JP3247940B2 - Methods for identifying active domains and amino acid residues of polypeptide and hormone variants - Google Patents
Methods for identifying active domains and amino acid residues of polypeptide and hormone variantsInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 本出願は1988年10月28日の米国特許出願番号第07/26
4,611号の継続出願である。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION The present application is filed on Oct. 28, 1988, U.S. Pat.
No. 4,611 is a continuation application.
（技術分野） 本発明はポリペプチド中の活性ドメインおよびアミノ
酸残基の同定法に関する。また本発明はホルモン変異体
に関する。TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for identifying active domains and amino acid residues in a polypeptide. The invention also relates to hormone variants.
（背景技術） ポリペプチドすなわちペプチドおよびたん白質には各
々特異的アミノ酸配列、構造および機能を有する広範囲
の生物学的分子が含まれる。ほとんどのポリペプチドは
特異的基質と相互作用しそのポリペプチドの機能を遂行
する。したがってズブチリシン、アミラーゼ、組織プラ
スミノーゲン活性化因子などの酵素は特異的基質と相互
作用を起こし、その特定の切断部位で加水分解を起こす
一方、ヒト成長ホルモン、インシュリンなどのたん白質
性ホルモンは特異的レセプターと相互作用を起こし成長
や代謝を調節する。別にポリペプチドと免疫原性レセプ
ターなど該ポリペプチドの主要標的ではない物質との相
互作用もある。多くのポリペプチドは別個の生物学的効
果を産む別々のリガンドまたはレセプターと相互作用す
る別個の領域を含む点で多機能的である。たとえばヒト
成長ホルモン（hGH）は成人において糖代謝および脂質
代謝に関係し、子供においては長骨の成長を誘する。BACKGROUND OF THE INVENTION Polypeptides or peptides and proteins include a wide range of biological molecules, each having a specific amino acid sequence, structure and function. Most polypeptides interact with specific substrates to perform the function of the polypeptide. Thus, enzymes such as subtilisin, amylase, and tissue plasminogen activator interact with specific substrates and hydrolyze at specific cleavage sites, whereas protein hormones such as human growth hormone and insulin are specific. Interacts with specific receptors to regulate growth and metabolism. Alternatively, there is an interaction between the polypeptide and a substance that is not the primary target of the polypeptide, such as an immunogenic receptor. Many polypeptides are multifunctional in that they contain distinct regions that interact with distinct ligands or receptors that produce distinct biological effects. For example, human growth hormone (hGH) is involved in glucose and lipid metabolism in adults and induces long bone growth in children.
アミノ酸配列を修正による天然のポリペプチドの機能
の改変について努力がはらわれてきている。１つの方法
はポリペプチドのアミノ酸配列中の１つ以上のアミノ酸
を別のアミノ酸に置換することである。インビトロ突然
変異誘発やクローン化遺伝子の発現によるたん白質工学
が種々のたん白質の熱的または酸化的安定性の改善に応
用された例が報告されている。ビラフランカ（Villafra
nca）,J.E.等、（1983）Science 222、782−788;ペリー
（Perry）,L.J.等（1984）Science 226、555−557;エス
テル（Estell）,D.A.等（1985）J.Biol.Chem.260、6518
−6521;ロゼンバーグ（Rosenberg）,S.等（1985）Natur
e（ロンドン）312、77−80;コートニー（Courtney）,M.
等（1985）Nature（ロンドン）、313、149−157。さら
にこのような方法を応用して基質特異性を変化させた酵
素を生成させたことも報告されている。エステル（Este
ll）,D.A.等（1986）Science 223、655−663;クレイク
（Craik）,C.S.等（1985）Science,228、291−297;ファ
ースト（Farsht）,A.R.等（1985）Nature（ロンドン）3
14、235−238;ウィンサー（Winther）,J.R.（1985）Car
lsberg Res.Commun.50、273−284;ウェルス（Wells）,
J.A.等（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.84、1219−1223。
修正すべきアミノ酸の決定は主にポリペプチドの結晶構
造、ポリペプチドの機能に関する化学的修正の効果およ
び、またはポリペプチドの作用モードを確認するための
種々の基質とポリペプチドとの相互作用に基づいて行な
われる。ある場合には、たとえば異なる基質特異性を有
するズブチリシン類の基質結合領域におけるアミノ酸配
列の差異など関連ポリペプチドの特異的アミノ酸残基の
差異に基づいてアミノ酸置換を誘導する場合もある。ウ
ェルス（Wells）,J.A.等（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.U
SA 84、5767。別の場合、分子の既知活性領域のアミノ
酸配列を第２の分子の既知活性領域のアミノ酸配列とな
るよう修正することも報告されている。ワートン（Whar
ton）R.P.等（1985）Nature 316、601−605、およびワ
ートン（Wharton）,R.P.等（1984）Cell 38、361−369
（ファージレセプターの認識ヘリックスの別のレセプタ
ー認識ヘリックスによる置換）；ジョーンズ（Jones）,
P.T.等（1986）Nature 321、522−525（ヒトミエローマ
たん白質の可変領域のマウス抗体の相当領域による置
換）。この方法は置換により変化する性質に関しいくら
かの予想を提供し得るが特定の性質を決定する全ての領
域および残基の評価を保証する方法ではない。せいぜい
置換残基の分子接触力に関するエネルギーの実験的見積
りが行なわれるぐらいである。特異的な修正残基に対す
る水素結合（ファースト（Farsht）,A.R.等（1985）Nat
ure 314、235;ブライアン（Bryan）,P.等（1986）Proc.
Natl.Acad.Sci.USA 83、3743;ウェルス（Wells）,J.A.
等（1986）Philos,Trans.R.Soc.London A.317、415）、
静電相互作用（ウェルス（Wells）,J.A.,等（1987）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 84、1219;クロニン（Cronin）,C.
N.,等（1987）J.Am.Chem.Soc.109、2222）および疎水的
および立体的効果（エステル（Estell）,D.A.等（198
6）Science 233、659;チェン（Chen）,J.T.等（1987）B
iochemistry 26、4093）の強さが見積られた。これらの
報告および別の報告（ラスコウスキー（Laskowski）,M.
等（1987）Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol.52、5
45:ウェルス（Wells）,J.A.等（1987）Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 84、5167;ジーンズ（Jones）,P.T.等（1986）N
ature 321、522;ワートン（Wharton）,R.P.等（1985）N
ature 316、601）は既知の接触残基の突然変異誘発は結
合に大きな効果を引き起こすが一方非接触残基の突然変
異誘発は比較的小さい効果しかないと結論づけた。Efforts have been made to alter the function of the native polypeptide by modifying the amino acid sequence. One method is to replace one or more amino acids in the amino acid sequence of the polypeptide with another amino acid. There have been reports of examples in which protein engineering by in vitro mutagenesis or expression of cloned genes has been applied to improve the thermal or oxidative stability of various proteins. Villafra
nca), JE et al. (1983) Science 222 , 782-788; Perry, LJ et al. (1984) Science 226 , 555-557; Ester (Estell), DA et al. (1985) J. Biol. Chem. 260 , 6518
−6521; Rosenberg, S. et al. (1985) Natur
e (London) 312 , 77-80; Courtney, M.
(1985) Nature (London), 313 , 149-157. Furthermore, it has been reported that an enzyme having altered substrate specificity was produced by applying such a method. Este
ll), DA et al. (1986) Science 223 , 655-663; Craik, CS et al. (1985) Science, 228 , 291-297; First (Farsht), AR et al. (1985) Nature (London) 3
14 , 235-238; Winther, JR (1985) Car
lsberg Res. Commun. 50 , 273-284; Wells,
JA et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84 , 1219-1223.
The determination of the amino acid to be modified is primarily based on the polypeptide's crystal structure, the effects of chemical modification on the function of the polypeptide, and / or the interaction of the polypeptide with various substrates to confirm the mode of action of the polypeptide. It is done. In some cases, amino acid substitutions may be induced based on differences in specific amino acid residues of related polypeptides, such as differences in amino acid sequences in the substrate binding regions of subtilisins having different substrate specificities. Wells, JA et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA 84 , 5767. In other cases, it has been reported to modify the amino acid sequence of the known active region of the molecule to be that of the second molecule. Wharton
(ton) RP et al. (1985) Nature 316 , 601-605, and Wharton, RP et al. (1984) Cell 38 , 361-369.
(Replacement of the phage receptor recognition helix with another receptor recognition helix); Jones,
PT et al. (1986) Nature 321 , 522-525 (replacement of the variable region of human myeloma protein with the corresponding region of a mouse antibody). Although this method may provide some conjecture about the properties that will change upon substitution, it is not a way to guarantee the evaluation of all regions and residues that determine a particular property. At best, an experimental estimate of the energy for the molecular contact force of the substituted residue is made. Hydrogen bonding to specific modified residues (Farsht, AR et al. (1985) Nat
ure 314 , 235; Bryan, P. et al. (1986) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 83 , 3743; Wells, JA
(1986) Philos, Trans. R. Soc. London A. 317 , 415),
Electrostatic interaction (Wells, JA, et al. (1987) Pro
c. Natl. Acad. Sci. USA 84 , 1219; Cronin, C.
N., et al. (1987) J. Am. Chem. Soc. 109 , 2222) and hydrophobic and steric effects (Estell, DA et al.
6) Science 233 , 659; Chen, JT et al. (1987) B
The strength of iochemistry 26 , 4093) was estimated. These and other reports (Laskowski, M .;
Etc. (1987) Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. 52, 5
45: Wells, JA et al. (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84 , 5167; Jeans, PT, etc. (1986) N
ature 321 , 522; Wharton, RP, etc. (1985) N
Nature 316 , 601) concluded that mutagenesis of known contact residues had a large effect on binding, whereas mutagenesis of non-contact residues had a relatively small effect.
アミノ酸配列と機能との関係を理解するための第２の
方法には、関連遺伝子間のインビボ相同的組換を利用し
たハイブリッドポリペプチドをコードするハイブリッド
DNA配列の生成によるものである。このようなハイブリ
ッドポリペプチドは大腸菌およびサルモネラ・ティフィ
ムリウム（Salmonella typhimurium）由来のtrpBおよび
trpA（シュナイダー（Schneider）,W.P.等（1981）Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA 78、2169−2173）；アルファ１お
よびアルファ２白血球インターフェロン（ウェバー（We
ber）,H.およびワイズマン（Weissmann）,C.（1983）Nu
c.Acids Res.11、5661）、大腸菌Ｋ−12の外膜ポアたん
白質ompCおよびphoE（トマセン（Thommassen）,J.等（1
985）EMBO ４、1583−1587）；およびバチルスステアロ
サーモフィラス（Bacillus stearothermophilus）およ
びバチルスリテニホルミス（Bacillus lichiniformis）
由来の好熱性アルファーアミラーゼ（グレー（Gray）,
G.L.等（1986）J.Bacteriol.166、635−643）の相同的
組換えにより得られると報告されている。このような方
法はハイブリッドアルファアミラーゼについて報告され
ているようにアミノ酸配列や機能の他に有用なハイブリ
ッドポリペプチドに関する有用な情報を提供し得るが所
定のポリペプチドを系統的に研究し標的物質の１つに活
性を示すポリペプチド中の詳細な領域やアミノ酸残基を
測定するのにこれらの方法を利用するのは難かしい。こ
のことはそのハイブリッドのDNAおよびアミノ酸配列を
規定する交叉組換えの部位が基本的に目的遺伝子のDNA
配列および宿主細胞の組換えメカニズムに依存すること
からくる。これらの方法は遺伝子の５′または３′末端
付近で交叉が起こる偶発的環境以外１つのポリペプチド
をコードするDNAの比較的小さいセグメントの別の遺伝
子由来の相当するセグメントによる所定のかつ方法論的
に必然的な置換を提供することはない。A second method for understanding the relationship between amino acid sequence and function includes hybrids encoding hybrid polypeptides utilizing in vivo homologous recombination between related genes.
This is due to the generation of a DNA sequence. Such hybrid polypeptides include trpB from E. coli and Salmonella typhimurium and
trpA (Schneider, WP, etc. (1981) Pro
Natl. Acad. Sci. USA 78 , 2169-2173); alpha 1 and alpha 2 leukocyte interferons (Weber
ber), H. and Weissmann, C. (1983) Nu
c. Acids Res. 11 , 5661), the outer membrane pore proteins ompC and phoE of E. coli K-12 (Thommassen, J. et al.
985) EMBO 4, 1583-1587); and Bacillus stearothermophilus (Bacillus stearothermophilus) and Bacillus Li tennis formal mistake (Bacillus lichiniformis)
Thermophilic alpha-amylase of origin (Gray,
GL et al. (1986) J. Bacteriol. 166 , 635-643). Such methods can provide useful information on useful hybrid polypeptides in addition to amino acid sequence and function as reported for hybrid alpha-amylase, but systematically study a given polypeptide and identify one of the target substances. It is difficult to use these methods to measure a detailed region or amino acid residue in a polypeptide that has high activity. This means that the crossover recombination site that defines the hybrid DNA and amino acid sequence is basically the DNA of the target gene.
It depends on the sequence and the recombination mechanism of the host cell. These methods involve the defined and methodological determination of a relatively small segment of DNA encoding one polypeptide by the corresponding segment from another gene, except for an accidental environment where crossover occurs near the 5 'or 3' end of the gene. It does not provide a necessary replacement.
たん白質性ホルモンとそれらのレセプターとの相互作
用をいくつかの方法で研究した報告がなされている。１
つの方法ではホルモンペプチドフラグメントを用いホル
モン上のレセプター結合部位の位置を決定した。別の方
法では中和モノクローナル抗体とペプチドフラグメント
間の競争を利用しエピトープマッピングによりレセプタ
ー結合部位の位置を決定した。これらの方法の例にはヒ
ト成長ホルモン（hGH）について報告された研究があ
る。There have been reports of studies of the interaction of protein hormones with their receptors in several ways. 1
One method used a hormone peptide fragment to determine the location of the receptor binding site on the hormone. Another method utilizes competition between neutralizing monoclonal antibodies and peptide fragments to determine the location of the receptor binding site by epitope mapping. Examples of these methods include studies reported on human growth hormone (hGH).
ヒト成長ホルモン（hGH）は正常なヒトの成長および
発達における多くの調節に関与している。この22000ダ
ルトンの脳下垂体ホルモンは線型成長（体発達）、泌
乳、マクロファージの活性化、他のインシュリン様およ
び糖尿病誘発効果を含む多くの生物学的効果を示す。チ
ョウラ（Chawla）,R.K.（1983）Ann.Rev.Med.34、519;
エドワーズ（Edwards）,C.K.等（1988）Science 239、7
69;ソーナー（Thorner）,M.O.等（1988）J.Clin.Inves
t.81、745参照。子供の成長ホルモン欠乏症は小人症を
引き起こすがこれは十年以上前からhGHの投与によりう
まく治療し得ることになっている。またhGHの遺伝的お
よび翻訳後修正型を区別し臨床的に投与されたときのhG
Hに対する免疫学的応答を調べたり、またこのホルモン
の循環レベルを定量したりするためにhGHの抗原性にも
興味が持たれる（ルイス（Lewis）,U.J.（1984）Ann.Re
v.Physiol.46、33）。Human growth hormone (hGH) is involved in many regulation in normal human growth and development. This 22,000 dalton pituitary hormone exhibits many biological effects, including linear growth (body development), lactation, macrophage activation, and other insulin-like and diabetogenic effects. Chowla, RK (1983) Ann. Rev. Med. 34 , 519;
Edwards, CK, etc. (1988) Science 239 , 7
69; Thorner, MO, et al. (1988) J. Clin. Inves
See t. 81 , 745. Growth hormone deficiency in children causes dwarfism, which has been successfully treated by administration of hGH for more than a decade. It also differentiates the genetically and post-translationally modified form of hGH and gives hG when administered clinically.
I am also interested in the antigenicity of hGH to examine the immunological response to H and to quantify the circulating levels of this hormone (Lewis, UJ (1984) Ann. Re.
v. Physiol. 46 , 33).
hGHは胎盤ラクトゲン、プロラクチンおよび他の成長
ホルモンの遺伝子および種的変異体を含む相同的ホルモ
ン群の一員である。ニコル（Nichol）,C.S.等（1986）E
ndocrine Reviews ７、169。hGHは広い種特異性を示
し、かつ単量体的に各クローン化ソマトジェニック（ラ
ング（Leung）,D.W.,等（1987）Nature 330、537）また
はプロラクチンレセプター（ボーチン（Boutin）,J.M.
等（1988）Cell 53、69）に結合する点でこれらの群の
中で異常である。hGHのクローン化遺伝子は大腸菌中分
泌型として発現され（チャン（Chang,C.N.等（1987）Ge
ne 55、189）、かつそのDNAおよびアミノ酸配列も報告
されている（ゴーデル（Goeddel）等（1979）Nature 28
1、544;グレー（Gray）等（1985）Gene 39、247）。hGH
の三次元的構造はまた分っていない。しかし、ブタの成
長ホルモンの三次元折りたたみパターンは中位の分解能
と精度で報告されている（アブデル−メグッド（Abdel
−Meguid）,S.S.等（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
4、6434）。hGH is a member of a family of homologous hormones that includes genes and species variants of placental lactogen, prolactin and other growth hormones. Nicol, CS, etc. (1986) E
ndocrine Reviews 7 , 169. hGH exhibits broad species specificity and is monomerically cloned from each somatogenic (Lung, DW, et al. (1987) Nature 330 , 537) or prolactin receptor (Boutin, JM).
(1988) are abnormal in these groups in that they bind to Cell 53 , 69). The cloned gene of hGH is expressed as a secreted form of Escherichia coli (Chang, CN et al. (1987) Ge
ne 55 , 189), and its DNA and amino acid sequences have also been reported (Goeddel et al. (1979) Nature 28 ).
1 , 544; Gray et al. (1985) Gene 39 , 247). hGH
The three-dimensional structure of is unknown. However, the three-dimensional folding pattern of porcine growth hormone has been reported with moderate resolution and accuracy (Abdel-Megood).
-Meguid), SS et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
4 , 6434).
hGH由来のペプチドフラグメントがhGHのレセプター結
合部位の位置決定に使用された。リ（Li）,C.H.（198
2）Mol,Cell.Biochem.46,31;ミルス（Mills）,J.B.,等
（1980）Endocrinology、107、391。他の報告ではウシ
成長ホルモンのたん白質分解後、残基96〜133のフラグ
メントが単離された。ヤマサキン（Yamasakin）等（197
0）Biochemistry ９、1107。しかし残基１−133を含む
より大きいフラグメントを組換え法で作ったときは検出
可能な結合活性は観測されなかった。クリビ（Krivi）,
G.G.等International Symposium on Growth Hormone;Ba
sic and Clinical Aspects、アブストラクトＩ−18、最
終プログラム、セロノシンポジア（Serono Symposia）
提供、USA、1987年６月14−18日。明らかにこれらの結
果は矛盾しており、かつ、たん白質性ホルモン、特にそ
の結合部位が２つ以上の不連続なエピトープおよび、ま
たは構造依存エピトープからなるものに関するレセプタ
ー結合部位の位置決めにペプチドフラグメントを使用す
るのは信頼性に欠けることを示している。The peptide fragment from hGH was used to locate the receptor binding site of hGH. Li, CH (198
2) Mol, Cell. Biochem. 46 , 31; Mills, JB, et al. (1980) Endocrinology, 107 , 391. Other reports have isolated a fragment between residues 96 and 133 after proteolysis of bovine growth hormone. Yamasakin, etc. (197
0) Biochemistry 9 , 1107. However, no detectable binding activity was observed when the larger fragment containing residues 1-133 was made recombinantly. Krivi,
GG etc.International Symposium on Growth Hormone; Ba
sic and Clinical Aspects, Abstract I-18, Final Program, Serono Symposia
Courtesy, USA, June 14-18, 1987. Clearly, these results are inconsistent, and peptide fragments have been used to locate receptor binding sites for protein hormones, especially those whose binding sites consist of more than one discontinuous epitope and / or a structure-dependent epitope. Use indicates lack of reliability.
エピトープマッピングによるレセプター結合部位の位
置決定に中和モノクローナル抗体を使用することは同様
の制限がある。たとえばモノクローナル抗体をレセプタ
ー結合検定中hGHの残基98−128からなるペプチドに対し
hGHレセプターと競合するのに使用した報告がある。た
とえhGHホルモンのペプチド98−128のみが中和モノクロ
ーナル抗体と結合しても、この領域がこれらの競争実験
に基づくレセプター結合部位を含むことが提唱された。
レテジン（Retegin）,L.A.,等（1982）Endocrinology 1
11、668。The use of neutralizing monoclonal antibodies to locate receptor binding sites by epitope mapping has similar limitations. For example, a monoclonal antibody was tested in a receptor binding assay against a peptide consisting of residues 98-128 of hGH.
There are reports used to compete with the hGH receptor. Even though only the hGH hormone peptide 98-128 bound to neutralizing monoclonal antibodies, it was proposed that this region would contain a receptor binding site based on these competition experiments.
Retegin, LA, etc. (1982) Endocrinology 1
11 , 668.
hGHホルモンの抗原部位を同定する試みに同様の方法
が使用されてきた。報告によると競合結合によるhGHに
対する異なる24個のモノクローナル抗体のエピトープマ
ッピングでは該ホルモン上の抗原部位はわずか４種に分
類された。スロウィー（Surowy）,T.K.等（1984）Mol,I
mmunol,21、345;アストン（Aston）,R.等（1985）Pharm
ac.Ther.27、403。しかしこの戦術は該ホルモンのアミ
ノ酸配列上のエピトープの位置は決められなかった。Similar methods have been used to attempt to identify the antigenic site of the hGH hormone. According to reports, epitope mapping of 24 different monoclonal antibodies to hGH by competitive binding classified only four antigenic sites on the hormone. Surowy, TK, etc. (1984) Mol, I
mmunol, 21, 345; Aston, R. et al. (1985) Pharm.
ac.Ther. 27 , 403. However, this strategy did not determine the location of the epitope on the amino acid sequence of the hormone.
抗原部位を限定する別の方法には目的たん白質上の短
かい線状ペプチドに対する抗体の結合テストがある。ゲ
イセン（Geysen）,H.M.等（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 81、3998;ゲイセン（Geysen）,H.M.（1985）Immuno
l.Today ６、364。しかしこの方法はレセプター結合部
位の位置を決めるには線状ペプチドフラグメントを用い
るのと同じ制限を受ける。有用となるためにはこの線状
配列はそれを認識するのにこの抗体の抗原中にみられる
構造が保持されていなければならない。さらにＸ線結晶
学から明らかになった抗体エピトープの部位に基づき
（シェリフ（Scheriff）,S.等（1987）Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 84、8075;アミット（Amit）,A.G.,等（1986）S
cience 233、747）事実上全ての抗体結合部位は部分的
に不連続であり（バーロー（Barlow）,D.J.等（1986）N
ature 322、747）かつ結果として線状フラグメントはこ
れらの構造をうまく真似ることができないことが推定さ
れてきた。またhGHのペプチドフラグメントはこれらの
フラグメントの非共有結合的結合により研究されてき
た。数人の研究者はヒト成長ホルモンの天然のアミノ酸
配列または化学修飾ペプチドを含む比較的長いフラグメ
ントを結合せた分析を報告している。バースタイン（Bu
rstein）,S.等（1979）J.of Endo.Met.48、964（アミノ
末端フラグメントhGH−（１−134）とカルボキシル末端
フラグメントhGH−（141−191）の組合せ））；リ（L
i）,C.H.等（1982）Mol,Cell.Biochem.46、31;ミリス
（Mills）,J.B.,等（1980）Endocrinology 107、391（h
GHのズブチリシン切断二本鎖型）。同様に、化学修飾フ
ラグメントhGH−（１−134）およびヒト絨毛性ソマトマ
モトロピン（胎盤ラクトゲンとも呼ばれる）由来の化学
修飾カルボキシ末端フラグメント（hCS−（141−19
1））も化学修飾フラグメントhCS−（１−133）およびh
GH−（141−191）同様非共有的に結合させた。米国特許
4,189,426。これらの研究者は肝臓成長ホルモンレセプ
ターへの結合決定基が成長ホルモンの最初の134個のア
ミノ末端残基であると誤って報告した（バースタイン
（Burstein），等（1978）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 7
5、5391−5394）。明らかにこれらの方法は間違った結
果を導く。さらに２個の大きいフラグメントを使用する
ことによりこの方法では潜在的には特定の相互作用に実
際に関与する特異的残基または領域を同定することなし
にこれらの組合せで使用される２個のフラグメントのど
ちらかにその機能を割振ることが可能である。hGHに関
する上述の方法および実験のレビューが報告されてい
る。ニコル（Nichol）,C.S.等（1986）Endocrine Rev.
７、169−203。Another way to define the antigenic site is to test the binding of the antibody to a short linear peptide on the protein of interest. Geysen, HM et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81 , 3998; Geysen, HM (1985) Immuno
l. Today 6 , 364. However, this method suffers from the same limitations as using linear peptide fragments to locate the receptor binding site. To be useful, the linear sequence must retain the structure found in the antigen of the antibody to recognize it. Furthermore, based on the site of the antibody epitope revealed by X-ray crystallography (Scheriff, S. et al. (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84 , 8075; Amit, AG, et al. (1986) S
cience 233 , 747) Virtually all antibody binding sites are partially discontinuous (Barlow, DJ et al. (1986) N
322 , 747) and consequently it has been presumed that linear fragments cannot mimic these structures well. Also, peptide fragments of hGH have been studied by the non-covalent association of these fragments. Several investigators have reported analyzes that bind relatively long fragments containing the natural amino acid sequence or chemically modified peptide of human growth hormone. Burstein (Bu
Rstein), S. et al. (1979) J. of Endo. Met. 48 , 964 (combination of amino terminal fragment hGH- (1-134) and carboxyl terminal fragment hGH- (141-191)));
i), CH et al. (1982) Mol, Cell. Biochem. 46 , 31; Mills, JB, et al. (1980) Endocrinology 107 , 391 (h
Subtilisin-cleaved double-stranded form of GH). Similarly, the chemically modified fragment hGH- (1-134) and the chemically modified carboxy-terminal fragment from human chorionic somatomamototropin (also called placental lactogen) (hCS- (141-19)
1)) also the chemically modified fragments hCS- (1-133) and h
Non-covalently bound as in GH- (141-191). US Patent
4,189,426. These investigators incorrectly reported that the binding determinant to the liver growth hormone receptor was the first 134 amino-terminal residues of growth hormone (Burstein, et al. (1978) Proc. Natl. Acad. .Sci.USA 7
5 , 5391-5394). Obviously, these methods lead to wrong results. By using two more large fragments, the method potentially uses the two fragments used in these combinations without identifying the specific residues or regions actually involved in the particular interaction. It is possible to assign that function to either. A review of the above methods and experiments on hGH has been reported. Nicol, CS, etc. (1986) Endocrine Rev.
7 , 169-203.
hGHの“欠失ペプチド”（hGH−32−46）由来の７残基
ペプチドフラグメントを他の哺乳類の成長ホルモンの類
似セグメント由来のアミノ酸残基を含むよう修正した別
の方法が報告されている。しかしそのような置換の効果
はあったとしても報告されてはいない。米国特許4,699,
897参考。それにもかかわらず短かいペプチドフラグメ
ントを使用する短所は、それらのフラグメントの線型配
列が本来の成長ホルモンにみられる構造をインビトロで
もインビボでも認識されるよう取り込れなければならな
いことから明白である。Another method has been described in which a seven residue peptide fragment from the "deleted peptide" of hGH (hGH-32-46) has been modified to include amino acid residues from analogous segments of other mammalian growth hormones. However, no such effects, if any, have been reported. U.S. Patent 4,699,
897 reference. The disadvantages of using short peptide fragments, nonetheless, are evident because the linear sequence of those fragments must incorporate the structures found in the native growth hormone in order to be recognized both in vitro and in vivo.
多くの天然のhGH変異体が同定されている。この中に
はhGH−Ｖ（シーバーグ（Seeberg）,P.H.（1982）DNA
１,239;米国特許第4,446,235号、4,670,393号および4,6
65,180号）およびhGHの残基32−46の欠失を含む20K hGH
（コスチオ（Kostyo）,J.L.等（1987）Biochemica et B
iophysica Acta 925、314;ルイス（Lewis）,U.J.,等（1
978）J.Biol.Chem.253、2679）が含まれる。Many natural hGH variants have been identified. These include hGH-V (Seeberg, PH (1982) DNA
1, 239; U.S. Pat. No. 4,446,235, No. 4,670,393 and 4,6
No. 65,180) and 20K hGH including deletion of residues 32-46 of hGH
(Kostyo, JL et al. (1987) Biochemica et B
iophysica Acta 925 , 314; Lewis, UJ, etc. (1
978) J. Biol. Chem. 253 , 2679).
ある研究者は、hGH中部位165のシステインをアラニン
に置換した通常Cys−53とCys−165の間で生成するジス
ルフィド結合の破壊を報告した。トクナガ（Tokunag
a）,T.,等（1985）Eur.J.Biochem,153、445。この単一
置換は明らかにhGHの三次構造を維持し、かつhGHのレセ
プターにより認識される変異体を生じた。One investigator reported the disruption of the disulfide bond normally formed between Cys-53 and Cys-165, where cysteine at position 165 in hGH was replaced with alanine. Tokunag
a), T., et al. (1985) Eur. J. Biochem, 153 , 445. This single substitution apparently retained the tertiary structure of hGH and resulted in a variant recognized by the receptor for hGH.
他の研究者は固体樹脂サポート上でのhGHのインビト
ロ合成を報告した。この研究者の第１の報告はhGHの正
しくない188個のアミノ酸配列を公表した。リ（Li）,C.
H.等（1966）J.Am.Chem.Soc.88、2050;および米国特許
第3,853,832号。第２の報告は190個のアミノ酸配列を公
表した。米国特許第3,853,833号、この後者の配列も正
しくないものである。特にhGHの配列は部位68の後にグ
ルタミンが入っており、部位73はグルタミンではなくグ
ルタミン酸、部位106はアスパラキンではなくアスパラ
ギン酸、部位108はアスパラギン酸ではなくアスパラギ
ンである。Others have reported in vitro synthesis of hGH on a solid resin support. The researcher's first report published an incorrect 188 amino acid sequence for hGH. Li, C.
H. et al. (1966) J. Am. Chem. Soc. 88 , 2050; and U.S. Pat. No. 3,853,832. The second report published a 190 amino acid sequence. U.S. Pat. No. 3,853,833, the latter arrangement is also incorrect. In particular, the sequence of hGH contains glutamine after site 68, site 73 is glutamic acid instead of glutamine, site 106 is aspartic acid instead of asparakin, and site 108 is asparagine instead of aspartic acid.
先に示したものに加え特定のモノクローナル抗体への
結合が変化したハイブリッドインターフェロンも報告さ
れている。キャンブル（Camble）,R.等、“ペプチド；
構造と機能”合成遺伝子から生成したインターフェロン
−α２類似物の性質、Proceedings of the Ninth Ameri
can Peptide Symposium、（1985）デバー（Deber）等
編、ピアスケミカル社、シカコ、Il1.,375−384。該文
献に公表されているようにα−１インターフェロンのア
ミノ酸残基101−114またはγ−インターフェロンの残基
98−114がα−２インターフェロンへと置換されてい
る。α−２インターフェロンはNK−２モノクローナル抗
体を結合するがα−１インターフェロンは結合しない。
α−２インターフェロン中のこの特定の領域はα−１お
よびα−２インターフェロン間の27個のアミノ酸の相異
中の７個がこの領域中に存在することから選択された。
報告されているようにこのようにして得たハイブリッド
はNK−２モノクローナル抗体との活性が実質的に減少し
ている。抗ウイルス活性をテストしてみるとこれらのハ
イブリッドは野生型のα−２インターフェロンの活性と
同程度の抗ウイルス活性を示した。この領域内のより小
さいセクションの置換も報告された。また３〜７個のア
ラニン残基クラスターの連続的置も報告された。しか
し、唯１つの類似体〔Ala−30、32、33〕IFN−α２が公
表されている。In addition to those shown above, hybrid interferons with altered binding to specific monoclonal antibodies have also been reported. Camble, R. et al., "Peptides;
Structure and Function "Proteedings of the Ninth Ameri
can Peptide Symposium, (1985) Ed. Deber et al., Pierce Chemical Co., Shikako, Il. 1, 375-384. Amino acid residues 101-114 of α-1 interferon or residues of γ-interferon as published in the literature
98-114 has been replaced by α-2 interferon. α-2 interferon binds NK-2 monoclonal antibody but not α-1 interferon.
This particular region in α-2 interferon was selected because seven out of 27 amino acid differences between α-1 and α-2 interferon are present in this region.
As reported, the hybrids thus obtained have substantially reduced activity with the NK-2 monoclonal antibody. When tested for antiviral activity, these hybrids showed similar antiviral activity to that of wild-type α-2 interferon. Substitutions of smaller sections within this region were also reported. Also, a contiguous arrangement of 3-7 alanine residue clusters was reported. However, only one analog [Ala-30, 32, 33] IFN-α2 has been published.
ニワトリ卵白リゾチームの小ペプチドフラグメント内
のアラニン置換および2A11または3A9細胞の刺激に関す
るこれらの置換の効果も報告されている。アレン（Alle
n）,P.M.等（1987）Nature 327、713−715。Alanine substitutions within the small peptide fragment of chicken egg white lysozyme and the effect of these substitutions on the stimulation of 2A11 or 3A9 cells have also been reported. Allen
n), PM et al. (1987) Nature 327 , 713-715.
抗原結合ループを含む二次構造ユニットの全ユニット
（ジョーンズ（Jones）,P.T.等（1986）Nature 321、52
2−525）またはDNA認識ヘリックス（ワートン（Wharto
n）,R.P.等（1985）Nature 316、601−605）の置換によ
る結合性の操作に関する別の報告もある。All units of the secondary structural unit including the antigen-binding loop (Jones, PT, et al. (1986) Nature 321 , 52
2-525) or the DNA recognition helix (Wharto
n), RP et al. (1985) Nature 316 , 601-605).
上述の文献は単に本出願の登録期日前の公表のため提
供したものであり先の発明または以前に登録された出願
に基づく優先権によりこれらの公開期日が早いことから
本発明の権利を失うという告白として解釈されるものは
なにもない。The above references are provided solely for publication prior to the date of registration of the present application, and prior art based on prior inventions or previously registered applications may lose their rights in the present invention due to their earlier publication date. Nothing is interpreted as a confession.
上述の参考文献により示される状況があるならば構造
と機能との関係を明らかにするためポリペプチドの有効
な系統的分析法が必要なことは明白である。したがって
ここでの目的はポリペプチドの機能活性に寄与するポリ
ペプチド内の活性ドメインの同定法を提供することであ
る。Clearly, given the circumstances indicated by the above references, an effective systematic analysis of polypeptides is needed to elucidate the relationship between structure and function. Accordingly, it is an object herein to provide a method for identifying active domains within a polypeptide that contribute to the functional activity of the polypeptide.
さらに本発明は機能活性を決定する活性アミノ酸の測
定法を提供することである。It is a further object of the present invention to provide a method for measuring active amino acids that determines functional activity.
さらに本発明の目的はポリペプチド内の生物学的活性
ドメインを系統的に同定する方法を提供することであ
る。It is a further object of the present invention to provide a method for systematically identifying biologically active domains within a polypeptide.
