JP3241555B2 - Amplification and detection of target nucleic acid sequences using thermostable enzymes - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は特定の核酸配列の増幅法
およびその増幅法により得られた特定核酸配列のＲＮＡ
コピーまたはＤＮＡコピーから目的とする核酸配列を検
出する方法およびそれらの方法に用いる試薬キットに関
する。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a method for amplifying a specific nucleic acid sequence and RNA of a specific nucleic acid sequence obtained by the amplification method.
The present invention relates to a method for detecting a nucleic acid sequence of interest from a copy or a DNA copy, and a reagent kit used for the method.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ＤＮＡまたはＲＮＡ等の遺伝子の検出に
よる疾病の診断方法が、細菌やウイルス等の検出のため
に開発されている。ある種の検体では、直接検出するの
に充分量の核酸が存在するが、目的遺伝子が非常に少量
であったり、存在比が非常に小さい場合、直接目的遺伝
子を検出することは困難である。従来は細胞培養法や細
菌培養法により目的遺伝子を増すことが行われてきた
が、これらの方法では長時間を要するという欠点があっ
た。2. Description of the Related Art Methods for diagnosing diseases by detecting genes such as DNA or RNA have been developed for detecting bacteria, viruses and the like. In some kinds of specimens, a sufficient amount of nucleic acid exists for direct detection, but it is difficult to directly detect the target gene when the target gene is extremely small or the abundance ratio is very small. Conventionally, the number of target genes has been increased by a cell culture method or a bacterial culture method, but these methods have a drawback that they require a long time.

【０００３】また他の標的核酸増幅法としてポリメラー
ゼ連鎖反応（ＰＣＲ；特公平４−６７９５７号公報）法
が知られている。この方法では、標的核酸の増幅の程度
はサイクル数によって調整される。増幅率は理論的には
２ⁿ （ｎはサイクル数）で求められる。実際に検出可能
量まで標的核酸を増幅するには２５〜３０サイクルが必
要であった。As another method of amplifying a target nucleic acid, a polymerase chain reaction (PCR; Japanese Patent Publication No. 4-67957) is known. In this method, the degree of amplification of the target nucleic acid is adjusted by the number of cycles. The amplification factor is theoretically determined by 2 ⁿ (n is the number of cycles). It took 25 to 30 cycles to actually amplify the target nucleic acid to a detectable amount.

【０００４】さらに、別の核酸増幅法として、複製ＲＮ
Ａベースの増幅系が知られている（特開平２−５８６４
号、特開平２−５００５６５号、特開平２−５０１５３
２号）。これらの方法は、標的核酸から二本鎖ＤＮＡを
合成する際に用いるプライマーに、ＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼのプロモーター配列を含有させることによ
り、二本鎖ＤＮＡ合成に引き続き、合成された二本鎖Ｄ
ＮＡを鋳型とし、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼによっ
て、標的核酸に相当するＲＮＡが合成される。さらに、
合成されたＲＮＡからＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ
によってＤＮＡ／ＲＮＡ鎖が合成され、ＤＮＡ鎖を分離
し一本鎖のＤＮＡを得る。ＤＮＡの分離の方法としては
加熱変性による方法（特開平２−５００５６５号、特開
平２−５０１５３２号）とリボヌクレアーゼＨを用いる
方法（特開平２−５８６４号）が知られている。こうし
て得た一本鎖ＤＮＡとプライマーによって、ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列を含む二本鎖Ｄ
ＮＡ合成を行い、ＲＮＡ転写反応を行う。この方法によ
れば、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにより、一分子の
二本鎖核酸から数十から数千分子のＲＮＡを転写増幅す
ることができ、ＰＣＲ法に比べ１サイクル当たりの増幅
効率が高い。またリボヌクレアーゼＨを用いた場合、Ｐ
ＣＲ法の際必要であった温度サイクルが不要であり、よ
り簡便に増幅が可能である。[0004] Further, as another nucleic acid amplification method, replicated RN
An A-based amplification system is known (JP-A-2-5864).
JP-A-2-500565, JP-A-2-50153
No. 2). In these methods, a primer used for synthesizing double-stranded DNA from a target nucleic acid contains a promoter sequence of a DNA-dependent RNA polymerase, so that the synthesized double-stranded DNA is synthesized following double-stranded DNA synthesis.
Using NA as a template, RNA corresponding to the target nucleic acid is synthesized by a DNA-dependent RNA polymerase. further,
A DNA / RNA strand is synthesized from the synthesized RNA by an RNA-dependent DNA polymerase, and the DNA strand is separated to obtain a single-stranded DNA. As a method for separating DNA, a method using heat denaturation (JP-A-2-500565, JP-A-2-501532) and a method using ribonuclease H (JP-A-2-5864) are known. The single-stranded DNA thus obtained and the primers are used to generate a double-stranded DNA containing a DNA-dependent RNA polymerase promoter sequence.
Perform NA synthesis and perform RNA transcription reaction. According to this method, tens to thousands of molecules of RNA can be transcribed and amplified from one molecule of double-stranded nucleic acid by the DNA-dependent RNA polymerase, and the amplification efficiency per cycle is higher than that of the PCR method. When ribonuclease H is used, P
The temperature cycle required for the CR method is unnecessary, and amplification can be performed more easily.

【０００５】[0005]

【発明が解決しようする課題】複製ＲＮＡベースの増幅
系では増幅効率が高いが、反応系で使用する従来の酵
素、すなわちＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依
存ＲＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
は熱安定性が低いため、増幅反応時の温度を高くするこ
とが出来ず、鋳型となる核酸とプライマー間での非特異
的ハイブリダイゼーションを避けることが出来ず、特異
性の低下が問題となる。また酵素の試薬としての供給
時、保存時に不安定性は大きな問題となり、冷凍保存や
冷蔵保存が必要となる。さらに、リボヌクレアーゼＨを
使用しない増幅法では二本鎖核酸の変性に加熱変性を用
いるが、酵素が不安定であるため加熱のたびに酵素群を
逐次添加する必要がある。本発明の目的は、非特異的ハ
イブリダイゼーションによる特異性の低下、酵素試薬の
供給、保存時の不安定を解決する方法を提供することに
ある。The amplification efficiency of a replication RNA-based amplification system is high, but the conventional enzymes used in the reaction system, ie, RNA-dependent DNA polymerase, DNA-dependent RNA polymerase, and DNA-dependent DNA polymerase have low thermal stability. Since the temperature is low, the temperature at the time of the amplification reaction cannot be increased, non-specific hybridization between the template nucleic acid and the primer cannot be avoided, and a decrease in specificity becomes a problem. In addition, instability during supply and storage of the enzyme as a reagent becomes a serious problem, and requires frozen storage or refrigerated storage. Furthermore, in the amplification method not using ribonuclease H, heat denaturation is used for denaturation of double-stranded nucleic acid. However, since the enzyme is unstable, it is necessary to sequentially add a group of enzymes each time heating is performed. An object of the present invention is to provide a method for solving the instability during nonspecific hybridization, supply of an enzyme reagent, and storage due to nonspecific hybridization.

【０００６】[0006]

