosaccharide derivative of the present invention further specifically has a human pancreatic α-amylase (pancreatic α-amylase) activity in the presence of a human salivary gland-derived α-amylase (salivary α-amylase) inhibitor. Pancreatic type α to be measured
-It can also be used as a substrate for measuring amylase activity. At this time, if necessary, one conjugate enzyme as described above may be added.
As usual, addition of α-amylase activator such as azide, thiocyanate, cyanate, sodium chloride, potassium chloride and the like described above is used as required.

【００６９】唾液型α−アミラーゼ抑制物質としては、
例えばClin.Chem 28/7 1525〜1527(1982)記載の小麦胚
芽由来インヒビターや、唾液型α−アミラーゼを特異的
に抑制するモノクローナル抗体等を使用すればよく、こ
のようなモノクローナル抗体としては、例えば、特開昭
58−183098号公報、特開昭60−155134号公報、特開昭61
−164161号公報、特開昭61−194365号公報、特公昭63−
2600号公報等に記載のものが挙げられるが勿論これらに
限定されるものではない。Examples of the salivary α-amylase inhibitor include:
For example, Clin.Chem 28/7 1525 to 1527 (1982) described wheat germ-derived inhibitor or a monoclonal antibody that specifically inhibits salivary α-amylase may be used, such as a monoclonal antibody, for example, , JP
58-183098, JP-A-60-155134, JP-A-61
JP-164161, JP-A-61-194365, JP-B-63-
Nos. 2600 and 2600 are mentioned, of course, but not limited thereto.

【００７０】尚、モノクローナル抗体の使用に際して
は、活性の異なるモノクローナル抗体を必要により２種
以上組み合わせて使用する等は任意である。以下に実施
例を挙げるが、本発明はこれら実施例により何ら限定さ
れるものではない。When using monoclonal antibodies, it is optional to use two or more monoclonal antibodies having different activities, if necessary. Examples are described below, but the present invention is not limited by these examples.

【００７１】[0071]

【実施例】【Example】

実施例１．p-ニトロフェニル O-(6-S-ベンジル-6-チオ-
α-D-グルコピラノシル)-(1→4)-トリス｛O-α-D-グル
コピラノシル-(1→4)｝-α-D-グルコピラノシド（以
下、化合物１と略す。）Embodiment 1 FIG. p-Nitrophenyl O- (6-S-benzyl-6-thio-
α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4) -tris {O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4)}-α-D-glucopyranoside (hereinafter abbreviated as compound 1)

【化３５】 の合成Embedded image Synthesis of

【００７２】(1)p-ニトロフェニル O-(2,3,4-トリ-O-ア
セチル-6-S-アセチル-6-チオ-α-D-グルコピラノシル)-
(1→4)-トリス｛O-(2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-グル
コピラノシル)-(1→4)｝-2,3,6-トリ-O-アセチル-α-D-
グルコピラノシド（以下、フルアセチル−AcSG5Pと略
す。）(1) p-Nitrophenyl O- (2,3,4-tri-O-acetyl-6-S-acetyl-6-thio-α-D-glucopyranosyl)-
(1 → 4) -tris ｛O- (2,3,6-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)｝-2,3,6-tri-O-acetyl-α -D-
Glucopyranoside (hereinafter abbreviated as full acetyl-AcSG5P)

【化３６】 の合成Embedded image Synthesis of

【００７３】特開昭63−170393号公報に記載の方法によ
り合成したp-ニトロフェニル O-(6-ブロモ-6-デオキシ)
-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-O-α-D-グルコピラノ
シル-(1→4)-O-α-D-グルコピラノシル-(1→4)-O-α-D-
グルコピラノシル-(1→4)-α-D-グルコピラノシド（BrG
5P）を常法によりアセチル化して得たp-ニトロフェニル
O-(2,3,4-トリ-O-アセチル-6-ブロモ-6-デオキシ)-α-
D-グルコピラノシル-(1→4)-トリス｛O-(2,3,6-トリ-O-
アセチル-α-D-グルコピラノシル)-(1→4)｝-2,3,6-ト
リ-O-アセチル-α-D-グルコピラノシド（フルアセチル
−BrG5P）5.97gをドライアセトン 180mlに溶解し、drie
rite 6g及びチオ酢酸カリウム 40gを加えて25℃で一晩
攪拌した。反応終了をT.L.C（ジクロロメタン：メタノ
ール＝60：1V/V二重展開）にて確認した後、drieriteを
瀘別し、ジクロロメタンで洗浄して瀘液と洗液を合せ減
圧濃縮した。得られたシロップをカラムクロマトグラフ
ィ［Wakogel C-200（和光純薬工業(株)商品名）；溶出
液(a)ジクロロメタン(b)ジクロロメタン／メタノール＝
300／1(c)ジクロロメタン／メタノール＝100／1］に供
し、溶出液(c)よりフルアセチル−AcSG5P 5.54g（収率9
3％）を得た。P-Nitrophenyl O- (6-bromo-6-deoxy) synthesized by the method described in JP-A-63-170393
-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4) -O-α-D-
Glucopyranosyl- (1 → 4) -α-D-glucopyranoside (BrG
P-Nitrophenyl obtained by acetylation of 5P) by a conventional method
O- (2,3,4-tri-O-acetyl-6-bromo-6-deoxy) -α-
D-glucopyranosyl- (1 → 4) -tris ｛O- (2,3,6-tri-O-
Dissolve 5.97 g of acetyl-α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4)｝-2,3,6-tri-O-acetyl-α-D-glucopyranoside (full acetyl-BrG5P) in 180 ml of dry acetone and dry
6 g of rite and 40 g of potassium thioacetate were added, followed by stirring at 25 ° C. overnight. After completion of the reaction was confirmed by TLC (dichloromethane: methanol = 60: 1 V / V double development), the drierite was filtered off, washed with dichloromethane, and the filtrate and the washing were combined and concentrated under reduced pressure. The obtained syrup was subjected to column chromatography [Wakogel C-200 (trade name of Wako Pure Chemical Industries, Ltd.); eluent (a) dichloromethane (b) dichloromethane / methanol =
300/1 (c) dichloromethane / methanol = 100/1] and eluate (c) was used to obtain 5.54 g of full acetyl-AcSG5P (yield 9
3%).