さらに本目的は本来のホルモンとは異なる望ましい生
物学的、生化学的および免疫原的性質を有するホルモン
変異体を提供することである。It is a further object of the present invention to provide a hormone variant having desirable biological, biochemical and immunogenic properties which differ from the original hormone.
さらに本目的は１つの生物学的機能については減少し
た活性を有しかつ第２の標的物質については実質的また
は増加した活性を有するホルモン変異体を提供すること
である。It is a further object of the present invention to provide a hormone variant that has reduced activity for one biological function and substantial or increased activity for a second target.
さらに本目的はhGHに対するソマトジェニックレセプ
ターに関する変化した結合活性および、または生物学的
活性を有し、かつ有効性を増したhGH変異体を提供する
ことである。It is a further object of the present invention to provide hGH variants having altered binding and / or biological activity with respect to hGH and / or having increased efficacy.
さらに本目的は１つ以上の望ましい生物学的性質は保
持しているが糖尿病誘発活性は減少しているhGH変異体
を提供することである。It is a further object of the present invention to provide hGH variants that retain one or more desirable biological properties but have reduced diabetogenic activity.
さらに本目的はhGHのソマトジェニックレセプターに
関する結合活性を増加したhPRLおよびhPLを提供するこ
とである。It is a further object of the present invention to provide hPRL and hPL with increased binding activity of hGH for somatogenic receptors.
さらに本目的はhGH変異体を含むポリペプチド変異体
のクローニングおよび発現に使用するDNA配列、ベクタ
ーおよび該ベクターを含む発現宿主を提供することであ
る。It is a further object of the present invention to provide DNA sequences, vectors and expression hosts containing the vectors used for cloning and expression of polypeptide variants, including hGH variants.
（本発明の概要） １つの特徴として本発明は第１の標的物質に関するポ
リペプチドの活性に影響する未知の活性ドメインを同定
することによるポリペプチドの構造と機能の系統的分析
法を提供する。これらの未知活性ドメインは該ポリペプ
チドの一次アミノ酸配列中に少なくとも２個の不連続ア
ミノ酸セグメントを含む。活性ドメインは該ポリペプチ
ド（親ポリペプチドと呼ぶ）の選択されたアミノ酸セグ
メントを該ポリペプチドの類似体に由来する類似アミノ
酸セグメントと置換することにより決定される。この類
似体は標的物質に関し親ペプチドと異なる活性を有して
いる。このようにして生成した各セグメント置換ポリペ
プチドの標的物質に関する活性を検定する。これらの活
性を親ポリペプチドの活性と比較する。この構造的に類
似するアミノ酸セグメントは標的物質に関し異なる相互
作用を起こす類似体に由来することからこのような活性
の比較は親ポリペプチド中の活性ドメインの位置の指標
を提供する。SUMMARY OF THE INVENTION In one aspect, the present invention provides a systematic method for analyzing the structure and function of a polypeptide by identifying unknown active domains that affect the activity of the polypeptide with respect to the first target. These unknown active domains contain at least two discontinuous amino acid segments in the primary amino acid sequence of the polypeptide. The active domain is determined by replacing selected amino acid segments of the polypeptide (referred to as the parent polypeptide) with similar amino acid segments derived from analogs of the polypeptide. This analog has an activity different from that of the parent peptide with respect to the target substance. The activity of each segment-substituted polypeptide thus generated with respect to the target substance is assayed. These activities are compared to the activity of the parent polypeptide. Such activity comparisons provide an indication of the location of the active domain in the parent polypeptide, as the structurally similar amino acid segments are derived from analogs that interact differently with the target.
さらに本方法は親ポリペプチドの活性ドメイン中の活
性アミノ酸の同定も含んでいる。本方法は親ポリペプチ
ドの活性ドメイン内のアミノ酸残基１個の各アミノ酸へ
の置換、および該残基置換ポリペプチドの標的物質に関
する検定を含んでいる。各残基置換ポリペプチドの活性
を親ポリペプチドの活性と比較する。活性アミノ酸残基
が同定されるまで活性ドメイン中の種々のアミノ酸につ
いてこれらのステップを繰り返す。The method further includes identifying an active amino acid in the active domain of the parent polypeptide. The method includes substituting one amino acid residue in the active domain of the parent polypeptide for each amino acid and assaying for the target substance of the polypeptide. The activity of each residue substituted polypeptide is compared to the activity of the parent polypeptide. These steps are repeated for various amino acids in the active domain until the active amino acid residue is identified.
本発明の別の特徴として、種々の標的物質に関し種々
の活性ドメインおよび活性アミノ酸残基を同定する方法
が提供される。これらの方法には第２の標的に関し上述
の方法の反復が含まれる。As another feature of the present invention, there is provided a method for identifying various active domains and active amino acid residues for various target substances. These methods include repetition of the methods described above for the second target.
上述の方法に従がい１つ以上の標的物質に関し親ポリ
ペプチドと比較して異なる活性を有するポリペプチド変
異体を同定する。これらの変異体は標的物質に関し親ポ
リペプチドの活性を決定する活性ドメインまたは活性ド
メイン中の活性アミノ酸残基の同定に基づき作られる。Polypeptide variants having different activities relative to the parent polypeptide for one or more target substances are identified according to the methods described above. These variants are made based on the identification of an active domain or active amino acid residues in the active domain that determine the activity of the parent polypeptide with respect to the target substance.
さらに本発明は少なくとも３つの部分からなる成長ホ
ルモン、プロラクチンおよび胎盤ラクトゲン変異体を含
む。第１部分は親ホルモンのアミノ酸の少なくとも１部
に対応し、第３部分は同親ホルモンの少なくとも１部に
対応し、かつ第２部分は親ホルモンの類似体のアミノ酸
配列に対応する。第２部分はポリペプチド変異体の第１
および第３部分の間には含まれない親ホルモンのアミノ
酸残基の類似体である。The invention further includes a growth hormone, prolactin and placental lactogen variant comprising at least three parts. The first portion corresponds to at least a portion of the amino acid of the parent hormone, the third portion corresponds to at least a portion of the parent hormone, and the second portion corresponds to the amino acid sequence of an analog of the parent hormone. The second part is the first of the polypeptide variant
And analogs of amino acid residues of the parent hormone not included between the third part.
また本発明にはhGHのセグメント置換および残基置換
変異体を含む特定のヒト成長ホルモン、ヒトプロラクチ
ンおよびヒト胎盤ラクトゲン変異体を含む。The invention also includes certain human growth hormone, including hGH segment and residue substitution variants, human prolactin and human placental lactogen variants.
（図面の簡単な説明） 第１図は活性ドメインの同定に使用する戦術を示して
いる。BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 shows the strategy used to identify the active domain.
第２図はhGH、hPL、pGHおよびhPRLのアミノ酸配列中
の保存性および可変性アミノ酸残基を示している。FIG. 2 shows conserved and variable amino acid residues in the amino acid sequences of hGH, hPL, pGH and hPRL.
第３図はhGHの推定される低分解能構造および各ヘリ
ックスに対しＮ末端開始残基から見たラセン投影図を示
している。疎水性、中性および荷電残基は各々○、■お
よび●で示されている。FIG. 3 shows the putative low-resolution structure of hGH and the helix projection from the N-terminal start residue for each helix. Hydrophobic, neutral and charged residues are indicated by ○, Δ and ●, respectively.
第４図は可溶性hGHレセプターに対する種々のセグメ
ント置換hGH変異体の結合に関する相対的減少を示す棒
グラフである。FIG. 4 is a bar graph showing the relative decrease in binding of various segment-substituted hGH variants to soluble hGH receptor.
第５図はソマトジェニックhGHレセプターと相互作用
する活性ドメインＡ、ＣおよびＦにおける類似アミノ酸
を示す。FIG. 5 shows similar amino acids in active domains A, C and F that interact with the somatogenic hGH receptor.
第６図はソマトジェニックレセプターの相対的結合位
置およびhGHに対する８個のモノクローナル抗体を示
す。FIG. 6 shows the relative binding positions of somatogenic receptors and eight monoclonal antibodies to hGH.
第７図は種々のアラニン置換hGH変異体の可溶性hGHソ
マジェニックレセプターに対する結合の相対的増減を示
す棒グラフである。T175の斜線棒はアラニンではなくセ
リンが置換していることを示している。R178の縞棒はア
ラニンではなくアスパラギンが置換されていることを示
している。FIG. 7 is a bar graph showing the relative increase or decrease in the binding of various alanine-substituted hGH variants to soluble hGH somogenic receptors. The hatched bar of T175 indicates that serine was substituted instead of alanine. The striped bar on R178 indicates that asparagine has been substituted for alanine.
第８図は実施例で用いているhGH遺伝子のDNAおよびア
ミノ酸配列を示している。FIG. 8 shows the DNA and amino acid sequence of the hGH gene used in the examples.
第９図は合成hGH遺伝子を含むベクターpB0475の構築
を示している。FIG. 9 shows the construction of the vector pB0475 containing the synthetic hGH gene.
第10図はhGHのアミノ酸配列を示すpB0475のDNA配列で
ある。FIG. 10 is the DNA sequence of pB0475 showing the amino acid sequence of hGH.
第11図はベクターpJ1446の構築を示している。 FIG. 11 shows the construction of vector pJ1446.
第12図は肝臓由来のソマトジェニックレセプターの可
溶性部分のアミノ酸配列を示すpJ1446のDNA配列であ
る。FIG. 12 shows the DNA sequence of pJ1446, which shows the amino acid sequence of the soluble part of the somatogenic receptor derived from the liver.
第13図から第20図は８個の異なるモノクローナル抗体
各々に対するhGH上のエピトープ結合部位を示してい
る。Figures 13 to 20 show the epitope binding sites on hGH for each of the eight different monoclonal antibodies.
第21図はhGH中のソマトジェニックレセプターに対す
る結合に関与する活性アミノ酸およびヘリックス１およ
び４に関するラセン投影図を示している。FIG. 21 shows a helix projection of active amino acids involved in binding to the somatogenic receptor in hGH and helices 1 and 4.
第22図はhGHおよびhGH変異体を50マイクログラム/kg/
日で投与したラットの経時的体重増加を示している。FIG. 22 shows 50 μg / kg / hGH and hGH mutants.
2 shows the weight gain over time of rats administered daily.
第23図は野生型hGHと比較したhGH変異体の活性に対す
るKd比のセミログプロットである。FIG. 23 is a semilog plot of the ratio of Kd to activity of the hGH mutant compared to wild-type hGH.
第24図はヒト血清（○）またはプラスミドphGHr（１
−238）を発現する大腸菌KS330培養物から単離したhGH
結合たん白質に対する〔125I〕hGHおよび未標識hGHの競
合結合曲線である。棒は平均値からの標準偏差を示す。
挿入図は競合結合曲線から導びいたスキャッチャードプ
ロットを示している。ヒト血清および大腸菌由来の結合
たん白質の濃度は各々0.1nMおよび0.08nMであった。FIG. 24 shows human serum (○) or plasmid phGHr (1
-238) hGH isolated from E. coli KS330 culture expressing
FIG. 2 is a competition binding curve of [ 125 I] hGH and unlabeled hGH for the bound protein. Bars indicate standard deviation from the mean.
The inset shows a Scatchard plot derived from the competition binding curve. The concentrations of binding proteins from human serum and E. coli were 0.1 nM and 0.08 nM, respectively.
第25図は2.8Å分解能のＸ線構造から決定したpGHの構
造に基づくhGHの構造モデルである。パネルＡはhGHレセ
プターエピトープの機能性等高線地図を示しパネルＢは
hPRLレセプターエピトープについて測定された同地図を
示している。黒丸の大きさは各残基のアラニン置換に関
する破壊効果の大きさを示している。小さな丸は２倍以
上の破壊を示し、大きい丸は10倍以上の破壊を示す。hG
Hレセプターエピトープにおける▲は（パネルＡ）結合
親和性が４倍以上増加させるE174Aの位置を示してい
る。FIG. 25 is a structural model of hGH based on the structure of pGH determined from the X-ray structure at 2.8 ° resolution. Panel A shows a functional contour map of the hGH receptor epitope, Panel B shows
Shows the same map measured for hPRL receptor epitope. The size of the black circle indicates the magnitude of the destructive effect on alanine substitution of each residue. Small circles indicate more than twice the destruction, large circles indicate more than 10 times the destruction. hG
に お け る in the H receptor epitope (Panel A) indicates the position of E174A at which binding affinity is increased by a factor of 4 or more.
第26図は大腸菌におけるhPRLの細胞内発現に使用した
プラスミドpB0760を示している。FIG. 26 shows the plasmid pB0760 used for intracellular expression of hPRL in E. coli.
第27図はhGH結合たん白質に対する結合に強く影響す
るhGH中の残基の位置を示している。結合親和性の10倍
以上の減少（○）、４〜10倍の減少（■）または４倍以
上の増加（▲）を引き起こすアラニン置換（T175または
R178の場合は各々セリンまたはアスパラギン）が示され
ている。α−ヘリックス領域のラセン投影図はそれらの
両親媒体およびヘリックス４において最も重要な決定因
子は親水性面（影部分）に存在するという事実を明らか
にしている。FIG. 27 shows the positions of the residues in hGH that strongly influence the binding to the hGH binding protein. Alanine substitution (T175 or A175) causing a 10-fold or greater decrease in binding affinity (○), a 4- to 10-fold decrease (■) or a 4-fold increase
In the case of R178, serine or asparagine) is indicated. Helix projections of the α-helix region reveal the fact that the most important determinants in helix 4 and their amphiphiles are located on the hydrophilic surface (shaded).
第28図はhGH（−）、野生型hPRL（−−）およびhPRL
変異体Ｄ（−−−−）の遠紫外（パネルＡ）または近紫
外（パネルＢ）における円二色スペクトルを示してい
る。FIG. 28 shows hGH (−), wild-type hPRL (−−) and hPRL
The circular two-color spectrum of the mutant D (----) in far ultraviolet (panel A) or near ultraviolet (panel B) is shown.
第29図は同類およびアラニンスキャニング突然変異誘
発により限定された結合に重要な領域に関するhGHとhPR
Lの配列比較を示している。同一残基は影を付け、また
その番号はhGH配列に基づいている。変異したとき結合
親和性が４倍以上変化する残基には丸を付けた。残基の
上のアステリスクは変異が結合親和性を２〜４倍減少さ
せる部分を示している。FIG. 29 shows hGH and hPR for conserved and critical regions for binding restricted by alanine scanning mutagenesis.
3 shows an alignment of L. Identical residues are shaded and their numbers are based on the hGH sequence. Residues whose binding affinity changes by a factor of 4 or more when mutated are circled. The asterisk above the residue indicates where the mutation reduces binding affinity by a factor of 2-4.
（発明の詳細な説明） １つの態様において本発明の方法は親ポリペプチドと
標的物質との相互作用に関するポリペプチド中の１つ以
上の活性ドメインを決定するための、ヒト成長ホルモン
またはヒトプロラクチンなどの親ポリペプチドの系統的
分析を提供する。本発明の方法を採用するにあたり目的
とする標的物質に異なる活性を示す該ポリペプチドに対
する１つ以上の類似体がなければならない。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION In one aspect, the methods of the present invention include human growth hormone or human prolactin, for determining one or more active domains in a polypeptide that are involved in the interaction of a parent polypeptide with a target substance. Provides a systematic analysis of the parent polypeptide. In employing the methods of the present invention, there must be one or more analogs to the polypeptide that exhibit different activities for the target substance of interest.
したがって本明細書で用いられているように“親ポリ
ペプチド”とは親ポリペプチドとは異なる標的物質への
活性を示す“類似体”が存在するポリペプチドを意味す
る。このようなポリペプチド、類似体および標的物質の
例を第１表に示す。Accordingly, as used herein, “parent polypeptide” refers to a polypeptide in which an “analog” having an activity on a target substance different from that of the parent polypeptide exists. Examples of such polypeptides, analogs and target substances are shown in Table 1.
もちろん第１表の親ポリペプチド、類似体および標的
物質は単に例である。また親ポリペプチドにはたとえば
スクシニルコエンザイムＡシンセターゼ、ミトコンドリ
アATPase、アミノアシルtRNAシンセターゼ、グルタミン
シンセターゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート
デヒドロゲナーゼおよびアスパラテートトランスカルバ
モラーゼなどの１つ以上のサブユニットを含むたん白質
性物質が含まれる（ハング（Huang）等（1982）Ann.Re
v.Biochem.51、935−971参照）。このような多重サブユ
ニット親ポリペプチドの場合、活性ドメインは親ポリペ
プチドの２つ以上のサブユニットにまたがっている。し
たがって後により詳細に述べる方法は特定のポリペプチ
ドの各サブユニットを探り、部分的には１つのサブユニ
ット上に含まれかつ部分的には１つ以上の他のサブユニ
ット上に含まれる特定の標的物質に対する活性ドメイン
および活性アミノ酸を確定するのに用い得る。 Of course, the parent polypeptides, analogs and target substances in Table 1 are merely examples. The parent polypeptide also includes a protein comprising one or more subunits such as, for example, succinyl coenzyme A synthetase, mitochondrial ATPase, aminoacyl-tRNA synthetase, glutamine synthetase, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, and aspartate transcarbamolase. (Huang et al. (1982) Ann.Re
v. Biochem. 51 , 935-971). In such a multiple subunit parent polypeptide, the active domain spans more than one subunit of the parent polypeptide. Thus, the methods described in more detail below probe each subunit of a particular polypeptide and identify specific subunits that are partially contained on one subunit and partially contained on one or more other subunits. It can be used to determine the active domain and active amino acid for the target substance.
一般的に親ポリペプチドおよび類似体は機能に関する
１つのポリペプチド群に属する。さらに通常このような
親ポリペプチドおよび類似体はあるアミノ酸配列、すな
わち保存残基を持つ。これらの配列ホモロジーは90％以
上のこともあるが約15％〜20％と低いこともある。In general, parent polypeptides and analogs belong to one group of polypeptides for function. Furthermore, usually such parent polypeptides and analogs have certain amino acid sequences, ie, conserved residues. These sequence homologies can be greater than 90%, but can be as low as about 15% to 20%.
一次配列ホモロジーに加え、親ポリペプチドの類似体
はポリペプチドおよびその類似体の三次元的枠組みでも
限定される。したがって類似体はアミノ酸配列において
親ポリペプチドからの多様性を示す場合もその分子の三
次構造の全て、または一部の比較に基づき親ポリペプチ
ドと構造的にホロモジーをもつこともある。チョシア
（Chothia）,C.等（1986）Embo.J.５,823。In addition to primary sequence homology, analogs of the parent polypeptide are also defined by the three-dimensional framework of the polypeptide and its analogs. Thus, analogs may show diversity in the amino acid sequence from the parent polypeptide, or may have structural holology with the parent polypeptide, based on a comparison of all or part of the tertiary structure of the molecule. Chothia, C. et al. (1986) Embo. J. 5 , 823.
一般に三次構造類似体は、その類似体の三次元構造が
親ポリペプチドの構造と一緒であることが知られている
場合同一と見なし得る。α−炭素軸の二乗平均分析（RM
S）を行うことにより（たとえばサクリフ（Sutcliff
e）,M.J.等（1987）Protein Engineering １,377−38
4）、もしあるとすれは三次元類似性をもつ領域の重な
りが同定される。テスト類似体配列の好ましくは60％以
上に関し、もしα−炭素軸が親ポリペプチドのα−炭素
軸と重っているかまたは約２Å〜約3.5ÅRMSの内にある
場合、そのテスト類似体は親ポリペプチドと三次元的に
類似している。もちろんこのことは２つの配列の間に存
在する挿入または欠失を除外する。In general, a tertiary structural analog may be considered identical if the three-dimensional structure of the analog is known to be consistent with the structure of the parent polypeptide. Mean square analysis of α-carbon axis (RM
S (for example, Sutcliff
e), MJ et al. (1987) Protein Engineering 1 , 377-38
4) If any, the overlap of regions with three-dimensional similarity is identified. For preferably 60% or more of the test analog sequence, if the α-carbon axis overlaps or is within about 2 ° to about 3.5 ° RMS of the parent polypeptide, the test analog is the parent analog. It is three-dimensionally similar to a polypeptide. This of course excludes insertions or deletions present between the two sequences.
上述の親ポリペプチドおよび類似体は天然の分子の公
開であるにもかかわらず、親ポリペプチドおよび類似体
にはインビトロ組換え法で導入される配列中に天然の変
異を含む変異体が含まれると理解すべきである。このよ
うに親ポリペプチドまたは類似体として用いる変異体は
その親ポリペプチドまたは類似体において１つ以上のア
ミノ酸残基の置換、挿入および、または欠失を含む変異
体を含む。このような変異体は本発明の方法を実行し活
性ドメインおよび、または活性アミノ酸の同定または本
発明のポリペプチド変異体の調製に使用し得る。したが
ってhGHの天然の変異体またはCys−165のAla置換を含む
組換え変異体はそれらが標的に対して活性をもつ限り親
ポリペプチドまたは類似体として使用し得る。このよう
な天然および組換え変異体には他の親ポリペプチド中の
特異的残基と等価の異なるアミノ酸残基が含まれ得る。
これらの異なるアミノ酸はそれらの残基が一次配列また
は三次構造により構造的に類似している、またはそれら
が機能的に等価であるならば等価であると云える。Although the parent polypeptides and analogs described above are public disclosures of the native molecule, parent polypeptides and analogs include variants that include the natural mutation in the sequence introduced by in vitro recombinant methods. Should be understood. Variants thus used as a parent polypeptide or analog include variants that include substitutions, insertions, and / or deletions of one or more amino acid residues in the parent polypeptide or analog. Such variants can be used to carry out the methods of the invention to identify active domains and / or active amino acids or to prepare polypeptide variants of the invention. Thus, natural variants of hGH or recombinant variants containing an Ala substitution of Cys-165 may be used as the parent polypeptide or analog as long as they have activity against the target. Such natural and recombinant variants may contain different amino acid residues equivalent to specific residues in other parent polypeptides.
These different amino acids are equivalent if their residues are structurally similar in primary sequence or tertiary structure, or if they are functionally equivalent.
さらに、多くの親ポリペプチドおよび類似体はその役
割を交換し得ることは明白である。したがって非ヒト成
長ホルモンおよびそれらの関連類似体群はそれぞれ親ポ
リペプチドとして使用できかつ同等にその活性ドメイン
を探ることができる。さらに、HIVウイルスに対するCD
−４レセプターなどの標的物質もCD−４レセプター類似
体に関する親ポリペプチドとしてHIV結合に寄与する活
性ドメインおよび活性アミノ酸の同定やCD−４変異体の
調製に使用される。Furthermore, it is clear that many parent polypeptides and analogs may exchange their roles. Thus, non-human growth hormones and their related analogs can each be used as parent polypeptides and equally explore their active domains. In addition, CD against HIV virus
Target substances such as the -4 receptor are also used as parent polypeptides for CD-4 receptor analogs to identify active domains and amino acids that contribute to HIV binding and to prepare CD-4 variants.
本明細書で使用しているように“標的”とは親ポリペ
プチドと相互作用する物質である。標的物質にはたん白
質性ホルモン、酵素基質、たん白質性レセプターに対す
るホルモン、たん白質性結合たん白質に対する一般的リ
ガンドおよびポリペプチドに接触し得る免疫系などが含
まれる。ホルモンレセプターの例にはhGHに対するソマ
トジェニックおよびラクトジェニックレセプターおよび
hPRLに対するレセプターが含まれる。他の標的物質には
抗体、プロテアーゼのインヒビター、たん白質性レセプ
ターに結合するホルモンおよび組織プラスミノーゲン活
性化因子（ｔ−PA）に結合するフィブリンが含まれる。As used herein, a "target" is a substance that interacts with a parent polypeptide. Target substances include proteinaceous hormones, enzyme substrates, hormones for proteinaceous receptors, general ligands for proteinaceous binding proteins and the immune system which can contact polypeptides. Examples of hormone receptors include somatogenic and lactogenic receptors for hGH and
Includes receptors for hPRL. Other target substances include antibodies, inhibitors of proteases, hormones that bind to protein receptors, and fibrin that binds to tissue plasminogen activator (t-PA).
一般に標的物質は親ポリペプチド上の“活性ドメイ
ン”と接触することにより親ポリペプチドと相互作用を
起こす。一般にこのような活性ドメインは該ポリペプチ
ドの表面上に存在するか、もしくは三次元構造の変化に
よりそのポリペプチドの表面に導き出される。ポリペプ
チドの表面とは、生理的条件下、すなわちインビボまた
はインビトロで発現した時と同様の条件下に存在する本
来の構造について規定される。そのアミノ酸セグメント
およびアミノ酸残基はいくつかの方法で確認される。も
しその三次元結晶構造が十分な分解能で分っているな
ら、そのポリペプチドの表面にあるアミノ酸残基は“表
面接近可能”なアミノ酸残基である。これら表面接近可
能残基にはその三次元構造の表面上に“転がる”理論上
の水分子と接触する残基である。Generally, the target substance interacts with the parent polypeptide by contacting the "active domain" on the parent polypeptide. Generally, such active domains are present on the surface of the polypeptide or are directed to the surface of the polypeptide by changes in three-dimensional structure. The surface of a polypeptide is defined in terms of its native structure under physiological conditions, ie, conditions similar to those expressed in vivo or in vitro. The amino acid segments and residues are identified in several ways. If the three-dimensional crystal structure is known with sufficient resolution, the amino acid residues on the surface of the polypeptide are "surface accessible" amino acid residues. These surface accessible residues are those that come into contact with a theoretical water molecule that "rolls" on the surface of the three-dimensional structure.
ポリペプチドの表面上の活性ドメインはそのポリペプ
チドの一次アミノ酸配列の単一のセグメントに含まれ
る。しかしながら多くの場合天然型のポリペプチドの活
性ドメインは親ポリペプチドの一次アミノ酸配列中の２
つ以上のアミノ酸セグメントから構成される。たとえば
ヒト成長ホルモンのソマトジェニックレセプターへの活
性ドメインを第５図に示す。示されているように活性ド
メインのドメインA,CおよびＦは各々hGH分子の不連続な
アミノ酸セグメント上に存在する。これらのアミノ酸セ
グメントは第４図中A,C,Fという文字で示されている。
活性ドメインを構成する不連続なアミノ酸セグメントは
活性ドメインおよび標的物質の間の相互作用に有意に関
係しない多くのアミノ酸残基により分離されている。一
般に不連続アミノ酸セグメント間の間隔は少なくともア
ミノ酸５残基分である。The active domain on the surface of a polypeptide is contained in a single segment of the primary amino acid sequence of the polypeptide. However, in many cases, the active domain of the native polypeptide will contain only two of the active domains of the parent polypeptide.
It is composed of one or more amino acid segments. For example, the active domain of human growth hormone for the somatogenic receptor is shown in FIG. As shown, domains A, C and F of the active domain are each located on a discrete amino acid segment of the hGH molecule. These amino acid segments are indicated by letters A, C and F in FIG.
Discontinuous amino acid segments that make up the active domain are separated by a number of amino acid residues that are not significantly involved in the interaction between the active domain and the target. Generally, the spacing between discontinuous amino acid segments is at least 5 amino acid residues.
本発明の方法は親ポリペプチドのアミノ酸配列中の未
知活性ドメインの検出を目的としている。標的物質に関
するポリペプチドの三次元結晶構造が入手できる場合、
たとえばインヒビターまたは転移状態類似体に関する酵
素の結晶構造が入手できる場合は除いて多くのポリペプ
チドのほとんどの活性ドメインは未知のままである。The method of the present invention is aimed at detecting an unknown active domain in the amino acid sequence of a parent polypeptide. If the three-dimensional crystal structure of the polypeptide for the target substance is available,
Most active domains of many polypeptides remain unknown, for example, unless the crystal structure of the enzyme for an inhibitor or transfer state analog is available.
本明細書で使用している“類似ポリペプチドセグメン
ト”または“類似セグメント”とは親ポリペプチド中の
対応する配列と置換して“セグメント置換ポリペプチ
ド”とするアミノ酸配列を意味する。一般的に類似セグ
メントは親ポリペプチドにおいて１つ以上の異なるアミ
ノ酸残基の置換、挿入または欠失を起こすが親ポリペプ
チド中で置換する選択されたセグメント中の他の残基の
相対的アミノ酸配列は維持される配列を有している。一
般に類似セグメントは親ポリペプチドと類似体の全アミ
ノ酸配列を両配列間の配列同一性が最大なるよう整列さ
せることにより同定される。この配列整列に基づく類似
セグメントは親ポリペプチドの対応する配列への置換用
に選択される。同様に三次構造ホモロジーを示す類似体
由来の類似セグメントは構造ホモロジーを示すこれらの
領域から誘導し得る。このような類似セグメントは親ポ
リペプチド中の対応する配列と置換される。さらにたと
えば構造的類似領域の隣接領域などの三次構造相同体の
他の領域も類似セグメントとして用いられる。As used herein, “similar polypeptide segment” or “similar segment” refers to an amino acid sequence that replaces the corresponding sequence in a parent polypeptide to form a “segment-substituted polypeptide”. In general, a similar segment will cause a substitution, insertion or deletion of one or more different amino acid residues in the parent polypeptide, but the relative amino acid sequence of another residue in the selected segment which is replaced in the parent polypeptide. Has a sequence that is maintained. Generally, similar segments are identified by aligning the entire amino acid sequence of the parent polypeptide and the analog such that sequence identity between the sequences is maximized. Similar segments based on this sequence alignment are selected for replacement of the parent polypeptide with the corresponding sequence. Analogous segments from analogs that also show tertiary structural homology can be derived from those regions that show structural homology. Such similar segments replace the corresponding sequence in the parent polypeptide. In addition, other regions of the tertiary structural homolog, for example, regions adjacent to structurally similar regions, are used as similar segments.
もし可能ならば類似セグメントを選択してセグメント
置換ポリペプチド中への不安定化アミノ酸残基の導入は
避けるべきである。このような置換にはかさ高側鎖や疎
水コア領域中へ親水性側鎖を導入するものが含まれる。If possible, similar segments should be selected to avoid introducing destabilizing amino acid residues into the segment-substituted polypeptide. Such substitutions include those that introduce bulky side chains or hydrophilic side chains into the hydrophobic core region.
一般的に親ポリペプチドおよび類似体のアミノ酸配列
は知られており、またある場合にはその３次元結晶構造
も入手可能である。１つ以上の類似体と親ポリペプチド
のアミノ酸配列の整列化により少なくとも予備分析で変
化を受けていない配列中の保存されているアミノ酸残基
を容易に見つけることができる。また配列整列化は１つ
以上のアミノ酸残基の置換、挿入または欠失を含む配列
変化領域も明らかにする。このような変化を含む領域に
より親ポリペプチド中のどのセグメントが類似セグメン
トと置換したかが決定される。それゆえ類似体の類似セ
グメントの置換はアミノ酸残基の置換だけでなく、アミ
ノ酸残基の挿入および、または欠失も起こし得る。In general, the amino acid sequences of parent polypeptides and analogs are known, and in some cases, their three-dimensional crystal structures are also available. Alignment of the amino acid sequence of the parent polypeptide with one or more analogs makes it easy to find conserved amino acid residues in the sequence that have not been changed, at least in a preliminary analysis. Sequence alignment also reveals regions of sequence variation that include substitutions, insertions or deletions of one or more amino acid residues. The region containing such changes determines which segment in the parent polypeptide has been replaced with a similar segment. Thus, substitutions of analogous segments of analogs can result in amino acid residue insertions and / or deletions as well as amino acid residue substitutions.
もし３次元構造の情報が入手可能な場合は類似セグメ
ントと置換すべきではない親ポリペプチド中の領域を同
定することが可能となる。たとえば親ポリペプチド中の
両親媒体ヘリックスの疎水性表面において過密領域が同
定された場合は類似セグメントと置換すべきではない。
そのように同定された残基はポリペプチド変異体中に保
持されるべきでかつ表面残基のみが類似残基と置換され
るべきである。If three-dimensional structural information is available, it will be possible to identify regions in the parent polypeptide that should not be replaced with similar segments. For example, if a congested region is identified on the hydrophobic surface of the amphipathic helix in the parent polypeptide, it should not be replaced with a similar segment.
Residues so identified should be retained in the polypeptide variant and only surface residues should be replaced with similar residues.
一般に類似セグメントは長さがアミノ酸３〜30残基、
好ましくは約３〜15残基、もっとも好ましくは約10〜15
残基である。ある場合、類似セグメントの好ましい長さ
は相同または親ポリペプチドと比べて類似セグメントの
１つ以上のアミノ酸残基の挿入および、または欠失のた
め変化ものもある。もし親ポリペプチドの３次元構造が
入手できないときは一般に全部ではないにしろ親ポリペ
プチドのほとんどをカバーする類似セグメントに関する
セグメント置換ポリペプチドを作る必要がある。しかし
全アミノ酸配列のセグメント置換は必ずしも必要ではな
い。たとえば全アミノ酸配列の１部のみをカバーする偶
然セグメント置換は特定標的物質に対する活性ドメイン
を同定するのに十分な情報を提供する。しかしほとんど
の場合アミノ酸配列の約15％以上が活性ドメイン同定の
ためセグメント置換を受けることが必要である。一般に
約50％、好ましくは約60％、より好ましくは約75％、も
っとも好ましくは100％のアミノ酸配列が構造情報がな
い場合にセグメント置換される。In general, similar segments are 3 to 30 amino acids in length,
Preferably about 3-15 residues, most preferably about 10-15
Residue. In some cases, the preferred length of the analogous segment may vary due to insertion and / or deletion of one or more amino acid residues of the analogous segment relative to the homologous or parent polypeptide. If the three-dimensional structure of the parent polypeptide is not available, it is generally necessary to create a segment-substituted polypeptide for a similar segment that covers most if not all of the parent polypeptide. However, segment substitution of the entire amino acid sequence is not always necessary. For example, an accidental segment substitution that covers only a portion of the entire amino acid sequence provides enough information to identify an active domain for a particular target. However, in most cases, more than about 15% of the amino acid sequence needs to undergo segment substitution to identify the active domain. Generally, about 50%, preferably about 60%, more preferably about 75%, and most preferably 100%, of the amino acid sequence is segment substituted in the absence of structural information.
ここで使用している“類似性アミノ酸残基”または
“類似残基”とは親ポリペプチドの対応セグメント中の
対応アミノ酸残基とは異なる類似セグメント中のアミノ
酸残基を意味する。したがってもし類似セグメントの置
換が１つのアミノ酸置換を起こすならそのアミノ酸残基
は類似残基である。１度親ポリペプチドおよび１つ以上
の類似体が同定されたならば１つ以上の類似体由来の類
似セグメントを親ポリペプチド中の選択されたセグメン
トと置換し多くのセグメント置換ポリペプチドを作る。
このような置換は組換えDNA技術を用い簡単に行なわれ
る。一般に親ポリペプチドをコードするDNA配列は簡便
な宿主で発現されるようにクローン化およびその他の処
理が行なわれる。親ポリペプチドコードDNAは親ポリペ
プチドを発現する細胞のmRNAから誘導されるか、または
化学合成的にDNA配列を構築することによるゲノムライ
ブラリーから入手し得る（マニアチス（Maniatis）,T.