【課題を解決するための手段】本発明の一つの態様は、
反応媒体中で実質的に一定の温度で標的核酸配列のコピ
ー数を増加させる方法であって、下記工程を含むことを
特徴とする耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅法で
ある。 工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第
一鋳型ＲＮＡに、第一鋳型の核酸配列（ＲＮＡ）に対し
て十分に相補的な配列およびその５’末端側にプロモー
ター配列を有する第一プライマーをハイブリダイズさ
せ、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長さ
せて、第一鋳型ＲＮＡに相補的な第二鋳型である第一プ
ライマー伸長物（ＤＮＡ）を得る； 工程２：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特
異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨにより、第一
鋳型ＲＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二
鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る； 工程３：一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、第二鋳型の核酸配
列（ＤＮＡ）に相補的な核酸配列を有する第二プライマ
ーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相補的な第二
プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このようにして標的
核酸配列の上流に機能可能なプロモーター配列を有する
二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （ここで第一プライマーまたは第二プライマーの核酸配
列は標的核酸配列に対して十分に相補的または相同的で
あり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プ
ライマーの３’末端に向けられる） 工程４：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列（第一鋳型ＲＮ
Ａ）と相補的な配列をもつ一本鎖の第三鋳型ＲＮＡを生
成させる； 工程５：一本鎖の第三鋳型ＲＮＡに、前記第二プライマ
ーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長させて、第三鋳型ＲＮＡに相補的な
第四鋳型である第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得
る； 工程６：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特
異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨにより、第三
鋳型ＲＮＡから第四鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二
鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る； 工程７：一本鎖の第四鋳型ＤＮＡに、前記第一プライマ
ーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長し、第四鋳型ＤＮＡに相補的な第一
プライマー伸長物（ＤＮＡ）および前記第一プライマー
のプロモーター配列に相補的な第四鋳型ＤＮＡ伸長物を
得、このようにして標的核酸配列の上流に機能可能なプ
ロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ
る； （ここで第一プライマーまたは第二プライマーの核酸配
列は標的核酸配列に対して十分に相補的または相同的で
あり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プ
ライマーの３’末端に向けられる） 工程８：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列（第一鋳型ＲＮ
Ａ）と相補的な配列を有する一本鎖の第三鋳型ＲＮＡの
コピーを増加させる；そして、 工程９：必要により前記ＲＮＡコピーを用いて前記工程
５から工程８を必要な回数繰り返す。SUMMARY OF THE INVENTION One aspect of the present invention provides
A method for increasing the copy number of a target nucleic acid sequence at a substantially constant temperature in a reaction medium, comprising the following steps: a method for amplifying a target nucleic acid sequence using a thermostable enzyme. Step 1: The single-stranded first template RNA obtained by denaturing the target nucleic acid as necessary has a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence (RNA) of the first template and a promoter sequence at the 5 ′ end thereof The first primer is hybridized and extended with a thermostable RNA-dependent DNA polymerase to obtain a first primer extension (DNA) that is a second template complementary to the first template RNA; Step 2: RNA / DNA hybrid Step 3: Separating the second template DNA from the first template RNA to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA) by a thermostable ribonuclease H that specifically decomposes only the RNA of step 3; A second primer having a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence (DNA) of the second template is hybridized to the two template DNA, and the resulting DNA is subjected to heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase. To obtain a second primer extension (DNA) complementary to the second template DNA, thus producing a double-stranded DNA intermediate having a functionally operable promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence; (Where the nucleic acid sequence of the first or second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 'end of the first primer is the 3' end of the second primer on the complementary strand Step 4: The target nucleic acid sequence (first template RN) is converted from the double-stranded DNA intermediate using a heat-resistant DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence.
A) generating a single-stranded third template RNA having a sequence complementary to A); Step 5: hybridizing the second primer to the single-stranded third template RNA, and using a heat-resistant RNA-dependent DNA polymerase Elongation to obtain a second primer extension (DNA), which is a fourth template complementary to the third template RNA; Step 6: With heat-resistant ribonuclease H, which specifically degrades only RNA of the RNA / DNA hybrid, Separating the fourth template DNA from the third template RNA to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA); Step 7: allowing the first primer to hybridize to the single-stranded fourth template DNA, First primer extension (DNA) that is extended by a sex DNA-dependent DNA polymerase and is complementary to the fourth template DNA and complementary to the promoter sequence of the first primer Obtaining a fourth template DNA extension, thus producing a double-stranded DNA intermediate having a functional promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence; wherein the nucleic acid sequence of the first or second primer is Is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, the 3 'end of the first primer is directed to the 3' end of the second primer on the complementary strand) Step 8: Recognizing the promoter sequence The target nucleic acid sequence (first template RN) from the double-stranded DNA intermediate using a heat-resistant DNA-dependent RNA polymerase capable of
A) increasing the copy of the single-stranded third template RNA having a sequence complementary to A); and step 9: repeating steps 5 to 8 as many times as necessary using the RNA copy.

【０００７】また本発明のもう一つの態様は、反応媒体
中で標的核酸配列のコピー数を増加させる方法であっ
て、下記工程を含むことを特徴とする耐熱性酵素を用い
る標的核酸配列の増幅法である。 工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第
一鋳型ＤＮＡに、第一鋳型の核酸配列に対して十分に相
補的な配列およびその５’末端側にプロモーター配列を
有する第一プライマーをハイブリダイズさせ、耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、第一鋳型Ｄ
ＮＡに相補的な第二鋳型である第一プライマー伸長物
（ＤＮＡ）を得る； 工程２：第一鋳型ＤＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して
一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る； 工程３；一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、第二鋳型の核酸配
列（ＤＮＡ）に相補的な核酸配列（ＤＮＡ）を有する第
二プライマーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存
ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相
補的な第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このよう
にして標的核酸配列の上流に機能可能なプロモーター配
列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （ここで第一プライマーまたは第二プライマーの核酸配
列は標的核酸配列に対して十分に相補的または相同的で
あり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プ
ライマーの３’末端に向けられる） 工程４：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列（第一鋳型ＤＮ
Ａ）と相補的な配列を有する一本鎖の第三鋳型ＲＮＡの
コピーを増加させる； 工程５：一本鎖の第三鋳型ＲＮＡに、前記第二プライマ
ーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長させて、第三鋳型ＲＮＡに相補的な
第四鋳型である第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得
る； 工程６：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特
異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨにより、第三
鋳型ＲＮＡから第四鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第四
鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る； 工程７：一本鎖の第四鋳型ＤＮＡに、第一プライマーを
ハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラ
ーゼにより伸長し、第四鋳型ＤＮＡに相補的な第一プラ
イマー伸長物（ＤＮＡ）および前記第一プライマーのプ
ロモーター配列に相補的な第四鋳型ＤＮＡ伸長物を得、
このようにして標的核酸配列の上流に機能可能なプロモ
ーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる； （ここで第一プライマーまたは第二プライマーの核酸配
列は標的核酸配列に対して十分に相補的または相同的で
あり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プ
ライマーの３’末端に向けられる） 工程８：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列と相補的な配列
を有する一本鎖の第三鋳型ＲＮＡのコピーを増加させ
る；そして、 工程９：必要により前記ＲＮＡコピーを用いて前記工程
５から工程８を必要な回数繰り返す。[0007] Another aspect of the present invention is a method for increasing the copy number of a target nucleic acid sequence in a reaction medium, comprising the following steps: Amplification of a target nucleic acid sequence using a thermostable enzyme. Is the law. Step 1: a first primer having a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence of the first template and a promoter sequence at the 5′-terminal side of the single-stranded first template DNA obtained by denaturing the target nucleic acid as necessary And heat resistance D
Extended by NA-dependent DNA polymerase, the first template D
Obtain a first primer extension (DNA) that is a second template complementary to NA; Step 2: separating the second template DNA from the first template DNA to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA) Step 3: a second primer having a nucleic acid sequence (DNA) complementary to the nucleic acid sequence (DNA) of the second template is hybridized to the single-stranded second template DNA, and is extended by a heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase. And obtaining a second primer extension (DNA) complementary to the second template DNA, thus producing a double-stranded DNA intermediate having a functionally operable promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence; The nucleic acid sequence of the first primer or the second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 ′ end of the first primer is located at the 3 ′ end of the second primer on the complementary strand. Vignetting are) Step 4: using a thermostable DNA-dependent RNA polymerase which can recognize said promoter sequence, wherein said target nucleic acid sequence from a double-stranded DNA intermediate (first mold DN
A) increasing the copy of the single-stranded third template RNA having a sequence complementary to A); Step 5: hybridizing the second primer to the single-stranded third template RNA to obtain a thermostable RNA-dependent DNA Extending with a polymerase to obtain a second primer extension (DNA) that is a fourth template complementary to the third template RNA; Step 6: heat-resistant ribonuclease H that specifically degrades only RNA of RNA / DNA hybrid Separating the fourth template DNA from the third template RNA to obtain a single-stranded fourth template nucleic acid (DNA); Step 7: allowing the first primer to hybridize to the single-stranded fourth template DNA, The first primer extension (DNA), which is extended by a thermostable DNA-dependent DNA polymerase and is complementary to the fourth template DNA, and the promoter sequence of the first primer The resulting complement specific fourth template DNA elongation product,
This produces a double-stranded DNA intermediate having a functional promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence; wherein the nucleic acid sequence of the first or second primer is sufficiently complementary to the target nucleic acid sequence. The 3 ′ end of the first primer is directed to the 3 ′ end of the second primer on the complementary strand) Step 8: Using a heat-resistant DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence Using the RNA copy to increase the copy of the single-stranded third template RNA having a sequence complementary to the target nucleic acid sequence from the double-stranded DNA intermediate; and Steps 5 to 8 are repeated as many times as necessary.