【００７４】(2)化合物１の合成 (1)で合成したフルアセチル−AcSG5P 0.294mmolをメタ
ノールに溶解し、0.294mmolのナトリウムトキシドを含
むメタノール溶液を加え、25℃にて静置した。脱アセチ
ル体の生成をT.L.C（ブタノール：エタノール：水＝
４：２：１V/V/V）にて確認した後、ベンジルブロマイ
ド 0.294mmolを加えて、窒素気流下、40℃で攪拌した。
反応終了をT.L.C（ブタノール：エタノール：水＝４：
２：１V/V/V）にて確認した後、反応液を30℃で減圧濃
縮した。得られたシロップをカラムクロマトグラフィ
［Sephadex LH-20（ファルマシア社商品名）；溶出液メ
タノール］に供し、化合物１ 145mgを得た。尚、反応収
率、旋光度の測定結果を表Ａに、またＩＲ，¹Ｈ−ＮＭ
Ｒの結果を表Ｂに夫々示す。(2) Synthesis of Compound 1 0.294 mmol of fluoracetyl-AcSG5P synthesized in (1) was dissolved in methanol, a methanol solution containing 0.294 mmol of sodium toxide was added, and the mixture was allowed to stand at 25 ° C. TLC (butanol: ethanol: water =
4: 2: 1 V / V / V), 0.294 mmol of benzyl bromide was added, and the mixture was stirred at 40 ° C under a nitrogen stream.
The reaction was terminated by TLC (butanol: ethanol: water = 4:
(2: 1 V / V / V), and the reaction solution was concentrated under reduced pressure at 30 ° C. The resulting syrup was subjected to column chromatography [Sephadex LH-20 (trade name of Pharmacia); methanol as eluent] to obtain 145 mg of Compound 1. The measurement results of the reaction yield and the optical rotation are shown in Table A, and IR, ¹ H-NM
The results of R are shown in Table B.

【００７５】実施例２．〜３４．一般式[II]で示される
各種オリゴサッカライド誘導体の合成 実施例１に於けるベンジルブロマイドを表１の「原料ハ
ロゲン体」の欄に記載の各種ハロゲン体に置き換え実施
例１と同様にして非還元グルコースの６位にＳ原子を介
して各種置換基を導入したオリゴサッカライド誘導体
（化合物２〜34）を合成した。得られた化合物の収率、
旋光度を表Ａに、またＩＲ，¹Ｈ−ＮＭＲの結果を表Ｂ
に夫々示す。Embodiment 2 FIG. ~ 34. Synthesis of Various Oligosaccharide Derivatives Represented by General Formula [II] Non-reducing was carried out in the same manner as in Example 1 except that benzyl bromide in Example 1 was replaced with various halogens described in the column of "raw material halogen" in Table 1. Oligosaccharide derivatives (compounds 2 to 34) in which various substituents were introduced at the 6-position of glucose via an S atom were synthesized. Yield of the obtained compound,
Table A shows the optical rotation and Table B shows the results of IR and ¹ H-NMR.
Are shown below.

【００７６】[0076]

【表１】 [Table 1]

【００７７】[0077]

【表２】 [Table 2]

【００７８】[0078]

【表３】 [Table 3]

【００７９】[0079]

【表４】 [Table 4]

【００８０】[0080]

【表５】 [Table 5]

【００８１】[0081]

【表６】 [Table 6]

【００８２】[0082]

【表７】 [Table 7]

【００８３】[0083]

【表８】 [Table 8]

【００８４】[0084]

【表９】 [Table 9]

【００８５】[0085]

【表１０】 [Table 10]

【００８６】[0086]

【表１１】 [Table 11]

【００８７】[0087]

【表１２】 [Table 12]

【００８８】[0088]

【表１３】 [Table 13]

【００８９】[0089]

【表１４】 [Table 14]

【００９０】[0090]

【表１５】 [Table 15]

【００９１】[0091]

【表１６】 [Table 16]

【００９２】実施例３５．化合物１のスルホキシド体
（以下、化合物35と略す。）Embodiment 35 FIG. Sulfoxide form of compound 1 (hereinafter abbreviated as compound 35)

【化３７】 の合成 化合物１ 0.057mmmolを酢酸に溶解し、0℃に冷却して暗
所にて、m-クロロ過安息香酸 0.057mmolを加え、暗所に
て、25℃で攪拌反応させた。反応終了をT.L.C（ブタノ
ール：エタノール：水＝４：２：１V/V/V）にて確認し
た後、反応液を水で抽出した。水層を酸性条件下、ジク
ロロメタンで洗浄した後、減圧濃縮し、未反応の化合物
１、化合物35−I（Ｒ体）及び35−II（Ｓ体）（化合物3
5の異性体２種）及び化合物１のスルホン体の混合物 67
mgを得た。この混合物を高速液体クロマトグラフィ(HPL
C)に供し、35−I（Ｒ体） 13.2mg及び35−II（Ｓ体） 1
2.1mgを得た。収率：Ｒ体22％、Ｓ体20％。旋光度
[α]_D：Ｒ体＋188°(CH₃OH)、Ｓ体＋167°(CH₃OH)。
尚、ＩＲ及び¹Ｈ−ＮＭＲの結果は表Ｃに示す。Embedded image Compound 1 0.057 mmol of Compound 1 was dissolved in acetic acid, cooled to 0 ° C., and 0.057 mmol of m-chloroperbenzoic acid was added in a dark place, followed by a reaction at 25 ° C. with stirring in a dark place. After confirming the completion of the reaction by TLC (butanol: ethanol: water = 4: 2: 1 V / V / V), the reaction solution was extracted with water. The aqueous layer was washed with dichloromethane under acidic conditions, and then concentrated under reduced pressure to obtain unreacted Compound 1, Compound 35-I (R form) and 35-II (S form) (Compound 3
Mixture of two isomers of 5) and the sulfone of compound 1 67
mg was obtained. This mixture was subjected to high performance liquid chromatography (HPL
C), 13.2 mg of 35-I (R form) and 35-II (S form) 1
2.1 mg were obtained. Yield: R-form 22%, S-form 20%. Optical rotation
[α] _D : R-form + 188 ° (CH ₃ OH), S-form + 167 ° (CH ₃ OH).
The results of IR and ¹ H-NMR are shown in Table C.

【００９３】[0093]

【表１７】 [Table 17]

【００９４】実施例３６．化合物２のスルホキシド体
（以下、化合物36と略す。）の合成 実施例35に於て、化合物１の代りに化合物２を用い、そ
れ以外は実施例35と全く同様にして化合物36−I（Ｒ
体）及び36−II（Ｓ体）を合成した。収率：Ｒ体14％、
Ｓ体11％。Embodiment 36 FIG. Synthesis of sulfoxide form of compound 2 (hereinafter abbreviated as compound 36) In Example 35, Compound 2 was used in place of Compound 1 and Compound 36-I (R
Isomer) and 36-II (S-isomer) were synthesized. Yield: R-form 14%,
S body 11%.

【００９５】実施例３７．化合物10のスルホキシド体
（以下、化合物37と略す。）の合成 実施例35に於て、化合物１の代りに化合物10を用い、そ
れ以外は実施例35と全く同様にして化合物37−I（Ｒ
体）及び37−II（Ｓ体）を合成した。収率：Ｒ体25％、
Ｓ体21％。旋光度[α]_D：Ｒ体＋138°(CH₃OH)、Ｓ体＋1
50°(CH₃OH)。尚、¹Ｈ−ＮＭＲの結果は表Ｄに示す。Embodiment 37 FIG. Synthesis of Sulfoxide Form of Compound 10 (hereinafter abbreviated as Compound 37) In Example 35, Compound 10 was used in place of Compound 1 and the rest of Compound 37-I (R
Isomer) and 37-II (S-isomer) were synthesized. Yield: 25% of R-form
S body 21%. Optical rotation [α] _D : R-form + 138 ° (CH ₃ OH), S-form + 1
50 ° (CH ₃ OH). The results of ¹ H-NMR are shown in Table D.