等（1982）Molecular Cloning、コールドスプリングハ
ーバーラボラトリー、N.Y.） それからこの親DNAを適当なプラスミドまたはベクタ
ーに挿入し宿主細胞のトランスホームに使用される。DN
A配列のクローニングおよび発現により親ポリペプチ
ド、セグメント置換ポリペプチド、残基置換ポリペプチ
ドおよびポリペプチド変異体を作るのには原核生物が好
ましい。たとえば大腸菌k12294株（ATCC No.31446）、
大腸菌Ｂ株、大腸菌X1776株（ATCC No.31537）および大
腸菌c600株およびc600hfl株、大腸菌W3110（F-,γ-,独
立栄養型、ATCC No.27325）、枯草菌などのバチルス類
およびサルモネラティフィムリウム（Salmonella typhi
murium）またはセラチアマルセサンス（Serratia marce
sans）などその他の腸内細菌および種々のシュードモナ
ス種が用いられる。好ましい原核生物は大腸菌W3110（A
TCC27325）である。原核生物中で発現したとき一般にポ
リペプチドはＮ−末端メチオニンまたはホルミルメチオ
ニンを含みかつグリコシル化されていない。もちろんこ
れらの例は制限することでなく説明を意図したものであ
る。As used herein, "similar amino acid residue" or "similar residue" refers to an amino acid residue in a similar segment that is different from the corresponding amino acid residue in the corresponding segment of the parent polypeptide. Thus, if substitution of a similar segment results in one amino acid substitution, the amino acid residue is a similar residue. Once the parent polypeptide and one or more analogs have been identified, similar segments from one or more analogs are replaced with selected segments in the parent polypeptide to create a number of segment-substituted polypeptides.
Such substitutions are easily made using recombinant DNA technology. Generally, the DNA sequence encoding the parent polypeptide is cloned and otherwise processed so that it can be expressed in a convenient host. The parent polypeptide-encoding DNA may be derived from mRNA of a cell expressing the parent polypeptide or may be obtained from a genomic library by constructing the DNA sequence chemically (Maniatis, T .;
(1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY) The parent DNA is then inserted into a suitable plasmid or vector and used to transform host cells. DN
Prokaryotes are preferred for cloning and expressing the A sequence to produce parent polypeptides, segment-substituted polypeptides, residue-substituted polypeptides and polypeptide variants. For example, E. coli k12294 strain (ATCC No. 31446),
E. coli B strains, E. coli X1776 strain (ATCC No.31537) and E. coli c600 strains and c600hfl strain, E. coli W3110 (F -, γ -, autotrophic type, ATCC No. 27325), Bacillus acids and Salmonella tee Fi beam such as Bacillus subtilis Lumium (Salmonella typhi
murium or Serratia marcesans
Other intestinal bacteria such as C. sans) and various Pseudomonas species are used. Preferred prokaryotes are E. coli W3110 (A
TCC27325). Generally, when expressed in a prokaryote, the polypeptide contains an N-terminal methionine or formyl methionine and is not glycosylated. Of course, these examples are intended to be illustrative, not limiting.
原核生物に加え、イースト培養物や多細胞生物由来の
細胞などの真核生物も使用される。原則としてこのよう
な細胞の培養物も使用可能である。しかし脊椎細胞が最
も興味深く、培養中（組織培養）の脊椎細胞の増殖は、
反復が可能である（“組織培養”アカデミックプレス
版、クルーズ（Kruse）およびパターソン（Patterson）
編（1973））。これらの有用な宿主細胞系列の例にはVE
ROおよびHeLa細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CH
O）細胞系列、W138、BHK,COS−７およびMDCK細胞系列が
ある。In addition to prokaryotes, eukaryotes such as yeast cultures and cells from multicellular organisms are also used. In principle, cultures of such cells can also be used. However, spinal cells are the most interesting, and the growth of spinal cells in culture (tissue culture)
Repeatable ("tissue culture" Academic Press Edition, Kruse and Patterson)
(1973)). Examples of these useful host cell lines include VE
RO and HeLa cells, Chinese hamster ovary (CH
O) There are cell lines, W138, BHK, COS-7 and MDCK cell line.
一般に宿主細胞に適合する種由来の複製およびコント
ロール配列を含むプラスミドベクターがこれらの宿主と
合せて使用される。通常このベクターは複製部位および
トランスホーム細胞に発現型選択を選択し得るたん白質
をコードする配列を有している。たとえば大腸菌は大腸
菌由来のプラスミドであるpBR322でトランスホームする
（マンデル（Mandel）,M.等（1970）J.Mol.Biol.53,15
4）。プラスミドpBR322はアンピシリンおよびテトラサ
イクリン耐性遺伝子を含んでおり、そのため容易な選択
手段を提供している。好ましいベクターはpB0475であ
る。実施例１参照。このベクターは宿主間での移動を可
能にし、それにより突然変異誘発および発現を容易にす
るファージおよび大腸菌の複製オリジンを含んでいる。Generally, plasmid vectors containing replication and control sequences from species compatible with the host cell are used in conjunction with these hosts. Usually, this vector has a replication site and a sequence encoding a protein that allows the phenotypic selection of the transformed cells. For example, E. coli is transformed with pBR322, a plasmid derived from E. coli (Mandel, M. et al. (1970) J. Mol. Biol. 53 , 15).
Four). Plasmid pBR322 contains the ampicillin and tetracycline resistance genes and thus provides an easy means of selection. A preferred vector is pB0475. See Example 1. This vector contains phage and E. coli replication origins that allow transfer between hosts, thereby facilitating mutagenesis and expression.
“発現ベクター”とは適当な宿主中のDNAの発現を可
能にする適当なコントロール配列に機能的に結合する該
DNA配列を含むDNA構築物を意味する。これらのコントロ
ール配列には転写を可能にするプロモーター、そのよう
な転写をコントロールするオペレーター配列、適当なmR
NAリボゾーム結合部位をコードする配列および転写およ
び翻訳の停止をコントロールする配列が含まれる。ベク
ターはプラスミドでもファージ粒子でも、または単に潜
在的ゲノム挿入物でもよい。１度適当な宿主にトランス
ホームすればそのベクターは宿主ゲノムとは独立に複製
しかつ機能するかまたはある場合にはゲノムそれ自身の
中に組込まれる。本明細書において“プラスミド”およ
び“ベクター”はプラスミドが現在もっとも一般的に用
いられているベクターであることからしばしば同義語的
に使用される。しかし、本発明は同様に機能し、かつ本
分野でよく知られている他の形の発現ベクターも包含す
る。An “expression vector” is one that is operably linked to a suitable control sequence that allows expression of the DNA in a suitable host.
A DNA construct comprising a DNA sequence is meant. These control sequences include a promoter that enables transcription, an operator sequence that controls such transcription,
Includes sequences encoding the NA ribosome binding site and sequences that control transcription and translation termination. The vector may be a plasmid or a phage particle, or simply a potential genomic insert. Once transformed into a suitable host, the vector replicates and functions independently of the host genome, or in some cases, integrates into the genome itself. As used herein, "plasmid" and "vector" are often used synonymously because plasmids are currently the most commonly used vector. However, the present invention encompasses other forms of expression vectors that function similarly and are well known in the art.
２つのDNAまたはポリペプチドの関係を述べるときの
“機能的に結合した”という言葉はそれらが互いに機能
的に関係することを意味する。たとえばおそらくシグナ
ル配列の切断によりたん白質成熟型を分泌するプロセス
においてシグナル配列として機能するなら該前配列はペ
プチドと機能的に結合している。プロモーターはコード
配列の転写をコントロールするならその配列と機能的に
結合している。リボゾーム結合部位は翻訳を可能とする
位置にあるならそれはコード配列と機能的に結合してい
る。The term "operably linked" when describing the relationship between two DNAs or polypeptides means that they are functionally related to each other. For example, the presequence is operably linked to the peptide if it functions as a signal sequence in the process of secreting the mature protein form, possibly by cleavage of the signal sequence. A promoter is operably linked to a coding sequence if it controls the transcription of that sequence. A ribosome binding site is operably linked to a coding sequence if it is in a position permitting translation.
１度本ポリペプチドがクローン化されればそのクロー
ン化親DNAについて部位特異的突然変異誘発（カーター
（Carter）,P.等（1986）Nucl.Acids Res.13,4331;ゾラ
ー（Zoller）,M.J.等（1982）Nucl.Acids Res.10,648
7）、カセット突然変異誘発（ウェルス（Wells）,J.A.
等（1985）Gene 34,315）、制限選択突然変異誘発（ウ
ェルス（Wells）,J.A.等（1986）Philos,Trans.R.Soc.L
ondon Ser A,317,415）または他の技術をほどこし置換
した類似セグメントにより規定されるアミノ酸配列の変
化をコードする“セグメント置換DNA配列が作られる。
適当な発現ベクターに機能的に結合しているとき、セグ
メント置換ポリペプチドが得られる。ある場合、親ポリ
ペプチドまたはセグメント修正ポリペプチドの回収は親
ポリペプチドまたはセグメント修正ポリペプチドをコー
ドするDNA配列に機能的に結合する適当なシグナル配列
を用いることにより発現宿主からそれらの分子を発現か
つ分泌させることで可能となる。これらの技術は当分野
でよく知られている。もちろん望ましいポリペプチドの
インビトロ化学合成などそれらのポリペプチドおよびセ
グメント置換ポリペプチドの生成に別の方法も使用し得
る（バラニー（Barany）,G.等（1979）“ペプチド”
（E.グロス（Gross）およびJ.メイエンホーファー（Mei
enhofer）編）アカデミックプレス版、N.Y.2巻、３〜25
4頁）。Once the polypeptide is cloned, site-directed mutagenesis of the cloned parent DNA (Carter, P. et al. (1986) Nucl. Acids Res. 13 , 4331; Zoller, MJ (1982) Nucl. Acids Res. 10 , 648
7), cassette mutagenesis (Wells, JA
(1985) Gene 34 , 315), restriction selective mutagenesis (Wells, JA et al. (1986) Philos, Trans. R. Soc. L
ondon Ser A, 317 , 415) or other techniques, and a "segment-substituted DNA sequence" is created which encodes the amino acid sequence alteration defined by the substituted analogous segment.
When operably linked to a suitable expression vector, a segment-substituted polypeptide is obtained. In some cases, recovery of the parent polypeptide or segment-modified polypeptide comprises expressing those molecules from an expression host by using an appropriate signal sequence operably linked to the DNA sequence encoding the parent polypeptide or segment-modified polypeptide; It is made possible by secretion. These techniques are well-known in the art. Of course, other methods may be used to generate those polypeptides and segment-substituted polypeptides, such as in vitro chemical synthesis of desired polypeptides (Barany, G. et al. (1979) "Peptides").
(E. Gross and J. Meienhofer (Mei
enhofer) ed.) Academic Press Edition, NY Volume 2, 3-25
4 pages).
１度種々のセグメント置換ポリペプチドが生成されれ
ばそれらを標的物質に接触させ、もし、標的物質と各セ
グメント置換ポリペプチドとの相互作用があればそれを
測定する。同じ標的物質に関するこれらの活性を親ポリ
ペプチドの活性と比較する。もしその類似体が親ポリペ
プチドと比べその標的物質に関し異なる活性を有してい
るなら、それらのセグメント置換ポリペプチドは親ポリ
ペプチド中の活性ドメインを規定する類似セグメントを
含んでいると推定される。Once the various segment-substituted polypeptides are produced, they are brought into contact with the target substance, and if there is any interaction between the target substance and each segment-substituted polypeptide, it is measured. These activities for the same target substance are compared to the activity of the parent polypeptide. If the analog has a different activity for the target substance as compared to the parent polypeptide, those segment-substituted polypeptides are presumed to contain a similar segment defining the active domain in the parent polypeptide. .
もし１つの類似体が親ポリペプチドより大きい活性を
有しているなら、複数のセグメント置換ポリペプチドが
その標的物質に関し活性の増加を示す可能性がある。こ
のような場合、類似体の活性ドメインおよびその標的物
質に関する活性を増加するように修正し得る親ポリペプ
チドの適当な領域を効果的に同定できる。その標的との
相互作用にかかわる類似体の領域が主に１つの連続する
アミノ酸セグメント内に存在するとき、このような事象
が起こりやすい。もし類似体の“活性ドメイン”が類似
体アミノ酸配列の不連続領域に含まれるなら、活性の増
加はセグメント置換ポリペプチドへ、類似体からの全て
の活性ドメインを同時に導入しなければならないからそ
のセグメント置換ポリペプチドの活性の増加は起こりそ
うもない。If one analog has greater activity than the parent polypeptide, multiple segment-substituted polypeptides may exhibit increased activity with respect to the target. In such cases, an appropriate region of the parent polypeptide that can be modified to increase the activity of the analog and its activity on the target substance can be effectively identified. Such an event is likely to occur when the region of the analog involved in interacting with its target is predominantly within one contiguous amino acid segment. If the "active domain" of an analog is contained in a discontinuous region of the amino acid sequence of the analog, the increased activity is due to the simultaneous introduction of all active domains from the analog into the segment-substituted polypeptide because the segment An increase in the activity of the substituted polypeptide is unlikely.
したがって、類似体は標的物質に対し親ポリペプチド
よりも小さい活性をもつことが好ましい。このような場
合、セグメント置換ポリペプチドには活性のロスがみら
れる。しかし、１度親ポリペプチド中の活性ドメインが
決定されたら、このポリペプチドは連続的にまたは同時
にそのような活性ドメインを置換して標的物質に関して
第１親ポリペプチドの活性を欠いた第２親ポリペプチド
とする類似体として使用できる。Therefore, it is preferred that the analog has less activity on the target substance than the parent polypeptide. In such a case, the segment-substituted polypeptide will lose activity. However, once the active domain in the parent polypeptide has been determined, the polypeptide can sequentially or simultaneously replace such active domains and replace the second parent, which lacks the activity of the first parent polypeptide with respect to the target substance. It can be used as an analog to a polypeptide.
ポリペプチド中の活性ドメインは標的物質に関するセ
グメント置換ポリペプチドの活性を親ポリペプチドのそ
れと比較することにより同定される。多くの分析測定が
可能であるが標的物質の非触媒的結合についてはセグメ
ント置換ポリペプチドと標的物質間に形成される複合体
の解離定数Kdを親ポリペプチドに関するKdと比べる方法
が簡便なものの１つである。セグメント置換により類似
置換残基あたり、約1.5、好ましくは約2.0のKd値の増減
は、置換セグメントがその標的物質と親ポリペプチドの
相互作用の活性ドメインであることを示している。The active domain in the polypeptide is identified by comparing the activity of the segment-substituted polypeptide with respect to the target substance to that of the parent polypeptide. Although many analytical measurements are possible, for the non-catalytic binding of the target substance, a simple method is to compare the dissociation constant Kd of the complex formed between the segment-substituted polypeptide and the target substance with the Kd of the parent polypeptide. One. A Kd value increase or decrease of about 1.5, preferably about 2.0 per analogous substitution residue due to segment substitution indicates that the substituted segment is the active domain of the interaction of the target substance with the parent polypeptide.
標的物質との触媒的相互作用の場合親酵素に対する活
性を測定する適当なパラメーターはKcat/Km比を比較す
ることである。親酵素に対し置換類似残基当り約1.5、
好ましくは2.0のKcat/Km値の増減は活性ドメインの置換
を示す。A suitable parameter for measuring the activity on the parent enzyme in the case of catalytic interaction with the target substance is to compare the Kcat / Km ratio. About 1.5 per substituted similar residue relative to the parent enzyme
Preferably, an increase or decrease of the Kcat / Km value of 2.0 indicates an active domain replacement.
本明細書で使用している“スキャニングアミノ酸”と
は親ポリペプチド内の活性アミノ酸を同定するのに用い
られるアミノ酸のことである。“残基置換ポリペプチ
ド”はスキャニングアミノ酸に関する親ポリペプチド中
のアミノ酸の少なくとも単一置換を含むポリペプチド変
異体である。“残基置換DNA配列”は残基置換ポリペプ
チドをコードする。このようなDNAおよびポリペプチド
はセグメント置換DNAおよびポリペプチドの調製で述べ
た方法で調製される。As used herein, "scanning amino acid" refers to an amino acid used to identify an active amino acid in a parent polypeptide. "Residue-substituted polypeptides" are polypeptide variants that contain at least a single substitution of an amino acid in a parent polypeptide for a scanning amino acid. "Residue substituted DNA sequence" encodes a residue substituted polypeptide. Such DNAs and polypeptides are prepared by the methods described for preparing segment-substituted DNAs and polypeptides.
アミノ酸スキャンで同定した“活性アミノ酸残基”は
一般的に標的物質と直接接触するものである。しかし、
活性アミノ酸は他の残基またはH2Oのような小分子また
はNa+,Ca+2,Mg+2またはZn+2などのイオン種で形成され
る塩橋を介して間接的に標的物質に接触することもあ
る。"Active amino acid residues" identified by amino acid scans are those that are generally in direct contact with the target substance. But,
Active amino acids can be indirectly targeted to target substances through salt bridges formed by other residues or small molecules such as H 2 O or ionic species such as Na + , Ca +2 , Mg +2 or Zn +2 May contact.
ある場合には、スキャニングアミノ酸は親ポリペプチ
ドの活性ドメイン中に同定されるアミノ酸と置換され
る。一般的に多くの残基置換ポリペプチドが調製され、
その各々は活性ドメイン内の種々のアミノ酸残基の位置
でスキャニングアミノ酸の単一置換を含んでいる。特定
の標的物質に関するそのような残基置換ポリペプチドの
活性を親ポリペプチドの活性と比較し、標的物質との相
互作用に関係する活性ドメイン中のアミノ酸残基を決定
する。このような分析に用いられるスキャニングアミノ
酸は置換したものとは異なるアミノ酸、すなわちその他
の19種の天然のアミノ酸である。In some cases, the scanning amino acids are replaced with amino acids identified in the active domain of the parent polypeptide. Generally, many residue-substituted polypeptides are prepared,
Each contains a single substitution of the scanning amino acid at various amino acid residues within the active domain. The activity of such a residue-substituted polypeptide for a particular target substance is compared to the activity of the parent polypeptide to determine amino acid residues in the active domain involved in the interaction with the target substance. The scanning amino acids used in such an analysis are amino acids different from the substituted ones, ie, the other 19 natural amino acids.
この表は各アミノ酸について以下の記号を使用してい
る。アミノ酸又はその残基 三文字記号 一文字記号 アラニン Ala Ａ グルタミン酸 Glu Ｅ グルタミン Gln Ｑ アスパラギン酸 Asp Ｄ アスパラギン Asn Ｎ ロイシン Leu Ｌ グリシン Gly Ｇ リジン Lys Ｋ セリン Ser Ｓ バリン Val Ｖ アルギニン Arg Ｒ スレオニン Thr Ｔ プロリン Pro Ｐ イソロイシン Ile Ｉ メチオニン Met Ｍ アミノ酸又はその残基 三文字記号 一文字記号 フェニルアラニン Phe Ｆ チロシン Tyr Ｙ システイン Cys Ｃ トリプトファン Trp Ｗ ヒスチジン His Ｈ 残基置換ポリペプチドの活性の効果がある場合、それ
を一様のスキャンニングアミノ酸残基への天然のアミノ
酸残基の変化に系統的に帰着させることができるのでス
キャンニングアミノ酸は各残基置換ポリペプチドと同じ
であることが最も望ましい。 The table uses the following symbols for each amino acid. Amino acid or its residue Three-letter symbol One-letter symbol Alanine Ala A Glutamic acid Glu E Glutamine Gln Q Aspartic acid Asp D Asparagine Asn N Leucine Leu L Glycine Gly G Lysine Lys K serine Ser S Valine Val V Arginine Arg R Threonine Thr T Proline Isoleucine Ile I Methionine Met M Amino acid or its residue Three-letter symbol One-letter symbol Phenylalanine Phe F Tyrosine Tyr Y Cysteine Cys C Tryptophan Trp W Histidine His H If the effect of the residue-substituted polypeptide is effective, scan it uniformly. Most preferably, the scanning amino acid is the same as each residue-substituted polypeptide, as it can be systematically attributed to the change of the natural amino acid residue to a scanning amino acid residue.
ある場合、１つ以上の残基におけるスキャンニングア
ミノ酸置換は標的物質に関する活性の分析を行うのに十
分な量の単離を可能にするレベルで発現しない残基置換
ポリペプチドを生ずる。このような場合種々のアミノ
酸、好ましくはアイソステリックなアミノ酸が用いられ
る。In some cases, scanning amino acid substitutions at one or more residues result in a residue substitution polypeptide that is not expressed at a level that allows isolation of a sufficient amount to perform an activity assay on the target. In such a case, various amino acids, preferably isosteric amino acids, are used.
最も好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さい
中性のアミノ酸である。このようなアミノ酸残基にはア
ラニン、グリシン、セリンおよびシステインが含まれ
る。アラニンはベータ炭素からとび出た側鎖をもたず、
かつ残基置換ポリペプチドの主鎖構造が変化しにくいこ
とからこのグループの中でも好ましいスキャンニングア
ミノ酸である。またアラニンはもっとも一般的なアミノ
酸であることからも好ましい。さらにそれは、埋った形
でも露出した形でも存在する（クレイトン（Creighto
n）,T.E.,“たん白質”（W.H.フリーマン社版,N.Y.）；
チォシア（Chothia）,C.（1976）J.Mol.Biol.150,1）。
もしアラニン置換が適当な量の残基置換ポリペプチドを
生じない場合、アイソステリックアミノ酸が使用され
る。別に優先性が減る順番に以下のアミノ酸が使用され
る:Ser,AsnおよびLeu。Most preferred scanning amino acids are relatively small neutral amino acids. Such amino acid residues include alanine, glycine, serine and cysteine. Alanine has no side chains jumping out of the beta carbon,
Further, since the main chain structure of the residue-substituted polypeptide is not easily changed, it is a preferred scanning amino acid in this group. Alanine is also preferred because it is the most common amino acid. Furthermore, it exists in both buried and exposed forms (Creighto
n), TE, “Protein” (WH Freeman, NY);
Chothia, C. (1976) J. Mol. Biol. 150 , 1).
If alanine substitution does not yield the appropriate amount of residue-substituted polypeptide, isosteric amino acids are used. The following amino acids are used in order of decreasing preference: Ser, Asn and Leu.
スキャンニングアミノ酸の使用はセグメント置換ポリ
ペプチドの分析により確認される活性ドメイン中の活性
アミノ酸の同定に限定されるわけではない。たとえば親
ポリペプチド中の１つ以上のアミノ酸が分っている場合
か、または標的物質との相互作用に関っていると考えら
れる場合、その残基およびその囲りのアミノ酸残基を探
るのにスキャンニングアミノ酸を使用することができ
る。さらにもし親ポリペプチドが小さいペプチド、すな
わち約３〜50アミノ酸残基であるなら、全分子にわたっ
てスキャンニングアミノ酸分析を行ないうる。The use of scanning amino acids is not limited to the identification of active amino acids in the active domain as confirmed by analysis of the segment-substituted polypeptide. For example, if one or more amino acids in the parent polypeptide are known, or are thought to be involved in interacting with the target substance, the search for that residue and its surrounding amino acid residues may be made. Scanning amino acids can be used. Furthermore, if the parent polypeptide is a small peptide, ie, about 3-50 amino acid residues, scanning amino acid analysis can be performed on all molecules.
１度活性アミノ酸残基が同定されたならアイソステリ
ックアミノ酸に置換される。このアイソステリック置換
は全ての場合に行う必要はないしまた活性アミノ酸が同
定される前にも行なわれる。このアイソステリックアミ
ノ酸置換はいくつかの置換が起こし得る構造への潜在的
破壊効果が最小となるように行なわれる。アイソステリ
ックアミノ酸を第II表に示す。Once an active amino acid residue is identified, it is replaced with an isosteric amino acid. This isosteric substitution need not be made in all cases and also before the active amino acid is identified. This isosteric amino acid substitution is made so as to minimize the potential destructive effect on the structure at which some substitutions may occur. The isosteric amino acids are shown in Table II.
活性アミノ酸残基は標的物質に関する残基置換ポリペ
プチドの活性を親ポリペプチドと比較することにより同
定し得る。一般に、Kd値の２倍の増減は置換残基が標的
物質との相互作用に活性があることを示している。同様
に標的物質との触媒的相互作用の場合、親酵素に対して
Kcat/Km値の２倍の増減は活性残基の置換を示してい
る。Active amino acid residues can be identified by comparing the activity of the residue-substituted polypeptide for the target substance with the parent polypeptide. Generally, a 2-fold increase or decrease in the Kd value indicates that the substituted residue is active in interacting with the target substance. Similarly, in the case of catalytic interaction with the target substance,
A 2-fold increase or decrease in the Kcat / Km value indicates replacement of the active residue.
推定上の、または既知の活性アミノ酸残基をスキャン
ニングアミノ酸分析にかけるとき、その残基に隣接する
アミノ酸残基をスキャンするべきである。その結果３残
基置換ポリペプチドができる。１つは推定上または既知
活性アミノ酸である部位Ｎにスキャンニングアミノ酸、
好ましくはアラニンを含んでいる。他の２つは部位Ｎ＋
１およびＮ−１にスキャンニングアミノ酸を含んでい
る。各置換ポリペプチドが標的物質に対しKdまたはKcat
/Km値に約２倍以上の効果を起こすならばそのスキャン
ニングアミノ酸は部位Ｎ＋２およびＮ−２で置換されて
いる。このことをKdまたはKcat/Km値への効果が２倍以
下となる少なくとも１個、好ましくは４個の残基が両方
向について同定されるまでか、または親ポリペプチドの
末端に到達するまでくり返す。このようにして、特定の
標的物質との相互作用に関係する連続するアミノ酸配列
に沿って１つ以上のアミノ酸が同定され得る。When a putative or known active amino acid residue is subjected to scanning amino acid analysis, the amino acid residues adjacent to the residue should be scanned. The result is a three residue substituted polypeptide. One is a scanning amino acid at site N, a putative or known active amino acid,
Preferably, it contains alanine. The other two are site N +
1 and N-1 contain scanning amino acids. Kd or Kcat for each target polypeptide
The scanning amino acid is substituted at sites N + 2 and N-2 if it produces an effect of about twice or more on the / Km value. This is repeated until at least one, and preferably four, residues are identified in both directions that have a 2-fold or less effect on Kd or Kcat / Km values, or until the end of the parent polypeptide is reached. . In this way, one or more amino acids can be identified along a contiguous amino acid sequence involved in an interaction with a particular target substance.
本発明の方法は特定の親ポリペプチドの１つ以上の標
的物質に関する活性ドメインの検出に使用される。さら
に種々の活性ドメイン内の活性アミノ酸もこの方法によ
り同定される。１度２つ以上の活性ドメインおよび活性
アミノ酸残基が特定のポリペプチドの種々の標的物質に
関して同定されたならその親ポリペプチドに対して種々
の修正を行って該ポリペプチドと１つ以上の標的物質間
の相互作用を修正できる。たとえばhGH表面上の２つの
活性ドメインはソマトジェニックレセプターおよびプロ
ラクチンレセプターについても同定された。この特殊な
場合の活性ドメインは重複している。したがってソマト
ジェニックおよびプロラクチンレセプターと相互作用す
る多くの共通する活性アミノ酸残基が存在する。hGHに
対する種々の修正は以後より詳しく説明する情報に基づ
いて行なわれる。The method of the present invention is used for detecting an active domain related to one or more target substances of a specific parent polypeptide. In addition, active amino acids in various active domains are also identified by this method. Once two or more active domains and active amino acid residues have been identified for various target substances of a particular polypeptide, various modifications may be made to the parent polypeptide to provide the polypeptide and one or more targets Interaction between substances can be modified. For example, two active domains on the hGH surface have also been identified for the somatogenic and prolactin receptors. The active domains in this special case are overlapping. Thus, there are many common active amino acid residues that interact with somatogenic and prolactin receptors. Various modifications to hGH will be made based on the information described in more detail below.
ある場合に種々の標的物質に関する活性ドメインは重
複していない。このような状況で１つのレセプターに関
する親ポリペプチド中の活性アミノ酸の修正は種々のア
ミノ酸による置換で行なわれ、その結果その標的物質と
の活性ドメインの相互作用は減少または増加し、それら
の変異体の生理作用が変化することになる。In some cases, the active domains for different target substances do not overlap. In such a situation, the modification of the active amino acid in the parent polypeptide for one receptor is made by substitution with various amino acids, so that the interaction of the active domain with its target substance is reduced or increased, and Physiology will change.
本明細書で使用している“相互作用変化”とは１つ以
上の活性ドメインが修正され標的物質とその変異体との
相互作用が親ポリペプチドと比べて変化しているポリペ
プチド変異体について用いられる。相互作用変化とは親
ポリペプチドと特定の標的物質との相互作用に比べポリ
ペプチド変異体の相互作用が少なくともも２倍増減する
ことで定義される。As used herein, “interaction change” refers to a polypeptide variant in which one or more active domains have been modified and the interaction between the target substance and the variant has been changed as compared to the parent polypeptide. Used. An interaction change is defined as at least a 2-fold increase or decrease in the interaction of the polypeptide variant as compared to the interaction between the parent polypeptide and the particular target substance.
標的物質と親ポリペプチド、ポリペプチド変異体、セ
グメント置換ポリペプチドおよび、または残基置換ポリ
ペプチドとの相互作用はインビトロまたはインビボの簡
便なアッセイで測定し得る。インビトロアッセイは標的
物質とポリペプチド、たとえば酵素と基質、ホルモンと
ホルモンレセプター、抗体と抗原などの検出可能な相互
作用を測定するのに用いられる。このような検出には色
変化、放射性変化、溶解度変化、ゲル電気泳動法およ
び、またはゲル排除法による分子量変化の測定などが含
まれる。インビボアッセイには生理作用、たとえば体重
変化、電解質バランスの変化、凝血時間の変化、血餅分
解の変化および抗原応答の誘導などを検出するアッセイ
が含まれるが、以上に示したものに限定されるわけでは
ない。一般に標的物質と目的ポリペプチド間の相互作用
変化を測定する可変パラメーターが存在するかぎりイン
ビトロアッセイが使用される。The interaction of the target substance with the parent polypeptide, polypeptide variant, segment-substituted polypeptide and / or residue-substituted polypeptide can be measured in a simple assay in vitro or in vivo. In vitro assays are used to measure detectable interactions between target substances and polypeptides, such as enzymes and substrates, hormones and hormone receptors, antibodies and antigens, and the like. Such detection includes color change, radioactivity change, solubility change, measurement of molecular weight change by gel electrophoresis and / or gel exclusion. In vivo assays include assays that detect physiological effects, such as changes in body weight, changes in electrolyte balance, changes in clotting time, changes in clot degradation and induction of antigen responses, but are limited to those set forth above. Do not mean. In general, in vitro assays are used so long as variable parameters exist to determine the change in interaction between the target substance and the polypeptide of interest.
本発明の例としてはヒト成長ホルモンのソマトジェニ
ックレセプターに関する該ホルモンの活性を決定する該
ホルモンの活性ドメインおよび活性アミノ酸を同定する
態様がある。本発明のこの態様を実施する場合、セグメ
ント置換および残基置換hGH変異体を含むヒト成長ホル
モン変異体で成長ホルモンのソマトジェニックレセプタ
ーとの結合相互作用が天然のヒト成長ホルモンとは異な
るものが調製または同定される。これらのヒト成長ホル
モン変異体の少なくとも１つはソマトジェニックレセプ
ターに関しより高いアフィニティーを有し、かつラット
のソマトジェネシスに対しより高い能力を有している。
他のものはソマトジェニックレセプターについて低い活
性を有している。このようなhGH変異体はhGHアゴニスト
またはアンタゴニストとして有用であり、かつそれらの
変異体はソマトジェニックレセプターとの実質的相互作
用がないことからヒト成長ホルモンの他のレセプターを
刺激するより高い能力を有している。さらにこれらの変
異体はhGH標準またはトレーサーとしてhGHのイムノアッ
セイにおいても有用である。たとえば抗hGHポリクロー
ナル抗体を含むヒトおよびマウス血清との反応性が有意
に低い変異体が同定されている。別のものにはhGHと同
じソマトジェニックレセプタに対する結合アフィニティ
を有するが成長を刺激する能力がより高いものがある。An example of the present invention is an embodiment for identifying the active domain and active amino acids of the human growth hormone, which determine the activity of the hormone with respect to the somatogenic receptor. In practicing this aspect of the invention, human growth hormone variants, including segment-substituted and residue-substituted hGH variants, are prepared in which the binding interaction of growth hormone with the somatogenic receptor is different from natural human growth hormone. Or identified. At least one of these human growth hormone variants has a higher affinity for somatogenic receptors and a higher capacity for somatogenesis in rats.
Others have low activity for somatogenic receptors. Such hGH variants are useful as hGH agonists or antagonists and have a greater ability to stimulate other receptors for human growth hormone due to their lack of substantial interaction with somatogenic receptors. are doing. In addition, these variants are useful in hGH immunoassays as hGH standards or tracers. For example, variants with significantly lower reactivity with human and mouse sera, including anti-hGH polyclonal antibodies, have been identified. Others have the same binding affinity for somatogenic receptors as hGH, but are more capable of stimulating growth.
肝臓由来のソマトジェニックレセプターと相互作用す
るヒト成長ホルモンの活性ドメインを測定する方法を第
１図に示した。この方法では、hGHのセグメントを、ク
ローン化hGH肝臓レセプターおよびhGHに対するモノクロ
ーナル抗体に対して非常にアフィニティーの小さいこと
が知られているhGH類似体由来の類似配列と系統的に置
換した。このようなhGH類似体にはヒト胎盤ラクトゲン
（pPL）、ブタ成長ホルモン（pGH）およびヒトプロラク
チン（hPRL）がある。これらの類似体はソマトジェニッ
クhGHレセプター（hGHr）と比べクローン化hGHレセプタ
ーに対しては約100〜10000倍も小さい結合アフィニティ
ーを有する（ハリントン（Harrington）,A.C.等（198
6）J.Clin.Invest,77,1817;バウマン（Baumann）,G.,等
（1986）J.Clin,Endocrinol.Metab.62,137）。FIG. 1 shows a method for measuring the active domain of human growth hormone which interacts with the somatogenic receptor derived from the liver. In this method, segments of hGH were systematically replaced with cloned hGH liver receptors and analogous sequences from hGH analogs known to have very low affinity for monoclonal antibodies to hGH. Such hGH analogs include human placental lactogen (pPL), porcine growth hormone (pGH) and human prolactin (hPRL). These analogs have a binding affinity for cloned hGH receptor that is about 100- to 10,000-fold less than somatogenic hGH receptor (hGHr) (Harrington, AC et al. (198)
6) J. Clin. Invest, 77 , 1817; Baumann, G., et al. (1986) J. Clin, Endocrinol. Metab. 62 , 137).
相同たん白質はそれらが大きな配列多様性を有すると
きでさえ同様な三次元構造を有することが知られている
ことからこれらの類似体が使用される（チョシア（Chot
hia）,C,等（1986）FMBO J.５,823）。そのように行う
と、類似配列置換をその分子の本来の構造を大きく破壊
することなしに容易に適用できるという見込みが増す。
ヒト成長ホルモンおよびその類似体hPL、pGHおよびhPRL
のアミノ酸配列を第２図に示す。これらのうち最後の３
個の類似体は各々85％、68％および23％のレベルでhGH
との配列同一性を共有する。These analogs are used because homologous proteins are known to have a similar three-dimensional structure even when they have a large sequence diversity (Chosia (Chot
hia), C, et al. (1986) FMBO J. 5 , 823). Doing so increases the likelihood that similar sequence substitutions can be readily applied without significantly disrupting the original structure of the molecule.