【０００８】さらに本発明のもう一つの態様は、上記増
幅法による増幅産物である一本鎖ＲＮＡ、二重鎖ＤＮＡ
またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに、必要により変性
処理を行った後、標識プローブをハイブリダイズさせ、
ハイブリダイズした標識プローブの標識またはハイブリ
ダイズしない標識プローブの標識を検出することを特徴
とする標的核酸配列の検出法である。[0008] Still another embodiment of the present invention relates to a single-stranded RNA or a double-stranded DNA which is an amplification product obtained by the above-described amplification method.
Alternatively, after performing a denaturation treatment on the DNA / RNA hybrid if necessary, the labeled probe is hybridized,
A method for detecting a target nucleic acid sequence, comprising detecting a label of a hybridized labeled probe or a label of a non-hybridized labeled probe.

【０００９】本発明のさらに別の態様は、特定の核酸配
列を増幅するためのキットである。かかるキットの一つ
の態様は、特定の核酸配列を増幅するためのキットであ
って（ａ）第一鋳型の核酸配列に対して十分に相補的な
配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有する
第一プライマー、（ｂ）第二鋳型の核酸配列に対して相
補的な核酸配列を有する第二プライマー、（ｃ）耐熱性
リボヌクレアーゼＨ、（ｄ）耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼ、（ｅ）耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラー
ゼ、（ｆ）耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、
（ｇ）リボヌクレオシドトリホスフェートおよび（ｈ）
デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを含み、
ただし、第一プライマーまたは第二プライマーの核酸配
列は標的核酸配列に対して十分に相補的または相同的で
あり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プ
ライマーの３’末端に向けられるキットである。[0009] Still another embodiment of the present invention is a kit for amplifying a specific nucleic acid sequence. One embodiment of such a kit is a kit for amplifying a specific nucleic acid sequence, which has (a) a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence of the first template and a promoter sequence at the 5 'end thereof. A first primer, (b) a second primer having a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template, (c) thermostable ribonuclease H, (d) thermostable RNA-dependent DNA polymerase, (e) thermostable DNA-dependent RNA polymerase, (f) thermostable DNA-dependent DNA polymerase,
(G) ribonucleoside triphosphate and (h)
And deoxyribonucleoside triphosphate,
However, the nucleic acid sequence of the first primer or the second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 ′ end of the first primer is located at the 3 ′ end of the second primer on the complementary strand. It is a kit aimed at.

【００１０】また該キットのもう一つ別の態様は、特定
の核酸配列を増幅するためのキットであって、（ａ）第
一鋳型の核酸配列に対して十分に相補的な配列およびそ
の５’末端側にプロモーター配列を有する第一プライマ
ー、（ｂ）第二鋳型の核酸配列に対して相補的な核酸配
列を有する第二プライマー、（ｃ）耐熱性リボヌクレア
ーゼＨ、（ｄ）耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、
（ｅ）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する耐熱
性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、（ｆ）リボヌクレオ
シドトリホスフェートおよび（ｇ）デオキシリボヌクレ
オシドトリホスフェートとを含み、ただし、第一プライ
マーまたは第二プライマーの核酸配列は標的核酸配列に
対して十分に相補的又は相同的であり、第一プライマー
の３’末端は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に
向けられるキットである。Another embodiment of the kit is a kit for amplifying a specific nucleic acid sequence, which comprises: (a) a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence of the first template; 'A first primer having a promoter sequence on the terminal side, (b) a second primer having a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template, (c) thermostable ribonuclease H, (d) thermostable DNA-dependent RNA polymerase,
(E) a thermostable DNA-dependent DNA polymerase having an RNA-dependent DNA polymerase activity, (f) ribonucleoside triphosphate and (g) deoxyribonucleoside triphosphate, provided that the nucleic acid sequence of the first primer or the second primer is a target. A kit that is sufficiently complementary or homologous to a nucleic acid sequence with the 3 'end of the first primer directed to the 3' end of the second primer on the complementary strand.

【００１１】さらに、キットのもう一つ別の態様は、特
定の核酸配列を増幅するためのキットであって、（ａ）
第一鋳型の核酸配列に対して十分に相補的な配列および
その５’末端側にプロモーター配列を有する第一プライ
マー、（ｂ）第二鋳型の核酸配列に対して相補的な核酸
配列を有する第二プライマー、（ｃ）耐熱性ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼ、（ｄ）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラ
ーゼ活性及びリボヌクレアーゼＨ活性を有する耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、（ｅ）リボヌクレオシド
トリホスフェートおよび（ｆ）デオキシリボヌクレオシ
ドトリホスフェートとを含み、ただし、第一プライマー
または第二プライマーの核酸配列は標的核酸配列に対し
て十分に相補的または相同的であり、第一プライマーの
３’末端は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向
けられるキットである。[0011] Further, another embodiment of the kit is a kit for amplifying a specific nucleic acid sequence, comprising:
A first primer having a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence of the first template and a promoter sequence at the 5 ′ end thereof, and (b) a first primer having a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template. Two primers, (c) thermostable DNA-dependent RNA polymerase, (d) thermostable D having RNA-dependent DNA polymerase activity and ribonuclease H activity
NA-dependent DNA polymerase, (e) ribonucleoside triphosphate and (f) deoxyribonucleoside triphosphate, provided that the nucleic acid sequence of the first or second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence. Wherein the 3 'end of the first primer is directed to the 3' end of the second primer on the complementary strand.

【００１２】該キットのさらに別の態様は、特定の核酸
配列を増幅するためのキットであって、（ａ）第一鋳型
の核酸配列に対して十分に相補的な配列およびその５’
末端側にプロモーター配列を有する第一プライマー、
（ｂ）第二鋳型の核酸配列に対して相補的な核酸配列お
よびその５’末端側にプロモーター配列を有する第二プ
ライマー、（ｃ）耐熱性リボヌクレアーゼＨ、（ｄ）耐
熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、（ｅ）耐熱性ＤＮ
Ａ依存ＲＮＡポリメラーゼ、（ｆ）耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、（ｇ）リボヌクレオシドトリホスフ
ェートおよび（ｈ）デオキシリボヌクレオシドトリホス
フェートとを含み、ただし、第一プライマーまたは第二
プライマーの核酸配列は標的核酸配列に対して十分に相
補的または相同的であり、第一プライマーの３’末端は
相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられるキ
ットである。Still another embodiment of the kit is a kit for amplifying a specific nucleic acid sequence, which comprises: (a) a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence of the first template and its 5 ′
A first primer having a promoter sequence on the terminal side,
(B) a second primer having a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template and a promoter sequence at the 5 ′ end thereof, (c) thermostable ribonuclease H, (d) thermostable RNA-dependent DNA polymerase, (E) Heat resistant DN
A-dependent RNA polymerase, (f) thermostable DNA-dependent D
NA polymerase, (g) ribonucleoside triphosphate and (h) deoxyribonucleoside triphosphate, provided that the nucleic acid sequence of the first or second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence. A kit in which the 3 'end of the first primer is directed to the 3' end of the second primer on the complementary strand.

【００１３】さらにまた、該キットの別の態様は、特定
の核酸配列を増幅するためのキットであって、（ａ）第
一鋳型の核酸配列に対して十分に相補的な配列およびそ
の５’末端側にプロモーター配列を有する第一プライマ
ー、（ｂ）第二鋳型の核酸配列に対して相補的な核酸配
列およびその５’末端側にプロモーター配列を有する第
二プライマー、（ｃ）耐熱性リボヌクレアーゼＨ、
（ｄ）耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、（ｅ）Ｒ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼＨ活性を有する耐熱性ＤＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ、（ｆ）リボヌクレオシドト
リホスフェートおよび（ｇ）デオキシリボヌクレオシド
トリホスフェートとを含み、ただし、第一プライマーま
たは第二プライマーの配列は標的核酸配列に対して十分
に相補的または相同的であり、第一プライマーの３’末
端は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられ
るキットである。Still another embodiment of the kit is a kit for amplifying a specific nucleic acid sequence, which comprises: (a) a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence of the first template and 5 ′ thereof. A first primer having a promoter sequence on the terminal side, (b) a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template and a second primer having a promoter sequence on the 5′-terminal side thereof, and (c) a thermostable ribonuclease H ,
(D) thermostable DNA-dependent RNA polymerase, (e) R
Thermostable DN having NA-dependent DNA polymerase H activity
A-dependent DNA polymerase, (f) ribonucleoside triphosphate and (g) deoxyribonucleoside triphosphate, provided that the sequence of the first or second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence. Yes, a kit in which the 3 'end of the first primer is directed to the 3' end of the second primer on the complementary strand.