【００９６】[0096]

【表１８】 [Table 18]

【００９７】実施例３８．化合物１のスルホン体（以
下、化合物38と略す。）Embodiment 38 FIG. Sulfone form of compound 1 (hereinafter abbreviated as compound 38)

【化３８】 の合成 化合物１ 0.028mmmolを酢酸に溶解し、0℃に冷却して暗
所にて、m-クロロ過安息香酸 0.085mmolを加え、暗所に
て、25℃で攪拌反応させた。反応終了をT.L.C（ブタノ
ール：エタノール：水＝４：２：１V/V/V）にて確認し
た後、反応液を水で抽出した。水層を酸性条件下、ジク
ロロメタンで洗浄した後、減圧濃縮し、化合物38 30mg
を得た。収率：43％。旋光度[α]_D：＋169°(CH₃OH)。
尚、ＩＲ及び¹Ｈ−ＮＭＲの結果は表Ｅに示す。Embedded image 0.028 mmol of Compound 1 was dissolved in acetic acid, cooled to 0 ° C., and 0.085 mmol of m-chloroperbenzoic acid was added in a dark place, followed by a reaction at 25 ° C. with stirring in a dark place. After confirming the completion of the reaction by TLC (butanol: ethanol: water = 4: 2: 1 V / V / V), the reaction solution was extracted with water. The aqueous layer was washed with dichloromethane under acidic conditions, and then concentrated under reduced pressure to give Compound 38 (30 mg).
I got Yield: 43%. Optical rotation [α] _D : + 169 ° (CH ₃ OH).
The results of IR and ¹ H-NMR are shown in Table E.

【００９８】実施例３９．化合物２のスルホン体（以
下、化合物39と略す。）の合成 実施例38に於て、化合物１の代りに化合物２を用い、そ
れ以外は実施例38と全く同様にして化合物39を合成し
た。収率：88％。旋光度[α]_D：＋91°(CH₃OH)。尚、Ｉ
Ｒ及び¹Ｈ−ＮＭＲの結果は表Ｅに示す。Embodiment 39 FIG. Synthesis of Sulfone Form of Compound 2 (hereinafter abbreviated as Compound 39) Compound 39 was synthesized in the same manner as in Example 38 except that compound 2 was used instead of compound 1 in Example 38. Yield: 88%. Optical rotation [α] _D : + 91 ° (CH ₃ OH). Note that I
The results of R and ¹ H-NMR are shown in Table E.

【００９９】実施例４０．化合物10のスルホン体（以
下、化合物40と略す。）の合成 実施例38に於て、化合物１の代りに化合物10を用い、そ
れ以外は実施例38と全く同様にして化合物40を合成し
た。収率：13％。旋光度[α]_D：156°(CH₃OH)。尚、¹Ｈ
−ＮＭＲの結果は表Ｅに示す。Embodiment 40 FIG. Synthesis of Sulfone Form of Compound 10 (hereinafter abbreviated as Compound 40) Compound 40 was synthesized in the same manner as in Example 38 except that compound 10 was used instead of compound 1 in Example 38. Yield: 13%. Optical rotation [α] _D : 156 ° (CH ₃ OH). In addition, ¹ H
The results of the NMR are shown in Table E.

【０１００】[0100]

【表１９】 [Table 19]

【０１０１】実施例４１．p-ニトロフェニル O-[6-S-
｛(2-モルホリノ)エチル｝-６-チオ-α-D-グルコピラノ
シル]-(1→4)-トリス｛O-α-D-グルコピラノシル-(1→
4)｝-α-D-グルコピラノシド（化合物23）の合成 トシルクロライド 236mg（1.24mmol）をジクロロメタン
に溶解した後、０℃に冷却し、4ー(2-ハイドロキシル)モ
ルホリン 0.1ml（0.825mmol）とピリジン 0.07ml（0.82
5mmol）を加え、５℃で一晩攪拌した。反応終了をＴ.
Ｌ.Ｃ（ジクロロメタン：メタノール＝20:１）にて確認
した後、反応液を2N-HClにて抽出した。2N-HCl層をジク
ロロメタンで洗浄し、続いて抽出液をNa₂C0₃にてアルカ
リ性とし、ジクロロメタンにて抽出した。これを無水硫
酸ナトリウムで乾燥した後、25℃にて減圧濃縮し、一般
式Ｒ²ＯＲ_Sで示される化合物（但し、Ｒ²：モルホリノ
エチル基、Ｒ_S：トシル基）とピリジンの混合物を得
た。実施例１の(1)と同様にして得られたフルアセチル-
AcSG5P 289.2mg（0.176mmol）をメタノール 30mlに溶解
した後、０℃に冷却し、ナトリウムメトキシドのメタノ
ール溶液 0.12ml（0.176mmolのナトリウムメトキシドを
含有）を加え、０℃にて30分攪拌した。これに、調製直
後の上記一般式Ｒ²ＯＲ_Sで示される化合物（但し、
Ｒ²：モルホリノエチル基、Ｒ_S：トシル基）とピリジン
の混合物を加え、窒素気流下５℃で20時間攪拌した。反
応終了をＴ.Ｌ.Ｃ（アセトン：酢酸：H₂O＝5:1:1 v/v/v
二重展開）にて確認した後、反応液をイオン交換樹脂
アンバーライト IR-120(H⁺)にて中和した。樹脂を濾別
し、メタノールで洗浄し、濾液と洗液をあわせて30℃に
て減圧濃縮した。得られた残渣をカラムクロマトグラフ
ィ〔Sephadex LH-20(ファルマシア社製);溶出液メタノ
ール,sep-pak(plus ENV._tC₁₈,ウォーターズ社製);溶出
液(a)水(b)水：メタノール＝10：２〕に供し、化合物23
（159mg）を得た。収率84％。旋光度[α]_D、ＩＲ及び¹
Ｈ−ＮＭＲは実施例23の結果と一致した。Embodiment 41 FIG. p-Nitrophenyl O- [6-S-
{(2-morpholino) ethyl} -6-thio-α-D-glucopyranosyl]-(1 → 4) -tris ｛O-α-D-glucopyranosyl- (1 →
4) Synthesis of｝ -α-D-glucopyranoside (Compound 23) After dissolving 236 mg (1.24 mmol) of tosyl chloride in dichloromethane, it was cooled to 0 ° C. and 0.1 ml (0.825 mmol) of 4- (2-hydroxyl) morpholine. And pyridine 0.07 ml (0.82
5 mmol) and stirred at 5 ° C. overnight. Terminate the reaction with T.
After confirmation by LC (dichloromethane: methanol = 20: 1), the reaction solution was extracted with 2N-HCl. The 2N-HCl layer was washed with dichloromethane, then the extract was made alkaline with Na ₂ CO ₃ and extracted with dichloromethane. This was dried over anhydrous sodium sulfate, and concentrated under reduced pressure at 25 ° C., the general formula R ² compound represented by OR _S (where, R ^2: morpholinoethyl group, R _S: tosyl group) to give a mixture of pyridine Was. Fluacetyl- obtained in the same manner as in Example 1 (1)
After dissolving 289.2 mg (0.176 mmol) of AcSG5P in 30 ml of methanol, the solution was cooled to 0 ° C., 0.12 ml of a methanol solution of sodium methoxide (containing 0.176 mmol of sodium methoxide) was added, and the mixture was stirred at 0 ° C. for 30 minutes. . In addition, a compound represented by the above general formula R ² OR _S immediately after preparation (provided that
A mixture of R ² : morpholinoethyl group, R _S : tosyl group) and pyridine was added, and the mixture was stirred at 5 ° C. for 20 hours under a nitrogen stream. The reaction was terminated by TLC (acetone: acetic acid: H ₂ O = 5: 1: 1 v / v / v
The reaction mixture was neutralized with an ion exchange resin Amberlite IR-120 (H ⁺ ). The resin was separated by filtration, washed with methanol, and the filtrate and the washing were combined and concentrated at 30 ° C. under reduced pressure. The obtained residue was purified by column chromatography [Sephadex LH-20 (Pharmacia); eluent _{methanol, sep-pak (plus ENV t} C 18, Waters.); Eluent (a) water (b) water: methanol = 10: 2] to give compound 23
(159 mg) was obtained. Yield 84%. Optical rotation [α] _D , IR and ¹
1 H-NMR was consistent with the result of Example 23.