Human growth hormone and its analogs hPL, pGH and hPRL
The amino acid sequence of is shown in FIG. The last three of these
Analogs are hGH at levels of 85%, 68% and 23% respectively
Share sequence identity with
第１図を参照すると、ヒトの成長ホルモンに対するソ
マトジェニックレセプター（hGHに対する“標的物
質”）と相互作用するヒト成長ホルモン中の１つ以上の
活性ドメインを同定する全戦術が示されている。示され
ているように、hGHは標的レセプター、この場合のソマ
トジェニックレセプターに対し正の結合活性を有してい
る。しかしhPRL,hPLおよびpGH類似体はマイナス記号で
示されているようにその標的物質に関し著しく活性が低
い。文字ＡからＦで示されている６個のセグメント置換
成長ホルモンはhGHの選択されたアミノ酸セグメントをh
PRL類似体の類似アミノ酸セグメントによる置換で生成
する。これらの選択されたセグメント各々は互いに異な
り、これらを選択してhGHの全アミノ酸配列または活性
ドメインを含むことが期待される領域を探る。セグメン
ト置換ヒト成長ホルモンの調製後各hGHソマトジェニッ
クレセプターに関する検定を行ないその活性を測定す
る。hGHと比較したこれらの結果は第１図のセグメント
修正ヒト成長ホルモンの下の＋または−の記号で示し
た。第１図から分るように、この図中のセグメント置換
ヒト成長ホルモンＣおよびＦはソマトジェニックレセプ
ターと結合しない。これらの結果に基づき、成長ホルモ
ン変異体ＣおよびＦ中の類似体由来の類似セグメントに
対応する成長ホルモン中の領域はhGHのソマトジェニッ
クレセプター結合に関する活性ドメインであると同定さ
れる。Referring to FIG. 1, there is shown a total tactic for identifying one or more active domains in human growth hormone that interact with the somatogenic receptor for human growth hormone (the "target" for hGH). As shown, hGH has a positive binding activity for the target receptor, in this case the somatogenic receptor. However, analogs of hPRL, hPL and pGH are significantly less active with respect to their target substances, as indicated by the minus sign. The six-segment substitution growth hormone, designated by the letters A to F, replaces the selected amino acid segment of hGH with h
Generated by substitution of a PRL analog with a similar amino acid segment. Each of these selected segments is different from one another and is selected to search for the region expected to contain the entire amino acid sequence or active domain of hGH. After preparation of the segment-substituted human growth hormone, an assay is performed for each hGH somatogenic receptor to determine its activity. These results compared to hGH are indicated by a + or-sign under the segment modified human growth hormone in FIG. As can be seen from FIG. 1, the segment-substituted human growth hormones C and F in this figure do not bind to the somatogenic receptor. Based on these results, the region in growth hormone corresponding to analogous segments from analogs in growth hormone variants C and F is identified as the active domain for somatogenetic receptor binding of hGH.
示されているように、もし構造の情報または他のデー
タがある場合は必ずしもヒト成長ホルモンの全アミノ酸
配列または他の親ポリペプチドを試験する必要はない。
したがって結晶学からの低分解能または高分解能情報は
類似物から選択されるアミノ酸セグメントの不安定化置
換を避けるための重要な情報を提供し得る。たとえばヒ
ト成長ホルモンのＸ線座標は得られていないがpGHの低
分解能Ｘ線結晶構造に基づくpGH構造モデルからのヘリ
ックス投影図は４本のヘリックスのうちの３本（ヘリッ
クス1,3および４）は強い疎水性モーメントをもつ両親
媒性であることを明らかにした。第３図参照。アイゼン
ハーグ（Eisenberg）,D.等（1984）J.Mol Biol.179,12
5。ポリペプチド中の疎水性コアは非常に密に存在する
ので（ポンダー（Ponder）,J.W.等（1987）J.Mol.Biol.
193.775）、それらの埋没したアミノ酸残基の変化は一
般に不安定化を招く（アルバー（Alber）,T.等（1987）
Biol.Chem.26,3754;レイダール−オルソン（Reidhaar−
Olson）,J.F.（1988）Science 241,53）。As indicated, it is not necessary to test the entire amino acid sequence of human growth hormone or other parent polypeptide if structural information or other data is available.
Thus, low or high resolution information from crystallography can provide important information to avoid destabilizing substitutions of amino acid segments selected from analogs. For example, the X-ray coordinates of human growth hormone have not been obtained, but helix projections from the pGH structural model based on the low-resolution X-ray crystal structure of pGH show three of the four helices (helix 1, 3 and 4). Revealed that it is amphiphilic with a strong hydrophobic moment. See FIG. Aizen Hague (Eisenberg), D., Etc. (1984) J.Mol Biol. 179, 12
Five. Since the hydrophobic core in the polypeptide is very dense (Ponder, JW et al. (1987) J. Mol. Biol.
193.775), changes in their buried amino acid residues leads to generally destabilizing (Alber (Alber), T., Etc. (1987)
Biol. Chem. 26 , 3754; Reidhaar-
Olson), JF (1988) Science 241 , 53).
さらにポリペプチド群たとえばヒト成長ホルモン群の
中のアミノ酸が非常によく保存されている領域は少なく
とも最初に調べる必要はない。これはそのような保存配
列の破壊はその分子の構造を破壊すると考えられるから
である。さらに他のデータは親ポリペプチドのある領域
は特定の標的物質との相互作用に関係しないことを示し
ている場合がある。たとえば突然変異誘発によるhGHの
Ｎ末端13残基アミノ酸の欠失（アシュケナジ（Ashkenaz
i）,A.等（1987）Endocrinology）121,414）および残基
32〜46を欠失したhGHの中立変異体（20Kd変異体；ルイ
ス（Lewis）,U.J.等（1980）Biochem.Biophys.Res.Comm
un.92,5111）はソマトジェニックレセプターに対する結
合性に大きく影響しないことが報告されている。さらに
残基134と149の間の残基の一部または全てを欠失した制
限たん白質分解によるhGHの２本鎖誘導体の生成もソマ
トジェニックレセプターに対する結合に著しい影響を示
さなかった。リ（Li）,C.H.（1982）Mol.Cell.Biochem.
46,31;ミルス（Mills）,J.B.等（1980）Endocrinology
107,391。In addition, regions of the polypeptides such as the human growth hormones where amino acids are very well conserved need not be investigated at least initially. This is because disruption of such a conserved sequence would destroy the structure of the molecule. Still other data may indicate that certain regions of the parent polypeptide are not involved in interacting with a particular target. For example, deletion of 13 amino acids at the N-terminal end of hGH by mutagenesis (Ashkenaz (Ashkenaz
i), A. et al. (1987) Endocrinology) 121 , 414) and residues
Neutral mutant of hGH lacking 32-46 (20Kd mutant; Lewis, UJ et al. (1980) Biochem. Biophys. Res. Comm
un. 92 , 5111) have been reported to have no significant effect on binding to somatogenic receptors. Furthermore, the formation of a double-stranded derivative of hGH by restriction proteolysis, in which some or all of the residues between residues 134 and 149 were deleted, did not significantly affect binding to the somatogenic receptor. Li, CH (1982) Mol. Cell. Biochem.
46 , 31; Mills, JB et al. (1980) Endocrinology
107, 391.
この情報に基づき、hGHのアミノ酸配列の６個のセグ
メントとが多くのhGH類似体由来の対応する類似アミノ
酸セグメントとの置換に選ばれた。これらの選択された
セグメントは第２図のＡからＦに対応する。これらのセ
グメントをジスルフィド結合、二次構造の境界（第４図
参照）、成長ホルモン群中に高度に保存される配列の領
域、またはそのソマトジェニックレセプターへの結合に
関与しないことが以前に同定された領域によって分離し
た。hGHの191残基中の85残基を集合的に置換した17個の
セグメント置換hGH変異体を調製した。第２図のＡから
Ｆに割り当てた領域および各領域内のセグメントを置換
したhGH変異体を第III表にまとめた。Based on this information, six segments of the amino acid sequence of hGH were selected for replacement with the corresponding similar amino acid segments from many hGH analogs. These selected segments correspond to A to F in FIG. These segments have previously been identified as not participating in disulfide bonds, secondary structure boundaries (see FIG. 4), regions of sequences highly conserved in the growth hormone family, or their binding to somatogenic receptors. Area. Seventeen segment-substituted hGH variants were prepared in which 85 out of 191 residues of hGH were collectively substituted. Table III summarizes the regions assigned to A to F in FIG. 2 and the hGH variants in which the segments within each region have been replaced.
一般にセグメント置換hGH変異体はヒト成長ホルモン
配列へ置換される類似セグメントにより決まる。しかし
ある場合には置換類似セグメント中の類似残基のすべて
がその構築物中に維持されるわけではない。このように
第III表のhPL（12−25）はヒト胎盤ラクトゲン（hPL）
のアミノ酸12〜25が親hGHのアミノ酸残基12〜25と置換
したセグメント置換hGH変異体のことである。この類似
セグメントを置換した効果は、第２図のこの領域中のhG
HとhPLのアミノ酸配列を比較することにより決定するこ
とができる。hPL（12−25）変異体では４個のアミノ酸
置換が生じているがなんの変化も起こらない。hPL（12
−25）の場合のこれらの残基は12、16、20および25であ
る。 Generally, segment-substituted hGH variants are determined by analogous segments replaced by human growth hormone sequences. However, in some cases, not all of the similar residues in the replacement analogous segment are maintained in the construct. Thus, hPL (12-25) in Table III is human placental lactogen (hPL)
Is a segment-substituted hGH variant in which amino acids 12 to 25 are replaced with amino acid residues 12 to 25 of parent hGH. The effect of replacing this similar segment is the hG in this region of FIG.
It can be determined by comparing the amino acid sequences of H and hPL. The hPL (12-25) mutant has four amino acid substitutions but no change. hPL (12
These residues in the case of -25) are 12, 16, 20 and 25.
hPL（12−25）変異体中の実際のアミノ酸置換および
他のセグメント置換変異体を第III表に示した。各置換
は数字の前後に文字を付けて表わされる。第１の文字お
よび数字は未修正hGHの残基番号におけるアミノ酸を示
している。最後の文字はその位置で置換したアミノ酸を
示している。したがってN12HはhGHの12番のアスパラギ
ンがhPL（12−25）変異体ではヒスチジンに置換してい
ることを示している。The actual amino acid substitutions and other segment substitution variants in the hPL (12-25) variants are shown in Table III. Each substitution is indicated by a letter before and after the number. The first letter and number indicate the amino acid at the residue number of the unmodified hGH. The last letter indicates the amino acid substituted at that position. Thus, N12H indicates that the asparagine at position 12 of hGH replaces histidine in the hPL (12-25) mutant.
したがって導入された実際の置換のいくつかは第２図
における対応するセグメントで示される置換とは対応し
ていない。このようにhPL（12−25）は全hPL（12−25）
セグメントが置換された場合４個の置換N12H,R16Q,L20A
およびF25Lを含むことになる。しかし、実際の変異体は
R16およびL20は維持しており、導入される置換は第III
表に示されているように４個の置換のうちの２個、すな
わちN12HおよびF25Lだけである。親hGHの１つ以上の残
基を維持する他のセグメント置換変異体には領域Ａおよ
びＥを含むものおよびセグメント置換変異体hPL（46−5
2）およびpGH（167−181）が含まれる。Thus, some of the actual substitutions introduced do not correspond to the substitutions shown in the corresponding segments in FIG. Thus, the hPL (12-25) is the total hPL (12-25)
4 replacements N12H, R16Q, L20A when segment is replaced
And F25L. However, the actual mutant is
R16 and L20 are maintained and the substitution introduced is
As shown in the table, only two of the four substitutions, N12H and F25L. Other segment substitution variants that maintain one or more residues of the parent hGH include those that include regions A and E and segment substitution variants hPL (46-5
2) and pGH (167-181).
各々のセグメント置換ヒト成長ホルモン変異体をクロ
ーン化可溶性hGHレセプターの細胞外領域からの
〔125I〕hGHの置換を用いたインビドロシステムで検定
しそのソマトジェニックレセプターに対するセグメント
置換変異体の相対的アフィニティーを定量した。レング
（Leung）,D.W.等（1987）Nature 330,537。この短縮型
のソマトジェニックレセプターは同膜型レセプターと比
べ若干結合アフィニティーは小さいが（Kd＝0.3nM）同
程度の活性を示す（スペンサー（Spencer）,S.A.等（19
88）J.Biol.Chem.263,7862）。Each segment-substituted human growth hormone mutant was assayed in an in vitro system using substitution of [ 125I ] hGH from the extracellular region of the cloned soluble hGH receptor and the relative affinity of the segment-substituted mutant for its somatogenic receptor. Was quantified. Rengu (Leung), DW, etc. (1987) Nature 330, 537. This truncated somatogenic receptor has a slightly lower binding affinity (Kd = 0.3 nM) than the same membrane type receptor, but shows the same activity (Spencer, SA, etc.
88) J.Biol.Chem. 263, 7862) .
実施例に詳細に述べられているように各々残基11−1
9,54−74および164−191を含む選択セグメントA,Cおよ
びＦはソマトジェニックレセプターと相互作用するhGH
分子の活性ドメインである。このことはこれらの領域内
のhGH類似体の類似セグメントを含むほとんどのセグメ
ント置換hGH変異体に関し10倍以上も低いKd値が観測さ
れたことに基づく。第４図参照。もちろんこのことはこ
れらの活性ドメイン内の各アミノ酸残基がそのソマトジ
ェニックレセプターの結合残基であることは意味しな
い。むしろそれらのドメインはそのような活性残基を見
い出し得るアミノ酸配列を規定している。さらに活性ド
メインA,CおよびＦの位置が決められた。たとえば変異
体hPRL（12−33）をアミノおよびカルボキシ末端変異体
hPRL（12−19）およびhPRL（22−33）に分断した。この
実験結果はhGHの活性ドメインを残基12〜19にしぼり込
んだ。同様に領域Ｆ（pGH（167−181））のアミノ末端
領域は結合アフィニティーの著しい低下を示した。最も
著しい効果にはたった２個の突然変異E56DおよびR56Mが
導入されたhPL（56−64）の結合よりも30倍も小さいも
のがあった。領域A,CおよびＦはhGHの一次配列上では非
常に離れているが、そのホルモンの三次構造はそれらを
非常に接近させている。第５図参照。これらの活性ドメ
インはヘリックス１のアミノ末端（活性ドメインＡ）,C
ys−53からヘリックス２の開始までのループ（活性ドメ
インＣ）およびヘリックス４の中央領域（活性ドメイン
Ｆ）を含むパッチを形成している。Residues 11-1 as described in detail in the Examples
Selected segments A, C and F, including 9,54-74 and 164-191, hGH interacting with somatogenic receptors
The active domain of a molecule. This is based on the observation of Kd values that are more than 10-fold lower for most segment-substituted hGH variants, including analogous segments of hGH analogs in these regions. See FIG. Of course, this does not mean that each amino acid residue within these active domains is a binding residue of the somatogenic receptor. Rather, those domains define the amino acid sequence at which such active residues can be found. Furthermore, the positions of the active domains A, C and F have been determined. For example, the mutant hPRL (12-33) can be substituted with amino and carboxy terminal variants
The fragment was divided into hPRL (12-19) and hPRL (22-33). The results of this experiment narrowed the active domain of hGH to residues 12-19. Similarly, the amino-terminal region of region F (pGH (167-181)) showed a marked decrease in binding affinity. The most striking effect was 30-fold less than the binding of hPL (56-64) with only two mutations, E56D and R56M. Regions A, C and F are very far apart on the primary sequence of hGH, but the tertiary structure of the hormone makes them very close. See FIG. These active domains are the amino terminus of helix 1 (active domain A), C
It forms a patch containing a loop from ys-53 to the start of helix 2 (active domain C) and a central region of helix 4 (active domain F).
さらにhGHに対する８個のMabをセグメント置換hGH変
異体に対して検定しhGHのエピトープの地図を作った。
さらにそのMabはhGHおよびhGH変異体を用いた競争検定
に用いhGHに対するhGHレセプター結合を阻害する各Mab
の能力を評価した。In addition, eight Mabs against hGH were tested against segment-substituted hGH variants to map the hGH epitope.
Furthermore, the Mab is used in a competition assay using hGH and hGH mutants, and each Mab inhibiting hGH receptor binding to hGH is used.
Were evaluated for their ability.
これらの実験結果を合せるとhGHへの類似セグメント
の置換は分子本来の構造を著しく破壊しないという証拠
および観測される活性はソマトジェニックレセプターと
レセプター置換hGH変異体との相互作用に関する直接的
効果によるものであるという証拠をいくつか提供してい
る。まずセグメント置換変異体はそのソマトジェニック
レセプターまたはMabに対する結合を破壊することに関
し非常に選択的である。第２にソマトジェニックレセプ
ターおよびMabは配列同様構造も認識する。該レセプタ
ーおよび少なくとも４個のMabは該たん白質三次構造感
受性の不連続エピトープを認識する。第３に精製変異体
全ての円二色スペクトルは実際に野生型hGHと同じであ
る。第４にpGH（164−190）を除いて全ての変異体は基
本的に野生型と同量発現した。インビボのたん白質分解
耐性が構造完全性のスクリーニングに用いられている。
ヘクト（Hecht）,M.H.,等（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.
USA 81,5685;ショートル（Shortle）.D.等（1985）Gene
tics 110,539 セグメント置換hGH変異体の結合活性変化は必ずしも
それら変異体中の置換残基が直接ソマトジェニックレセ
プターと接していることを示しているとは限ぎらない。
破壊的突然変異は好ましい相互作用がなくなるだけでな
く、不都合なものも誘導する。たとえばhPRL（12−19）
セグメント置換hGH変異体中のN12R変異体はAsn12の水素
結合するアミド基を変化させるばかりでなく、Arg置換
は正に荷電したより大きい側鎖を導入する。さらに多く
の結合性接触がその類似体間に保存されるのでその結果
全ての接触ではないにしろある領域をセグメント置換hG
H変異体で探ることができる。Taken together, these experiments demonstrate that replacement of a similar segment with hGH does not significantly disrupt the native structure of the molecule, and that the observed activity is due to a direct effect on the interaction between the somatogenic receptor and the receptor-substituted hGH variant Provide some evidence that First, segment substitution mutants are highly selective for disrupting their binding to the somatogenic receptor or Mab. Second, somatogenic receptors and Mabs recognize structures as well as sequences. The receptor and at least four Mabs recognize the protein tertiary structure sensitive discontinuous epitope. Third, the circular two-color spectra of all purified variants are in fact the same as wild-type hGH. Fourth, except for pGH (164-190), all mutants expressed basically the same amount as the wild type. In vivo proteolytic resistance has been used to screen for structural integrity.
Hecht, MH, et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 81, 5685;. Short Le (Shortle) .D etc. (1985) Gene
tics 110, 539 substituted residues avidity changes necessarily in their variants segment-substituted hGH variants is not limited Gila is to indicate that the direct contact with the Soma preparative transgenic receptor.
Disruptive mutations not only eliminate favorable interactions, but also induce disadvantages. For example, hPRL (12-19)
The N12R mutant in the segment-substituted hGH mutant not only changes the hydrogen-bonding amide group of Asn12, but the Arg substitution introduces a more positively charged side chain. Because more binding contacts are conserved between its analogs, segment replacement of some, if not all, regions of hG
Can be explored with the H mutant.
第２図の活性ドメインA,CおよびＦ内の特定の活性ア
ミノ酸を同定するためこれらの活性ドメインの精密構造
分析を行った。この分析ではこれら３個の活性ドメイン
の残基を順番にアラニンと置換した。63個の単一アラニ
ン変異体を作り、各々の可溶性hGHレセプター（shGHr）
に対する結合定数を測定した。レング（Leung）,D.W.等
（1988）J.Biol.Chem.263,7862。In order to identify specific active amino acids in the active domains A, C and F in FIG. 2, a precise structural analysis of these active domains was performed. In this analysis, the residues of these three active domains were sequentially replaced with alanine. Create 63 single alanine variants, each soluble hGH receptor (shGHr)
Was determined. Rengu (Leung), DW, etc. (1988) J.Biol.Chem. 263, 7862 .
この分析に基づき第IV表にリストしたアミノ酸残基は
ソマトジェニックレセプターとの相互作用に関して活性
なhGH分子内の残基を構成している。これは、それらの
残基のアラニン置換により誘導される相対的解離定数が
野生型hGHに比べ４倍以上になることに基づいている。
第７図参照。Based on this analysis, the amino acid residues listed in Table IV constitute residues within the hGH molecule that are active for interaction with the somatogenic receptor. This is based on the fact that the relative dissociation constants induced by alanine substitution of those residues are more than 4-fold compared to wild-type hGH.
See FIG.
hGH変異体を作るのに好ましいこれらの残基のアミノ
酸置換を示す。The amino acid substitutions of these residues which are preferred for making hGH variants are shown.
ソマトジェニックレセプターに対しあまり活性でない
その他のアミノ酸残基を第Ｖ表に示す。一般にこれらの
残基はアラニンと置換したとき相対的Kd値が２倍以下の
増加を示す。 Other amino acid residues that are less active on the somatogenic receptor are shown in Table V. Generally, these residues show a 2-fold or less increase in relative Kd values when substituted with alanine.
第Ｖ表 I4 N12 S55 E66 Q181 P5 M14 S57 K70 R183 L6 L15 P59 S71 G187 S7 R16 S62 K168 R8 R19 N63 I179 アラニンと置換したとき相対的にKd値が減少する（つ
まりソマトジェニックレセプターに対してはより大きい
アフィニティーを示す）hGH中のアミノ酸残基を第VI表
にリストする。Table V I4 N12 S55 E66 Q181 P5 M14 S57 K70 R183 L6 L15 P59 S71 G187 S7 R16 S62 K168 R8 R19 N63 I179 The Kd value decreases relatively when substituted with alanine (ie, greater for somatogenic receptors) Amino acid residues in hGH (indicating affinity) are listed in Table VI.
第VI表 P2 E65 S184 T3 Q69 E186 L10 L73 S188 H18 R167 F191 R64 E174 １残基置換hGH変異体、E174A、は驚くべきことにソマ
トジェニックレセプターに対する解離定数が有意に（ほ
ぼ５倍）に減少する。ソマトジェニックレセプターに対
する結合アフィニティを示すことに加え、この変異体は
ラットの体重検定においてhGHと比べソマトジェニック
能の増加を示した。この置換および1.4倍以上のソマト
ジェニック結合の増加を示す他の特定の残基置換を第VI
I表に示す。Table VI P2 E65 S184 T3 Q69 E186 L10 L73 S188 H18 R167 F191 R64 E174 One residue substituted hGH variant, E174A, surprisingly has a significant (approximately 5-fold) reduction in the dissociation constant for the somatogenic receptor. In addition to exhibiting a binding affinity for the somatogenic receptor, this variant showed increased somatogenic potency compared to hGH in a rat body weight assay. This substitution, and other specific residue substitutions that exhibit a 1.4-fold or greater increase in somatogenic binding, are described in Section VI.
It is shown in Table I.
第VII表 ソマトジェニック結合の増加を示すhGH変異体 hGH残基 置換アミノ酸 H18 Ａ R64 Ｋ E65 Ａ L73 Ａ E174 A,N,Q,S,G E186 Ａ S188 Ａ F191 Ａ 第７図には示されていないアラニン置換を含む他の変
異体を第VIII表にリストする。Table VII hGH variants hGH residue substituted amino acids H18 A R64 K E65 A L73 A E174 A, N, Q, S, G E186 A S188 A F191 A showing increased somatogenic binding are shown in FIG. Other variants containing no alanine substitutions are listed in Table VIII.
第VIII表 変異体 Kd（mM） Kd（var）/Kd（wt） H21A NE − K172A/F176A 201 543 N47A 0.84 2.3 P48A NE − Q49A 0.36 1.0 T50A 0.38 1.0 S51A Q46A NE − V173A NE − 注:NE−振とうフラスコ中容易に単離し得るほど発現さ
れなかったもの（すなわち、野生型発現レベルの約５％
以下） 同定後、hGH中のソマトジェニックレセプターに対す
る活性アミノ酸残基を予備分析で行ったスキャンニング
アミノ酸以外の種々のアミノ酸で置換することにより分
析を行う。第IX表にその残基置換変異体を示した。Table VIII Mutants K d (mM) K d (var) / K d (wt) H21A NE − K172A / F176A 201 543 N47A 0.84 2.3 P48A NE − Q49A 0.36 1.0 T50A 0.38 1.0 S51A Q46A NE − V173A NE − Note: NE-Not easily expressed in shake flasks (ie, about 5% of wild-type expression level)
After identification, analysis is performed by substituting the active amino acid residue for the somatogenic receptor in hGH with various amino acids other than the scanning amino acid performed in the preliminary analysis. Table IX shows the residue substitution variants.
調製したhGH変異体に加え、第Ｘ表にはhGH中の特定の
アミノ酸残基と、生物学的機能が変化した変異体を生成
することが予想される置換アミノ酸を示した。 In addition to the prepared hGH variants, Table X shows the specific amino acid residues in hGH and the substituted amino acids that are expected to produce variants with altered biological function.
別の態様においてはプロラクチンレセプターに対する
hGHの結合エピトープを決定した。hGHは成長ホルモンレ
セプターにもプロラクチン（PRL）レセプターにも結合
し得る。本明細書に示されているようにこれらのレセプ
ターはhGHへの結合の関し互いに競争し、このことはそ
れらの結合部位が重復していることを示している。スキ
ャンニング突然変異誘発データはhPRLレセプターに対す
るhGHのエピトープはヘリックス１の中央部（残基Phe25
およびAsp26を含む）、ループ領域（Ile58およびArg64
を含む）およびヘリックス４の中央領域（残基K168,K17
2,E174およびF176を含む）にある決定基から成る。これ
らの残基はhGHの構造モデル地図を作ったときのパッチ
を形成する。この結合パッチは本明細書で述べられ、か
つB.C.カニンガム（Cunningham）およびJ.A.ウェルズ
（Wells）（1989）Sceince 244,1081−1085）により公
表されたhGHレセプターについて決定されたものと重復
するが同一のものではない。hGHに関するこれらのレセ
プター結合部位の非重復領域に突然変異を起こすことに
より、hGHの選択性が各レセプターへの結合アフィニテ
ィーを損失することなく、hGHレセプター側へ2000倍以
上またはhPRLレセプター側へ20倍以上シフトした。同様
に重復領域に突然変異を起こすことにより、両レセプタ
ーに対し同時に500倍以上結合を減少させ得た。このよ
うなhGHのレセプター選択的変異体は、線型成長または
泌乳などのhGHの種々の生物学的活性と特異的レセプタ
ー結合現象を結びつける有用な分子プローブとなる。 In another embodiment, for the prolactin receptor
The binding epitope of hGH was determined. hGH can bind to both growth hormone receptors and prolactin (PRL) receptors. As shown herein, these receptors compete with each other for binding to hGH, indicating that their binding sites are duplicated. The scanning mutagenesis data shows that the hGH epitope for the hPRL receptor is in the middle of helix 1 (residues Phe25
And Asp26), loop region (Ile58 and Arg64
And the central region of helix 4 (residues K168, K17
2, including E174 and F176). These residues form a patch when mapping the structural model of hGH. This binding patch repeats but is identical to that determined for the hGH receptor described herein and published by BC Cunningham and JA Wells (1989) Sceince 244 , 1081-1085). Not something. By mutating the non-redundant regions of these receptor binding sites for hGH, the selectivity of hGH can be increased by more than 2000-fold to the hGH receptor or 20-fold to the hPRL receptor without loss of binding affinity to each receptor. This has shifted. Similarly, by mutagenizing the duplication region, binding to both receptors could be reduced more than 500-fold simultaneously. Such receptor-selective variants of hGH are useful molecular probes that link various biological activities of hGH, such as linear growth or lactation, with specific receptor binding phenomena.
別の態様ではヒト成長ホルモン（hGH）のレセプター
結合決定基を通常の非結合類似体、ヒトプロラクチン
（hPRL）中に入れた。本明細書およびカニンガム（Cunn
ingham）,B.C.およびウェルズ（Wells）,J.A.（（198
9）Sceince 244,1081−1085）で公表されたアラニンス
キャンニング突然変異誘発は、ヒト肝臓からクローン化
したhGHレセプターに対する結合を調節するhGH中の重要
な残基を同定した。hPRL由来の別の突然変異がhGHに導
入され、hGHレセプター結合部位内のhPRL置換は結合能
をほとんど破壊することを明らかにした。その後hPRLの
cDNAをクローン化し大腸菌で発現させた。それからレセ
プター結合に非常に重要と思われるhGHからの置換を順
次導入し突然変異を起こした。部位指定突然変異誘発を
７回くり返した後、その会合定数がhGHレセプターの100
00倍以上に強化された８個の突然変異を含むhPRL変異体
を同定した。このhPRL変異体は野生型よりもわずか６倍
結合が弱く、一方hGHとの配列一致性はわずか26％であ
った。これらの結果はhGHおよびhPRLと構造類似性を示
し、hGHレセプターエピトープの同一性を確証してい
る。さらに一般にこれらの実験はアゴニストまたはアン
タゴニストなどの新しい性質をもつハイブリッドホルモ
ンを設計するのに有効であることが分っている近縁でか
つ機能的に多様なホルモン類からレセプター結合性を容
易に借し得ることを示している。In another embodiment, the receptor binding determinant of human growth hormone (hGH) was incorporated into a common unbound analog, human prolactin (hPRL). This specification and Cunningham (Cunn
ingham), BC and Wells, JA ((198
9) Alanine scanning mutagenesis published in Sceince 244 , 1081-1085) identified key residues in hGH that regulate binding to the hGH receptor cloned from human liver. Another mutation from hPRL was introduced into hGH, demonstrating that hPRL substitutions in the hGH receptor binding site almost destroyed binding ability. Then hPRL
The cDNA was cloned and expressed in E. coli. Subsequent substitutions from hGH, which appeared to be very important for receptor binding, were then introduced and mutated. After seven rounds of site-directed mutagenesis, the association constant is 100 hGH receptor.
An hPRL mutant was identified that contained eight mutations that were enhanced more than 00-fold. This hPRL variant had only 6-fold weaker binding than the wild-type, while sequence identity with hGH was only 26%. These results show structural similarity with hGH and hPRL, confirming the identity of the hGH receptor epitope. More generally, these experiments readily borrow receptor binding from closely related and functionally diverse hormones that have been shown to be effective in designing hybrid hormones with new properties, such as agonists or antagonists. It is possible to do.
以下に示すものは例であって本発明の範囲を制限する
ものではない。The following are examples and do not limit the scope of the invention.
実施例１ hGH突然変異誘発および発現ベクター 効率的な突然変異誘発を行うためhGHコード配列を変
えることなく均等に分布する18個の単独の制限部位をも
つ合成hGH遺伝子を作った。この合成hGH DNA配列を各
々およそ60塩基対長で隣接するカセットと10bp重復する
７個の合成DNAカセットをライゲーションすることによ
り組立てNsi IからBgl IIで示される405bpのDNAフラグ
メントを作った。この連結フラグメントをポリアクリル
アミドゲルで精製し、これから溶出してアルカリホスフ
ァターゼプロモーターおよびSt IIシグナル配列（チャ
ン（Chang）,C.N.等（1987）Gene 55,189），ファージf
1の複製オリジンおよび複製オリジンおよびβ−ラクタ
マーゼ遺伝子を含むbp1205から4361までのpBR322の領域
を含む受容ベクターpB0475を同様に切断したものにクロ
ーン化した。この配列はダイデオキシ分析により確認し
た（サンガー（Sanger）,F.等（1977）Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 74,5463）。Example 1 hGH Mutagenesis and Expression Vectors For efficient mutagenesis, a synthetic hGH gene with 18 single restriction sites evenly distributed without altering the hGH coding sequence was created. This synthetic hGH DNA sequence was assembled by ligation of seven synthetic DNA cassettes, each of which is approximately 60 base pairs in length and adjacent to each other by 10 bp, to produce a DNA fragment of 405 bp represented by NsiI to BglII. The ligated fragment was purified on a polyacrylamide gel, eluted from it, and the alkaline phosphatase promoter and StII signal sequence (Chang, CN, etc. (1987) Gene 55 , 189), phage f
The receiving vector pB0475, which contains the region of pBR322 from bp 1205 to 4361 containing the replication origin of 1 and the replication origin and the β-lactamase gene, was cloned into similarly cleaved versions. This sequence was confirmed by dideoxy analysis (Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad.
Sci.USA 74, 5463).
第９図に示したようにpB0475を構築した。長さ475bp
のDra I,Rsa Iフラグメント上に含まれる繊維上ファー
ジ由来のf1由来のDNAをpBR322の単独のPvu II部位にク
ローン化しプラスミドp652を作った。テトラサイクリン
耐性遺伝子のほとんどはp652をNhe IおよびNar Iを制限
切断し、DNAポリメラーゼとdNTPを用いてその粘着末端
を充填し、かつ大きい方の3850bpのフラグメントそれ自
体をライゲーションすることにより欠失させてプラスミ
ドｐΔ652を構築した。ｐΔ652をEcoR I,EcoR Vで切断
し、その3690bpのフラグメントをアルカリホスファター
ゼプロモーター、ST IIシグナル配列および中立hGH遺伝
子を含むphGH4R（チャン（Chang）,C.N.等（1987）Gen
e.55,189）由来の1300bp EcoR I,EcoR Vフラグメントと
ライゲーションした。この構築物をpB0473と命名した。
合成DNAを３種の様式でpB0473にクローン化した。ベク
ターpB0473をNsi I,Ggl IIで切断し、両方とも合成DNA
由来の240bp Nsi I,Hind IIIフラグメントおよび1170bp
Hind II,Bgl IIフラグメントにライゲーションした。
この構築物pB0475はhGHの中立ポリペプチドをコードす
るDNAを含むがhGH遺伝子の突然変異誘発やその後の操作
を可能にする多くの新しい単独制限部位を有している。
hGHアミノ酸配列とともにpB0475の全DNA配列を第10図に
示す。pB0475中のhGH配列内の単独制限部位は類似体pG
H,pPLおよびhPRL由来の類似セグメントをコードするDNA
配列を含む変異原カセットの挿入を可能にする（ウェル
ス（Wells）,J.A.等（1985）Gene 34,315）。別にhGH配
列を一本鎖ベクターpB0475の部位指定突然変異誘発によ
り修正し、つづいて単独制限部位の１つについての制限
選択を行った（ウェルズ（Wells）,J.A.等（1986）Phil
os,Trans.R.Soc.London Ser A 317,415） 第III表にあげた17種類のセグメント置換hGH変異体を
調製した。各々は野生型hGHと同様のレベルおよび後に
述べるhGH−hGHハイブリッドをはるかに越えるレベルで
大腸菌の細胞周辺腔に分泌された。hGHおよびhGH変異体
は低リン酸最小培地で生育した大腸菌W3110,tonA株（AT
CC27325）で発現させた（チャン（Chang）,C.N.等（198
7）Gene 55,189）。PB0475 was constructed as shown in FIG. Length 475bp
The DNA from f1 derived from the phage on fiber contained on the Dra I and Rsa I fragments was cloned into the single Pvu II site of pBR322 to create plasmid p652. Most of the tetracycline resistance genes have been deleted by restriction cleavage of p652 with Nhe I and Nar I, filling in its sticky ends with DNA polymerase and dNTPs, and ligating the larger 3850 bp fragment itself. Plasmid pΔ652 was constructed. pΔ652 was digested with EcoR I and EcoR V and its 3690 bp fragment was phGH4R (Chang, CN, etc. (1987) Gen containing the alkaline phosphatase promoter, ST II signal sequence and neutral hGH gene).
e. 55 , 189) from the 1300 bp EcoR I, EcoR V fragment. This construct was named pB0473.