【００１４】本発明のキットのもう一つ別の態様は、特
定の核酸配列を増幅するためのキットであって、（ａ）
第一鋳型の核酸配列に対して十分に相補的な配列および
その５’末端側にプロモーター配列を有する第一プライ
マー、（ｂ）第二鋳型の核酸配列に対して相補的な核酸
配列およびその５’末端側にプロモーター配列を有する
第二プライマー、（ｃ）耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメ
ラーゼ、（ｄ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性お
よびリヌクレアーゼＨ活性を有する耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼ、（ｅ）リボヌクレオシドトリホスフ
ェートおよび（ｆ）デオキシリボヌクレオシドトリホス
フェートとを含み、ただし、第一プライマーまたは第二
プライマーの配列は標的核酸配列に対して十分に相補的
または相同的であり、第一プライマーの３’末端は相補
的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられるキット
である。[0014] Another embodiment of the kit of the present invention is a kit for amplifying a specific nucleic acid sequence, comprising:
A first primer having a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence of the first template and a promoter sequence at the 5 'end thereof, and (b) a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template and its 5 'A second primer having a promoter sequence on the terminal side, (c) a thermostable DNA-dependent RNA polymerase, (d) a thermostable DNA-dependent D having RNA-dependent DNA polymerase activity and nuclease H activity
NA polymerase, (e) ribonucleoside triphosphate and (f) deoxyribonucleoside triphosphate, provided that the sequence of the first or second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence; The 3 'end of the first primer is a kit directed to the 3' end of the second primer on the complementary strand.

【００１５】本発明の標的核酸はＤＮＡであってもＲＮ
Ａであってもよい。二本鎖の場合や一本鎖であっても高
次構造をとっているような場合は、予め加熱、酸、アル
カリ等の変性処理により一本鎖として増幅反応に供す
る。また、標的核酸がＤＮＡである場合、従来公知の方
法により、ＲＮＡに変換してから本発明の増幅法を実施
してもよい。The target nucleic acid of the present invention may be DNA or RN.
A may be used. In the case of a double-stranded structure or a single-stranded structure having a higher-order structure, it is subjected to an amplification reaction in advance as a single-stranded structure by heating, denaturing treatment with an acid, an alkali, or the like. When the target nucleic acid is DNA, the amplification method of the present invention may be carried out after conversion into RNA by a conventionally known method.

【００１６】本発明において使用する第一プライマー
は、標的核酸配列である第一鋳型の核酸配列に対して十
分に相補的な核酸配列およびその５’末端側にプロモー
ター配列を有する。第一プライマーの３’末端は相補的
鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられる。また、
本発明における第二プライマーは第二鋳型の核酸配列に
対して相補的な核酸配列を有し、標的核酸配列に対して
十分に相同である。第二プライマーは第二鋳型の核酸配
列に対して相補的な核酸配列に加えて必要によりその
５’末端側にプロモーター配列を有していてもよい。第
二プライマーにプロモーター配列を有している場合、こ
の第一プライマー、第二プライマーのプロモーターはそ
れぞれ異なっていても同一であってもよい。異なる場合
はそれぞれのプロモーターに作用する耐熱性ＤＮＡ依存
ＲＮＡポリメラーゼを必要により複数種用いる。プロモ
ーターの種類によっては一種の耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡ
ポリメラーゼにより２種のプロモーターともに機能する
ように選択することも可能である。第一プライマー、第
二プライマー共にプロモーター機能を持たせることで増
幅効率をより高めることが可能である。The first primer used in the present invention has a nucleic acid sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence of the first template, which is the target nucleic acid sequence, and a promoter sequence at the 5 'end thereof. The 3 'end of the first primer is directed to the 3' end of the second primer on the complementary strand. Also,
The second primer in the present invention has a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template, and is sufficiently homologous to the target nucleic acid sequence. The second primer may have a promoter sequence at its 5 'end if necessary in addition to the nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template. When the second primer has a promoter sequence, the promoters of the first primer and the second primer may be different or the same. If different, a plurality of heat-resistant DNA-dependent RNA polymerases acting on respective promoters are used if necessary. A type of thermostable DNA-dependent RNA depending on the type of promoter
It is also possible to select such that the two types of promoters function together by a polymerase. Amplification efficiency can be further improved by providing both the first primer and the second primer with a promoter function.

【００１７】プロモーター配列の設定は増幅しようとす
る標的核酸により多様性があり、特異性が高い状態で増
幅を行う場合、プライマーのＴｍを５０〜７０℃に設定
するのが好ましい。これ以下の温度で増幅を行う場合、
プライマーの配列を充分吟味して特異性を維持する必要
があり、増幅しようとする核酸配列が自由に選択できな
くなってしまう。The setting of the promoter sequence varies depending on the target nucleic acid to be amplified, and when performing amplification in a state of high specificity, it is preferable to set the Tm of the primer to 50 to 70 ° C. When performing amplification at temperatures below this,
It is necessary to carefully examine the primer sequence to maintain the specificity, and the nucleic acid sequence to be amplified cannot be freely selected.

【００１８】本発明に用いるプロモーター配列は特に制
限はないが、耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが作
用するように機能する配列である必要がある。このよう
なプロモーター配列としては、例えばサーマス サーモ
フィルス(Thermus thermphilus) のＤＮＡ依存ＲＮＡポ
リメラーゼならば、 5'-CTTGACAAAAAGGAGGGGGATTGATTGATAGCAT-3' 5'-TTCGCGCCCATCGTACACCGAGGCGGTATCCTC-3' 5'-CTTGACGGAGGCGGACGGCGCTGGTACACT-3' 5'-CTGGACAGGGCCCCCGTGTCCCGCTATCCT-3' 5'-CTAGCCTCAGGGCTTCCATGGGTGCTATACT-3' 5'-CTTGACCCCGCAGGCCTCGAGGGCTTACCT-3' が知られている。一般的にプロモーター配列にはその後
に続く複製開始点までのスペーサー配列が存在してい
る。例えば CTTGACAAAAAGGAGGGGGATTGATAGCAT ならばその後に続く GGCTTT が知られている。これらの複製開始点までのスペーサー
配列、さらには複製を開始する部分の配列を合わせてプ
ロモーターと考えることもでき、事実、この配列を含む
場合の方が転写複製の効率が高いことも知られている。
したがって、この配列部分を含む形でプロモーター付き
プライマーを設計することで転写増幅の効率を上げるこ
とができる。本発明ではこの複製開始点までのスペーサ
ー配列を含んだ配列をプライマーの5'末端側に結合した
プライマーでも増幅が可能である。The promoter sequence used in the present invention is not particularly limited, but must be a sequence that functions so that a thermostable DNA-dependent RNA polymerase acts. Examples of such a promoter sequence include, for example, the DNA-dependent RNA polymerase of Thermus thermophilus (Thermus thermphilus); 3 '5'-CTAGCCTCAGGGCTTCCATGGGTGCTATACT-3'5'-CTTGACCCCGCAGGCCTCGAGGGCTTACCT-3'is known. Generally, the promoter sequence has a spacer sequence extending to the replication origin that follows. For example, in the case of CTTGACAAAAAGGAGGGGGATTGATAGCAT, the following GGCTTT is known. It is also possible to consider the spacer sequence up to these replication origins, and further the sequence of the part that initiates replication, as a promoter.In fact, it is also known that the efficiency of transcription and replication is higher when this sequence is included. I have.
Therefore, the efficiency of transcription amplification can be increased by designing a primer with a promoter containing this sequence portion. In the present invention, amplification can be performed even with a primer in which a sequence containing a spacer sequence up to the replication start point is linked to the 5 'end of the primer.