【０１０２】実施例４２．〜４４．一般式[II]で示され
る各種オリゴサッカライド誘導体の合成 実施例４１と同様にして、一般式[II]に於けるＲ¹、Ｒ²
及びｎが表Ｆに記載の如き各種オリゴサッカライド誘導
体（化合物42〜44）を合成した。得られた化合物の収
率、旋光度を表Ｆに、またＩＲ，¹Ｈ−ＮＭＲの結果を
表Ｇに夫々示す。Embodiment 42 FIG. ~ 44. Synthesis of Various Oligosaccharide Derivatives Represented by General Formula [II] In the same manner as in Example 41, R ¹ , R ²
And various oligosaccharide derivatives (compounds 42 to 44) as shown in Table F were synthesized. Table F shows the yield and optical rotation of the obtained compound, and Table G shows the results of IR and ¹ H-NMR.

【０１０３】[0103]

【表２０】 [Table 20]

【０１０４】[0104]

【表２１】 [Table 21]

【０１０５】実施例４５．各種オリゴサッカライド誘導
体基質のα−アミラーゼによる水解速度及びKm値の測定 （操作法）表Ｈに記載の各種オリゴサッカライド誘導体
を基質として用い、50mM BES[N,N-ビス(2-ハイドロキシ
エチル)-2-アミノエタンスルホン酸]-NaOH緩衝液(pH7.
6，20mM NaCl及び2mM CaCl₂含有)中に於て、常法によ
り、Km値(mM)及び水解速度(Vmax)を求めた。Embodiment 45 FIG. Measurement of Water Degradation Rate and Km Value of Various Oligosaccharide Derivative Substrates by α-Amylase (Procedure) Using 50 mM BES [N, N-bis (2-hydroxyethyl)-, using various oligosaccharide derivatives described in Table H as substrates. 2-aminoethanesulfonic acid] -NaOH buffer (pH 7.
Km value (mM) and water dissociation rate (Vmax) were determined in a conventional method in 6,20 mM NaCl and 2 mM CaCl ₂ .

【０１０６】（結果）測定結果を表Ｈに示す。尚、水解
速度は、(p-ニトロフェニル)マルトペンタオシド(G5P)
に対する水解速度を１とした相対値で示した。 実施例４６．各種オリゴサッカライド誘導体基質のα−
アミラーゼによる水解位置の検索 実施例45で用いたオリゴサッカライド誘導体基質の夫々
について水解位置を調べた。(Results) Table H shows the measurement results. In addition, the hydrolysis rate is (p-nitrophenyl) maltopentaoside (G5P)
The relative value was set as the water dissolution rate with respect to 1. Embodiment 46 FIG. Α- of various oligosaccharide derivative substrates
Search for position of hydrolysis by amylase The position of hydrolysis was examined for each of the oligosaccharide derivative substrates used in Example 45.

【０１０７】（操作法）50mM BES[N,N-ビス(2-ハイドロ
キシエチル)-2-アミノエタンスルホン酸]-NaOH緩衝液(p
H7.6，20mM NaCl及び2mM CaCl₂含有)に基質を1.5mM溶解
させた溶液50μlと、ヒト膵由来α−アミラーゼ(HPA)又
はヒト唾液腺由来のα−アミラーゼ(HSA)5μlを混合
し、37℃で5〜10分間加温した。反応混合物に7.5％酢酸
溶液100μlを加え、酵素反応を停止させた。該試料中の
α−アミラーゼによる水解生成物量はHPLCにより求め
た。(Operation method) 50 mM BES [N, N-bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid] -NaOH buffer (p
(H7.6, containing ₂₀ mM NaCl and 2 mM CaCl ₂ ) 50 μl of a 1.5 mM solution of the substrate and 5 μl of human pancreatic α-amylase (HPA) or human salivary gland α-amylase (HSA) were mixed. Warmed at <RTIgt; 5 C </ RTI> for 5-10 minutes. 100 μl of a 7.5% acetic acid solution was added to the reaction mixture to stop the enzyme reaction. The amount of hydrolyzate produced by α-amylase in the sample was determined by HPLC.

【０１０８】（結果）測定結果を表Ｈに示す。(Results) Table H shows the measurement results.

【０１０９】[0109]

【表２２】 [Table 22]

【０１１０】[0110]

【表２３】 [Table 23]

【０１１１】[0111]

【表２４】 [Table 24]

【０１１２】[0112]

【表２５】 [Table 25]

【０１１３】[0113]

【表２６】 [Table 26]