Synthetic DNA was cloned into pB0473 in three ways. Vector pB0473 was cut with Nsi I and Ggl II, and both were synthesized DNA
240 bp Nsi I, Hind III fragment and 1170 bp from
Hind II and Bgl II fragments were ligated.
This construct, pB0475, contains DNA encoding the neutral polypeptide of hGH, but has many new single restriction sites that allow mutagenesis and subsequent manipulation of the hGH gene.
The entire DNA sequence of pB0475 along with the hGH amino acid sequence is shown in FIG. The sole restriction site within the hGH sequence in pB0475 is the analog pG
DNA encoding similar segments from H, pPL and hPRL
It allows insertion of a mutagen cassette containing the sequence (Wells, JA et al. (1985) Gene 34 , 315). Separately, the hGH sequence was modified by site-directed mutagenesis of the single-stranded vector pB0475, followed by restriction selection for one of the single restriction sites (Wells, JA et al. (1986) Phil.
os, Trans. R. Soc. London Ser A 317 , 415) Seventeen segment-substituted hGH variants listed in Table III were prepared. Each was secreted into the periplasmic space of E. coli at levels similar to wild-type hGH and far beyond the hGH-hGH hybrid described below. hGH and hGH mutants were grown on Escherichia coli W3110, tonA strain (AT
CC27325) (Chang, CN, etc. (198
7) Gene 55 , 189).
hGHおよびhGH変異体は以下のように精製した。細胞ペ
レット200gに４倍容（800ml）の10mMトリス（pH8.0）を
加えた。この混合物をペレットが溶解するまで室温でシ
ェーカーにより振とうした。この混合物をホモジナイズ
して低温室で１時間攪拌した後、7000gで15分間遠心し
た。その上清をデカンテーションしてから45％飽和とな
るように硫酸アンモニウムを加え（277g/）、室温で
１時間攪拌した。11000g30分間の遠心後、そのペレット
を40mlの10mMトリス（pH8.0）に懸濁した。この溶液を
２の10mMトリス（pH8.0）に対し一晩透析し、この試
料を遠心または0.45ミクロンメンブレンで濾過した。そ
の後試料を100mlのDEAEセルロース（ファーストフロ
ー、ファルマシア製）カラムにかけた。カラム容量の８
〜10倍の10mMトリス（pH8.0）中ゼロから300mM NaClの
勾配を用いてカラムの溶出を行った。PAGEで同定したhG
Hフラクションを集めて10mMトリス−HCl（pH8.0）に対
し一晩透析した。この試料をCentri−Prep10限外濾過に
よりおよそ1mg/mlになるまで濃縮した。hGH and hGH variants were purified as follows. To 200 g of the cell pellet, 4 volumes (800 ml) of 10 mM Tris (pH 8.0) was added. The mixture was shaken on a shaker at room temperature until the pellets were dissolved. The mixture was homogenized and stirred in a cold room for 1 hour, and then centrifuged at 7,000 g for 15 minutes. After the supernatant was decanted, ammonium sulfate was added thereto so as to be 45% saturated (277 g /), and the mixture was stirred at room temperature for 1 hour. After centrifugation at 11000 g for 30 minutes, the pellet was suspended in 40 ml of 10 mM Tris (pH 8.0). The solution was dialyzed overnight against 2 10 mM Tris, pH 8.0, and the sample was centrifuged or filtered through a 0.45 micron membrane. The sample was then applied to a 100 ml DEAE cellulose (Fast Flow, Pharmacia) column. Column capacity of 8
The column was eluted using a gradient from zero to 300 mM NaCl in 10 mM Tris pH 8.0. HG identified by PAGE
The H fraction was collected and dialyzed against 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) overnight. This sample was concentrated to approximately 1 mg / ml by Centri-Prep10 ultrafiltration.
実施例２ hGHおよびhGHの相同組換え体 ブタの成長ホルモンのＣ末端領域に結合したhGHの種
々の長さのＮ末端領域を含むランダムハイブリッドライ
ブラリを直列に結合した遺伝子のランダム組換え法によ
り構築した。グレー（Gray）,G.L.等（1986）J.Bacteri
ol.166,635。Example 2 hGH and homologous recombinants of hGH Construction by random recombination of genes in which a random hybrid library containing N-terminal regions of various lengths of hGH linked to the C-terminal region of porcine growth hormone was linked in series did. Gray, GL, etc. (1986) J. Bacteri
ol. 166, 635.
pB0475のEcoR I部位を該プラスミドのEcoR I制限処理
により除去し、DNAポリメラーゼとdNTPを添加すること
により粘着末端を充填した後、このプラスミドをライゲ
ーションした。つぎにhGH遺伝子の３′末端の直前に新
しいEcoR I部位を導入した。これはEcoR I部位を含むhG
H−4Rの345bp Bgl II,EcoR VフラグメントをEcoR I-−p
B0475構築物由来の同様の制限レクターにサブクローニ
ングすることにより行った。それからpGH遺伝子（シー
バーグ（Seeburg）P.H.等（1983）DNA２,37）をこの構
築物のhGH遺伝子の３′末端直後に導入した。これは先
に述べた構築物のEcoR I,EcoR V消化物の大きい方のフ
ラグメントにpGHcDNAを含むEcoR I、Hind III（充填）
フラグメントを導入することにより行った。このプラス
ミドpB0509は３′末端に単独のEcoR I部位をもつ本来の
hGH遺伝子と、それに同じ方法でつづく本来のpGH遺伝子
を含む。hGH遺伝子とpGH遺伝子のホモロジーのためpB05
09の一部は大腸菌rec+MM294（ATCC31446）にトランスホ
ームしたときインビボ組換えを起こしハイブリッドhGH/
pGHを生ずる。これらの組換え体は集めたDNAをEcoR Iで
制限処理し、EcoR I部位を失うような組換えを行わなか
ったプラスミドを線状にすることにより濃縮した。２回
の制限選択および大腸菌rec+MM294へのトランスホーメ
ーションの後、ほとんど全てのクローンがハイブリッド
hGH/pGH組換え体となった。22個のクローンの配列分析
は、hGH/pGHハイブリッドがアミノ末端hGH配列とそれに
つづくアミノ酸残基＋19,＋29,＋48,＋94,＋105,＋123
および＋164で始まるpGH配列を含んでいることを示し
た。After removing the EcoR I site of pB0475 by EcoRI restriction treatment of the plasmid and filling in the sticky ends by adding DNA polymerase and dNTP, the plasmid was ligated. Next, a new EcoRI site was introduced just before the 3 'end of the hGH gene. This is the hG containing the EcoR I site
The 345 bp Bgl II, EcoR V fragment of H-4R was digested with EcoR I -- p
This was done by subcloning into a similar restriction vector from the B0475 construct. Then pGH gene (Seeburg (Seeburg) PH, etc. (1983) DNA 2, 37) were introduced immediately after the 3 'end of the hGH gene in the construct. This is because the larger fragment of the EcoR I and EcoR V digests of the previously described construct contains EcoRI, HindIII (filled) containing pGH cDNA.
This was done by introducing fragments. This plasmid, pB0509, has a native EcoR I site at the 3 'end.
Includes the hGH gene followed by the original pGH gene in the same way. pB05 for homology between hGH and pGH genes
A part of 09 hybridized when transformed into Escherichia coli rec + MM294 (ATCC31446) and caused in vivo recombination.
This produces pGH. These recombinants were enriched by restriction of the collected DNA with EcoRI and linearization of plasmids that had not undergone recombination to lose the EcoRI site. After two rounds of restriction selection and transformation into E. coli rec + MM294, almost all clones are hybrid
It became an hGH / pGH recombinant. Sequence analysis of the 22 clones showed that the hGH / pGH hybrid was the amino-terminal hGH sequence followed by the amino acid residues +19, +29, +48, +94, +105, +123.
And a pGH sequence beginning with +164.
hGH遺伝子に均等に分布する交叉点を有する７個のhGH
−pGHハイブリッドが得られた。しかし極端なカルボキ
シ末端ハイブリッド（hGH（１−103）−pGH（164−19
1））のみが精製および分析に十分なレベルで大腸菌か
ら分泌された。このhGH−pGHハイブリッドはヘリックス
４の疎水面上に存在する３個の置換（M170L,V173Aおよ
びV180M）を導入する。したがって第２図のヘリックス
領域A,D,EおよびＦにおける配列変化のほとんどはヘリ
ックスの疎水面上の残基の突然変異を避けるよう設計し
た。たとえば上述のハイブリッドhGH−pGH変異体は、M1
70,V173,F176およびV180を維持するよう修正した。なぜ
ならこれらの残基はヘリックス４の疎水面上内に存在す
るからである。7 hGHs with crossover points evenly distributed in the hGH gene
A -pGH hybrid was obtained. However, the extreme carboxy-terminal hybrid (hGH (1-103) -pGH (164-19
Only 1)) was secreted from E. coli at levels sufficient for purification and analysis. This hGH-pGH hybrid introduces three substitutions (M170L, V173A and V180M) present on the hydrophobic surface of helix 4. Therefore, most of the sequence changes in helical regions A, D, E and F in FIG. 2 were designed to avoid mutation of residues on the hydrophobic face of the helix. For example, the hybrid hGH-pGH mutant described above
Modified to maintain 70, V173, F176 and V180. This is because these residues are on the hydrophobic surface of helix 4.
実施例３ 可溶性ヒト成長ホルモンレセプターの大腸菌からの発現
および精製 可溶性ヒト成長ホルモンレセプターshGHrをコードす
るクローン化DNA配列（レング（Leung）,D.W.等（198
7）Nature 330,537）をpB0475にサブクローンしpJ1466
を作った（第11図および第12図参照）。Example 3 Expression and Purification of Soluble Human Growth Hormone Receptor from E. coli Cloned DNA sequence encoding soluble human growth hormone receptor shGHr (Leung, DW et al. (198)
7) Nature 330, 537) was subcloned into the pB0475 pJ1466
(See FIGS. 11 and 12).
ベクターpC1S.2SHGHR（レング（Leung）,D.W.等（198
7）Nature 330,537）をXba IおよびKpn Iで消化し、hGH
の分泌シグナルおよび246コドンの細胞外領域をコード
する1.0bpフラグメントを精製した（マニアチス（Mania
tis）,T.等（1982）モレキュラークローニング、コール
ドスプリングハーバーラボラトリー,N.Y.）。このフラ
グメントを同様に切断したM13mp18にライゲーションし
組換え体用に一本鎖DNAを精製した（メシング（Messin
g）,J.（1983）Methods in Enzymology,101巻、20
頁）。部位指定突然変異誘発（カーター（Carter）,P.
等（1986）Nucleic Acids Res.13,4331）を18mer.ジゴ
ヌクレオチド５′−Ａ−AGT−GAT−GCA−TTT−TCT−GG
−３′により行ないコドン＋１にNsi Iを導入した。変
異配列はダイデオキシ配列分析（サンガー（Sanger）,
F.等Proc.Natl.Acad.Sci.USA74,5463）により確認し
た。変異体の二本鎖DNAを精製しNsi IおよびSma Iで切
断した。hGHレセプターの246コドン細胞外領域を含む90
0bpフラグメントを単離した。pB0475をNsi IおよびEcoR
Vで切断し4.1kbフラグメント（合成hGH遺伝子を欠く）
を精製した。Vector pC1S.2SHGHR (Leung, DW, etc. (198
7) Nature 330, 537) was digested with Xba I and Kpn I, hGH
A 1.0 bp fragment encoding the secretion signal and extracellular region of 246 codons was purified (Maniatis
tis), T. et al. (1982) Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, NY). This fragment was ligated to similarly cut M13mp18 to purify single-stranded DNA for recombinant (Messin (Messin
g), J. (1983) Methods in Enzymology, 101, 20
page). Site-directed mutagenesis (Carter, P.
(1986) Nucleic Acids Res. 13 , 4331) is an 18-mer. Digonucleotide 5'-A-AGT-GAT-GCA-TTT-TCT-GG.
NsiI was introduced at codon +1 by -3 '. The mutant sequence was analyzed by dideoxy sequence analysis (Sanger,
F. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 , 5463). The mutant double-stranded DNA was purified and cut with NsiI and SmaI. 90 containing the 246 codon extracellular region of the hGH receptor
The 0 bp fragment was isolated. pB0475 with Nsi I and EcoR
4.1 kb fragment digested with V (lacking synthetic hGH gene)
Was purified.
レセプターの900bpフラグメントおよび4.1Kbベクター
フラグメントをライゲーションし、その組換えクローン
（pJ1446）を制限地図により確認した。これを大腸菌KS
303にトランスホームし（ストローチ（Strauch）,K.等
（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,1576）、ついで、
低リン酸培地（チャン（Chang）,C.N.（1987）Gene 55,
189）中30℃で生育した。レセプターフラグメントたん
白質をhGHアフィニティ−クロマトグラフィーで精製し
た（スペンサー（Spencer）,S.A.等（1988）J.Biol.Che
m.263,7862;レング（Leung）D.W.等（1987）Nature 33
0,537）。pJ1446の配列をクローン化レセプターのアミ
ノ酸配列とともに第12図に示す。The 900 bp fragment and the 4.1 Kb vector fragment of the receptor were ligated, and the recombinant clone (pJ1446) was confirmed by a restriction map. This is E. coli KS
Transform to 303 (Strauch, K. et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 , 1576).
Low phosphate medium (Chang, CN (1987) Gene 55 ,
189). The receptor fragment protein was purified by hGH affinity chromatography (Spencer, SA et al. (1988) J. Biol. Che.
m 263, 7862;. Rengu (Leung) DW, etc. (1987) Nature 33
0, 537). FIG. 12 shows the sequence of pJ1446 together with the amino acid sequence of the cloned receptor.
大腸菌W3110,deg P株（ストローチ（Strauch）,K.L.
等（1988）PNAS USA 85,1576）をpJ1446でトランスホ
ームし、ファーメンター中低リン酸培地（チャン（Chan
g）,C.N.（1987）Gene 55,189）を用い30℃で生育させ
た。246アミノ酸のhGHrを用い予備データをとった。ア
ミノ酸１〜238番を含むわずかに短かいhGHrを本明細書
の実施例１で用いた。このレセプターについて得られた
結果は246アミノ酸hGHrで得た値と区別できなかった。E. coli W3110, deg P strain (Strouch, KL
(1988) PNAS USA 85 , 1576) was transformed with pJ1446 and fermented in a low phosphate medium (Chan).
g), and grown at 30 ° C. using CN (1987) Gene 55 , 189). Preliminary data was taken using hGHr of 246 amino acids. A slightly shorter hGHr containing amino acids 1-238 was used in Example 1 herein. The results obtained for this receptor were indistinguishable from those obtained with 246 amino acid hGHr.
カルボキシル末端異質性の問題を避けるためにGln238
の後に停止コドンを入れたプラスミドphGHr（１−238）
を構築した。phGHr（１−238）を含むKS330培養物から
は結合たん白質がphGHr（１−246）を含む培養物からよ
りもわずかに高い収率でかつより均一なものが生成した
（データ示さず）。湿重量0.2kgの細胞ペレットから始
め70〜80パーセントの収率で20〜40mgの高純度結合たん
白質がルーチンに単離された（２の高密度細胞培養物
から）。Ｎ末端シーケンシングおよび質量スペクトル分
析と組合せたペプチドマッピングでその生成物は残基１
から238に及んでいることが確認された。Gln238 to avoid carboxyl-terminal heterogeneity problems
PhGHr (1-238) with a stop codon after
Was built. KS330 cultures containing phGHr (1-238) produced slightly higher yields and more uniform bound protein than cultures containing phGHr (1-246) (data not shown). Starting from a 0.2 kg wet cell pellet, 20-40 mg of high purity bound protein was routinely isolated (from 2 high density cell cultures) in 70-80 percent yield. In peptide mapping combined with N-terminal sequencing and mass spectrometry, the product was identified as residue 1
To 238.
phGHr（１−246）テンプレートの部位指定突然変異誘
発をオリゴヌクレオチド を用いて行ない（カーター（Carter），等（1986）Nucl
eic Acids Res.13,4431−4443）phGHr（１−240,C241
R）を作った（式中アステリスクはphGHr（１−246）と
のミスマッチを示し、下線は新しい単独のMlu I部位で
あり、CGT−TAGはC241R突然変異とそれにつづく停止コ
ドンを示す（第Ｘ表Ａ）。Oligonucleotides for site-directed mutagenesis of phGHr (1-246) template (Carter, et al. (1986) Nucl
eic Acids Res. 13 , 4433-14443) phGHr (1-240, C241
R) (where the asterisk indicates a mismatch with phGHr (1-246), the underlined is a new single MluI site, and the CGT-TAG indicates the C241R mutation followed by a stop codon (X Table A).
プラスミドphGHr（１−238）をMlu I部位（第Ｘ表
（Ａ））に対する制限選択（ウェルズ（Wells），等（1
986）Phil.Trans.R.Soc.Lond.A,317,415−423）を用い
たphGHr（１−240,C241R）テンプレートの部位指定突然
変異誘発により生成した。簡単に云うとオリゴヌクレオ
チド はGln238（CAAトリプレット）の後に翻訳停止コドンを
誘導しかつMlu I制限部位（下線）を修正した。ヘテロ
二本鎖による最初のトランスフェクションから二本鎖DN
Aを回収した後、再トランスホームしてDNAシーケンシン
グの前に目的とするphGHr（１−238）プラスミドを増や
した。 Plasmid phGHr (1-238) was restricted to the MluI site (Table X (A)) by restriction selection (Wells), et al.
986) was generated by site-directed mutagenesis of the phGHr (1-240, C241R) template using Phil. Trans. R. Soc. Lond. A, 317 , 415-423). Oligonucleotides in short Induced a translation stop codon after Gln238 (CAA triplet) and modified the Mlu I restriction site (underlined). Double-stranded DN from first transfection with heteroduplex
After recovering A, the target phGHr (1-238) plasmid was increased before re-transformation and DNA sequencing.
最終的にphGHr（１−238）中にクローン化したhGH結
合たん白質がcDNA変異体またはクローニングアーテファ
クトを生じさせるT51A突然変異を含むことはDNAシーケ
ンシングで確認された。それゆえA51Tリバータントは報
告されている配列と同じである（レング（Leung）等（1
987）Nature（London）330,537−543。部位51にThrまた
はAlaを含むたん白質の精製および結合性は区別できな
い（データ示さず）。Ala51結合たん白質変異体は特性
が明らかになっているのでひきつづく全ての分析用に選
択された。DNA sequencing confirmed that the hGH binding protein ultimately cloned into phGHr (1-238) contained a T51A mutation that resulted in a cDNA variant or cloning artifact. The A51T revertant is therefore identical to the reported sequence (Leung et al. (1)
987) Nature (London) 330 , 537-543. Purification and binding of proteins containing Thr or Ala at site 51 are indistinguishable (data not shown). The Ala51 binding protein variant was selected for all subsequent analyses because of its characterization.
ヒト血清から単離した天然の産物と大腸菌由来の組換
えhGH結合たん白質の特異性を比較するため野生型と種
々のhGH変異体のアフィニティーを測定した。To compare the specificity of the native product isolated from human serum with the recombinant hGH binding protein from E. coli, the affinity of wild-type and various hGH variants was determined.
両たん白質はhGHと特定の化学量論比の複合体を形成
した（第24図）。これから分るように野生型hGHおよび
その変異体のアフィニティーは２つの結合たん白質間で
ほぼ同じであった（上述、右側欄）。組換えhGH結合た
ん白質はヒト血清由来の中立たん白質と比べ非常に高い
アフィニティーを有している。このことは、その組換え
たん白質の純度および均一性を反映している。hGH結合
たん白質に対する結合能を破壊するhGHの４つのアラニ
ン変異体に対する結合アフィニティーの変化によって示
されるように両たん白質は同じ特異性を有している（上
述Kd（変異体）/Kd（wt））。Tyr246にまで及び結合た
ん白質に対するhGHのアフィニティ−（Kd＝0.36±0.08n
M）は実質的にGln238の後で終っているものと同じであ
り（0.40±0.03nM）、このことは、その分子の７個目の
システインを含む最後の８残基はhGHの結合に関し重要
ではないことを示している。 Both proteins formed a complex with hGH at a specific stoichiometric ratio (FIG. 24). As can be seen, the affinity of wild-type hGH and its mutants was nearly identical between the two binding proteins (see above, right column). Recombinant hGH binding protein has much higher affinity than neutral protein from human serum. This reflects the purity and homogeneity of the recombinant protein. Both proteins have the same specificity as indicated by a change in binding affinity to the four alanine variants of hGH that disrupts the ability to bind to the hGH binding protein (Kd (mutant) / Kd (wt )). The affinity of hGH for Tyr246 and for binding proteins (Kd = 0.36 ± 0.08n
M) is substantially the same as that ending after Gln238 (0.40 ± 0.03 nM), which means that the last eight residues of the molecule, including the seventh cysteine, are important for hGH binding. Is not.
実施例４ レセプターおよびモノクローナル抗体結合検定 精製したhGHまたはhGH変異体（95％以上の純度）につ
いて、実施例３の可溶性hGHレセプターへの結合に関す
る検定を行った。SDS−PAGE後のコーマージ染色ゲルの
レーザーデンシトメータスキャンニングにより精製ホル
モンの濃度を定量した。これらの値は280nmの吸光度に
よる濃度（ε280 0.1％＝0.93）とよく一致した。解離定
数（Kd）は25℃における可溶性hGHレセプターに結合す
る〔125I〕hGHの競合置換に関するスキャッチャード分
析から計算した。この〔125I〕hGHはスペンサー（Spenc
er）,S.A.等（1988）,J.Biochem,263,7862）の方法に従
って調製した。Example 4 Receptor and monoclonal antibody binding assay Purified hGH or hGH variants (95% or higher purity) were assayed for binding to the soluble hGH receptor of Example 3. The concentration of purified hormone was quantified by laser densitometer scanning of the Comerge stained gel after SDS-PAGE. These values were in good agreement with the concentration determined by absorbance at 280 nm (ε 280 0.1% = 0.93). Dissociation constants (Kd) were calculated from Scatchard analysis for competitive displacement of [ 125I ] hGH binding to soluble hGH receptor at 25 ° C. This [ 125 I] hGH is from Spencer
er), SA et al. (1988), J. Biochem, 263 , 7862).
酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を用い種々のセグ
メント置換および残基置換hGH変異体に対する８個のモ
ノクローナル抗体の結合を検定した。以下のMabを使用
した。The binding of eight monoclonal antibodies to various segment-substituted and residue-substituted hGH variants was assayed using an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). The following Mab was used:
hGHに対するウサギポリクローナル抗体をアフィニテ
ィー精製し、0.005M炭酸ナトリウム（pH10）中最終２μ
g/mlの濃度、24℃、16〜20hでマイクロプレート（Nunc
プレート、インターメド社、デンマーク）をコーティン
グした。このプレートをバッファＢ中（50mMトリス〔pH
7.5〕、0.15M NaCl,2mM EDTA,5mg/ml BSA,0.05％トウィ
ーン20,0.02％アジ化ナトリウム）0.1μg/mlの各hGHと2
5℃、２時間反応させた。プレートを洗浄後バッファＢ
で150〜0.002nMに段階的に希釈した指示Mabとインキュ
ベートした。２時間後プレートを洗浄し、ホースラディ
ッシュパーオシダーゼ結合抗マウス抗体で染色して検定
した。得られた値は各hGH変異体への最高結合量の半値
を与えるのに必要な各Mabの濃度を表わしている。 Rabbit polyclonal antibody to hGH was affinity purified and final 2 μl in 0.005 M sodium carbonate (pH 10).
g / ml at 24 ° C for 16-20 h
Plate, Intermed, Denmark). This plate was placed in buffer B (50 mM Tris [pH
7.5], 0.15 M NaCl, 2 mM EDTA, 5 mg / ml BSA, 0.05% Tween 20, 0.02% sodium azide) 0.1 μg / ml of each hGH and 2
The reaction was performed at 5 ° C. for 2 hours. Buffer B after washing plate
With the indicated Mab serially diluted from 150 to 0.002 nM. After 2 hours, the plates were washed and stained with horseradish perosidase-conjugated anti-mouse antibody and assayed. The values obtained represent the concentration of each Mab required to give half the maximum amount of binding to each hGH variant.
抗hGH MabによるhGHからのhGHレセプターの競合置換
は以下のように測定した。この検定は先に述べたように
抗GHウサギポリクローナル抗体をコートしたマイクロプ
レートにおける野生型hGHの固体化により行った。レセ
プター（10nMで固定）および所定の抗hGH Mab（150〜0.
002nMの範囲で希釈）をhGHコートマイクロプレートに入
れ25℃で16〜20時間インキュベートし、その後未結合成
分を洗浄した。結合レセプター量はhGHと該レセプター
との結合を阻害しないホースラディッシュパーオキシダ
ーゼに結合させた抗レセプターMabを加えることにより
定量した。標準化置換値はプレート上のhGHを飽和する
のに必要なMab濃度の半値に対する該レセプターの50％
を置換するのに必要なMab濃度の比から計算した。この
値は各Mabの該レセプター置換能の比較に用いた。Competitive displacement of hGH receptor from hGH by anti-hGH Mab was measured as follows. This assay was performed by solidifying wild-type hGH in a microplate coated with anti-GH rabbit polyclonal antibody as described above. Receptor (fixed at 10 nM) and a given anti-hGH Mab (150-
(Diluted in the range of 002 nM) in an hGH-coated microplate and incubated at 25 ° C. for 16-20 hours, after which the unbound components were washed. The amount of bound receptor was quantified by adding an anti-receptor Mab conjugated to horseradish peroxidase that did not inhibit hGH binding to the receptor. The normalized displacement value is 50% of the receptor relative to half the Mab concentration required to saturate hGH on the plate.
Was calculated from the ratio of the Mab concentrations required to replace. This value was used to compare the ability of each Mab to displace the receptor.
実意例５ ソマトジェニックレセプター結合の活性ドメイン 実施例３の可溶性ソマトジェニックレセプターおよび
実施例４で述べたモノクローナル抗体への結合に関し、
実施例１および２で述べた17個のセグメント置換hGH変
異体を検定した。ソマトジェニックレセプターに対する
結合検定の結果を第III表に示す。これから分るように
結合能をほとんど破壊するセグメント置換は第４図およ
び第５図の領域A,CおよびＦ内のものである。さらにこ
れらの領域をさらに小さいセグメントにしぼり込みソマ
トジェニックレセプターへの結合に関係するhGH分子の
活性ドメインの位置を決定した。第III表からの最も重
要な結果を第４図に示す。この図は、類似体hPRL、hPL
およびpGH由来の類似配列の置換による可溶性hGHレセプ
ターへの結合における相対的減少を示した棒グラフであ
る。各々アミノ酸残基12−19、54−74および164−190を
含む３つの活性ドメイン領域A,CおよびＦが同定され
た。これらの領域は第５図のhGH分子の３次元表示に示
されている。Practical Example 5 Active Domain of Somatogenic Receptor Binding For binding to the soluble somatogenic receptor of Example 3 and the monoclonal antibody described in Example 4,
The 17 segment-substituted hGH variants described in Examples 1 and 2 were assayed. The results of the binding assay for somatogenic receptors are shown in Table III. As can be seen, the segment substitutions that almost destroy the binding capacity are in regions A, C and F of FIGS. 4 and 5. In addition, these regions were squeezed into smaller segments to determine the location of the active domain of the hGH molecule involved in binding to the somatogenic receptor. The most important results from Table III are shown in FIG. This figure shows the analogs hPRL, hPL
And Figure 4 is a bar graph showing the relative decrease in binding to soluble hGH receptor by substitution of similar sequences from pGH. Three active domain regions, A, C and F, containing amino acid residues 12-19, 54-74 and 164-190, respectively, were identified. These regions are shown in the three-dimensional representation of the hGH molecule in FIG.
これから分るように、３つの活性ドメインA,Cおよび
ＦはhGHのアミノ酸配列中では不連続であるけれどもhGH
に関するソマトジェニック結合部位を規定する分子構造
においては連続領域を形成している。As can be seen, the three active domains, A, C and F, are discontinuous in the amino acid sequence of hGH but hGH
In the molecular structure defining the somatogenic binding site, a continuous region is formed.
実施例６ hGHエピトープマッピング 特定のセグメント置換hGH変異体に対する８種のモノ
クローナル抗体の結合を第XI表に示す。Example 6 hGH Epitope Mapping The binding of eight monoclonal antibodies to specific segment-substituted hGH variants is shown in Table XI.
pGH（167−190）変異体は除いて各モノクローナル抗
体に対する結合能の破壊は著しくかつ非常に選択的であ
る。第13〜20図はhGHの３次元構造内の各Mabに対するエ
ピトープの位置を示している。第６図はソマトジェニッ
クレセプターに対する結合部位に対するエピトープを示
している。 With the exception of the pGH (167-190) variant, the disruption of binding ability to each monoclonal antibody is significant and very selective. Figures 13-20 show the location of the epitope for each Mab within the three-dimensional structure of hGH. FIG. 6 shows the epitope for the binding site for the somatogenic receptor.
たとえばhPRL（88−95）,hPRL（97−104）,hPL（109
−112）およびhPRL（111−129）変異体はMab1に結合し
ないが、それらの領域以外の他のセグメント置換hGHは
野生型hGHと同様の効率で結合した。Mab2,3,4,5および
６への結合は一次配列の不連続であるが、ホルモン３次
元構造においては近接している領域の突然変異により阻
害された（第６図および第14〜19図参照）。これと対照
的にMab1,7および８は第13図、第19図および第20図に示
したように連続的配列で規定される突然変異により阻害
された。さらに所定のモノクローナル抗体への結合を阻
害する領域を、特定のセグメント置換hGH領域のサブド
メインへの細分化または特定のMabにすでに結合した共
通の置換を有する変異体の分析により解析した。たとえ
ばpGH（11−33）はMab4への強固な結合を維持している
がhPRL（12−33）は結合能を失っていた。したがって、
hPRL（12−33）変異体における破壊的突然変異はpGH（1
1−33）では変異していない残基:N12,L15,R16,D26およ
びE30に限定し得る。さらにhPRL（12−19）変異体は結
合能を失ったがhPRL（22−23）は失なわなかったことか
ら（第16図参照）、これはN12,L15およびR16に限定され
る。N12H突然変異がpGH（11−33）とは共通しない変異
であることからこれでMab4への結合の阻害を説明し得
る。このことをAsn−12のアラニン置換でテストした。N
12A残基置換hGH変異体へのMab3またはMab4の結合は100
倍以上も減少したが他のMabへの結合は影響を受けなか
った。For example, hPRL (88-95), hPRL (97-104), hPL (109
The −112) and hPRL (111-129) mutants did not bind to Mab1, but other segment-substituted hGH outside of those regions bound with similar efficiency as wild-type hGH. Binding to Mab2,3,4,5 and 6 is discontinuous in the primary sequence but was inhibited by mutations in adjacent regions in the hormone three-dimensional structure (FIGS. 6 and 14-19). reference). In contrast, Mab 1, 7 and 8 were inhibited by mutations defined in a contiguous sequence as shown in FIG. 13, FIG. 19 and FIG. In addition, regions that inhibit binding to a given monoclonal antibody were analyzed by subdividing the specific segment-substituted hGH region into subdomains or analyzing variants with common substitutions already bound to a specific Mab. For example, pGH (11-33) maintained tight binding to Mab4, while hPRL (12-33) lost binding ability. Therefore,
The disruptive mutation in the hPRL (12-33) mutant is pGH (1
In 1-33), residues which are not mutated can be limited to N12, L15, R16, D26 and E30. Furthermore, the hPRL (12-19) mutant lost binding ability, but not hPRL (22-23) (see FIG. 16), which is limited to N12, L15 and R16. This may explain the inhibition of binding to Mab4, as the N12H mutation is a mutation not common to pGH (11-33). This was tested by alanine substitution of Asn-12. N
Binding of Mab3 or Mab4 to 12A residue-substituted hGH variants is 100
Although it decreased more than 2-fold, binding to other Mab was not affected.
このセットのhGH変異体を用いることにより、８個のM
abのほとんどの結合が共通セットの突然変異により阻害
されたとしてもこれらのMab全てのエピトープを解明し
得る。たとえばhPRL（12−19）はMab2,3および４への結
合を示さないが、他の変異体はこれらのMabが種々の構
造を認識することを示した。特にMab2および３はpGH（1
1−33）により阻害されるがMab4は影響を受けなかっ
た。Mab3および４の結合はhPL（12−25）により阻害さ
れたがMab2への結合は影響を受けなかった。このように
８個の抗体は重複するが完全に重ならないエピトープを
有する。結合を乱す突然変異はヘリックスおよびループ
の両方に存在し、かつ常にホルモン構造において近接し
ている。By using this set of hGH variants, eight M
The epitopes of all these Mabs can be resolved, even if the binding of most of the abs is inhibited by a common set of mutations. For example, hPRL (12-19) shows no binding to Mab2, 3, and 4, while other mutants have shown that these Mabs recognize different structures. In particular, Mab 2 and 3 were pGH (1
1-33), but Mab4 was not affected. Binding of Mab3 and 4 was inhibited by hPL (12-25) but binding to Mab2 was not affected. Thus, the eight antibodies have overlapping but not completely overlapping epitopes. Mutations that disrupt binding are present in both the helix and the loop and are always close in hormonal structure.
合せて考えてみると、８個のMabセットのエピトープ
はこのホルモンのほとんどをカバーする。しかしなおMa
bが結合しない領域がある。たとえば20個の変異体のう
ちの３個はテストしたMab（hPRL（22−33）,pGH（48−5
2）およびhPRL（126−136））のいずれに対する結合も
有意に乱さなかった。Taken together, the epitopes of the eight Mab sets cover most of this hormone. But still Ma
There is an area where b does not combine. For example, three of the 20 mutants tested the Mab (hPRL (22-33), pGH (48-5
Binding to both 2) and hPRL (126-136) was not significantly disrupted.
抗体エピトープとレセプター結合部位には有意な差が
ある。第１に阻害的突然変異により規定されるパッチは
どのMabに関してよりもレセプターに関するものの方が
大きい。第２の差はレセプターがMabよりもホルモンの
阻害的置換に対しより耐性が強い。これはどの変異体の
レセプターへの結合に関してもその最大の減少は約70倍
であるがほとんど全ての抗体にはN12Aなどの単一置換の
結果の場合のように1000倍の結合の減少をひき起こす少
なくとも１つの変異体がある。There are significant differences between the antibody epitope and the receptor binding site. First, patches defined by inhibitory mutations are larger for the receptor than for any Mab. The second difference is that the receptors are more resistant to inhibitory displacement of hormones than Mab. This means that the maximum reduction in binding of any variant to the receptor is about 70-fold, but almost all antibodies result in a 1000-fold reduction in binding, as in the case of a single substitution such as N12A. There is at least one variant that occurs.