【００１９】プロモーター配列としては、その他に以下
のものがある。 5'-CTTGACGCCGCCCAGGGCGGGCCTCTACCCT-3' 5'-TTTGAGGGCCTGGGGCAGTACCTCTTCT-3' 5'-TTTGTAAAGTGCTTTATTTCACAAAACT-3' 5'-TTTCACAAAACTGTCCCTCCCCCCGGGTTAGACT-3' 5'-TTGACACTCTCGGGCGGGTGTGCTAGCCT-3' 5'-CTTGAGGATCTCGGGGAGGCGGGCTTCCAT-3' 5'-TTGGGGTGGAGGAGCTTCTGCCGTAGAAT-3' 5'-CTTGACAAAAAGGAGGGGGATTGATAGCAT-3' 5'-CGTGAGGGCCACGGCGAGCGCGCCTAGGGGT-3' 5'-CTAGTCCAAGGGAAAGTATAGCCCAAGGTACACT-3' 5'-CTTGACGTGAAACTTGAAGACCACCATCTCAA-3' 5'-TTCGCGCCCATCGTACACCGAGGCGGTATCCTC-3' 5'-CTTGACGGAGGCGGACGGCGCTGGTACACT-3' 5'-CTGGACAGGGCCCCCGTGTCCCGCTATCCT-3' 5'-CTAGCCTCAGGGCTTCCATGGGTGCTATACT-3' 5'-CTTGACAAAaaggagggggattgatagcat-3' 5'-CTTGACCCCGCAGGCCTCGAGGGCTTACCT-3' 5'-CTTGACACCGCAGGCCTAGAGGGCTTACCT-3' 5'-CTTGACACCGCAGGCCTCGAGGGCTATCCT-3' 5'-CTTGACACCGCGGGCCTCGAGGGCTATAAT-3' 5'-CTGGACACCGCAGGCCTCGAGGGCTATCCT-3' 5'-CTTGACACCCCAGGCCTCGAGGGGTATCCT-3' 5'-GTTTACAAAATCCCCGCCCCCGTCCTAGCCT-3' 5'-CTTGCCAATCCGCCCCTTAGAGTGTACCATAGCGA-3' 5'-GTTGACCATCTTCCTCCTTGGCCTTATCCT-3' 5'-GTTGACGGGACGGGGAGGAGGGCCTATCCT-3' 5'-CTTGTCAAGTAAGCTTAGCTATGGTAACAT-3' 5'-CTTGACGGGGAGGAGGCAACGGGGTAAAAC-3'Other promoter sequences include the following. 5'-CTTGACGCCGCCCAGGGCGGGCCTCTACCCT-3 '5'-TTTGAGGGCCTGGGGCAGTACCTCTTCT-3'5'-TTTGTAAAGTGCTTTATTTCACAAAACT-3'5'-TTTCACAAAACTGTCCCTCCCCCCGGGTTAGACT-3'5'-3'-CTTGACAAAAAGGAGGGGGATTGATAGCAT-3'5'-CGTGAGGGCCACGGCGAGCGCGCCTAGGGGT-3'5'-CTAGTCCAAGGGAAAGTATAGCCCAAGGTACACT-3'5'-CTTGACGTGAAACTTGAAGACCACCATCATCAA-3'5'-TTCGCGCCCATCGCCTCGGCCTCGGCCTCCGCCTGCCTCTCGGCCTGCCTCGGCCTCCGCCTCGGCCTCGGCCTCCCGGCCTGCCTCGGCTCC -CTAGCCTCAGGGCTTCCATGGGTGCTATACT-3 '5'-CTTGACAAAaaggagggggattgatagcat-3'5'-CTTGACCCCGCAGGCCTCGAGGGCTTACCT-3'5'-CTTGACACCGCAGGCCTAGAGGGCTTACCT-3'5'-CTTGACACCGCAGGCCTCGAGGGCTATCCTGGCT-GGCTGATC-GGCTGATCCTGGCTCTGGCTCTGGCTCTGGCTCTGGCTCTGGCTCTGGCTCTGGCTCTGG-3CT CTTGACACCCCAGGCCTCGAGGGGTATCCT-3 '5'-GTTTACAAAATCCCCGCCCCCGTCCTAGCCT-3'5'-CTTGCCAATCCGCCCCTTAGAGTGTACCATAGCGA-3'5'-GTTGACCATCTTCCTCCTTGGCCTTATCCT-3'5'-GTTGACGGGACGGGTAGCTGACTCTCTCT TATGGTAACAT-3 '5'-CTTGACGGGGAGGAGGCAACGGGGTAAAAC-3'

【００２０】一般にファージのプロモーターは特異性が
高いが、その他の生物のプロモーターは必ずしも特異性
が高いとは言えない場合がある。ここで言う特異性の高
さとは、プロモーターに依存するＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼが作用できるプロモーター配列が、そのＤＮＡ
依存ＲＮＡポリメラーゼには一種または複数あっても非
常に少ないこと、またプロモーターとしての活性が非常
に低いことを言う。したがって、検出しようとする試料
核酸中に各種プロモーターが存在していても実質上問題
なく特異的にプロモーターに依存するＤＮＡ依存性ＲＮ
Ａポリメラーゼが作用できることを示す。In general, phage promoters have high specificity, but promoters of other organisms may not always be high in specificity. The term “high specificity” as used herein means that a promoter sequence capable of acting on a promoter-dependent DNA-dependent RNA polymerase has its DNA
It means that one or more dependent RNA polymerases are very low and that the activity as a promoter is very low. Therefore, even if various promoters are present in the sample nucleic acid to be detected, the DNA-dependent RN which specifically depends on the promoters without any problem.
A shows that A polymerase can act.

【００２１】一方、細菌その他の生物ではＤＮＡ依存Ｒ
ＮＡポリメラーゼが作用するプロモーター配列は必ずし
も一種類ではなく、複数種のプロモーター配列が存在す
ることが知られている。細菌や真菌類では共通性の高い
ものも存在する。したがって、検出しようとする試料核
酸中にも用いるＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼが作用す
るプロモーター配列が存在する可能性も考えられる。On the other hand, in bacteria and other organisms, DNA-dependent R
It is known that there is not always one type of promoter sequence on which NA polymerase acts, and there are a plurality of types of promoter sequences. Some bacteria and fungi have high commonality. Therefore, it is conceivable that the sample nucleic acid to be detected may contain a promoter sequence on which the DNA-dependent RNA polymerase to be used acts.

【００２２】本発明ではこのような点も考慮して検討を
進めた結果、耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの作
用可能な５０〜７０℃で反応することにより、非特異的
なプロモーター機能が発現されないため特異性の高い増
幅および検出が可能である。なお、本発明における標的
核酸配列の上流に機能可能なプロモーター配列を有する
二本鎖ＤＮＡ中間体とは、工程３または工程７における
二本鎖ＤＮＡ中間体（図１または図３）を意味し、耐熱
性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼの作用により、ＤＮＡ
を鋳型としてＲＮＡの合成を開始する機能を有するもの
である。該プロモーターが機能して生成するＲＮＡは、
標的ＲＮＡと相補的な配列を有する。In the present invention, as a result of studying in consideration of such points, the reaction at 50 to 70 ° C. at which a heat-resistant DNA-dependent RNA polymerase can act does not result in the expression of a non-specific promoter function. Highly specific amplification and detection are possible. In the present invention, the double-stranded DNA intermediate having a promoter sequence operable upstream of the target nucleic acid sequence means the double-stranded DNA intermediate (FIG. 1 or FIG. 3) in step 3 or step 7, By the action of thermostable DNA-dependent RNA polymerase, DNA
Has a function of initiating the synthesis of RNA using as a template. RNA produced by the function of the promoter is:
It has a sequence complementary to the target RNA.

【００２３】本発明にいう耐熱性酵素とは、ハイブリダ
イゼーションを特異的に行うために５０〜７０℃で酵素
反応が実施可能であり、核酸の加熱変性を行う９０〜９
５℃、１０秒〜１０分程度でも失活の少ない酵素をい
う。またこのような酵素は一般的に冷蔵保存、室温保存
でも十分安定であり、冷凍保存の必要がない場合が多
く、供給時、保存時の安定性もよい。The term “thermostable enzyme” as used in the present invention means that an enzyme reaction can be carried out at 50 to 70 ° C. in order to specifically carry out hybridization, and 90 to 9 wherein heat denaturation of nucleic acid is carried out.
It refers to an enzyme with little deactivation even at 5 ° C. for about 10 seconds to 10 minutes. In addition, such enzymes are generally sufficiently stable even under refrigerated storage or room temperature storage, and in many cases, there is no need for frozen storage, and the stability during supply and storage is also good.