【０１１４】表Ｈから明らかな如く、本発明に係る一連
のオリゴサッカライド誘導体は、α−アミラーゼ活性測
定用基質として、 (1)水解速度が速い（特開平1−45391号公報に記載の基
質BG5Pより水解速度が速いものとしては、化合物４，５
−II，６〜11，14〜17，23，25〜27，31，39が挙げら
れ、その中でも特に化合物６，８，23はBG5Pの約２倍と
高感度である。）。 (2)特開昭63−39600号公報に記載の分別測定法に於ける
基質FG5Pより分別性の優れた基質として使用できる（特
に化合物23及び29は夫々FG5Pの約1.35倍及び1.2倍の分
別性を持つ。）。 (3)何れも、膵型α−アミラーゼでの水解速度が唾液型
α−アミラーゼの水解速度より速く、膵型α−アミラー
ゼ活性測定用基質として充分使用できる（その中でも、
化合物39は膵型α−アミラーゼでの水解速度が唾液型α
−アミラーゼの３倍と高く、また、膵型α−アミラーゼ
でBG5Pの約1.5倍の水解速度を持つ。従って、唾液型α
−アミラーゼ抑制物質の使用量が少なくてすむ上、膵型
α−アミラーゼに対する感度が高いことから、特に有効
である。）。 という特長を有する。As is clear from Table H, a series of oligosaccharide derivatives according to the present invention can be used as a substrate for measuring α-amylase activity as follows: (1) It has a high hydrolysis rate (substrate BG5P described in JP-A-1-45391). Compounds having higher hydrolysis rates include compounds 4, 5
-II, 6 to 11, 14 to 17, 23, 25 to 27, 31, and 39, among which compounds 6, 8, and 23 are particularly about twice as high as BG5P and have high sensitivity. ). (2) It can be used as a substrate having a better separation property than the substrate FG5P in the fractionation measurement method described in JP-A-63-39600 (especially, compounds 23 and 29 are separated by about 1.35 times and 1.2 times, respectively, of FG5P. With nature.). (3) In any case, the hydrolysis rate of pancreatic α-amylase is faster than the hydrolysis rate of salivary α-amylase, and can be sufficiently used as a substrate for measuring pancreatic α-amylase activity (in particular,
Compound 39 has a water hydrolysis rate of pancreatic α-amylase with salivary α
-3 times higher than amylase and about 1.5 times higher than BG5P for pancreatic α-amylase. Therefore, saliva type α
-It is particularly effective because it requires a small amount of an amylase inhibitor and has high sensitivity to pancreatic α-amylase. ). It has the feature of.

【０１１５】実施例４７．各種オリゴサッカライド誘導
体基質のNaN₃存在下でのα−アミラーゼによる水解生成
物比及び水解速度比の測定 （操作法）表Ｊに記載の各種オリゴサッカライド誘導体
を基質として用い、50mM BES[N,N-ビス(2-ハイドロキシ
エチル)-2-アミノエタンスルホン酸]-NaOH緩衝液(pH7.
6，20mM NaCl及び2mM CaCl₂含有)に基質を1.4mMとなる
ように溶解し、基質液とした。この基質液に活性化剤と
して１ＭのNaN₃を添加したものと、添加しないものを夫
々調製した。基質液１mlにヒト膵型α−アミラーゼ（Ｈ
ＰＡ）又はヒト唾液型α−アミラーゼ（ＨＳＡ）を100
μl加え、37℃で15分反応させた後、7.5％酢酸100μlに
て反応を止め、ＨＰＬＣにて生成物を確認し、水解生成
物比及び水解速度比を求めた。Embodiment 47 FIG. Measurement of hydrolysis product ratio and hydrolysis rate ratio of α-amylase of various oligosaccharide derivative substrates in the presence of NaN ₃ (Operation method) Using various oligosaccharide derivatives described in Table J as substrates, 50 mM BES [N, N -Bis (2-hydroxyethyl) -2-aminoethanesulfonic acid] -NaOH buffer (pH 7.
The substrate was dissolved at 1.4 mM in 6, ₂₀ mM NaCl and 2 mM CaCl _{2 to} obtain a substrate solution. To this substrate solution, 1 M NaN ₃ as an activator was added, and one without the addition was prepared. Human pancreatic α-amylase (H
PA) or human salivary α-amylase (HSA)
After addition of μl and reaction at 37 ° C. for 15 minutes, the reaction was stopped with 100 μl of 7.5% acetic acid, the product was confirmed by HPLC, and the ratio of hydrolyzed product and hydrolyzed rate were determined.

【０１１６】（結果）測定結果を表Ｊ及び表Ｋに示す。
表Ｊ及び表Ｋから明らかなように2-クロロ-4-ニトロフ
ェニルマルトトリオシド（Ｇ３Ｃ）とその誘導体（化合
物32及び化合物42）並びに2-クロロ-4-ニトロフェニル
マルトテトラオシド（Ｇ４Ｃ）とその誘導体（化合物33
及び化合物43）のすべてにおいて、NaN₃添加により2-ク
ロロ-4-ニトロフェノール（以下、ＣＮＰと略記す
る。）が生成し、ＣＮＰ生成速度も４〜56倍と増加する
ことが判る。(Results) The measurement results are shown in Tables J and K.
As is clear from Tables J and K, 2-chloro-4-nitrophenylmaltotrioside (G3C) and its derivatives (compounds 32 and 42) and 2-chloro-4-nitrophenylmaltotetraoside (G4C) And its derivatives (compound 33
Also, in all of Compound 43), it can be seen that 2-chloro-4-nitrophenol (hereinafter abbreviated as CNP) is produced by the addition of NaN ₃ , and the CNP production rate is increased by 4- to 56-fold.

【０１１７】また、Ｇ４Ｃに於ては、NaN₃存在下でα−
アミラーゼ総活性が低下しているのに対し、非還元末端
をブロックした化合物33と化合物43では総活性も増加し
ており、これは修飾基導入による効果と考えられる。更
に、Ｇ４Ｃ並びにその誘導体（化合物33及び化合物43）
では、NaN₃の添加で有意にＣＮＰを生成することが判
る。以上のことから、化合物32,33,42,43は活性化剤の
存在下で共役酵素を使用せずにα−アミラーゼ活性の測
定を行うことができることが判る。[0117] Also, Te is at the G4C, NaN ₃ in the presence α-
While the total amylase activity was reduced, the total activity of compound 33 and compound 43 whose non-reducing ends were blocked was also increased, which is considered to be the effect of the introduction of the modifying group. Further, G4C and its derivatives (Compound 33 and Compound 43)
It can be seen that CNP is produced significantly by the addition of NaN ₃ . From the above, it can be seen that the compounds 32, 33, 42, and 43 can measure α-amylase activity in the presence of an activating agent without using a coupling enzyme.

【０１１８】[0118]

【表２７】 [Table 27]

【０１１９】[0119]

【表２８】 [Table 28]

【０１２０】実施例４８．α−アミラーゼ活性の測定 （測定試液）化合物８．並びに、p-ニトロフェニル O-
(6-O-(ヘ゛ンシ゛ル-α-D-グルコピラノシル)-(1→4)-トリス
｛O-α-D-グルコピラノシル-(1→4)｝-α-D-グルコピラ
ノシド(BG5P)各90mgをグルコアミラーゼ400単位、α-グ
ルコシダーゼ300単位、20mmol/l NaCl及び2mmol/l CaCl
₂を含む50mmol/l BES-NaOH緩衝液(pH7.6) 30mlに溶解
し、測定試液とした。Embodiment 48 FIG. Measurement of α-amylase activity (measurement test solution) Compound 8. And p-nitrophenyl O-
(6-O- (pentyl-α-D-glucopyranosyl)-(1 → 4) -tris ｛O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4)｝-α-D-glucopyranoside (BG5P) Amylase 400 units, α-glucosidase 300 units, 20 mmol / l NaCl and 2 mmol / l CaCl
₂ was dissolved in 30 ml of a 50 mmol / l BES-NaOH buffer solution (pH 7.6) to give a test solution.