実施例７ MabおよびshGHrの競合的結合 レセプター結合を乱す多くの変異体は１つ以上のMab
の結合も乱す。それゆえ、hGHに対するhGHレセプターの
結合を阻害する８個のMabの各々の能力を評価した。こ
の検定の結果を第XII表に示す。Example 7 Competitive binding of Mab and shGHr Many mutants that disrupt receptor binding have more than one Mab
Also disrupts the binding of Therefore, the ability of each of the eight Mabs to inhibit binding of the hGH receptor to hGH was evaluated. The results of this test are shown in Table XII.
表から分るようにMab5および６はhGHレセプターの結
合を阻害する上で最も効率がよい。このことはそれらの
Mabがレセプターに対する決定基と密接に重復する残基5
4−74までのレープおよびヘリックス４内に存在する抗
原決定基を有することによる（第５図、第６図、第17図
および第18図参照）。Mab2は次に競合的な抗体であり、
かつレセプターと共通する阻害的突然変異を共有する
（pPRL（12−19））。これに対しMab3および４はMab2に
比べおおよそ1000倍競争力が小さいがそれらはまたヘリ
ックス１中にレセプターと重復する阻害的突然変異を共
有している。第15図および第16図参照。Mab3および４を
乱すヘリックス１中の突然変異がMab2またはレセプター
への結合を乱す残基と異なるならこの見かけ上の差は容
易に解決されよう。事実、１つの変異体（N12A）はMab2
またはそのレセプターへの結合に影響することなくMab3
または４の結合を乱す。 As can be seen from the table, Mab 5 and 6 are the most efficient at inhibiting hGH receptor binding. This means that
Residue 5 where the Mab repeats closely with the determinant for the receptor
By having an antigenic determinant present in leps 4 and up to 4-74 helix 4 (see FIGS. 5, 6, 17 and 18). Mab2 is the next competitive antibody,
And share a common inhibitory mutation with the receptor (pPRL (12-19)). In contrast, Mab3 and 4 are approximately 1000 times less competitive than Mab2, but they also share an inhibitory mutation in helix 1 that duplicates the receptor. See FIG. 15 and FIG. This apparent difference would be easily resolved if the mutation in helix 1 that disrupts Mab 3 and 4 differs from the residue that disrupts binding to Mab 2 or the receptor. In fact, one mutant (N12A) is Mab2
Or Mab3 without affecting binding to its receptor
Or disrupt the bond of 4.
Mab7はhGHに対しそのレセプターと比較的強く競合
し、またたとえばhPL（46−52）などレセプター結合を
わずかに乱すセグメント置換hGH変異体により阻害され
る。したがってMab2および７はレセプター結合部位の境
界上に存在するように思える。Mab1および８はレセプタ
ーの検出可能な置換を与えられなかった。また予想され
るようにこれらはレセプターと重復する抗原決定基を含
んでいない。これらの競合結合データは直接的エピトー
プマッピングデータおよびレセプター結合データととも
に第５図に示されるようなレセプター結合部位の一般的
位置を強く支持している。Mab7 competes relatively strongly for its receptor for hGH and is inhibited by segment-substituted hGH variants that slightly disrupt receptor binding, eg, hPL (46-52). Thus, Mab 2 and 7 appear to be on the border of the receptor binding site. Mab 1 and 8 did not give a detectable displacement of the receptor. Also, as expected, they do not contain antigenic determinants that duplicate the receptor. These competitive binding data together with the direct epitope mapping data and the receptor binding data strongly support the general location of the receptor binding site as shown in FIG.
実施例８ レセプター活性アミノ酸残基 実施例５、６および７におけるhGHの分析はレセプタ
ー結合に重要なヘリックス１のアミノ末端領域（残基11
−19）を含んでいる。さらに残基54−74および167−191
もレセプター結合に重要であることが分った。レセプタ
ー結合に活性なこれらのドメイン中のアミノ酸の同定は
全部で63個の単一アラニン変異体を分析することにより
行った。第XIII表、第XIV表、および第XV表参照。Example 8 Receptor Active Amino Acid Residues Analysis of hGH in Examples 5, 6 and 7 shows the amino terminal region of helix 1 (residue 11) important for receptor binding.
-19). Further residues 54-74 and 167-191
Have also been found to be important for receptor binding. The identification of amino acids in these domains that are active for receptor binding was performed by analyzing a total of 63 single alanine variants. See Tables XIII, XIV, and XV.
アミノ末端残基位置の不明確さのためアラニン置換は
残基２−19を含むように行った（アブデル−メギド（Ab
del−Meguid）、S.S.等（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.US
A 84,6434）。実際に結合のもっとも著しい減少はF10A
（６倍）でつづいてヘリックス１のＮ末端の残基４−６
のアラニン置換で起こった（第21図参照）。結合に関し
て実質的により大きい効果（20倍以上）は残基54〜74の
ループおよびカルボキシ末端配列167−191内の特異的ア
ラニン置換で起った。いくつかのアラニン変異体の結合
は4.5倍に増加した。最も劇的な例は多くの破壊的アラ
ニン突然変異の中間に位置するE174Aであった。第４
図、第７図および第21図参照。 Alanine substitutions were made to include residues 2-19 (Abdel-Megid (Ab
del-Meguid), SS, etc. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. US
A 84, 6434). In fact the most significant decrease in binding is F10A
(6x) followed by residues 4-6 at the N-terminus of helix 1
(See FIG. 21). Substantially greater effects (> 20-fold) on binding occurred with a loop of residues 54-74 and a specific alanine substitution within the carboxy terminal sequence 167-191. Binding of some alanine mutants increased 4.5-fold. The most dramatic example was E174A, located in the middle of many disruptive alanine mutations. 4th
See FIG. 7, FIG. 7 and FIG.
ほとんどの破壊的アラニン置換はF10からR64およびD1
71からV185に広がる約25Å角のパッチをホルモン上に形
成する（第21図参照）。さらにこれらの側鎖はその分子
の同じ方向を向いているようである。たとえばヘリック
ス４に関する結合に最も影響する全てのアラニン変異体
（D171A,K172A,E174A,F176A,I179A,C182AおよびR183A）
はこのヘリックスの３回半に限られまたそれらの側鎖は
このヘリックスの同じ面から突き出ている（第21図参
照）。このモデルに基づいて、T175およびR178は、第21
図で示されているように中央位置を占めていることから
結合に関与していることが予想される。Most destructive alanine substitutions are from F10 to R64 and D1
A patch of about 25 ° angle extending from 71 to V185 is formed on the hormone (see FIG. 21). Furthermore, these side chains appear to point in the same direction of the molecule. For example, all alanine variants that most influence binding on helix 4 (D171A, K172A, E174A, F176A, I179A, C182A and R183A)
Is limited to three and a half times the helix and their side chains protrude from the same face of the helix (see FIG. 21). Based on this model, T175 and R178
Since it occupies a central position as shown in the figure, it is expected that it is involved in binding.
T175A変異体は振とうフラスコ中検定するのに十分な
収率で発見されないけれども、より保存的変異体（T175
S）であった。したがってT175S変異体はレセプター結合
が16倍減少した。同様に、R178Aはあまり発現されない
にもかかわらずR178Nは分析可能な収量で発現した。R17
8Nは結合アフィニティが４倍以上減少した。Although the T175A mutant is not found in sufficient yield to assay in shake flasks, the more conservative mutant (T175
S). Thus, the T175S mutant had a 16-fold decrease in receptor binding. Similarly, R178N was expressed in measurable yields even though R178A was poorly expressed. R17
8N reduced binding affinity by more than 4-fold.
カルボキシ末端における次に破壊的変異体はV185Aで
あった。V185Aはヘリックス４の外にあるけれども、こ
のモデルによりヘリックス４内の破壊的突然変異と同じ
方向を向いていることが予想される。これに対し結合パ
ッチ外のアラニン突然変異またはその中にあり上述のも
のと反対を向いているアラニン突然変異（R167A,K168A,
V180A,Q181A,S184A.E186A,S188A）は一般にレセプター
結合に関して影響しないか、またはほとんど影響しな
い。The next disruptive mutant at the carboxy terminus was V185A. Although V185A is outside helix 4, this model is expected to point in the same direction as the disruptive mutation in helix 4. In contrast, the alanine mutation outside the binding patch or the alanine mutation therein (R167A, K168A,
V180A, Q181A, S184A.E186A, S188A) generally have little or no effect on receptor binding.
ヘリックス１におけるアラニン変異体は並みの効果し
かもたないがこれにも同様の分析を行った。このヘリッ
クス内でもっとも結合を破壊するアラニン置換はこのヘ
リックスの同じ面に存在する残基6,10および14のもので
あった。もっとも小さい破壊的アラニン突然変異（L9A,
N12AおよびL15A）ヘリックス１の反対の面に存在する。
さらにこのことはhGHに対する結合をレセプターと競合
しない抗hGH Mab3および４の両方がAsn−12に結合する
という事実により確認される。第XVI表参照。A similar analysis was performed for the alanine variant in helix 1 which had only modest effects. The most disruptive alanine substitutions within this helix were those of residues 6,10 and 14, which occupy the same face of the helix. The smallest disruptive alanine mutation (L9A,
N12A and L15A) Located on the opposite side of helix 1.
This is further confirmed by the fact that both anti-hGH Mab 3 and 4, which do not compete with the receptor for binding to hGH, bind to Asn-12. See Table XVI.
54−74ループ内の側鎖の相対的位置はそれらがヘリッ
クス１および４内の側鎖のようには固定し得ない。しか
し偶数残基の突然変異は奇数残基に比べ結合を大きく阻
害するという結合において著しい周期性がある。特にこ
のことはこの領域の最初の部分によくあてはまり（54−
59）かつ偶数残基はレセプターの方に突き出ておりかつ
奇数残基は反対を向いているという構造を反映してい
る。 The relative position of the side chains in the 54-74 loop cannot be fixed as they do in helices 1 and 4. However, even-numbered residue mutations have a significant periodicity in binding, in which binding is significantly inhibited compared to odd-numbered residues. This is especially true for the first part of this area (54-
59) and reflects the structure that the even residues protrude towards the receptor and the odd residues point in the opposite direction.
実施例９ アラニン置換hGH変異体の構造完全性および結合エネル
ギー いくつかの証拠はレセプター結合を乱すアラニン置換
は分子の構造をゆがめることによりそれを起こすのでは
ないことを示している。第１に８種のMabはhGHに関して
同様レセプターへの結合の破壊を起こすほとんどすべて
のアラニン変異体と反応する。先の第XII表参照。Example 9 Structural Integrity and Binding Energy of Alanine-Substituted hGH Mutants Some evidence indicates that alanine substitutions that disrupt receptor binding do not cause it by distorting the structure of the molecule. First, the eight Mabs react with almost all alanine mutants that also cause a disruption of receptor binding for hGH. See Table XII above.
例外は各々抗hGH Mab6および５への結合を選択的に破
壊するR64AおよびC182Aである。これら２つのMabは以前
にhGHへの結合に関しソマトジェニックレセプターと競
合することが示された。さらにレセプター結合に影響し
ない２つのアラニン変異体を作った。１つは２つのMab
の結合に影響し（N12A）、もう１つはMabのいずれにも
影響しない（K168A）。このデータはMabもしくはレセプ
ターへの結合が変異体構造の非常に局所的なゆらぎによ
り破壊されることを示している。さらに全てのhGH変異
体の遠紫外円二色スペクトルは野生型hGHと実質的に同
じであった。Exceptions are R64A and C182A, which selectively disrupt binding to anti-hGH Mab 6 and 5, respectively. These two Mabs have previously been shown to compete with the somatogenic receptor for binding to hGH. In addition, two alanine variants were created that did not affect receptor binding. One is two Mab
And the other does not affect any of the Mab (K168A). This data indicates that binding to the Mab or receptor is disrupted by very localized fluctuations in the mutant structure. Furthermore, the far ultraviolet circular dichroism spectra of all hGH variants were substantially the same as wild-type hGH.
振とうフラスコ中、アラニン変異体の約20％（D11A,T
60A,P61A,T67A,N72A,E74A,D169A,M170A,V173A,T175A,L1
77A,K178A,C189A,G190A）は単離および分離するのに十
分なレベルで分泌されなかった。このような変異体をコ
ードする遺伝子は同じベクターで発現され、かつその発
現は特定のアラニンコドンとは独立しているので定常的
発現レベルの変化は、おそらく分泌レベルの差および、
またはhGH変異体のたん白質分解を反映したものであ
る。ヘリックス４における非発現性アラニン変異体のい
くつかはヘリックスの疎水性側面を白で示した第21図に
示されている疎水性面上に存在する（M170A,V173Aおよ
びL177A）。しかしいくつかのアラニン置換がヘリック
ス１（L6A,L9AおよびF10A）およびヘリックス４（F176A
およびV180A）の疎水性面内で容認されていることから
このことは一般的な効果ではない。About 20% of alanine mutants (D11A, T
60A, P61A, T67A, N72A, E74A, D169A, M170A, V173A, T175A, L1
77A, K178A, C189A, G190A) were not secreted at sufficient levels to isolate and segregate. Since the genes encoding such variants are expressed in the same vector, and their expression is independent of the specific alanine codon, changes in steady state expression levels are likely due to differences in secretion levels and
Alternatively, it reflects the protein degradation of the hGH mutant. Some of the non-expressing alanine mutants in helix 4 are on the hydrophobic side shown in FIG. 21 (M170A, V173A and L177A) with the hydrophobic side of the helix shown in white. However, some alanine substitutions were found in helix 1 (L6A, L9A and F10A) and helix 4 (F176A
This is not a general effect as it is tolerated in the hydrophobic plane of V180A).
さらにhGH変異体の発現の減少は荷電または中性アミ
ノ酸がアラニンと置換したときにしばしば観察される
（D11A,T60A,T67A,N72A,F74A,D169A,T175A,R178A）。水
素結合基をその部位に保存するT175SおよびR178Nのよう
な突然変異はたとえあったとしても野生型よりも低いレ
ベルで発現される。非発現性のC189A変異体はカルボキ
シ末端スルフィドを破壊し、かつその相対物（C182A）
も野生型よりもはるかに低いレベルで発現する。他のい
つくかの非発現性アラニン変異体（T60A,T61AおよびT67
A）はループ構造内に存在する。したがって低レベル発
現または非発現は多くの構造効果に由来するが単一構造
的または単一機能的置換によって回避し得る。Furthermore, reduced expression of hGH mutants is often observed when charged or neutral amino acids are replaced with alanine (D11A, T60A, T67A, N72A, F74A, D169A, T175A, R178A). Mutations such as T175S and R178N that conserve a hydrogen bonding group at that site are expressed at lower levels, if any, than wild type. Non-expressing C189A mutant disrupts carboxy terminal sulfide and its counterpart (C182A)
Are also expressed at much lower levels than the wild type. Several other non-expressing alanine mutants (T60A, T61A and T67
A) exists in the loop structure. Thus, low-level expression or non-expression derives from many structural effects but can be avoided by a single structural or single functional substitution.
結合に10倍以上の効果を示す置換（I58A,R64A,K172A,
T175S、F176S,F176A）は直接結合に関与しているようで
ある。天然に存在する（ファーシュト（Fersht）,A.R.
（1972）J.Mol.Biol.64,497;ブラウン（Brown）,L.R.等
（1978）Eur.J.Biochem.88、87;マリバー（Malivor）,
R.等（1973）J.Mol.Biol.76,123）または部位指定突然
変異誘発で作り上げられた（ファーシュト（Fersht）,
A.R.等（1985）Nature 314,225;ブライアン（Bryan）,
P.等（1986）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83,3743;ウェル
ズ（Wells）,J.A.等（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8
4,1219;クロニン（Cronin）,O.N.等（1987）J.Am.Chem.
Soc.109,2222;グラフ（Graf）,L.等（1988）Proc.Natl.
Acad.Sci.USA 85,4961）水素結合または塩橋の強さは微
環境に依存して１〜5Kcal/molの範囲に広く分布してい
る。hGHに関する結合自由エネルギーの減少はE56,Q68,D
171,K172およびR64の各アラニン置換に対し0.8、1.0、
1.2、1.6および1.8Kcal/mol（ΔΔＧ結合＝＋RTlnKd
（変異体）/Kd（wt））であった。疎水性側鎖のたん白
質中への埋没のエネルギーはエタノール中への転移の自
由エネルギーに対応する傾向がある（エステル（Estel
l）,D.A.等（1986）Science 233,659;ノザキ（Nozak
i）,Y.等（1980）“疎水性効果”（ウィリー版、N.Y.4
〜21頁）。Substitutions that show a 10-fold or greater effect on binding (I58A, R64A, K172A,
T175S, F176S, F176A) appear to be involved in direct binding. Naturally occurring (Fersht, AR
(1972) J. Mol. Biol. 64 , 497; Brown, LR, etc. (1978) Eur. J. Biochem. 88 , 87; Malivor,
(1973) J. Mol. Biol. 76 , 123) or site-directed mutagenesis (Fersht,
AR et al. (1985) Nature 314 , 225; Bryan,
(1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 , 3743; Wells, JA et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8
4 , 1219; Cronin, ON et al. (1987) J. Am. Chem.
Soc. 109 , 2222; Graph (Graf), L. et al. (1988) Proc. Natl.
Acad.Sci.USA 85, 4961) the strength of the hydrogen bonds or salt bridges are widely distributed in the range of 1~5Kcal / mol depending on the microenvironment. Reduction of binding free energy for hGH is E56, Q68, D
0.8, 1.0, for each alanine substitution of 171, K172 and R64
1.2, 1.6 and 1.8 Kcal / mol (ΔΔG bond = + R T lnKd
(Mutant) / Kd (wt)). The energy of embedding of hydrophobic side chains into proteins tends to correspond to the free energy of transfer into ethanol (esters (Estel
l), DA et al. (1986) Science 233 , 659; Nozaki
i), Y. et al. (1980) "Hydrophobic effect" (Willie version, NY4
~ 21).
したがってF175A,F10A,F54A,I58AおよびV185Aの結合
自由エネルギーの減少は各々1.6、1.0、0.9、1.7および
0.9Kcal/molであった。これらの値はPhe,IleまたはVal
からAlaへの置換における疎水性自由エネルギーの予想
値、各々2.0、2.4および1.0Kcal/molよりもわずかに小
さい。この分析により、T175S変異体の効果（ΔΔＧ結
合＝1.6Kcal/mol）はガンマメチル基の損失に期待され
る効果（ΔΔＧ疎水性＝0.7Kcal/mol）よりも大きい。h
GHとそのソマトジェニックレセプターとの分子接触の性
質を十分把握するためには直接的構造の情報が必要であ
る。しかし、これらアラニン変異体の結合エネルギーは
それらが全く別のシステムにおける接触残基について行
った以前の測定の範囲内にあることを示している。事
実、レセプター結合に最も破壊的であるC182Aを除いた
アラニン置換変異体の結合自由エネルギーの総和は（−
13.2Kcal/mol）、hGHとそのレセプター間の総結合自由
エネルギーと一致している（−13Kcal/mol）。Therefore, the reduction of binding free energy of F175A, F10A, F54A, I58A and V185A is 1.6, 1.0, 0.9, 1.7 and 1.7, respectively.
It was 0.9 Kcal / mol. These values are Phe, Ile or Val
Expected hydrophobic free energies for substitution of Ala to Ala, slightly less than 2.0, 2.4 and 1.0 Kcal / mol, respectively. By this analysis, the effect of the T175S mutant (ΔΔG binding = 1.6 Kcal / mol) is greater than the expected effect on loss of gamma methyl groups (ΔΔG hydrophobicity = 0.7 Kcal / mol). h
Direct structural information is needed to fully understand the nature of molecular contact between GH and its somatogenic receptor. However, the binding energies of these alanine variants indicate that they are within previous measurements made on contact residues in a completely different system. In fact, the sum of the binding free energies of the alanine substitution mutants except for C182A, which is the most disruptive to receptor binding, is (-
13.2 Kcal / mol), which is consistent with the total binding free energy between hGH and its receptor (-13 Kcal / mol).
実施例10 hGH変異体の抗hGHポリクローナルとの反応性 hGH変異体hPRL（22−23）,E174AおよびhPRL（88−9
5）をラットの体重検定でテストした。この検定の結果
を第22図に示す。これから分るようにhPRL（22−33）以
外の変異体は生育約14日後減少能を有している。成長の
レベルダウンは生物学的効果を中和する種々の成長ホル
モンに対する抗体の発現に寄因する。hPRL（22−33）変
異体が成長しつづけたという事実はそれが野生型hGHま
たは使用した他の変異体と同じ免疫原性をもたないこと
を示している。Example 10 Reactivity of hGH variants with anti-hGH polyclonal hGH variants hPRL (22-23), E174A and hPRL (88-9
5) was tested in a rat weight test. The results of this test are shown in FIG. As can be seen, mutants other than hPRL (22-33) have the ability to decrease about 14 days after growth. Reduced levels of growth are attributed to the expression of antibodies to various growth hormones that neutralize biological effects. The fact that the hPRL (22-33) mutant has continued to grow indicates that it does not have the same immunogenicity as wild-type hGH or other mutants used.
hGHに対する種々のhGH変異体の反応性をポリクローナ
ル抗体を含むヒトおよびマウスの血清と比較した結果を
第XVII表に示す。Table XVII shows the results of comparing the reactivity of the various hGH variants to hGH with human and mouse sera containing polyclonal antibodies.
表から分るように残基22〜33の領域内に置換を含む変
異体は野生型hGHに対し各ヒトおよびマウス抗血清との
結合活性が実質的に減少しているか、またはある場合に
は活性をもたない。 As can be seen, variants containing substitutions in the region of residues 22-33 have substantially reduced, or in some cases, reduced, binding activity to wild-type hGH with each human and mouse antiserum. Has no activity.
変異体pGH57−73を除いて、他の領域の置換を含む変
異体は有意な反応性の減少を示さない。残基11および33
の間のセグメント置換変異体はソマトジェニックレセプ
ターへの結合能を維持しているので、このような変異体
はソマトジェネシスの推進能は維持しているが他の性
質、この場合抗hGHポリクローナル抗体への反応性を変
化させた変異体の生成を示している。With the exception of mutant pGH57-73, mutants containing substitutions in other regions do not show a significant decrease in reactivity. Residues 11 and 33
Since the segment substitution mutants between the two maintain the ability to bind to somatogenic receptors, such mutants maintain the ability to promote somatogenesis but have other properties, in this case, anti-hGH polyclonal antibodies. 2 shows the generation of a mutant having an altered reactivity.
実施例11 Kdと能力の関係 特定のhGH変異体のKd（変異体）/Kd（野生型）の比と
ラット体重検定におけるこれら変異体の能力のセミログ
プロットを第23図に示す。これから分るように線型関係
の存在はソマトジェニックレセプターへの結合アフィニ
ティーの減少は能力の減少を示している。Example 11 Relationship between Kd and Ability A semilog plot of the ratio of Kd (mutant) / Kd (wild type) for specific hGH variants and the ability of these variants in a rat body weight assay is shown in FIG. As can be seen, the presence of a linear relationship indicates a decrease in binding affinity to the somatogenic receptor indicates a decrease in potency.
図から分るように、hGH変異体E174Aはソマトジェニッ
クレセプターに関し野生型hGHよりも高い結合アフィニ
ティーを有している。また、この能力は野生型hGHより
も約12％大きい。As can be seen, the hGH mutant E174A has a higher binding affinity for the somatogenic receptor than wild-type hGH. This capacity is also about 12% greater than wild-type hGH.
さらに変異体pPRL（94−104）は基本的に野生型と同
じ結合定数を有しているが能力は約2.7倍大きい。Furthermore, the mutant pPRL (94-104) has essentially the same binding constant as the wild type, but is approximately 2.7-fold more potent.
実施例12 プロラクチンレセプター結合に関するhGHの活性ドメイ
ン ヒト成長ホルモン（hGH）は線型成長、泌乳、窒素遅
延、糖尿病誘発性およびインシュリン様効果およびマク
ロファージ活性化など多くの生理効果を示す。R.K.チョ
ウラ（Chawla）,J.S.パークス（Parks）およびD.ラドマ
ン（Rudman）,Annu.Rev.Med.34,519−547（1983）;O.G.
P.イサクソン（Isaksson），等（1985）,Annu.Rev.Phys
iol.47,483−499;C.K.エドワーズ（Edwards）等（198
8）Science 239,769−771。これらの効果は各々hGHと特
異的細胞レセプターとの相互作用で始まる。J.P.ハイス
（Hughs）等（1985）Annu.Rev.Physiol.47,469−482。
これまでのhGHと結合する生成物を作るクローン化遺伝
子の肝臓のhGHレセプター（A.W.レング（Leung），等
（1987）Nature（ロンドン）330、537−543）および乳
腺のヒトプロラクチン（hPRL）レセプター（J.M.ブーチ
ン（Boutin）等、（1988）Cell53,69−77）のみであっ
た。hPRLレセプターへのhGHのレセプター“スピルオー
バー”は高レベルのhGHを生産する先端巨大症が、通常
レベルのhPRLを有するにもかかわらず過プロラクチン症
となる場合の臨床的徴候である（J.E.フラドキン（Frad
kin）等（1989）New Engl.J.Med.320,640−644）。しか
しhGHと結合する他のレセプターが存在し、これには胎
盤ラクトゲン（PL）レセプター（M.フリーマーク（Free
mark）等（1987）Endocrinology）120,1865−1872）。
これらのレセプターに関するhGH上の結合部位が同一の
ものであるかどうか、またはどのレセプター（レセプタ
ー群）が薬学効果を担っているかは分っていなかった。
これらの問題を解くためにhGHおよびhPRLレセプター結
合部位の位置決めがなされた。得られた結果はこれらの
レセプター結合部位は重復しているが、同一のものでは
ないことを示している。このことはhGHのレセプター特
異的変異体の合理的設計を可能にする。Example 12 Active Domain of hGH for Prolactin Receptor Binding Human growth hormone (hGH) exhibits many physiological effects such as linear growth, lactation, nitrogen delay, diabetes inducing and insulin-like effects and macrophage activation. RK Chawla, JS Parks and D. Rudman, Annu. Rev. Med. 34 , 519-547 (1983); OG
P. Isaksson, et al. (1985), Annu. Rev. Phys.
iol. 47 , 483-499; CK Edwards et al. (198
8) Science 239 , 769-771. Each of these effects begins with the interaction of hGH with a specific cellular receptor. JP Hughs et al. (1985) Annu. Rev. Physiol. 47 , 469-482.
The hepatic hGH receptor (AW Leung, et al. (1987) Nature (London) 330 , 537-543) and the human prolactin (hPRL) receptor in the mammary gland of the cloned genes that make up products that bind to the previous hGH ( JM Boutin et al. (1988) Cell 53 , 69-77). The receptor "spillover" of hGH to the hPRL receptor is a clinical sign when acromegaly producing high levels of hGH results in hyperprolactinosis despite having normal levels of hPRL (JE Hradkin (Frad
Kin) et al. (1989) New Engl. J. Med. 320 , 640-644). However, there are other receptors that bind to hGH, including the placental lactogen (PL) receptor (M. Freemark)
mark) et al. (1987) Endocrinology) 120 , 1865-1872).
It was not known whether the binding sites on hGH for these receptors were identical or which receptors (receptors) were responsible for the pharmacological effect.
To solve these problems, hGH and hPRL receptor binding sites were located. The results obtained indicate that these receptor binding sites are duplicated, but not identical. This allows the rational design of receptor specific variants of hGH.
hGHおよびhPRLレセプターには32％の配列ホモロジー
をもつ細胞外ホモロジー結合ドメイン、単一のトランス
メンブレンドメインおよび配列も長さも様々である細胞
質内ドメインがある。hGHレセプターの細胞外結合ドメ
インは大腸菌中で発現され、かつ可溶性血清結合たん白
質など天然に見られるものと同一の結合性を有する（S.
A.スペンサー（Spencer）等（1988）J.Biol.Chem.263,7
862−7867）。同様にhPRLレセプターの細胞外ドメイン
は大腸菌内で発現されかつ精製された。hPRLレセプター
フラグメントは残基Gln1からThr211にわたり、単一のト
ランスメンブレンドメインの直前で終っている。それは
完全な長さのレセプターと実質的に同じ高い結合アフィ
ニティーおよび特異性を有している。この実験で用いて
いるhPRLレセプターをコードする遺伝子はカナダ．モン
トリオール．マクギル大学、ケリー（Kelly）,P.A.博士
により提供された。このDNA配列はヒト乳腺cDNAライブ
ラリーから入手し、プロラクチンレセプター群の交叉種
メンバーのうち既知の保存領をカバーするプローブで同
定された。たとえばダビエス（Davies）J.A.等（1989）
Mol.Endrocrinology ３,674−680;エデリー（Edery）等
（1989）Proc.Natl.Acad.Sci.USA86,2112−2116;ジオリ
コアー（Jolicoeur）等（1989）Mol.Endrocrinology
３,895−900参照。これらの短縮型で高純度のレセプタ
ーはhGH変異体の結合アフィニティーの迅速かつ正確な
検定に非常に有用な試薬である。The hGH and hPRL receptors have an extracellular homology binding domain with 32% sequence homology, a single transmembrane domain and a cytoplasmic domain of varying sequence and length. The extracellular binding domain of the hGH receptor is expressed in E. coli and has the same binding properties as those found in nature, such as soluble serum binding protein (S.
A. Spencer (Spencer), etc. (1988) J.Biol.Chem. 263, 7
862-7867). Similarly, the extracellular domain of the hPRL receptor was expressed and purified in E. coli. The hPRL receptor fragment extends from residue Gln1 to Thr211 and ends just before the single transmembrane domain. It has substantially the same high binding affinity and specificity as the full length receptor. The gene encoding the hPRL receptor used in this experiment is from Canada. Montreal. Courtesy of Dr. Kelly, McGill University, PA. This DNA sequence was obtained from a human mammary gland cDNA library and identified with probes that cover known conserved regions of the cross-species members of the prolactin receptor family. For example, Davides JA (1989)
Mol. Endrocrinology 3 , 674-680; Edery et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 , 2112-2116; Geolicoeur et al. (1989) Mol. Endrocrinology.
3 , 895-900. These truncated, high-purity receptors are very useful reagents for rapid and accurate assays of hGH variant binding affinity.
hPRLおよびhGHレセプター結合部位の関係 hGHおよびhPRLレセプターのエピトープが重復してい
るかどうかを測定するため我々はhPRLレセプターフラグ
メントがhGH由来のhGHレセプターフラグメントと置換し
得るかどうかを分析した（データ示さず）。事実、hPRL
レセプターフラグメントはhGHレセプター結合部位に関
し見かけ上のKd値1nMで競合する。これはhGHに対するhP
RLレセプターの直接的結で測定されたアフィニティーと
実質的に同じである（結果示さず）。Relationship of hPRL and hGH receptor binding sites To determine whether hGH and hPRL receptor epitopes are duplicated, we analyzed whether the hPRL receptor fragment could replace the hGH-derived hGH receptor fragment (data not shown). . In fact, hPRL
Receptor fragments compete for an apparent Kd value of 1 nM for the hGH receptor binding site. This is the hP for hGH
Substantially the same as the affinity measured by direct binding of the RL receptor (results not shown).
第III表のセグメント置換hGH変異体のうちの７つを用
いhPRLレセプターに関するhGH上のエピトープの位置を
決定した。この実験にはhGHΔ32−46変異体を用いた。
方法はhGHsの代りにhPRLrをレセプターとして用いたこ
と以外先に述べたhGHレセプターに対するhGH上のエピト
ープの決定に用いた方法、すなわちhGH変異体の結合へ
の影響により行った。上述の12個のセグメント置換hGH
変異体の結果を第XVIII表に示す。Seven of the segment-substituted hGH variants in Table III were used to determine the location of the epitope on hGH for the hPRL receptor. The hGHΔ32-46 mutant was used in this experiment.
The method was the same as that described above for determining the epitope on hGH for the hGH receptor except that hPRLr was used as the receptor instead of hGHs, that is, the effect on the binding of the hGH mutant was used. The above 12 segment replacement hGH
The results for the variants are shown in Table XVIII.
第XVIII表 hPRLレセプター（hPRLr）の細胞外ドメインに対する
ホモログ−スキャンニング突然変異誘発により調製した
hGH変異体の結合。変異体は種々のhGH類似体:pGH,hPL,
またはhPRLから置換したセグメントに従って命名した。
導入された突然変異の正確な記述はコンマで区切られた
一連の単一変異体で与えられる。各単一変異体は野生型
残基の１文字コードとそれにつづく成熟hGH中のそのコ
ドンの位置および変異体残基で示される。hGHの変異体
を先に述べた方法で生産し、精製した。hPRLrへの結合
は基本的にhGHrについて述べた方法で測定した（スペン
サー（Spencer）,S.A.等（1988）J.Biol.Chem.263,7862
−7867）。もっともこの方法ではhPRLrに対するアフィ
ニティ精製ウサギポリクローナル抗体を用いキャリヤ−
たん白質としてギブコ製BSA（粗）を使ってhPRLr複合体
を沈殿させた。一般にKD値の標準偏差は報告されている
値の20％以下であった。hGHrに対する結合アフィニティ
ーの相対的減少（KD（変異体）/KD（hGH））は第III表
から得られたものである。レセプター選択性の変化はhG
Hrに対する結合アフィニティーをhPRLrと比較した相対
的減少比で計算した。WT＝野生型。Table XVIII Prepared by homolog-scanning mutagenesis on the extracellular domain of the hPRL receptor (hPRLr)
Binding of hGH variants. The variants are various hGH analogues: pGH, hPL,
Or named according to the segment replaced from hPRL.
The exact description of the mutations introduced is given in a series of single variants separated by commas. Each single variant is indicated by the one-letter code for the wild-type residue followed by its codon position in mature hGH and the variant residue. Mutants of hGH were produced and purified as described above. Binding to hPRLr was determined basically methods described for hGHR (Spencer (Spencer), SA, etc. (1988) J.Biol.Chem. 263, 7862
-7867). However, this method uses an affinity-purified rabbit polyclonal antibody against hPRLr and uses
The hPRLr complex was precipitated using Gibco's BSA (crude) as a protein. The standard deviation of the general K D values were less than 20% of the value reported. The relative decrease in binding affinity for hGHr (K D (mutant) / K D (hGH)) is from Table III. Changes in receptor selectivity are hG
The binding affinity for Hr was calculated as the relative reduction ratio compared to hPRLr. WT = wild type.
表から分るようにpGH（11−33）およびpGH（57−73）
はRhPLレセプター結合アフィニティーに大きな影響を及
ぼす一方pGH（48−52）は影響をもたない。hGHレセプタ
ーとは異なりhPRLレセプターはhPRLおよびhPLとは結合
するがpGHとは結合しない。予想されるように、結合競
合ホルモンhPRLまたはhPL由来の実質的に全ての置換は
結合に影響しなかった。唯一の例外はhPRLレセプターへ
の結合アフィニティーが70倍以上減少するhPRL（22−3
3）である。このようにhPRLレセプターはhGH中ヘリック
ス１の中央領域および残基57および73の間のループ付近
の突然変異に非常に敏感である。 As can be seen from the table, pGH (11-33) and pGH (57-73)
Has a significant effect on RhPL receptor binding affinity, while pGH (48-52) has no effect. Unlike the hGH receptor, the hPRL receptor binds to hPRL and hPL but does not bind to pGH. As expected, virtually all substitutions from the binding competitor hPRL or hPL did not affect binding. The only exception is hPRL (22-3) in which binding affinity to the hPRL receptor is reduced by more than 70-fold.