【００２４】耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（耐
熱性逆転写酵素とも呼ぶ）としては、サーマス・サーモ
フィルス(Thermus thermophilus)、サーマス・アクアテ
ィカス(Thermus aquaticus) 由来のＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼに該活性があることが知られている。耐熱性
ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ（耐熱性ＲＮＡポリメラ
ーゼとも呼ぶ）としては、サーマス・サーモフィルス(T
hermus thermophilus)由来の酵素などが挙げられる。該
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼはプロモーター配
列を認識することができる。As the thermostable RNA-dependent DNA polymerase (also referred to as thermostable reverse transcriptase), the DNA-dependent DNA polymerase derived from Thermus thermophilus or Thermus aquaticus has the activity. It has been known. Examples of the thermostable DNA-dependent RNA polymerase (also referred to as thermostable RNA polymerase) include Thermos thermophilus (T.
hermus thermophilus). The thermostable DNA-dependent RNA polymerase can recognize a promoter sequence.

【００２５】耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（耐
熱性ＤＮＡポリメラーゼとも呼ぶ）としては、サーマス
・サーモフィルス(Thermus thermophilus)、サーマス・
アクアティカス(Thermus aquaticus) 、ピロコッカス・
フリオサス(Pyrococcus furiosus) 、サーモコッカス・
リトラリス(Thermococcus litorakis)、サーマス・フラ
ビス(Thermus flavus)由来のものなどが挙げられる。耐
熱性リボヌクレアーゼＨとしては、サーマス サーモフ
ィルス(Thermus therophilus) 由来の酵素などがあげら
れるが、その他の酵素でも本発明の耐熱性に合致するな
らば使用可能である。Examples of the thermostable DNA-dependent DNA polymerase (also referred to as thermostable DNA polymerase) include Thermus thermophilus and Thermus thermophilus.
Aquaticus (Thermus aquaticus), Pyrococcus
Phyrococcus furiosus, Thermococcus
And litoralis (Thermococcus litorakis) and those derived from Thermus flavus. Examples of the thermostable ribonuclease H include enzymes derived from Thermus therophilus, and other enzymes can be used as long as they meet the thermostability of the present invention.

【００２６】一般にＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼには
ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性が存在すること、ま
たサーマス・サーモフィルス由来、サーマス・アクアテ
ィカス由来のＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにはＲＮＡ
依存ＤＮＡポリメラーゼ活性が存在することが知られて
おり、両活性をもつ一種のＤＮＡポリメラーゼを共通に
用いることも可能である。In general, RNA-dependent DNA polymerases have a DNA-dependent DNA polymerase activity, and DNA-dependent DNA polymerases derived from Thermus thermophilus and Thermus aquaticus have RNA-dependent DNA polymerase activities.
It is known that a dependent DNA polymerase activity exists, and it is also possible to use one kind of DNA polymerase having both activities in common.

【００２７】また我々は、サーマス・サーモフィルス由
来の耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼが耐熱性リボ
ヌクレアーゼＨの活性を有することを見い出した（特願
平6-258190号) 。したがってサーマス・サーモフィルス
由来の耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼを使用する
ことにより、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼと耐
熱性リボヌクレアーゼＨに代えて、１種の物質（酵素）
でもって３種の酵素活性を利用することが可能となる。We have also found that a thermostable DNA-dependent DNA polymerase derived from Thermos thermophilus has the activity of thermostable ribonuclease H (Japanese Patent Application No. 6-258190). Therefore, by using a thermostable DNA-dependent DNA polymerase derived from Thermos thermophilus, one substance (enzyme) can be used instead of thermostable RNA-dependent DNA polymerase and thermostable ribonuclease H.
This makes it possible to utilize three types of enzyme activities.

【００２８】本発明に使用する耐熱性酵素としては、耐
熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレ
アーゼＨおよび耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼが
ひとつの酵素であることが好ましい。このような酵素と
しては、下記理化学的性質を有するサーマス・サーモフ
ィルス由来の酵素であることが好ましい。 （１）次の反応を触媒する。 ＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡを合成する。 ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡのみに特異的にかつ
エンド的に作用してＤＮＡ一本鎖を生じさせる。 ＤＮＡを鋳型として、ＤＮＡを合成する。 （２）分子量：８５，０００〜９５，０００ （３）熱安定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の
活性を保持する。 （４）至適ｐＨ：約７．５〜９．３ 上記酵素の製造については、特願平6-258190号に記載さ
れる。例えば好熱性細菌であるサーマス・サーモフィラ
スＨＢ８（ＡＴＣＣ２７６３４）を培養し、該培養物か
ら、上記理化学的性質を有する耐熱性リボヌクレアーゼ
Ｈを採取して得られる。As the thermostable enzyme used in the present invention, thermostable RNA-dependent DNA polymerase, thermostable ribonuclease H and thermostable DNA-dependent DNA polymerase are preferably one enzyme. Such an enzyme is preferably an enzyme derived from Thermos thermophilus having the following physicochemical properties. (1) catalyze the next reaction. DNA is synthesized using RNA as a template. It acts specifically and endogenously only on RNA / DNA double-stranded RNA to produce a DNA single strand. DNA is synthesized using the DNA as a template. (2) Molecular weight: 85,000 to 95,000 (3) Thermal stability: After treatment at 75 ° C. for 2 hours, activity of 50% or more is maintained. (4) Optimum pH: about 7.5 to 9.3 The production of the above enzyme is described in Japanese Patent Application No. 6-258190. For example, it is obtained by culturing Thermos thermophilus HB8 (ATCC 27634) which is a thermophilic bacterium and collecting the thermostable ribonuclease H having the above physicochemical properties from the culture.

【００２９】本発明の方法における工程１では必要によ
り変性処理した単鎖の第一鋳型核酸に、第一プライマー
をハイブリダイズさせ、デオキシリボヌクレオシドトリ
ホスフェートの存在下に、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼおよび／または耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼにより伸長させて、第一鋳型核酸に相補的な第二
鋳型である第一プライマー伸長物を得る。第一プライマ
ー伸長物は、第一鋳型がＲＮＡの場合には、耐熱性ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼ、第一鋳型がＤＮＡの場合に
は、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、標的核酸配
列がＤＮＡおよびＲＮＡを含む場合は、耐熱性ＤＮＡ依
存ＤＮＡポリメラーゼおよび耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼにより伸長させて、ＤＮＡ伸長生成物を得る
（図１、図２、工程１）。In step 1 of the method of the present invention, a first primer is hybridized to a single-stranded first template nucleic acid which has been denatured as required, and a heat-resistant RNA-dependent DNA polymerase and / or a heat-resistant RNA-dependent DNA polymerase are added in the presence of deoxyribonucleoside triphosphate. Alternatively, it is extended by a thermostable DNA-dependent DNA polymerase to obtain a first primer extension product which is a second template complementary to the first template nucleic acid. When the first template is RNA, the first primer extension is heat-resistant RN.
A-dependent DNA polymerase, heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase when the first template is DNA, and heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase and heat-resistant RNA-dependent DNA polymerase when the target nucleic acid sequence contains DNA and RNA. Thus, a DNA extension product is obtained (FIG. 1, FIG. 2, step 1).