【０１２１】（測定方法）測定試液 2mlに検体血清 100
μlを加え、37℃に加温し、この反応液の波長405nmに於
ける吸光度変化を測定した。別に、α−アミラーゼ活性
既知の標準検体を用い、上記と同様に操作し、検量関係
を求め、この検量線から検体のα−アミラーゼ活性を求
めた。この時の標準検体の各希釈段階に於けるα−アミ
ラーゼ活性（Somogyi単位/dl）と波長405nmに於ける１
分間当りの吸光度増加量（ΔA）との関係を図１に示
す。尚、図１に於て−○−は化合物８を用いた場合の結
果を、又−×−はBG5Pを用いた場合の結果を夫々示す。
図１より明らかな如く、α−アミラーゼ活性（Somogyi
単位/dl）に対してプロットした吸光度増加量（ΔA/mi
n）を結ぶ検量線はどちらの場合も原点を通る直線とな
り、検量線は良好な定量性を示しているが、化合物８の
場合はBG5Pに比べ、約1.7倍高感度であった。(Measurement method) Sample serum was added to 2 ml of the test solution.
The mixture was heated to 37 ° C., and the change in absorbance of the reaction solution at a wavelength of 405 nm was measured. Separately, a standard sample with a known α-amylase activity was used and operated in the same manner as above to determine the calibration relationship, and the α-amylase activity of the sample was determined from this calibration curve. At this time, the α-amylase activity (Somogyi unit / dl) in each dilution step of the standard sample and 1 at a wavelength of 405 nm.
FIG. 1 shows the relationship with the amount of increase in absorbance per minute (ΔA). In FIG. 1,-○-shows the results when compound 8 was used, and-×-shows the results when BG5P was used.
As is clear from FIG. 1, α-amylase activity (Somogyi
Absorbance increase plotted against unit / dl) (ΔA / mi
The calibration curve connecting n) was a straight line passing through the origin in both cases, and the calibration curve showed good quantification. However, Compound 8 was about 1.7 times more sensitive than BG5P.

【０１２２】実施例４９．α−アミラーゼ活性の分別測
定 （測定試液） 第１液 化合物23及びp-ニトロフェニル O-[6-デオキシ-6-｛(2-
ピリジル)アミノ｝-α-D-グルコピラノシル]-(1→4)-ト
リス｛O-α-D-グルコピラノシル-(1→4)｝-α-D-グルコ
ピラノシド(FG5P)各300mgとイソマルターゼ25単位を50m
lの0.08M 3,3-ジメチルグルタル酸−NaOH緩衝液(pH6.
9，20mmol/lのNaClを含む)に溶解し夫々第１液とした。 第２液 化合物23及びFG5P各300mgとα-グルコシダーゼ1150単位
を50mlの0.08M 3,3-ジメチルグルタル酸−NaOH緩衝液(p
H6.9，20mmol/lのNaClを含む)に溶解し夫々第２液とし
た。 酵素試料液 ヒト唾液型α−アミラーゼ（シグマ社製）とヒト膵液か
ら調製したヒト膵型α−アミラーゼを各々5.5単位/lに
調製後、３：１，１：１，１：３の比で混合した。Embodiment 49 FIG. Differential measurement of α-amylase activity (measurement test solution) Liquid 1 Compound 23 and p-nitrophenyl O- [6-deoxy-6-｛(2-
Pyridyl) amino {-α-D-glucopyranosyl]-(1 → 4) -tris {O-α-D-glucopyranosyl- (1 → 4)}-α-D-glucopyranoside (FG5P) 300mg each and 25 units of isomaltase 50m
l of 0.08 M 3,3-dimethylglutaric acid-NaOH buffer (pH 6.
(Including 9, 20 mmol / l of NaCl), respectively, to obtain first liquids. Second liquid Compound 23 and 300 mg each of FG5P and 1150 units of α-glucosidase were added to 50 ml of 0.08 M 3,3-dimethylglutaric acid-NaOH buffer solution (p
H6.9, containing 20 mmol / l NaCl) to obtain second solutions. Enzyme sample solution Human salivary α-amylase (manufactured by Sigma) and human pancreatic α-amylase prepared from human pancreatic juice are each prepared at 5.5 units / l, and then mixed at a ratio of 3: 1, 1: 1, 1: 3. did.

【０１２３】（測定方法）30℃に予備加温した第１液又
は第２液300μlに50μlの酵素試料液を加え、よく混合
後、30℃に保温し、この反応液の400nmに於ける吸光度
の経時変化を、第１液を使用する際には第１液に精製水
50μlを加えよく混合したものを、第２液を使用する際
には第２液に精製水50μlを加えよく混合したものを盲
検として測定した。次いで、第１液中での吸光度の変化
率（ΔE₁/min）と第２液中での吸光度の変化率（ΔE₂/m
in）を求めてΔE₁/min／ΔE₂/minを算出した。ΔE₁/min
／ΔE₂/minと試料液中のヒト膵型α−アミラーゼの活性
比率との関係を図２に示す。尚、図２に於て−○−は化
合物23を用いた場合の結果を、また、−×−はFG5Pを用
いた場合の結果を夫々示す。図２より明らかなように、
どちらの場合もΔE₁/min／ΔE₂/minとヒト膵型α−アミ
ラーゼの活性比率との間には良好な直線関係が得られる
が、化合物23の場合は、FG5Pの約1.35倍の分別性を示し
ている。(Measurement method) Add 50 μl of the enzyme sample solution to 300 μl of the first solution or the second solution preheated to 30 ° C., mix well, keep the temperature at 30 ° C., and measure the absorbance of the reaction solution at 400 nm. When the first solution is used, the purified water is added to the first solution.
When 50 μl was added and mixed well, when the second liquid was used, 50 μl of purified water was added to the second liquid and mixed well, and the mixture was measured blindly. Next, the rate of change of absorbance in the first liquid (ΔE ₁ / min) and the rate of change of absorbance in the second liquid (ΔE ₂ / m
in) was calculated, and ΔE ₁ / min / ΔE ₂ / min was calculated. ΔE ₁ / min
FIG. 2 shows the relationship between / ΔE ₂ / min and the activity ratio of human pancreatic α-amylase in the sample solution. In FIG. 2,-○-shows the results when compound 23 was used, and-×-shows the results when FG5P was used. As is clear from FIG.
In both cases, a good linear relationship is obtained between ΔE ₁ / min / ΔE ₂ / min and the activity ratio of human pancreatic α-amylase. In the case of compound 23, however, the discrimination was about 1.35 times that of FG5P. Is shown.