3). The hPRL receptor is thus very sensitive to mutations in the central region of helix 1 in hGH and near the loop between residues 57 and 73.
またホモログ−スキャンデータによりhPRLおよびhGH
レセプターエピトープはいくつかのセグメント置換変異
体がレセプター結合選択性に大きな変化を与えることか
ら同一ではないことが示された（第XVIII表）。たとえ
ばpGH（11−33）またはhPRL（22−33）により引き起こ
される結合への影響はhGHレセプターに対してよりもhPR
Lレセプターに対しての方が約100倍大きい。一方、hPL
（56−64）およびhPRL（54−74）はhPRLレセプターに関
してほとんど影響しない一方それらは各々17倍および69
倍hGHレセプターへの結合が弱くなった。さらにこれら
の選択的結合効果（先に議論したモノクローナル抗体の
結合とともに）はレセプター結合アフィニティーの減少
はhGHの変異体における局所的であり、全体的構造変化
によらないことを実証している。In addition, hPRL and hGH are
Receptor epitopes were shown to be not identical because some segment substitution mutants significantly alter receptor binding selectivity (Table XVIII). For example, the effect on binding caused by pGH (11-33) or hPRL (22-33) is higher for the hPR receptor than for the hGH receptor.
About 100 times larger for the L receptor. On the other hand, hPL
(56-64) and hPRL (54-74) have little effect on the hPRL receptor, while they are 17-fold and 69 respectively.
The binding to the hGH receptor was weakened. Furthermore, these selective binding effects (along with the binding of the monoclonal antibodies discussed above) demonstrate that the decrease in receptor binding affinity is local in the hGH variant and not due to global structural changes.
hPRLレセプターへの結合を強く調節するhGH中の特定
の側鎖をアラニンスキャンニング突然変異誘発および相
同的置換により同定した。第XIX表に示したhGH変異体を
調製した。hPRL置換、F25SおよびD26Eはヘリックス１に
おける結合アフィニティーの最も大きい減少を引き起こ
した（各々21および4.5倍）。これらの残基はヘリック
ス１の親水性面から突き出ており、かつ結合に緩やかな
効果を与えるヘリックス１中の他の突然変異（主にH18A
およびF10A）と同じ側に存在する。Particular side chains in hGH that strongly regulate binding to the hPRL receptor were identified by alanine scanning mutagenesis and homologous substitution. The hGH variants shown in Table XIX were prepared. hPRL substitutions, F25S and D26E, caused the greatest decrease in binding affinity in helix 1 (21 and 4.5 fold, respectively). These residues protrude from the hydrophilic surface of helix 1 and other mutations in helix 1 that give a modest effect on binding (mainly H18A
And F10A) are on the same side.
hGHレセプターの結合に影響することが知られている
ループ領域（54〜68）中の４個の残基ならびに近接して
いるがhGHレセプター結合に影響しないこの領域に先行
する２つの残基（Q49AおよびT50A）をテストした。最も
破壊的な変異体はI58AおよびR64Aであり、これらは各々
結合アフィニティが32倍および６倍減少している。他の
４個の突然変異の影響は無視できる。Four residues in the loop region (54-68) that are known to affect hGH receptor binding, as well as two residues adjacent to this region that do not affect hGH receptor binding (Q49A And T50A). The most disruptive mutants are I58A and R64A, which have reduced binding affinity by a factor of 32 and 6 respectively. The effects of the other four mutations are negligible.
ヘリックス１およびループ領域（58−64）がhPRLレセ
プターに対する強力な結合決定基を含むという事実はヘ
リックス４と関係する。というのはこのヘリックスはこ
れら２つの構造の間に押し込まれているためである（第
25図Ｂ）。事実、C165〜V185に結合するジスルフィド間
のヘリックス４領域のアラニンスキャンニングは強力な
結合決定基を明らかにした（第XIX表）。最も破壊的突
然変異はほとんど４個のヘリックスターン、R167〜R178
に分布しており、かつ同じ親水性面に存在する。Related to helix 4 is the fact that helix 1 and the loop region (58-64) contain strong binding determinants for the hPRL receptor. Because the helix is pushed between these two structures (No.
25 Figure B). In fact, alanine scanning of the helix 4 region between the disulfides binding to C165-V185 revealed strong binding determinants (Table XIX). The most disruptive mutations are almost four helix turns, R167-R178
And are present on the same hydrophilic surface.
第XIX表 hPRLまたはhGHレセプターフラグメント（hPRLrまたは
hGHr）に対するhGHの単一変異体の結合。部位指定突然
変異誘発で作ったQ22N,F25S,D26E,Q29SおよびE33K以外
のhGHの変異体は先に述べたように調製及び精製した
（カニンガム（Cunningham）,B.C.およびウェルズ（Wel
ls）,J.A.（1989）Science 244,1330−1335;ゾラー（Zo
ller）,M.J.およびスミス（Smith）,M.（1982）Nucleic
Acids Res.10,6487−6499）。レセプター結合アッセイ
および変異体の名称を第XVIIIに示す。hGHrに対する結
合アフィニティーの減少のデータは第III表からとっ
た。NDは測定しなかったことを示す。Table XIX hPRL or hGH receptor fragment (hPRLr or
Binding of a single mutant of hGH to hGHr). Mutants of hGH other than Q22N, F25S, D26E, Q29S and E33K made by site-directed mutagenesis were prepared and purified as previously described (Cunningham, BC and Wells).
ls), JA (1989) Science 244 , 1330-1335; Zoller (Zo
ller), MJ and Smith, M. (1982) Nucleic
Acids Res. 10 , 6487-6499). Receptor binding assays and variant names are shown in Section XVIII. Data for reduced binding affinity to hGHr was taken from Table III. ND indicates not measured.
機能地勢図はhGHおよびhPRLレセプターの位置に基づ
いて導びいた（第28図）。hPRLレセプターに対する最高
のエピトープ部分は（第25図Ｂ）、結合アフィニティー
の２倍以上の減少を示す突然変異が割り振られる。この
基準によりhPRLレセプターのエピトープは基本的にF10
〜Q29のヘリックス１の前面、F54〜Q68のループおよびR
167からR178のヘリックス４の親水性面に限定される。
一方、hGHレセプターエピトープ（第25図Ａ）はアミノ
末端領域からI4〜M14のヘリックス４の前面、F54からS7
1のヘリックス１の前面およびD171からV185のヘリック
ス４の親水性面の残基を含む。さらに変異分析がhPRLエ
ピトープに残存するギャップを満たすのに必要であるが
このエピトープがhGHレセプターのエピトープと重復す
るが同一のものではないことは明らかである。これらの
データはhGHを認識する結合決定基の全てがhGHおよびhP
RLレセプターに関しその細胞外結合ドメインと32％のホ
モロジーを持つにもかかわらず同一のものではないこと
を示している。 Functional topographic maps were derived based on the location of hGH and hPRL receptors (FIG. 28). The highest epitope portion for the hPRL receptor (FIG. 25B) is assigned mutations that show a more than 2-fold decrease in binding affinity. By this criterion, the epitope of the hPRL receptor is basically F10
Front of helix 1 of ~ Q29, loop of F54 ~ Q68 and R
Restricted to the hydrophilic side of helix 4 from 167 to R178.
On the other hand, the hGH receptor epitope (Fig. 25A) is located in front of helix 4 of I4-M14 from the amino-terminal region, F54-S7
It contains residues from the front of helix 1 of 1 and the hydrophilic face of helix 4 from D171 to V185. Furthermore, mutation analysis is required to fill the remaining gap in the hPRL epitope, but it is clear that this epitope repeats but is not identical to the hGH receptor epitope. These data indicate that all of the binding determinants that recognize hGH are hGH and hP
This shows that the RL receptor is not the same despite its 32% homology with its extracellular binding domain.
レセプター結合アフィニティーに大きな変化を起こす
残基は間接的な構造効果によってそれを行っている。し
かしこれらの破壊的効果のほとんどがテストした全ての
単一変異体が８個のhGHモノクローナル抗体群に対し完
全な結合アフィニティーを維持しており、かつしばしば
レセプター選択性の変化に導くがレセプターアフィニテ
ィーに均一な影響を与えないことから局所的な効果によ
るものと考えられている（第XIX表および以下参照）。Residues that cause major changes in receptor binding affinity do so through indirect structural effects. However, most of these destructive effects tested all single mutants that retained full binding affinity for the eight hGH monoclonal antibody groups, and often lead to altered receptor selectivity, but with increased receptor affinity. It is thought to be due to local effects as it has no uniform effect (see Table XIX and below).
hGHのレセプター特異的変異体の設計 多くの単一hGH変異体はレセプター結合選択性に多く
の変化を起こす（第XIX表）。最も顕著なのはhGHレセプ
ターに対するアフィニティーの４倍増加を導くがhPRLレ
セプターへの結合は20倍以上減少するE174Aである。こ
のことはレセプター選択性の120倍の変化を示してい
る。別の突然変異は（主にR178NおよびI179M）はhGHを
選択的にhPRレセプターに結合させる。一般的にレセプ
ター特異性を最も変化させる変異体は２つのレセプター
エピトープの非重復領域に存在する。Design of receptor-specific variants of hGH Many single hGH variants cause many changes in receptor binding selectivity (Table XIX). Most notable is E174A, which leads to a four-fold increase in affinity for the hGH receptor but reduces binding to the hPRL receptor by more than 20-fold. This indicates a 120-fold change in receptor selectivity. Another mutation (primarily R178N and I179M) selectively binds hGH to the hPR receptor. In general, the variant that most alters receptor specificity resides in the non-redundant regions of the two receptor epitopes.
レセプター結合の自由エネルギー変化が加算的である
ならわずかな突然変異をもつhGHの非常に特異的な変異
体を設計することができると考えられた。事実２つの最
もhGHレセプター選択的な単一変異体（K168AおよびE174
A）を合せると、その二重変異体はhGHレセプターへの結
合に関し2300倍の選択性を示す（第XX表）。先に指摘し
たようにhPL（56−64）の結合選択性はわずか２つの突
然変異E56DおよびR64Mを含むhPL（56−64）によりほぼ2
0倍増加し得る（第XIII表）。これらのhGH変異体（K168
A、E174AまたはE56D、R64M）は実質的に好ましいレセプ
ター、各々hGHまたはhPRLに対する選択性を減少してい
ない。また同時に両レセプターへの結合を減らすことも
できる。It was thought that very specific variants of hGH could be designed with slight mutations if the change in free energy of receptor binding was additive. In fact, the two most hGH receptor selective single mutants (K168A and E174)
Combining A), the double mutant shows 2300-fold selectivity for binding to the hGH receptor (Table XX). As pointed out above, the binding selectivity of hPL (56-64) was almost 2 with hPL (56-64) containing only two mutations, E56D and R64M.
Can increase 0-fold (Table XIII). These hGH mutants (K168
A, E174A or E56D, R64M) do not substantially reduce selectivity for the preferred receptor, hGH or hPRL, respectively. At the same time, binding to both receptors can be reduced.
第XX表 hGHおよびhPRLレセプター（hGHrおよびhPRLr）を識別
するよう設計されたhGHの二重変異体の結合。hGH変異体
は部位指定突然変異誘発により調製し、精製し、かつ第
XIII表に述べた方法でhGHrまたはhPRLrへの結合を検定
した。KD測定値の標準偏差は報告されている値の±100
％であった10M以上の値以外報告されている値の20％以
下であった。Table XX Binding of double mutants of hGH designed to identify hGH and hPRL receptors (hGHr and hPRLr). hGH variants are prepared by site-directed mutagenesis, purified, and
Binding to hGHr or hPRLr was assayed as described in Table XIII. ± K D of the standard deviation of the measurements are reported value 100
% Was less than 20% of the reported value except for values above 10M.
たとえば個々にhGHおよびhPRLレセプターへの結合ア
フィニティーを大きく減少させるK172AおよびF176Aを合
せると各々550および15000倍のアフィニティーの破壊を
生む。 For example, the combination of K172A and F176A, which greatly reduce the binding affinity to the hGH and hPRL receptors, individually, results in 550 and 15,000 fold disruption of affinity, respectively.
全ての場合において結合自由エネルギー変化（ΔΔＧ
結合）は驚くべきほどに加算的である（第XXI表）。突
然変異の加算的効果は酵素−基質相互作用にもみられ
（P.J.カーター（Carter）等（1984）Cell38、835−84
0;J.A.ウェルズ（Wells）等、（1987）Proc.Natl.Acad.
Sci.USA 84、5167−5171）、プロテアーゼ−プロテアー
ゼインヒビター相互作用（M.ラスコウスキー（Laskowsk
i）等、“プロテアーゼインヒビター：医学および生化
学的特徴”（1983）,N.カツヌマ（Katunuma）編、ジャ
パンサイエンスソサイアティー版、東京、55〜68）およ
びたん白質の安定性（D.ショーントル（Shortle）等、
（1986）Protein.１、81−89（1986）;M.H.メクト（Mec
ht）、J.M.スターテバント（Sturtevant）およびR.T.ソ
ーアー（Sawer）Protein １、43−46）にもみられ、ま
たこれらの参考文献で公表されているように変異残基が
独立に機能しかつ互いに接しているときは一般に見うけ
られる。このことは多くのhGH変異体中で対を作ってい
る残基は独立に機能していることを示している。このよ
うな加算性は望ましいレセプター結合アフィニティーお
よび特異性をもつhGH変異体を作る上で非常に予想可能
な状況を作り出している。In all cases, the binding free energy change (ΔΔG
Binding) is surprisingly additive (Table XXI). The additive effect of the mutation is also seen in enzyme-substrate interactions (PJ Carter et al. (1984) Cell 38 , 835-84.
0; JA Wells et al. (1987) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 84 , 5167-5171), protease-protease inhibitor interaction (M. Laskowsk).
i) et al., "Protease inhibitors: medical and biochemical characteristics" (1983), edited by N. Katunuma, Japan Science Society, Tokyo, 55-68) and protein stability (D. Sean) Shortle, etc.
(1986) Protein. 1 , 81-89 (1986); MH Mect (Mec)
ht), JM Sturtevant and RT Sauer Protein 1 , 43-46), and the mutated residues function independently and border each other as published in these references. Time is commonly seen. This indicates that the pairing residues in many hGH variants function independently. Such additivity creates a very predictable situation in generating hGH variants with the desired receptor binding affinity and specificity.
第XXI表 hGHまたはhPRLレセプター（hGHrまたはhPRLr）への結
合に関するhGH中の変異の加算的効果。野生型hGHに対す
る変異体の結合自由エネルギー変化（ΔΔＧ結合）は ΔΔＧ結合＝RTln〔CKD（変異体）/KD（hGH）〕 に従い結合アフィニティーの減少から計算した。単一ま
たは多重変異ホルモンのKD（変異体）/KD（hGH）値は第
XIII表−第XX表から得た。Table XXI Additive effects of mutations in hGH on binding to hGH or hPRL receptor (hGHr or hPRLr). The change in binding free energy (ΔΔG binding) of the mutant to wild-type hGH was calculated from the decrease in binding affinity according to ΔΔG binding = RTln [CK D (mutant) / K D (hGH)]. Single or multiple mutant hormones have K D (mutant) / K D (hGH)
Obtained from Table XIII-Table XX.
hGHと同様にアドレナリンレセプター（R.J.レフコウ
ィッツ（Lefkowitz）およびM.G.キャロン（Caron）（19
88）J.Biol.Chem.263、4993−4996）、IGF−Ｉレセプタ
ー（M.A.カサイエリ（Cascieri）等、（1989）J.Biol.C
hem.264、2199−2202）、IL−２レセプター（R.J.ロブ
（Robb）等（1984）J.Exp.Med.160、1126−1146;R.J.ロ
ブ（Robb）等（1988）Proc.Natl.Acad.Sci.USA85、5654
−5658）およびANPレセプター（D.ロー（Lowe）および
D.ゴーデル（Goeddel）、非公開）など２つ以上のレセ
プターまたはレセプターサブタイプが存在する多くの例
がある。これらの場合、特定のレセプター機能を特定の
薬学的効果と結びつけるのは難しい。しかしレセプター
特異的ホルモン類似体の使用でこの仕事を非常に簡便化
できる。たとえばカテコールアミン類似体はβ−アドレ
ナリンレセプターサブタイプの特性を明らかにし、かつ
レセプター機能を生理的応答に結びつけるのに使いられ
る（R.J.レフコウィッツ（Lefkowitz）等、（1983）Ann
u.Rev.Biochem.52、159−186）。同様に、hGHのレセプ
ター特異的変異体はhGHの他のレセプターの同定やhGHの
複合体薬理学におけるhGHおよびhPRLレセプターの働き
を探る上での重要な道具を提供する。この研究はレセプ
ター特異的変異体の合理的設計を可能にするホルモンに
おけるレセプター結合部位を同定するための系統的方法
を示している。 Adrenergic receptors (RJ Lefkowitz and MG Caron (19
88) J. Biol. Chem. 263 , 4993-4996), IGF-I receptor (MA Cascieri et al., (1989) J. Biol. C.
Chem. 264 , 2199-2202), IL-2 receptor (RJ Robb et al. (1984) J. Exp. Med. 160 , 1126-1146; RJ Robb et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 , 5654
−5658) and ANP receptors (D. Lowe and
There are many instances where there are more than one receptor or receptor subtype, such as D. Goeddel, unpublished. In these cases, it is difficult to associate a particular receptor function with a particular pharmaceutical effect. However, the use of receptor-specific hormone analogs can greatly simplify this task. For example, catecholamine analogs have been used to characterize the β-adrenergic receptor subtype and to link receptor function to physiological responses (RJ Lefkowitz et al. (1983) Ann.
u. Rev. Biochem. 52 , 159-186). Similarly, receptor-specific variants of hGH provide an important tool in identifying other receptors for hGH and exploring the role of hGH and hPRL receptors in complex pharmacology of hGH. This study shows a systematic method for identifying receptor binding sites on hormones that allows for rational design of receptor-specific variants.
実施例13 ヒト成長ホルモンに結合するとヒトプロラクチンの作製 プロラクチン（PRL）は成長ホルモン（GH）、胎盤ラ
クトゲン（PL）およびプロリフェリンを含む相同ホルモ
ン群の１員である。ニコル（Nicoll）、C.S.等（1986）
Endocrinol.Rev.７、169−203。集合的にこのグループ
のホルモンは成長、分化、電解質バランスなどに関する
巾広い生理効果を調節する。チョウラ（Chawla）、R.K.
等（1983）Ann.Rev.Med.34、519−547;イサクソン（Isa
ksson）O.G.P.等（1985）Ann.Rev.Physiol.47、483−49
9。これらの薬理学的効果は特定の細胞レセプターへの
結合で始まる。たとえばhPRLはラクトジェニックレセプ
ターには結合するがソマトジェニックレセプターには結
合せず、また泌乳は活性化するが骨成長は活性化しな
い。hGHはラクトジェニックレセプターおよびソマトジ
ェニックレセプターの両方と結合し、かつ泌乳および骨
成長の両方を活性化する。レセプター結合特異性の差の
分子的基礎はまだ理解されていない。Example 13 Production of human prolactin upon binding to human growth hormone Prolactin (PRL) is a member of a homologous hormone family that includes growth hormone (GH), placental lactogen (PL) and proliferin. Nicol, CS, etc. (1986)
Endocrinol. Rev. 7 , 169-203. Collectively, this group of hormones regulates a wide range of physiological effects on growth, differentiation, electrolyte balance, and so on. Chowla, RK
Med. 34 , 519-547; Isaxon (Isa).
ksson) OGP et al. (1985) Ann. Rev. Physiol. 47 , 483-49
9. These pharmacological effects begin with binding to specific cellular receptors. For example, hPRL binds to lactogenic but not somatogenic receptors, and activates lactation but not bone growth. hGH binds to both lactogenic and somatogenic receptors and activates both lactation and bone growth. The molecular basis of the difference in receptor binding specificity is not yet understood.
hPRLのクローニングと発現 hPRLのcDNAをλgt10中のヒトの脳下垂体cDNAライブラ
リーから（ハイン（Huynh）、T.V.等（1985）“DNAクロ
ーニング技術−方法"1巻、D.M.グローバー（Glover）編
（オックスフォードIRLプレス）、49−78）公表されたD
NA配列の５′および３′末端に対応するオリゴヌクレオ
チドを用いた（コーク（Cooke）、N.E.等（1981）J.Bio
l.Chem.256、4007−4016）ハイブリダイゼーションによ
り（マニアチス（Maniatis）、T.等編（1982）“モレキ
ュラークローニング、ラボラトリーマニュアル（コール
ドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリン
グハーバー、NY））クローニングした。ほぼ全長のcDNA
クローンが同定され、またコドン22から停止コドンの下
流55bpまでの720bp Bst II−Hind IIIフラグメントをpJ
C118にサブクローン化した。この配列をダイデオキシ法
（サンガー（Sanger）、F.等（1977）Proc.Natl.Acad.S
ci.USA 74、5463−5467）により決定したところ以前に
報告されていたものと全く一致した（コーク（Cook
e）、K.E.等（1981）J.Biol.Chem.256、4007−4016）。Cloning and Expression of hPRL cDNA for hPRL was extracted from a human pituitary cDNA library in λgt10 (Huynh, TV et al. (1985) “DNA Cloning Techniques—Methods,” Volume 1, DM Glover, Oxford IRL Press), 49-78) Published D
Oligonucleotides corresponding to the 5 'and 3' ends of the NA sequence were used (Cooke, NE et al. (1981) J. Bio.
l.Chem. 256, 4007-4016) by hybridization (Maniatis (Maniatis), T. et al., eds. (1982) "Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)) was cloned. substantially the entire length CDNA
A clone was identified and the 720 bp Bst II-Hind III fragment from codon 22 to 55 bp downstream of the stop codon was pJ
Subcloned into C118. This sequence was sequenced using the dideoxy method (Sanger, F. et al. (1977) Proc. Natl. Acad. S.
ci.USA 74 , 5463-5467), which was entirely consistent with that previously reported (Cook).
e), KE et al. (1981) J. Biol. Chem. 256 , 4007-4016).
標準法により細胞内発現ベクターpBO760（第26図）を
作った（マニアチス（Maniatis）、T.等編（1982）モレ
キュラークローニングラボラトリーマニュアル（コール
ドスプリングハーバーラボラトリー、コールドスプリン
グハーバー、NY）。hPRL遺伝子の転写にpHGH207−１由
来の大腸菌trpプロモーターを用いた（デボア（deBoe
r）、H.A.等（1982）“プロモーターの構造と機能”ロ
ドリゲス（Rodriguez）、R.L.およびチャンベリン（Cha
mberlin）、M.J.編（プラガー版、ニューヨーク）、462
−481）。hPRLコード配列は47bp Xba I−BstE II合成DN
AカセットおよびhPRL cDNA由来の720bp BstE II−Hind
IIIフラグメントを含んでいる。合成DNAカセットは という配列であり、開始コドンはアステリスクで示して
ある。ファージf1オリジン、pBR複製オリジンおよびpBR
322β−ラクタマーゼ遺伝子はpBO475に由来する（カニ
ンガム（Cunningham）、B.C.等（1989）Science 243、1
330−1335）。The intracellular expression vector pBO760 (FIG. 26) was prepared by standard methods (Maniatis, T. et al. (1982) Molecular Cloning Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). Transcription of hPRL gene The E. coli trp promoter derived from pHGH207-1 was used for the
r), HA et al. (1982) "Structure and function of promoters", Rodriguez, RL and Chamberin (Cha).
mberlin), edited by MJ (Plager version, New York), 462
−481). hPRL coding sequence is 47 bp Xba I-BstE II synthetic DN
720 bp BstE II-Hind from A cassette and hPRL cDNA
Contains the III fragment. Synthetic DNA cassette And the start codon is indicated by an asterisk. Phage f1 origin, pBR replication origin and pBR
The 322β-lactamase gene is derived from pBO475 (Cunningham, BC et al. (1989) Science 243 , 1).
330-1335).
pBO760を含む大腸菌（MM294）を15μg/mlカルベニシ
リン添加M9ハイケース培地100mlを含む0.5L振とうフラ
スコ中37℃で４時間増殖させた（初期対数期;A550＝0.1
〜0.3）（ミラー（Miller）、J.H.（1972）“分子遺伝
学実験”（コールドスプリングハーバーラボラトリー、
コールドスプリングハーバー、NY）。インドルアクリル
酸を添加し（最終50μg/ml）trpプロモーターを誘導し
た。細胞をさらに６〜8h増殖した後遠心で収穫した。細
胞分画実験はhPRLはほとんど排他的に包含粒子中に存在
し、SDS−PAGEで分析してみると全細胞たん白質中の２
〜５％にあたることを示した（データ示さず）。E. coli (MM294) containing pBO760 was grown for 4 hours at 37 ° C. in a 0.5 L shake flask containing 100 ml of M9 high case medium supplemented with 15 μg / ml carbenicillin (early log phase; A 550 = 0.1).
~ 0.3) (Miller, JH (1972) "Molecular Genetics Experiments" (Cold Spring Harbor Laboratory,
Cold Spring Harbor, NY). Indolacrylic acid was added (final 50 μg / ml) to induce the trp promoter. Cells were grown for an additional 6-8 h before harvesting by centrifugation. In the cell fractionation experiments, hPRL was almost exclusively present in the inclusion particles, and when analyzed by SDS-PAGE, 2P in the whole cell protein was found.
５5% (data not shown).
hPRLの精製および再生。hPRLを含む包含粒子を基本的
に報告されている方法で単離した（ウィンクラー（Wink
ler）、M.E.等（1986）Biochemistry 25、4041−404
5）。簡単に云うと、湿細胞ペレット50gを0.25リットル
の10mMトリス（pH8.0）、1mM EDTA（TEバッファ）に懸
濁し、激しい超音波処理で細胞を分解した。不溶性の物
質で遠心（10,000×g15分間）で集め25mlのTEバッファ
に懸濁した。このサスペンジョンを50％グリセリン0.2
リットルのクッション上に重層し、9000×g25分間の遠
心によりhPRL包含粒子をペレット化した。この包含粒子
由来のhPRL（純度約20％）を5mlのTEバッファに懸濁し
た。Purification and regeneration of hPRL. Inclusion particles containing hPRL were isolated by essentially reported methods (Wink
ler), ME et al. (1986) Biochemistry 25 , 4041-404.
Five). Briefly, 50 g of the wet cell pellet was suspended in 0.25 liter of 10 mM Tris (pH 8.0), 1 mM EDTA (TE buffer) and the cells were disrupted by vigorous sonication. The insoluble material was collected by centrifugation (10,000 × g for 15 minutes) and suspended in 25 ml of TE buffer. Add this suspension to 50% glycerin 0.2
Layered onto a liter cushion and pelleted hPRL-containing particles by centrifugation at 9000 × g for 25 minutes. HPRL (purity about 20%) derived from the inclusion particles was suspended in 5 ml of TE buffer.
TEバッファ中0.3gの還元グルタチオン（シグマ）を含
む8N GnHCl溶液156mlに包含粒子を溶かすことによりpPR
Lを再生した。室温で30分間緩やかに撹拌した後この混
合物を０℃に冷やし、0.6gの酸化グルタチオンを含む冷
TEバッファ844mlで希釈した。この溶液を４℃で一晩ゆ
っくりと撹拌した後、24時間に３回外液を変える４の
TEバッファを用いた透析を行った。不溶性物質を遠心で
除去した（10,000×g20分間）。PPR by dissolving the inclusion particles in 156 ml of 8N GnHCl solution containing 0.3 g reduced glutathione (Sigma) in TE buffer
Played L. After gently stirring at room temperature for 30 minutes, the mixture is cooled to 0 ° C and cooled with 0.6 g of glutathione oxide.
Diluted with 844 ml of TE buffer. After slowly stirring the solution overnight at 4 ° C., change the external solution three times in 24 hours.
Dialysis using TE buffer was performed. Insoluble material was removed by centrifugation (10,000 × g for 20 minutes).
さらに再生し可溶化したhPRLを45％飽和の（NH4）2SO
4の添加および室温2.5時間の攪拌による沈殿化で精製し
た。この沈殿を遠心（12,000×g30分間）で集め5mlのTE
バッファに溶解した。室温30分後この溶液を清澄化した
後（10,000×g10分間）、ミリポアフィルターで濾過し
た（0.45μｍ）。この溶液を４℃で一晩0.5リットルのT
Eバッファに対して透析した。最後にこのhPRL（純度85
％）を基本的にhGHの精製について述べた方法と同じDEA
E高速マトリクスを用いたFPLCにより均一となるまで
（＞95％）精製した（カニンガム（Cunningham）、B.C.
等（1989）Science、243、1330−1335）。Further, the regenerated and solubilized hPRL is 45% saturated (NH 4 ) 2 SO
Purified by addition of 4 and precipitation by stirring at room temperature for 2.5 hours. This precipitate is collected by centrifugation (12,000 xg for 30 minutes) and 5 ml of TE
Dissolved in buffer. After 30 minutes at room temperature, the solution was clarified (10,000 × g for 10 minutes) and then filtered through a Millipore filter (0.45 μm). 0.5 L of this solution at 4 ° C overnight
Dialysis was performed against E buffer. Finally, this hPRL (purity 85
%) DEA basically the same as the method described for the purification of hGH
E Purified to homogeneity (> 95%) by FPLC using high speed matrix (Cunningham, BC
(1989) Science, 243 , 1330-1335).
hGHおよびhPRL変異体の突然変異誘発および結合性部
位指定突然変異誘発（ゾラー（Zoller）、M.J.等（198
2）Nucleic Acids Res.,10、6487−6500）は大腸菌のメ
チル化修復欠損株MutLを用いて行った（クレーマー（Kr
amer）、B.等（1984）Cell38、879−887）。変異体クロ
ーンの濃縮化は、インビボ生成ヘテロ二本鎖のトランス
ホーメーション後に得られた最初のプラスミドDNAプー
ルに制限精製または制限選択を応用し得るように各々単
独制限部位を導入または除外する変異原オリゴヌクレオ
チドを設計することにより行った（ウェルス）Well
s）、J.A.等（1986）Phil.Trans.R.Soc.Lond.A 317、41
5−423）。全てのオリゴヌクレオチドはもっとも上流の
ミスマッチの５′側に正確にマッチする12bpおよびもっ
とも下流のミスマッチの３′側に正確にマッチする10bp
を有するよう設計する。hGHの突然変異誘発の場合、先
に述べたhGH合成遺伝子は多くの制限部位を含んでお
り、これをプラスミドpBO475にクローン化した。hGHの
変異体は大腸菌の細胞周辺腔に分泌され（チャン（Chan
g）、C.N.等（1987）Gene55、189−196）先に述べたよ
うに精製した。Mutagenesis of hGH and hPRL variants and binding site-directed mutagenesis (Zoller, MJ et al. (198
2) Nucleic Acids Res., 10 , 6487-6500) was carried out using a methylation repair deficient MutL strain of E. coli (Kramer (Kr.
amer), B. et al. (1984) Cell 38 , 879-887). Enrichment of the mutant clones is accomplished by introducing or excluding mutagenesis restriction sites or restriction selections, respectively, to the initial pool of plasmid DNA obtained after transformation of the in vivo generated heteroduplex. Performed by designing oligonucleotides (Wells) Well
s), JA et al. (1986) Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 317 , 41
5-423). All oligonucleotides are 12 bp exactly matching 5 'of the most upstream mismatch and 10 bp exactly matching 3' of the most downstream mismatch.
Is designed to have In the case of hGH mutagenesis, the previously described hGH synthetic gene contains a number of restriction sites, which were cloned into plasmid pBO475. hGH mutants are secreted into the periplasmic space of E. coli (Chan
g), CN et al. (1987) Gene 55 , 189-196) Purified as previously described.
各類似体のKd値は本明細書およびスペンサー（Spence
r）S.A.等（1988）、J.Biol.Chem.263、7862−7867に述
べられている精製組換えhGH結合たん白質に結合した〔
125I〕hGHの競合的置換により測定した。先に述べたhGH
結合たん白質（クローン化ヒト肝臓レセプターの残基１
〜238を含む）をフー（Fuh）、G.等（（1989）、提出）
により述べられている方法により大腸菌から分泌させ精
製した。置換曲線を３回作成し、またKd値の標準偏差は
一般に報告値の20％以下であり、Kd値が10μＭ以上とな
る場合を除いて報告値の50％を越えることはなかった。The Kd value for each analog is described herein and in Spencer.
r) Binds to purified recombinant hGH-binding protein described in SA et al. (1988), J. Biol. Chem. 263 , 7862-7867 [
125 I] hGH. HGH mentioned earlier
Binding protein (residue 1 of cloned human liver receptor)
~ 238 (including fuh), G. et al. ((1989), submitted)
And secreted from E. coli and purified. Displacement curves were generated in triplicate and the standard deviation of the Kd values was generally less than 20% of the reported value and did not exceed 50% of the reported value except where the Kd value was greater than 10 μM.
hPRLおよびhPRL変異体の濃度は吸光係数Ｓ（0.1
％、280）＝0.9（ウェトローファー（Wetlaufer）、D.
B.（1962）Adv.in Prot.Chem.17、303−390）を用いたA
280で測定した。これは変異体が芳香族残基における突
然変異を含む場合はそれに応じて調整した。吸光度によ
り測定した濃度値はSDS−PAGEとhGHのコマージブルーに
よる染色を用いたレーザーデンシトメトリーによって測
定した値と10％以内の誤差で一致していた。円二色スペ
クトルはアビブキャリー60スペクトロポーラリメーター
を用いて測定した。The concentration of hPRL and hPRL mutant was determined by the extinction coefficient S (0.1
%, 280) = 0.9 (Wetlaufer, D.
B. (1962) Adv. In Prot. Chem. 17 , 303-390)
Measured at 280 . This was adjusted accordingly if the mutant contained a mutation in an aromatic residue. The concentration values measured by absorbance were within 10% of the values measured by SDS-PAGE and laser densitometry using hGH staining with Comage Blue. Circular dichroism spectra were measured using an Aviv Carry 60 spectropolarimeter.
hPRL中どの残基がhGHレセプターへの結合にもっとも
破壊的であるかを探るため（第27図）、まず多くのhPRL
残基をhGH中に導入した（第XXII表）。To determine which residues in hPRL are most disruptive to binding to the hGH receptor (Fig. 27), first
Residues were introduced into hGH (Table XXII).
hGH中部位58、64、176および178の単一アラニン置換
はレセプター結合を著しく破壊するが、これらの部位に
おけるhPRL残基の置換はほとんど影響しなかった。hPRL
置換の最も大きい効果は部位176および178を含むヘリッ
クス４残基中に存在した。これらのデータはhPRLのヘリ
ックス４領域における残基がhGHレセプターへの結合の
欠除を最もよく説明し得ることを示している。 Although single alanine substitutions at sites 58, 64, 176 and 178 in hGH significantly disrupted receptor binding, substitution of hPRL residues at these sites had little effect. hPRL
The greatest effect of the substitution was in the four helix residues containing sites 176 and 178. These data indicate that residues in the helix 4 region of hPRL may best explain the lack of binding to the hGH receptor.