【００３０】第一鋳型がＲＮＡの場合、各工程２〜９は
以下のように実施する（図１）。工程２では、ＲＮＡ／
ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特異的に分解する耐
熱性リボヌクレアーゼＨにより、第一鋳型ＲＮＡから第
二鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮ
Ａ）を得る。工程３では、一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、
第二鋳型の核酸配列（ＤＮＡ）に相補的な核酸配列を有
する第二プライマーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮ
Ａに相補的な第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、こ
のようにして標的核酸配列の上流に機能可能なプロモー
ター配列に結合した標的核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ
中間体を生成させる。ここで第一プライマーまた第二プ
ライマーの核酸配列は標的核酸配列に対して十分に相補
的または相同的であり、第一プライマーの３’末端は相
補的鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられる。工
程４では、前記プロモーター配列を認識することができ
る耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記
二本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列（第一鋳型Ｒ
ＮＡ）と相補的な配列をもつ一本鎖の第三鋳型ＲＮＡを
生成させる。工程５では、一本鎖の第三鋳型ＲＮＡに、
前記第二プライマーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＲＮ
Ａ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、第三鋳型
ＲＮＡに相補的な第四鋳型である第二プライマー伸長物
（ＤＮＡ）を得る。工程６では、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブ
リッドのＲＮＡのみを特異的に分解する耐熱性リボヌク
レアーゼＨにより、第三鋳型ＲＮＡから第四鋳型ＤＮＡ
を分離して一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る。工
程７では一本鎖の第四鋳型ＤＮＡに、前記第一プライマ
ーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長し、第四鋳型ＤＮＡに相補的な第一
プライマー伸長物（ＤＮＡ）および前記第一プライマー
のプロモーター配列に相補的な第四鋳型ＤＮＡ伸長物を
得、このようにして上流に機能可能なプロモーター配列
に結合した標的核酸配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を
生成ささせる。ここで第一プライマーまたは第二プライ
マーの核酸配列は標的核酸配列に対して十分に相補的な
または相同的であり、第一プライマーの３’末端は相補
的な鎖上の第二プライマーの３’末端に向けられる。工
程８では前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列（第一鋳型ＲＮ
Ａ）と相補的な配列を有する一本鎖の第三鋳型ＲＮＡの
コピーを増加させる。そして工程９では必要により前記
ＲＮＡコピーを用いて前記工程５から工程８を必要な回
数繰り返す。When the first template is RNA, steps 2 to 9 are performed as follows (FIG. 1). In step 2, RNA /
The second template DNA is separated from the first template RNA by a thermostable ribonuclease H that specifically degrades only the RNA of the DNA hybrid to form a single-stranded second template nucleic acid (DN
Obtain A). In step 3, the single-stranded second template DNA is
A second primer having a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence (DNA) of the second template is hybridized and heat-resistant DN
A-dependent DNA polymerase to extend the second template DN
A second primer extension (DNA) complementary to A is obtained, and thus a double-stranded DNA having a target nucleic acid sequence bound to a functional promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence
Produce an intermediate. Here, the nucleic acid sequence of the first primer or the second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 ′ end of the first primer is located at the 3 ′ end of the second primer on the complementary strand. Pointed. In step 4, the target nucleic acid sequence (first template R) is converted from the double-stranded DNA intermediate using a heat-resistant DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence.
A single-stranded third template RNA having a sequence complementary to NA) is generated. In step 5, the single-stranded third template RNA is
The second primer is hybridized and heat-resistant RN
It is extended by A-dependent DNA polymerase to obtain a second primer extension (DNA) which is a fourth template complementary to the third template RNA. In Step 6, the fourth template DNA is converted from the third template RNA by using a thermostable ribonuclease H that specifically degrades only RNA of the RNA / DNA hybrid.
To obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA). In step 7, the first primer is hybridized to a single-stranded fourth template DNA, extended by a heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase, and a first primer extension product (DNA) complementary to the fourth template DNA and A fourth template DNA extension complementary to the promoter sequence of the first primer is obtained, thus producing a double-stranded DNA intermediate having the target nucleic acid sequence linked to the upstream operable promoter sequence. Here, the nucleic acid sequence of the first primer or the second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 ′ end of the first primer is 3 ′ of the second primer on the complementary strand. Pointed to the end. In step 8, the target nucleic acid sequence (first template RN) is converted from the double-stranded DNA intermediate using a heat-resistant DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence.
The copy of the single-stranded third template RNA having a sequence complementary to A) is increased. In step 9, the above steps 5 to 8 are repeated as necessary by using the RNA copy as necessary.

【００３１】第一鋳型がＤＮＡの場合、各工程２〜９は
以下のように実施する（図２）。工程２では、第一鋳型
ＤＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二鋳型
核酸（ＤＮＡ）を得る。工程３では、一本鎖の第二鋳型
ＤＮＡに、第二鋳型の核酸配列（ＤＮＡ）に相補的な核
酸配列（ＤＮＡ）を有する第二プライマーをハイブリダ
イズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより
伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相補的な第二プライマー伸長
物（ＤＮＡ）を得、このようにして標的核酸配列の上流
にプロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成
させる。ここで第一プライマーまたは第二プライマーの
核酸配列は標的核酸配列に対して十分に相補的または相
同的であり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の
第二プライマーの３’末端に向けられる。工程４では、
前記プロモーター配列を認識することができる耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二本鎖ＤＮ
Ａ中間体から前記標的核酸配列（第一鋳型）と相補的な
配列をもつ一本鎖の第三鋳型ＲＮＡのコピーを増加させ
る。工程５では、一本鎖の第三鋳型ＲＮＡに、前記第二
プライマーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより伸長させて、第三鋳型ＲＮＡに
相補的な第四鋳型である第二プライマー伸長物（ＤＮ
Ａ）を得る。工程６では、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド
のＲＮＡのみを特異的に分解する耐熱性リボヌクレアー
ゼＨにより、第三鋳型ＲＮＡから第四鋳型ＤＮＡを分離
して一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る。工程７で
は、一本鎖の第四鋳型ＤＮＡに、第一プライマーをハイ
ブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ
により伸長し、第四鋳型ＤＮＡに相補的な第四鋳型ＤＮ
Ａ伸長物を得、このようにして上流に機能可能なプロモ
ーター配列に結合した標的核酸配列を有する二本鎖ＤＮ
Ａ中間体を生成させる。ここで第一プライマーまたは第
二プライマーの核酸配列は標的核酸配列に対して十分に
相補的なまたは相同的であり、第一プライマーの３’末
端は相補的な鎖上の第二プライマーの３’末端に向けら
れる。工程８では、前記プロモーター配列を認識するこ
とができる耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用い
て、前記二本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列（第
一鋳型）と相補的な配列を有する一本鎖の第三鋳型ＲＮ
Ａのコピーを増加させる。そして、工程９では必要によ
り前記ＲＮＡコピーを用いて前記工程５から工程８を必
要な回数繰り返す。When the first template is DNA, steps 2 to 9 are performed as follows (FIG. 2). In step 2, the second template DNA is separated from the first template DNA to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA). In step 3, a second primer having a nucleic acid sequence (DNA) complementary to the nucleic acid sequence (DNA) of the second template is hybridized to the single-stranded second template DNA, and extended by a heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase. Then, a second primer extension (DNA) complementary to the second template DNA is obtained, and thus a double-stranded DNA intermediate having a promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence is generated. Here, the nucleic acid sequence of the first primer or the second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 ′ end of the first primer is located at the 3 ′ end of the second primer on the complementary strand. Pointed. In step 4,
Heat-resistant D capable of recognizing the promoter sequence
Using NA-dependent RNA polymerase, the double-stranded DN
A copy of the single-stranded third template RNA having a sequence complementary to the target nucleic acid sequence (first template) is increased from the A intermediate. In step 5, the second primer is hybridized to a single-stranded third template RNA, and the heat-resistant RNA-dependent D
A second primer extension (DN), which is a fourth template complementary to the third template RNA after being extended by NA polymerase
Obtain A). In step 6, the fourth template DNA is separated from the third template RNA by a thermostable ribonuclease H that specifically degrades only the RNA of the RNA / DNA hybrid to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA). In step 7, the first primer is hybridized to the single-stranded fourth template DNA, extended by a thermostable DNA-dependent DNA polymerase, and the fourth template DN complementary to the fourth template DNA.
A extension and thus a double stranded DN having a target nucleic acid sequence linked to an upstream operable promoter sequence
Produce A intermediate. Here, the nucleic acid sequence of the first primer or the second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 ′ end of the first primer is 3 ′ of the second primer on the complementary strand. Pointed to the end. In step 8, a single-stranded DNA having a sequence complementary to the target nucleic acid sequence (first template) is converted from the double-stranded DNA intermediate using a heat-resistant DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence. Third template RN
Increase the copy of A. In step 9, the above steps 5 to 8 are repeated as necessary by using the RNA copy as necessary.