【０１２４】[0124]

【発明の効果】本発明のオリゴサッカライド誘導体は、
α−アミラーゼ活性測定用基質として、またヒトα−ア
ミラーゼの各アイソザイム活性の分別測定用基質とし
て、或は膵型α−アミラーゼの特異的測定用基質として
極めて有用であり、 (1)既存の同種基質と比べて、高感度である、分別
性に優れている、膵型α−アミラーゼの特異的測定用
基質として用いた場合に唾液型α−アミラーゼ抑制物質
の使用量が少なくてすみ、且つ感度も良い、 (2)既存の同種オリゴサッカライド誘導体（非還元末端
グルコースの６位にＯ原子を介して各種置換基を有する
オリゴサッカライド誘導体）と比べて合成が容易であ
る、等の点に顕著な効果を奏するものであり斯業に貢献
するところ大なる発明である。The oligosaccharide derivative of the present invention comprises:
It is extremely useful as a substrate for measuring α-amylase activity, as a substrate for differential measurement of each isozyme activity of human α-amylase, or as a substrate for specific measurement of pancreatic α-amylase. Compared with high sensitivity, excellent separability, when used as a substrate for specific measurement of pancreatic α-amylase, the amount of the salivary α-amylase inhibitor used is small, and the sensitivity is good. (2) It has a remarkable effect in that it is easier to synthesize than existing oligosaccharide derivatives of the same kind (oligosaccharide derivatives having various substituents via an O atom at the 6-position of the non-reducing terminal glucose). It is a great invention that plays and contributes to the industry.

【０１２５】[0125]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】実施例48に於て得られた、α−アミラーゼ活性
（Somogyi単位/dl）と波長405nmに於ける１分間当りの
吸光度増加量（ΔA）との関係を示す。FIG. 1 shows the relationship between α-amylase activity (Somogyi unit / dl) and increase in absorbance per minute (ΔA) at a wavelength of 405 nm, obtained in Example 48.

【図２】実施例49に於て得られた、ΔE₁/min／ΔE₂/min
（第１液中での吸光度の変化率と第２液中での吸光度の
変化率との比）と試料液中のヒト膵型α−アミラーゼの
活性比率との関係を示す。FIG. 2 shows ΔE ₁ / min / ΔE ₂ / min obtained in Example 49
The relationship between (the ratio of the change rate of the absorbance in the first solution to the change rate of the absorbance in the second solution) and the activity ratio of human pancreatic α-amylase in the sample solution is shown.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

図１に於て、−○−は本発明化合物８を用いた場合の結
果を、また−×−は既存のBG5Pを用いた場合の結果を夫
々示す。第２図に於て−○−は本発明化合物23を用いた
場合の結果を、また−×−は既存のFG5Pを用いた場合の
結果を夫々示す。In FIG. 1, -−- shows the results when the compound 8 of the present invention was used, and-×-shows the results when the existing BG5P was used. In FIG. 2,-○-shows the results when compound 23 of the present invention was used, and-×-shows the results when existing FG5P was used.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07H 15/14 203 C12Q 1/40 ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＣＡＯＬＤ（ＳＴＮ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (58) Field surveyed (Int. Cl. ⁷ , DB name) C07H 15/14 203 C12Q 1/40 REGISTRY (STN) CA (STN) CAOLD (STN)