組換えhPRLは天然様の構造および機能性を維持してい
た。まず近および遠紫外線CDスペクトル（第28図）は天
然のhPRLのスペクトルと同じであった（ビューリー（Be
wley）、T.A.（1979）“ホルモン研究の最近の進歩"35
巻、155〜213頁、アカデミープレス、N.Y.）、遠紫外線
スペクトルはhGHと同じであり、このことは208nmおよび
224nmにおける平均残基だ円率の重要な差が知られてい
るが同様の４−ヘリックス束構造の存在を示している。
これらのホルモンの芳香族残基の数や微環境の差を反映
する近紫外CDは著しく異なる。別の研究で組換えhPRLは
hPRL ELISAにおいて十分な免疫学的交叉反応性を維持
しており（データ示さず）、またラットのリンパ腫Nb2
細胞を増殖させることにおいてhGHと等価であった（タ
ナカ（Tanaka）、T.等（1980）J.Clin.Endo.metab.51、
1058−1063）。還元すると精製hPRLはSDS−PAGEにおけ
る移動度の著しい減少を起こし（hGHでもみられる）、
このことはジスルフィド結合の形成を示している（ポリ
ット（Pollitt）、S.等（1983）J.Bacteriol.153、27−
32）。アミノ末端配列分析は細胞内発現hPRLはアミノ末
端メチオニンを維持していることを示した。しかし、メ
チオニルhGHと同様このことは見かけ上その構造や機能
に影響しない。Recombinant hPRL maintained its native-like structure and functionality. First, the near- and far-ultraviolet CD spectra (FIG. 28) were identical to those of native hPRL (beauties (Be
wley), TA (1979) “Recent advances in hormone research” 35
Vol. 155-213, Academy Press, NY), the deep ultraviolet spectrum is the same as hGH, which means that
Significant differences in average residue ellipticity at 224 nm are known, indicating the presence of a similar 4-helix bundle structure.
Near-UV CDs, which reflect differences in the number of aromatic residues and microenvironment of these hormones, are markedly different. In another study, recombinant hPRL
Sufficient immunological cross-reactivity was maintained in the hPRL ELISA (data not shown) and rat lymphoma Nb2
It was equivalent to hGH in growing cells (Tanaka, T. et al. (1980) J. Clin. Endo.metab. 51 ,
1058-1063). Upon reduction, purified hPRL causes a significant decrease in mobility on SDS-PAGE (also found in hGH),
This indicates the formation of disulfide bonds (Pollitt, S. et al. (1983) J. Bacteriol. 153 , 27-
32). Amino-terminal sequence analysis indicated that the intracellularly expressed hPRL maintained the amino-terminal methionine. However, like methionyl hGH, this apparently does not affect its structure or function.
hGH結合たん白質へのhPRLの結合はhGHと比較して105
倍以上も減少し（第XXIII表）、これは結合アッセイの
検出限界以下である。The binding of hPRL to hGH binding protein is 10 5 compared to hGH.
More than a two-fold reduction (Table XXIII), below the detection limit of the binding assay.
hGH由来のヘリックス４中の３つの残基を組合せて（H
171D、N175TおよびY176F）、hPRLに導入した。アラニン
スキャンニング突然変異誘発およびhPRL置換（第XXII
表）はこれらの残基がhGHのhGHレセプターへの結合に非
常に重要であることを示している。hPRLのこの三重変異
体はhGHよりは14000倍も弱いがhGH結合たん白質に検出
可能な結合を起こした。さらにテトラ変異体を作るため
他の重要なヘリックス４残基（K178R）を導入すると、
これは野生型よりわずか660倍低いだけのレベルの結合
に強められた（第XIII表の変異体Ｂ）。hPRL変異体Ｂへ
のhGH残基184〜188の導入はhGH結合たん白質への結合を
強化しなかった。しかしhPRL変異体Ｃを与えるE174Aの
導入（第XXIII表）はE174AがhGHに組込まれたときと同
じようにhGH結合たん白質への結合アフィニティーをさ
らに3.5倍増加した。 By combining three residues in helix 4 from hGH (H
171D, N175T and Y176F), introduced into hPRL. Alanine scanning mutagenesis and hPRL substitution (XXII
Table) shows that these residues are critical for the binding of hGH to the hGH receptor. This triple mutant of hPRL caused detectable binding to the hGH binding protein, albeit 14,000 times weaker than hGH. Introducing another important four-helix residue (K178R) to create a tetra mutant,
This was enhanced to a level of binding that was only 660-fold lower than wild-type (variant B in Table XIII). Introduction of hGH residues 184-188 into hPRL mutant B did not enhance binding to hGH binding protein. However, the introduction of E174A, which gives hPRL variant C (Table XXIII), further increased the binding affinity to hGH binding protein by a factor of 3.5, similar to when E174A was incorporated into hGH.
ヘリックス４領域への結合力をもつことから残基54〜
74を含むループ領域を分析した。hPRL中のループ領域を
hGH由来の配列（第XIII表のhGH（54−74））で完全に置
換することはhGH結合たん白質へのかろうじて検出可能
な結合を与える。この変異体を変異体Ｂと合せたとき結
合アフィニティーが実質的に増加する。しかし、この新
しい変異体（Ｂ＋hGH（54−74））の結合アフィニティ
ーは変異体Ｂ単独のときよりもほとんど10倍減少する。
したがって54−74ループ中のいくつかのhGH残基はヘリ
ックス４中のhGH置換と適合しなかった。我々はhGHの54
−74ループからアラニンスキャンニング突然変異誘発に
よりもっとも結合に影響することが示された７個の残基
を選択した。hGHのR64A突然変異は結合アフィニティー
を20倍以上減少させるが、hGHのR64K変異体（hPRL置
換）はhGH結合たん白質への結合がわずかに多い（第XXI
I表）。それゆえhPRL中のLys64は変化しないままであっ
た。結果としてhGHにおいてアラニンへの変化が最も破
壊的であった７個の置換のうちの６個をhPRLへ組込ん
だ。この新しい変異体（Ｂ＋H65F:S56E:L58I:E56S:D68
N:Q66E）はＢ＋hGH（54−74）よりも50倍も強く結合す
るが野生型hGHの結合アフィニティーよりもわずかに110
倍小さいだけである。しかし、これは変異体Ｂ単独より
もわずかな改善を示したのみで（６倍）、先にhGHのル
ープ領域において観察された強い相互作用に期待される
ほどではなかった。それゆえ、ループ内の６個の突然変
異をさらに分断し、H54F:S56E:L58I＋変異体Ｂの組合せ
が変異体Ｂ単独よりも３倍も結合が弱いことが明らかに
なった。最後に変異体Ｃへの突然変異E62S:D63N:Q66Eの
組込みは（変異体Ｄ）はhGHに比べ結合アフィニティー
がわずかに６倍低いだけの最も高いアフィニティーをも
つ類似体を生ずる。別の単一突然変異（H54F、S56E、L5
8I、A59P、N71SおよびL179I）はhGH結合たん白質へのhP
RL変異体Ｄの結合アフィニティーを高めることはなかっ
た。変異体Ｄの構造は事実上CDスペクトル分析（第28
図）またはELISA活性（データ示さず）によって天然のh
PRLと区別できなかった。Residues 54-
The loop region containing 74 was analyzed. loop region in hPRL
Complete substitution with the sequence from hGH (hGH (54-74) in Table XIII) provides barely detectable binding to the hGH binding protein. When this variant is combined with variant B, the binding affinity is substantially increased. However, the binding affinity of this new mutant (B + hGH (54-74)) is reduced almost 10-fold compared to mutant B alone.
Thus, some hGH residues in the 54-74 loop were incompatible with hGH substitutions in helix 4. We hgh 54
The seven residues from the -74 loop that were shown to affect binding most by alanine scanning mutagenesis were selected. The hGH R64A mutation reduces binding affinity by more than 20-fold, whereas the hGH R64K mutant (hPRL substitution) binds slightly more to the hGH binding protein (XXI).
Table I). Therefore Lys64 in hPRL remained unchanged. As a result, six of the seven substitutions in hGH where the change to alanine was most disruptive were incorporated into hPRL. This new mutant (B + H65F: S56E: L58I: E56S: D68
N: Q66E) binds 50-fold more strongly than B + hGH (54-74) but only 110-fold more than the binding affinity of wild-type hGH.
Only twice as small. However, this only showed a slight improvement over mutant B alone (6-fold), not as expected for the strong interaction previously observed in the hGH loop region. Therefore, the six mutations in the loop were further disrupted, revealing that the combination of H54F: S56E: L58I + Variant B had three times less binding than Variant B alone. Finally, the incorporation of the mutation E62S: D63N: Q66E into mutant C (mutant D) yields the analog with the highest affinity with only a 6-fold lower binding affinity compared to hGH. Another single mutation (H54F, S56E, L5
8I, A59P, N71S and L179I) are hPs to hGH binding proteins
It did not increase the binding affinity of RL variant D. The structure of mutant D was virtually analyzed by CD spectrum (No. 28).
(Figure) or ELISA activity (data not shown)
Indistinguishable from PRL.
これらの研究は部位指定突然変異誘発由来の機能情報
のみを用いた遠い関係の類似体の結合性を回復させ得る
可能性を示した。hGHのアラニンスキャンニング突然変
異誘発はhGHのレセプターへの結合を調節するのに重要
な側鎖の系統的分析を提供した（第27図）。この情報は
hGHレセプターに結合し得ないことを説明するhPRL中の
多くの残基を浮き立たせた（第29図）。しかしさらに分
析することでhGH中のアラニン置換がhGH中のhPRL置換よ
りもより破壊的であることが示された（第XXII表）。さ
らにいくつかのhPRL置換は、特にhPRL中により大きい側
鎖が存在するとき結合アフィニティーに関し他のものよ
りかなり破壊的であった。たとえばhGH中の保存的（し
かしより大きい）F176Y置換はhGHレセプターに関する結
合アフィニティーに８倍の減少を引き起こすが、一方よ
り小さいR64K置換は結合アフィニティーのわずかな増加
を示した。このようにhGH中の破壊的hPRL置換の分析は
最初にhPRLへの結合アフィニティーを遂行するヘリック
ス４中の残基クラスターの導入を示している。このこと
は野生型hPRLによるhGHレセプターへの結合が観察され
ないことから非常に重要であり、使用した検定の範囲内
の結合アフィニティーをもたらすため（Kd≦50μＭ）hP
RL中に同時にいくつかのhGH置換を導入することが必要
である。These studies showed the potential to restore the binding of distantly related analogs using only functional information from site-directed mutagenesis. Alanine scanning mutagenesis of hGH provided a systematic analysis of side chains important in regulating hGH binding to the receptor (FIG. 27). This information
A number of residues in the hPRL have been highlighted which explain the inability to bind to the hGH receptor (FIG. 29). However, further analysis showed that the alanine substitution in hGH was more destructive than the hPRL substitution in hGH (Table XXII). In addition, some hPRL substitutions were significantly more disruptive than others with respect to binding affinity, especially when larger side chains were present in the hPRL. For example, a conservative (but larger) F176Y substitution in hGH caused an 8-fold decrease in binding affinity for the hGH receptor, while a smaller R64K substitution showed a slight increase in binding affinity. Thus, analysis of destructive hPRL substitutions in hGH initially indicates the introduction of a cluster of residues in helix 4 that performs binding affinity to hPRL. This is very important since no binding to the hGH receptor by wild-type hPRL is observed and results in binding affinity within the assay used (Kd ≦ 50 μM).
It is necessary to introduce several hGH substitutions into the RL at the same time.
ヘリックス４に機能的に重要な残基を導入することに
よりhPRLに容易に検出可能な結合アフィニティーを導入
された。しかし、54−74間のループ領域を作り出すこと
はより困難であることが分った。hGHの全ループをhPRL
に組込むことによる結合の増加は期待されたよりも小さ
く、至適化されたヘリックス４変異体Ｂと組合せたとき
は結合に対して破壊的であった。我々のデータはhPRLの
54−74ループ構造はこのたん白質中の他の相互作用によ
り支持されることを示している。この問題は段階的に解
決された。まず、hGH中のhPRL置換を伴アラニン置換で
重要であると同定されたhGH由来の６個のループ残基をh
PRLに導入した。これはその状況を改善したにもかかわ
らずいくつかのhGH突然変異（H54F、S56EおよびL58Iに
しぼった）の組分合せはhPRLに対して破壊的であった。
これらのデータはループ中のいくつかの残基がその構造
に重要でありそのまま残した方がより安定であることを
示している。Introduction of a functionally important residue in helix 4 introduced a readily detectable binding affinity to hPRL. However, creating a loop region between 54-74 has been found to be more difficult. hPRL for all loops of hGH
The increase in binding due to incorporation into was smaller than expected and was disruptive to binding when combined with the optimized helix 4 mutant B. Our data for hPRL
The 54-74 loop structure indicates that it is supported by other interactions in this protein. This problem was resolved in stages. First, the six loop residues from hGH identified as important in alanine substitutions with hPRL substitutions in hGH were identified as h
Introduced in PRL. Although this improved the situation, the combination of several hGH mutations (H54F, S56E and L58I) was destructive to hPRL.
These data indicate that some residues in the loop are important for its structure and are more stable to leave.
突然変異誘発の多くの反復サイクルがhPRLのhGHレセ
プターへの堅い結合を可能する残基の組合せを一本化す
るのに必要であった。この戦術は変異効果が実際に観察
されるように加算的であるという仮定に依存している。
たとえばE174A突然変異がhPRL変異体ＣまたはhGHに加え
られたとき結合を３〜５倍増加した。さらに変異体Ｄに
対するH54F、S56E、およびL58I単一変異体の破壊的効果
は（4.4倍）変異体Ｂに付加された３つの全ての突然変
異の組合せによって引き起こされる破壊とほぼ同じであ
った（３倍）。Many repetitive cycles of mutagenesis were required to unify the residue combinations that allowed tight binding of hPRL to the hGH receptor. This tactic relies on the assumption that the mutation effect is additive as actually observed.
For example, when the E174A mutation was added to hPRL mutant C or hGH, binding was increased 3-5 fold. Furthermore, the disruptive effect of the H54F, S56E, and L58I single mutants on mutant D was (4.4-fold) approximately the same as the disruption caused by the combination of all three mutations added to mutant B ( 3 times).
変異体Ｄの結合アフィニティーはわずか６倍減少する
だけであるにもかかわらず変異体Ｄに組込んでさらに結
合を改善する試みを行いうるV14NおよびH185Vなどいく
つかの他の残基がある。すなわちhGH中のアラニン置換
がhGHの結合を２〜３倍の減少を起こす部位がある（第2
9図）。高分解能の構造が設計過程の助けとなるが、そ
れは明らかに基本的なものではない。突然変異効果の累
積性は天然の変化および淘汰サイクルによるたん白質進
化と同じ様式で結合性を収れんさせうる。There are several other residues, such as V14N and H185V, that can be incorporated into mutant D to attempt to further improve binding, even though the binding affinity of mutant D is reduced only by 6-fold. That is, there is a site where alanine substitution in hGH causes a two- to three-fold reduction in hGH binding (second
9). High-resolution structures aid the design process, but they are obviously not fundamental. The cumulative nature of the mutational effects can converge the binding in the same manner as protein evolution through natural changes and selection cycles.
従来のたん白質工学実験は高分解能構造分析を用いて
基質接触残基による天然の変異体酵素の基質特異性の実
際的変換が可能であることを示した（ウェルズ（Well
s）J.A.等（1987）Proc.Natl.Acad.Sci.USA84、5167−5
171;ウィルクス（Wilks）、H.M.等（1988）Science 24
2、1541−1544）。同様に他のものは結合性は抗原結合
ループ（ジョーンズ（Jones）、P.T.等（1986）Nature3
21、522−525）またはDNAレセプターヘリックス（ワー
トン（Wharton）、R.P.等（1985）Nature316、601−60
5）を含む二次構造ユニットの全ユニットの置換により
産み出し得ることを示した。しかし、hPRLにhGHレセプ
ター結合性を与えるにはhPRLの構造枠組内の選択的残基
置換を必要とする。さらにCDスペクトルデータはhPRL変
異体Ｄの全構造はそれがhGHと同様の結合性は維持して
いるにもかかわらず、hPRLの構造には非常によく似てい
るがhGHには似ていない。Conventional protein engineering experiments have shown that high-resolution structural analysis allows the practical conversion of the substrate specificity of the native mutant enzyme by substrate contact residues (Wells).
s) JA et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84 , 5167-5.
171; Wilks, HM et al. (1988) Science 24
2 , 1541-1544). Similarly, others have antigen binding loops (Jones, PT et al. (1986) Nature 3 ).
21 , 522-525) or DNA receptor helix (Wharton, RP, et al. (1985) Nature 316 , 601-60).
It was shown that it can be produced by replacing all units of the secondary structural unit including 5). However, conferring hPRL with hGH receptor binding requires selective residue substitutions within the structural framework of hPRL. Furthermore, the CD spectral data show that the entire structure of hPRL variant D is very similar to hPRL but not to hGH, although it retains the same binding properties as hGH.
hGHレセプターへの結合特異性がhPRLに組込まれ得る
という事実はソマトジェニックレセプター結合に対する
特定の残基の機能的重要性を確認している。またこれら
の研究はhGHとhPRLがわずか23％の一致しかもたないに
もかかわらず両者の構造的関係に対する動かぬ証拠を提
供する。これは成長ホルモン、プロラクチン、プロリフ
ェリンまたは胎盤ラクトゲン構造を始めとするこのホル
モン群内に含まれる新しいレセプター結合機能に近づく
合理的方法を提供する。このようなハイブリッドはレセ
プターサブタイプの薬理学的重要性とともにレセプター
結合および活性化を区別する上で有用である。これらの
類似性はアゴニストまたはアンタゴニストとしてより有
用な性質をもつ新しいレセプター特異的ホルモンの設計
に導く。The fact that the binding specificity for the hGH receptor can be incorporated into hPRL confirms the functional importance of particular residues for somatogenic receptor binding. These studies also provide immovable evidence for the structural relationship between hGH and hPRL, despite only 23% agreement. This provides a rational way to approach new receptor binding functions contained within this group of hormones, including growth hormone, prolactin, proliferin or placental lactogen structures. Such hybrids are useful in distinguishing between receptor binding and activation, as well as the pharmacological significance of the receptor subtype. These similarities lead to the design of new receptor-specific hormones with more useful properties as agonists or antagonists.
実施例14 ヒト胎盤ラクトゲンへのヒト成長ホルモンの結合性の付
与 ヒト胎盤ラクトゲン（hPL）のhGHレセプターに対する
結合アフィニティーはhGHに比べ30倍小さい（G.バウマ
ン（Baumann）等（1986）J.Clin.Endocrinol.Metab.6
2、134;A.C.ヘリントン（Herington）、等（1986）J.Cl
in.Invest.77、1817）。以前の変異実験はhGHレセプタ
ーに対するhGHの結合部位は基本的にアミノ末端（残基
４−14）付近のいくつかのマイナーな決定基とともに２
つの領域（残基54−74および171−185を含む）内に存在
する。Example 14 Provision of Human Growth Hormone Binding to Human Placental Lactogen The binding affinity of human placental lactogen (hPL) to the hGH receptor is 30 times smaller than hGH (G. Baumann et al. (1986) J. Clin. Endocrinol.Metab. 6
2 , 134; AC Herington, et al. (1986) J. Cl.
in.Invest. 77 , 1817). Earlier mutation experiments have shown that the binding site of hGH to the hGH receptor is essentially 2 min with some minor determinants near the amino terminus (residues 4-14).
Present in one region, including residues 54-74 and 171-185.
hPLの全配列はhGHと85％が同じである。hGH上のレセ
プター結合エピトープを広く構成している３つの領域内
でhPLはわずか７個所で異なり以下の置換を含む:P2Q、I
4V、N12H、R16Q、E56D、R64M、およびI179M。（この命
名法では野生型hGHの残基を１文字コードで示し、つづ
いて成熟hGHの部位番号およびhPL中の残基を示した）。
これら７個の各部位においてhGHの単一アラニン置換を
作った。これらのうち、４つのアラニン置換、I4A、E56
A、R64A、およびI179Aは結合アフィニティーの２倍以上
の減少を引き起こすことが分った。一般にアラニン置換
は結合に関しヒトプロラクチン由来の相同的置換よりも
大きい効果を有している。それゆえ、hGHに導入されたh
PL由来の置換のいくつかの効果を研究した。I179A置換
はアフィニティーの2.7倍の減少を起こした一方、I179M
はわずか1.7倍の効果しか示さなかった。しかし、R64A
およびR64M置換は結合アフィニティーの同一およびより
大きい減少（約20倍を引き起こした。さらに、hGHの二
重変異体（E56D:R64M）のアフィニティーはさらに計30
倍の減少を示した（第Ｉ表）。このようにE56DおよびR6
4Mは基本的にhGHとhPLのレセプター結合アフィニティー
の差を決定する。それゆえhPLの二重変異体D56E、M64R
は実質的にhGHレセプターへの結合アフィニティーが増
加している。M179IおよびV4Iのような付加的修正もhPL
のhGHレセプターへの結合を高める。The entire sequence of hPL is 85% identical to hGH. Within the three regions that make up the receptor binding epitope on hGH, the hPL differs in only seven places and includes the following substitutions: P2Q, I
4V, N12H, R16Q, E56D, R64M, and I179M. (In this nomenclature, the residues of wild-type hGH are indicated by a one-letter code, followed by the site number of mature hGH and the residues in hPL).
A single alanine substitution of hGH was made at each of these seven sites. Of these, four alanine substitutions, I4A, E56
A, R64A, and I179A were found to cause more than a two-fold decrease in binding affinity. In general, alanine substitutions have a greater effect on binding than homologous substitutions derived from human prolactin. Therefore, h introduced in hGH
Some effects of substitution from PL were studied. The I179A substitution caused a 2.7-fold decrease in affinity while the I179M
Showed only a 1.7-fold effect. But R64A
And the R64M substitution caused an identical and greater decrease in binding affinity (approximately 20-fold. In addition, the affinity of the double mutant of hGH (E56D: R64M) was further increased by a total of 30
It showed a two-fold decrease (Table I). Thus E56D and R6
4M basically determines the difference in receptor binding affinity between hGH and hPL. Hence the double mutant of hPL D56E, M64R
Has substantially increased binding affinity to the hGH receptor. Additional modifications such as M179I and V4I also hPL
Enhances binding to hGH receptor.
実施例15 ヒト成長ホルモンへの結合に関する部位174でのアミノ
酸置換の効果 先に示されているように、Glu174のAlaによる置換（E
174A）はヒト成長ホルモンのそのレセプターへのアフィ
ニティーを４倍以上増加させる。部位174における至適
置換残基を決めるため他の12個の残基で置換したhGH変
異体を作りhGH結合たん白質とのアフィニティーを測定
した（第XXIV表）。荷電ではなく側鎖の大きさが結合ア
フィニティーを決定する主要要素である。アラニンが至
適置換を起こし、Ser、Gly、Gln、Asn、Glu、His、Ly
s、Leu、そしてTyrの順でつづいている。Example 15 Effect of Amino Acid Substitution at Site 174 on Binding to Human Growth Hormone As shown above, substitution of Glu174 with Ala (E
174A) increases the affinity of human growth hormone for its receptor by more than 4-fold. To determine the optimal substitution residue at site 174, an hGH mutant substituted with another 12 residues was prepared, and the affinity with the hGH binding protein was measured (Table XXIV). The size of the side chain, not the charge, is a key factor in determining binding affinity. Alanine makes optimal substitution, Ser, Gly, Gln, Asn, Glu, His, Ly
s, Leu, then Tyr.
実施例16 第XXV表に示したhGH変異体を構築した。野生型hGHに
対するこれらの相対的能力を示す。 Example 16 The hGH variants shown in Table XXV were constructed. The relative potencies for wild-type hGH are shown.
本発明の好ましい態様を述べてきたがこれら公開した
態様を種々に変化させうること、およびこのような修正
は本発明の範囲内にあることは当業者にとって明白であ
る。 Having described preferred embodiments of the invention, it will be apparent to one skilled in the art that these disclosed embodiments may be varied in various ways, and that such modifications are within the scope of the invention.
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (56)参考文献 特開 昭62−104584（ＪＰ，Ａ) Ｓｃｉｅｎｃｅ，243，1330−1336 （1989) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) G01N 33/53 - 33/98 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)Continuation of the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI C12P 21/02 C12P 21/02 H C12N 15/00 ZNAA (56) References JP-A-62-104584 (JP, A) Science, 243, 1330 -1336 (1989) (58) Field surveyed (Int. Cl. 7 , DB name) G01N 33/53-33/98 C12N 15/00-15/90 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)
Claims (15)
標的物質と相互作用する少なくとも１つの第１の未知活
性ドメインを同定する方法で、 ａ）該親ポリペプチドに対する類似体由来の第１の類似
ポリペプチドセグメントで該親ポリペプチドの第１の選
択されたアミノ酸セグメントを置換し第１のセグメント
置換ポリペプチドを生成すること。ここで該親ポリペプ
チドおよび該類似体は該第１標的物質に対して異なる相
互作用を有する。 ｂ）該第１セグメント置換ポリペプチドを該第１標的物
質と接触させ、該第１標的物質と該セグメント置換ポリ
ペプチドとの相互作用を測定すること。 ｃ）該親ポリペプチドに対する類似体由来の第２の類似
ポリペプチドセグメントを用いステップａ）およびｂ）
を反復することにより該第１セグメント置換ポリペプチ
ドとは違う類似アミノ酸セグメントを含む少なくとも１
つの第２のセグメント置換ポリペプチドを生成するこ
と。 ｄ）該親ポリペプチドおよび該第１および第２セグメン
ト置換ポリペプチドの該第１標的物質に対する活性の差
を比較して該親ポリペプチド中の該第１活性ドメインの
位置を確認すること。 以上ａ）〜ｄ）のステップを含む方法。1. A method for identifying at least one first unknown active domain that interacts with a first target substance in the amino acid sequence of a parent polypeptide, comprising: a) a first derivative derived from an analog to the parent polypeptide. Replacing the first selected amino acid segment of the parent polypeptide with a similar polypeptide segment of the above to produce a first segment-substituted polypeptide. Here, the parent polypeptide and the analog have different interactions with the first target substance. b) contacting the first segment-substituted polypeptide with the first target substance, and measuring an interaction between the first target substance and the segment-substituted polypeptide. c) steps a) and b) using a second analogous polypeptide segment from an analog to said parent polypeptide
By repeating at least one amino acid segment containing a similar amino acid segment different from the first segment-substituted polypeptide.
Generating two second segment-substituted polypeptides. d) comparing the difference in activity of the parent polypeptide and the first and second segment-substituted polypeptides to the first target substance to confirm the position of the first active domain in the parent polypeptide. A method comprising the above steps a) to d).
ドの一次アミノ酸配列中の少なくとも２つの不連続のア
ミノ酸セグメントを含む請求の範囲第１項記載の方法。2. The method of claim 1, wherein said unknown active domain comprises at least two discontinuous amino acid segments in the primary amino acid sequence of said parent polypeptide.
記親ポリペプチドの第２の標的物質と相互作用する第２
の未知活性ドメインを同定することを含み、かつ該第１
標的物質に代えて該第２標的物質を用いてステップａ）
〜ｄ）を反復することを含む方法。3. The method according to claim 1, further comprising the step of: interacting with a second target substance of the parent polypeptide.
Identifying an unknown active domain of
Step a) using the second target substance instead of the target substance
A method comprising repeating ~ d).
性ドメイン内の少なくとも１つの第１活性アミノ酸残基
を同定することを含み、かつ ｅ）該第１活性ドメイン内の種々の第１アミノ酸残基を
スキャンニングアミノ酸で置換することにより第１残基
置換ポリペプチドを生成すること。ここでスキャンニン
グアミノ酸とは親ポリペプチド内の活性アミノ酸を同定
するのに用いられるアミノ酸である。 ｆ）該第１残基置換ポリペプチドを前記第１標的物質と
接触させ該標的物質と該残基置換ポリペプチドとの相互
作用を測定すること。 ｇ）ステップｅ）において第１アミノ酸残基に代えて第
２アミノ酸残基を用いてステップｅ）とｆ）を反復する
ことにより該第１活性ドメイン内の少なくとも１つの第
２アミノ酸残基をスキャンニングアミノ酸で置換し少な
くとも１つの第２残基置換ポリペプチドを生成するこ
と。 ｈ）親ポリペプチドおよび各該第１および第２残基置換
ポリペプチドの該第１標的物質に対する活性の差を比較
して該第１活性ドメイン内の第１活性アミノ酸残基の位
置を確認すること。 以上ｅ）〜ｈ）のステップを含む方法。4. The method according to claim 1, comprising identifying at least one first active amino acid residue in said first active domain, and e) selecting various amino acids in said first active domain. Generating a first residue substituted polypeptide by replacing the first amino acid residue with a scanning amino acid. Here, a scanning amino acid is an amino acid used to identify an active amino acid in a parent polypeptide. f) contacting the first residue-substituted polypeptide with the first target substance and measuring the interaction between the target substance and the residue-substituted polypeptide. g) scanning at least one second amino acid residue in the first active domain by repeating steps e) and f) using the second amino acid residue in place of the first amino acid residue in step e) Substituting a ninth amino acid to produce at least one second residue substituted polypeptide. h) comparing the difference in activity of the parent polypeptide and each of the first and second residue-substituted polypeptides to the first target substance to confirm the position of the first active amino acid residue in the first active domain; thing. A method including the above steps e) to h).
１標的物質に代えて第２標的物質を用いてステップａ）
〜ｈ）を反復し第２活性ドメインおよび該第２活性ドメ
イン内の少なくとも１つの活性アミノ酸残基を同定する
ことを含む方法。5. The method according to claim 4, further comprising the step of using a second target substance instead of the first target substance.
A) repeating steps h-h) to identify a second active domain and at least one active amino acid residue within said second active domain.
１活性ドメイン内の少なくとも１つの前記活性アミノ酸
残基を種々のアミノ酸で置換するステップを含み、前記
第１標的物質との相互作用は変化するが、前記親ポリペ
プチドの前記第２標的物質との相互作用を維持している
ポリペプチド変異体を生成する方法。6. The method according to claim 5, further comprising the step of replacing at least one of said active amino acid residues in the first active domain with various amino acids, A method of producing a polypeptide variant that varies in action, but retains the interaction of the parent polypeptide with the second target substance.
アミノ酸残基を同定する方法で、 （ａ）該親ポリペプチド内の残基番号Ｎの第１アミノ酸
残基をスキャンニングアミノ酸で置換しＮ−置換ポリペ
プチドを生成すること、ここでスキャンニングアミノ酸
とは親ポリペプチド内の活性アミノ酸を同定するのに用
いられるアミノ酸である、 （ｂ）該第１残基に対し残基番号Ｎ＋１およびＮ−１の
各アミノ酸残基をスキャンニングアミノ酸で置換し各々
Ｎ＋１−およびＮ−１−置換ポリペプチドを生成するこ
と、 （ｃ）該各置換ポリペプチドを標的物質と接触させ該標
的物質と該置換ポリペプチドとの相互作用を測定するこ
と、 （ｄ）親ポリペプチドおよび置換ポリペプチドの該標的
物質に対する活性の差を比較すること、 （ｅ）もし該標的物質と該Ｎ＋１置換ポリペプチドとの
間の該活性差が２倍以上のときは残基番号を増やし、ま
た該標的物質と該Ｎ−１置換ポリペプチドとの該活性差
が２倍以上のときは残基番号を減らしてステップ（ｂ）
〜（ｄ）を反復すること、 以上（ａ）〜（ｅ）を含む方法。7. A method for identifying at least one active amino acid residue in a parent polypeptide, comprising: (a) replacing the first amino acid residue of residue number N in the parent polypeptide with a scanning amino acid; -Generating a substituted polypeptide, wherein the scanning amino acid is the amino acid used to identify the active amino acid in the parent polypeptide; (b) the residue numbers N + 1 and N Replacing each amino acid residue of -1 with a scanning amino acid to produce N + 1- and N-1-substituted polypeptides, respectively; (c) contacting each of said substituted polypeptides with a target substance and substituting said target substance Measuring the interaction with the polypeptide; (d) comparing the difference in activity of the parent polypeptide and the substituted polypeptide to the target substance; (e) if the target When the activity difference between the substance and the N + 1-substituted polypeptide is 2 times or more, the residue number is increased, and when the activity difference between the target substance and the N-1 substituted polypeptide is 2 times or more, Is to reduce the residue number and step (b)
Repeating (d), (d), a method comprising (a) to (e) above.
グアミノ酸の置換を含む少なくとも４個の置換ポリペプ
チドで前記親ポリペプチドに比べ２倍以下の活性差を有
するものが同定されるまでステップ（ｂ）〜（ｄ）を反
復する請求の範囲第７項記載の方法。8. The method according to claim 1, wherein at least four substituted polypeptides containing a scanning amino acid substitution at four consecutive residues are identified as having at least two times the difference in activity relative to said parent polypeptide. The method according to claim 7, wherein b) to (d) are repeated.
ラクチン、α−インターフェロン、γ−インターフェロ
ン、組織プラスミノーゲン活性化因子、IGF−１、TGH−
β１、EGF、CD−４レセプター、TNF、GMCSF、TGF、卵胞
刺激ホルモン、リューテナイジングホルモン、胎盤ラク
トゲン、成長ホルモンレセプター、TGF−β２、インヒ
ビン、TGF−α、スブチリシン（バチルスアミリルクイ
フェイシャンス）、スブチリシン（バチルスリチェニホ
ルミス）、インシュリン、トリプシンおよびウロキナー
ゼからなる群から選択される請求の範囲第１項、第４項
又は第７項記載の方法。9. The method according to claim 9, wherein the parent polypeptide is a growth hormone, prolactin, α-interferon, γ-interferon, tissue plasminogen activator, IGF-1, TGH-
β 1 , EGF, CD-4 receptor, TNF, GMCSF, TGF, follicle-stimulating hormone, lutenizing hormone, placental lactogen, growth hormone receptor, TGF-β 2 , inhibin, TGF-α, subtilisin (Bacillus amylyl quifei) 8. The method according to claim 1, 4 or 7, wherein the method is selected from the group consisting of: shans), subtilisin (Bacillus licheniformis), insulin, trypsin and urokinase.
ト胎盤ラクトゲンおよびヒトプロラクチンからなる群か
ら選択される請求の範囲第９項記載の方法。10. The method of claim 9, wherein said parent polypeptide is selected from the group consisting of human growth hormone, human placental lactogen and human prolactin.
であり、かつ前記類似体がヒト胎盤ラクトゲン、ブタ成
長ホルモンおよびヒトプロラクチンからなる群から選択
される請求の範囲第１項記載の方法。11. The method of claim 1 wherein said parent polypeptide is human growth hormone and said analog is selected from the group consisting of human placental lactogen, porcine growth hormone and human prolactin.
テリックアミノ酸又は中性アミノ酸である請求の範囲第
４項または第７項記載の方法。12. The method according to claim 4, wherein said scanning amino acid is an isosteric amino acid or a neutral amino acid.
ン、セリン、グリシンおよびシスティンからなる群から
選択される中性アミノ酸である請求の範囲第12項記載の
方法。13. The method according to claim 12, wherein said scanning amino acid is a neutral amino acid selected from the group consisting of alanine, serine, glycine and cysteine.
である請求の範囲第13項記載の方法。14. The method according to claim 13, wherein said scanning amino acid is alanine.
かつ前記活性が可溶性ホルモンレセプターを用いたイン
ビトロアッセイで測定される請求の範囲第１項、第４項
または第７項記載の方法。15. The parent polypeptide is a hormone,
8. The method according to claim 1, wherein said activity is measured by an in vitro assay using a soluble hormone receptor.
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