Claims (13)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 下記一般式[I] 【化１】［式中、Ｒは−ＳＲ ^2’ ， 【化２】 又は 【化３】 を表わし（但し、Ｒ ² ’はアルキル基、又はフェニル
基、置換フェニル基（置換基は炭素数１〜５のアルキル
基，炭素数１〜５のアルコキシ基等）、アミノ基、置換
アミノ基（置換基は炭素数１〜５のアルキル基，炭素数
２〜５のヒドロキシアルキル基，炭素数２〜５のスルホ
アルキル基，炭素数３〜５のヒドロキシスルホアルキル
基等）、及びピリジル基，置換ピリジル基（置換基は炭
素数１〜５のアルキル基，炭素数１〜５のアルコキシ
基，アミノ基等），ピペリジル基，ピペラジル基及びモ
ルホリニル基から選ばれる置換基を有するアルキル基を
表し、Ｒ ² はアルキル基又は置換アルキル基を表わ
す。）、Ｒ ^１ は光学的に検出可能な基又は水素原子を表
し、ｎは０〜５の整数を表わす。尚、前記光学的に検出
可能な基は、グルコアミラーゼ[E.C.3.2.1.3.]、α−グ
ルコシダーゼ[E.C.3.2.1.20]、β−グルコシダーゼ[E.
C.3.2.1.21.]、イソマルターゼ[E.C.3.2.1.10.]または
β−アミラーゼ[E.C.3.2.1.2.]等の共役酵素の作用を受
けて加水分解されるものであり、且つ、加水分解後に
（Ａ）それ自体可視部や紫外部に吸収を有するもの、
（Ｂ）それ自体蛍光を有するもの、（Ｃ）酸化酵素の作
用を受けてカプラーと結合して色素を生ずるもの、
（Ｄ）酸化剤によりカプラーと結合して色素を生ずるも
の、又は（Ｅ）フルクトースを生ずるもの、である。］
で示されるオリゴサッカライド誘導体。1. The following general formula [I]Embedded image [whereinR is -SR ^{2 '} , Embedded imageOr(However,R ^Two 'Is an alkyl group or phenyl
Group, substituted phenyl group (substituent is alkyl having 1 to 5 carbon atoms)
Group, alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, etc.), amino group, substitution
Amino group (substituent is an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms,
2-5 hydroxyalkyl group, 2-5 carbon sulfo
Alkyl group, hydroxysulfoalkyl having 3 to 5 carbon atoms
Group), pyridyl group, substituted pyridyl group (substituent is charcoal
Alkyl group of 1 to 5 carbon atoms, alkoxy of 1 to 5 carbon atoms
Group, amino group, etc.), piperidyl group, piperazyl group and
An alkyl group having a substituent selected from a rufolinyl group;
Represents, R ^Two Represents an alkyl group or a substituted alkyl group
You. ),R ¹ Represents an optically detectable group or a hydrogen atom.
Andn represents an integer of 0 to 5.In addition, the optical detection
Possible groups include glucoamylase [EC 3.2.1.3.], Α-group
Lucosidase [EC3.2.1.20], β-glucosidase [E.
C.3.2.1.21.], Isomaltase [EC3.2.1.10.] Or
Being affected by the action of conjugate enzymes such as β-amylase [EC3.2.1.2.]
And after hydrolysis,
(A) itself having absorption in the visible or ultraviolet region,
(B) a substance having fluorescence itself, (C) production of oxidase
A dye that combines with a coupler to produce a dye,
(D) a dye is formed by bonding to a coupler by an oxidizing agent;
Or (E) produces fructose.]
An oligosaccharide derivative represented by the formula: 【請求項２】 請求項１に於て、一般式[I]のＲが−Ｓ
Ｒ ^2’ である下記一般式[II] 【化４】 （式中、Ｒ¹，Ｒ ^２’ 及びｎは前記と同じ。）で示され
るオリゴサッカライド誘導体。2. The method according to claim 1, whereinR is -S
R ^{2 '} The following general formula [II]: (Where R¹,R ^{2 '} And n are the same as above. )
Oligosaccharide derivatives. 【請求項３】 請求項１に於て、一般式[I]のＲが 【化５】 である下記一般式[III] 【化６】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは前記と同じ。）で示されるオ
リゴサッカライド誘導体。3. The method according to claim 1, wherein R of the general formula [I] is The following general formula [III]: (Wherein R ¹ , R ² and n are the same as described above). 【請求項４】 請求項１に於て、一般式[I]のＲが 【化７】 である下記一般式[IV] 【化８】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは前記と同じ。）で示されるオ
リゴサッカライド誘導体。4. The method according to claim 1, wherein R of the general formula [I] is The following general formula [IV]: (Wherein R ¹ , R ² and n are the same as described above). 【請求項５】 下記一般式[V] 【化９】 （式中、Ｘはハロゲン原子を表わし、Ｒ³は水素原子又
はアシル基を表わし、Ｒ ¹ 及びｎは請求項１に記載され
たものと同じ。）で示されるオリゴサッカライド誘導体
を、一般式Ｒ⁴ＣＯＳＨ（式中、Ｒ⁴はアルキル基又はフ
ェニル基を表わす。）で示されるチオカルボン酸又はそ
の塩と反応させて、非還元末端グルコースの６位にアシ
ルチオ基（−ＳＣＯＲ⁴基）を導入し、次いで、要すれ
ば脱アシル保護した後、これに、一般式Ｒ²Ｘ²（式中、
Ｘ²はハロゲン原子を表わし、Ｒ ² は請求項１に記載され
たものと同じ。）で示されるハロゲン化アルキル又はハ
ロゲン化置換アルキルを作用させるか、或は一般式Ｒ²
ＯＲ_S（式中、Ｒ_Sはトシル基、ブロシル基、トリフルオ
ロメタンスルホニル基又はメシル基を表わし、Ｒ ² は請
求項１に記載されたものと同じ。）で示される化合物を
作用させることを特徴とする、一般式[II] 【化１０】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは請求項１に記載されたものと
同じ。）で示されるオリゴサッカライド誘導体の製造
法。5. The following general formula [V] (Wherein, X represents a halogen atom, R ³ represents a hydrogen atom or an acyl group, and R ¹ and n are as defined in claim 1)
Same as ) Is reacted with a thiocarboxylic acid represented by the general formula R ⁴ COSH (wherein R ⁴ represents an alkyl group or a phenyl group) or a salt thereof to form a 6-position of non-reducing terminal glucose. in introducing a acylthio group (-SCOR ⁴ group), then, in after deacylated protected if necessary, to the general formula R ² X ² (wherein,
X ² represents a halogen atom; R ² is as defined in claim 1;
Same as ) Or a halogenated substituted alkyl represented by the general formula R ²
In OR _S (wherein, R _S represents a tosyl group, brosyl group, a trifluoromethanesulfonyl group or a mesyl group, R ² is請
Same as described in claim 1. Wherein the compound represented by the general formula [II] is acted upon: (Wherein R ¹ , R ² and n are as defined in claim 1)
Same . )). 【請求項６】 一般式[II] 【化１１】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは請求項１に記載されたものと
同じ。）で示されるオリゴサッカライド誘導体を酸化す
ることを特徴とする、一般式[III] 【化１２】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは請求項１に記載されたものと
同じ。） 又は、一般式[IV] 【化１３】 （式中、Ｒ¹，Ｒ²及びｎは請求項１に記載されたものと
同じ。）で示されるオリゴサッカライド誘導体の製造
法。6. A compound of the general formula [II] (Wherein R ¹ , R ² and n are as defined in claim 1)
Same . ), Wherein the oligosaccharide derivative represented by the general formula [III] is oxidized. (Wherein R ¹ , R ² and n are as defined in claim 1)
Same . Or the general formula [IV] (Wherein R ¹ , R ² and n are as defined in claim 1)
Same . )). 【請求項７】 一般式[I] 【化１４】 （式中、Ｒ，Ｒ¹及びｎは請求項１に記載されたものと
同じ。）で示されるオリゴサッカライド誘導体を基質と
して用いることを特徴とする、α−アミラーゼ活性測定
法。7. A compound of the general formula [I] (Wherein R, R ¹ and n are as defined in claim 1)
Same . A) using the oligosaccharide derivative represented by the formula (1) as a substrate. 【請求項８】 １〜３種の共役酵素の共存下に測定を行
なう、請求項７に記載の測定法。8. The method according to claim 7, wherein the measurement is performed in the presence of one to three types of conjugated enzymes. 【請求項９】 一般式[I] 【化１５】 （式中、Ｒ，Ｒ¹及びｎは請求項１に記載されたものと
同じ。）で示されるオリゴサッカライド誘導体を基質と
して用いることを特徴とする、α−アミラーゼ活性分別
測定法。9. A compound of the general formula [I] (Wherein R, R ¹ and n are as defined in claim 1)
Same . ), Wherein the oligosaccharide derivative represented by the formula (1) is used as a substrate. 【請求項１０】 １〜３種の共役酵素の共存下に測定を
行なう、請求項９に記載の分別測定法。10. The method according to claim 9, wherein the measurement is performed in the presence of one to three types of conjugate enzymes. 【請求項１１】 一般式[I] 【化１６】 （式中、Ｒ，Ｒ¹及びｎは請求項１に記載されたものと
同じ。）で示されるオリゴサッカライド誘導体を基質と
して用い、ヒト唾液腺由来のα−アミラーゼ活性を抑制
する物質の存在下に測定を行なうことを特徴とする、ヒ
ト膵由来のα−アミラーゼ活性の特異的測定法。11. A compound of the general formula [I] (Wherein R, R ¹ and n are as defined in claim 1)
Same . Using the oligosaccharide derivative represented by the formula (1) as a substrate in the presence of a substance that suppresses α-amylase activity derived from human salivary glands, characterized in that the method for specific measurement of α-amylase activity derived from human pancreas is carried out. . 【請求項１２】 １〜３種の共役酵素の共存下に測定を
行なう、請求項１１に記載の測定法。12. The method according to claim 11, wherein the measurement is performed in the presence of one to three types of coupling enzymes. 【請求項１３】 一般式［Ｉ］に於いて、Ｒ ^１ で示され
る光学的に検出可能な基が、アリール基、置換アリール
基、ウンベリフェリル基、置換ウンベリフェリル基、イ
ンドキシル基、置換インドキシル基又は式［１］ 【化３８】 で示されるフルクトース残基である、請求項１に記載の
オリゴサッカライド誘導体。 13. A compound represented by R ¹ in the general formula [I].
Optically detectable group is an aryl group, a substituted aryl
Group, umbelliferyl group, substituted umbelliferyl group,
Ndokishiru group, a substituted indoxyl group, or a group represented by formula [1] [of 38] The fructose residue represented by the formula:
Oligosaccharide derivatives.