【００３２】本発明法で複数の耐熱酵素群を用いた場
合、加熱変性時にもこれらの酵素群の失活がなく、酵素
の逐次添加の必要がない。従来の核酸増幅法では常温で
は通常の酵素が作用するが、高温ではこれらの酵素が不
安定なため使用することが出来ない。一方、プライマー
の特異性を維持しようとすると反応温度は高いほうが好
ましい。したがって比較的低い温度でプライマーの特異
性を維持しようとした場合、プライマー配列に大きな制
限を加える必要があり、また有機溶媒、例えばジメチル
ホルムアミドなどを添加して低い温度でのストリンジェ
ンシーを高めることが必要となり好ましくない。When a plurality of thermostable enzyme groups are used in the method of the present invention, these enzyme groups are not deactivated even during heat denaturation, and there is no need to sequentially add enzymes. In conventional nucleic acid amplification methods, ordinary enzymes act at room temperature, but cannot be used at high temperatures because these enzymes are unstable. On the other hand, to maintain the specificity of the primer, the reaction temperature is preferably higher. Therefore, in order to maintain the specificity of the primer at a relatively low temperature, it is necessary to greatly restrict the primer sequence, and it is necessary to increase the stringency at a low temperature by adding an organic solvent such as dimethylformamide. It is necessary and not preferable.

【００３３】第一プライマーおよび第二プライマーとな
るオリゴヌクレオチドは、例えばＡＢＩ社（Applied Bi
osystems Inc. ）のＤＮＡシンセサイザー３９１型を用
いてホスホアミダイト法により合成出来る。他の合成法
としてリン酸トリエステル法、Ｈ−ホスホネート法、チ
オホスファイト法等がある。また生物学的起源、例えば
制限エンドヌクレアーゼ消化物から単離してもかまわな
い。プライマーとして機能するように設定された核酸な
らば長さ、構造に特に制限はない。一般に、プライマー
部分として６〜５０、好ましくは１０〜３０ヌクレオチ
ドである。また、プロモーター領域と標的核酸とハイブ
リダイズするプロモーター配列部分との間にスペーサー
を設けることも可能であるが、このスペーサーは一般に
０〜１００、好ましくは０〜２０ヌクレオチドがよい。The oligonucleotides serving as the first primer and the second primer are, for example, ABI (Applied Bi
osystems Inc.) using a DNA synthesizer model 391 by the phosphoramidite method. Other synthesis methods include the phosphoric acid triester method, the H-phosphonate method, and the thiophosphite method. It may also be isolated from biological sources, for example from restriction endonuclease digests. There is no particular limitation on the length and structure of the nucleic acid as long as it is set to function as a primer. Generally, the primer portion is 6 to 50, preferably 10 to 30 nucleotides. It is also possible to provide a spacer between the promoter region and the portion of the promoter sequence that hybridizes with the target nucleic acid, but this spacer is generally from 0 to 100, preferably from 0 to 20 nucleotides.

【００３４】第一プライマーおよび第二プライマーの濃
度としては、それぞれ一般に10〜50000nM 好ましくは10
0 〜500nM である。リボヌクレオシドトリホスフェート
およびデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃
度としては、一般にdNTP 10〜10000 μM 、rNTP10〜100
00 μM 、好ましくはdNTP 100〜2000μM 、rNTP100〜40
00μM である。またリボヌクレオシドトリホスフェート
及びデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの濃度
比率としては、一般に1/10〜2/1 好ましくは1/2 〜3/4
である。The concentrations of the first primer and the second primer are generally 10 to 50,000 nM, preferably 10 to 50 000 nM, respectively.
It is 0 to 500 nM. The concentration of ribonucleoside triphosphate and deoxyribonucleoside triphosphate is generally 10 to 10,000 μM dNTP, 10 to 100 rNTP.
00 μM, preferably dNTP 100-2000 μM, rNTP 100-40
00 μM. The concentration ratio of ribonucleoside triphosphate and deoxyribonucleoside triphosphate is generally 1/10 to 2/1, preferably 1/2 to 3/4.
It is.

【００３５】耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとし
てはサーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilu
s)、サーマス・アクアティカス(Thermus aquaticus) の
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼにその活性がある
ことが知られており、２価金属イオンの種類、量を選択
することでＲＮＡ支配ＤＮＡポリメラーゼ活性を発現す
ることが知られている。しかしＲＮＡ依存ＤＮＡポリメ
ラーゼとＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ活性を同時に発
現させるのは容易ではなく、本発明者らは二つの酵素活
性を最大限に発現させる条件を鋭意検討した結果、Mgイ
オンとMnイオンとの比率を1:1 〜4:1 、好ましくは、1.
5:1 〜3:1 の条件が好ましいことを見出した。さらにＤ
ＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼに対しても２価金属イオン
の種類、量は重要であり、これら三者の活性を最大限に
発現させるには、MgイオンとMnイオンとの比率を1:1 〜
4:1 、好ましくは、1.5:1 〜3:1 かつ、dNTP:rNTP=1:10
〜10:1、好ましくは1:2 〜3.5 の条件が好ましい。As the thermostable RNA-dependent DNA polymerase, Thermus thermophilu
s), It is known that the thermostable DNA-dependent RNA polymerase of Thermus aquaticus has its activity, and the RNA-dominant DNA polymerase activity is expressed by selecting the type and amount of divalent metal ions. It is known to However, it is not easy to simultaneously express RNA-dependent DNA polymerase and DNA-dependent DNA polymerase activities, and the present inventors have conducted intensive studies on the conditions for maximizing the expression of the two enzyme activities. The ratio is from 1: 1 to 4: 1, preferably 1.
It has been found that a condition of 5: 1 to 3: 1 is preferable. And D
The type and amount of divalent metal ions are also important for NA-dependent RNA polymerase, and in order to maximize the activity of these three ions, the ratio of Mg ions to Mn ions should be 1: 1 to
4: 1, preferably 1.5: 1 to 3: 1 and dNTP: rNTP = 1: 10
~ 10: 1, preferably 1: 2 to 3.5.

【００３６】耐熱性酵素は従来から知られていたが、本
願発明のように耐熱性酵素を複数組み合わせて使用する
ことは公知でなかった。また単に耐熱酵素を組み合わせ
ても核酸増幅反応は起こらないし、サイクル化すること
でより高い増幅効率を得ることは容易に到達できるもの
ではない。Although thermostable enzymes have been known, it has not been known to use a plurality of thermostable enzymes in combination as in the present invention. Further, a nucleic acid amplification reaction does not occur simply by combining heat-resistant enzymes, and it is not easy to achieve higher amplification efficiency by cycling.

【００３７】本発明では反応時間は増幅する核酸配列、
プライマーの配列やＴｍ、酵素量など諸条件により多様
であり、１サイクルの反応時間は約５〜３００分、好ま
しくは２０〜１２０分が適当である。所謂サイクルとい
う概念はあるが実質的に一定の温度で実施するためサイ
クル数何回という数字は示されない。これらの条件は増
幅効率や増幅量、反応所要時間も考慮して設定される。
標的核酸が単鎖であっても高次構造をとっている場合も
多く、反応開始時に反応液を９０〜９５℃に上昇させる
ことも可能である。この場合も実質的に酵素の劣化がな
いので反応液を準備した後、加熱処理することが可能で
あって、簡便性、コンタミ防止の観点からも優れた方法
である。反応中は反応液を５０〜７０℃の一定温度に保
持するのみで増幅が可能であって、特殊な機器を必要と
せず容易に実施可能である。In the present invention, the reaction time depends on the nucleic acid sequence to be amplified,
It varies depending on various conditions such as the primer sequence, Tm, and the amount of enzyme, and the reaction time for one cycle is about 5 to 300 minutes, preferably 20 to 120 minutes. Although there is a concept of a so-called cycle, the number of cycles is not shown because the operation is performed at a substantially constant temperature. These conditions are set in consideration of amplification efficiency, amplification amount, and reaction time.
Even when the target nucleic acid is single-stranded, it often has a higher-order structure, and the reaction solution can be raised to 90 to 95 ° C. at the start of the reaction. Also in this case, since there is substantially no deterioration of the enzyme, it is possible to perform a heat treatment after preparing a reaction solution, which is an excellent method from the viewpoint of simplicity and prevention of contamination. During the reaction, amplification can be performed only by maintaining the reaction solution at a constant temperature of 50 to 70 ° C., and the reaction can be easily performed without requiring special equipment.

【００３８】本発明の増幅法により増幅した核酸を必要
により検出することが可能である。この増幅した核酸の
検出はＲＮＡコピーを測定することも、プロモーター配
列を有する二重鎖ＤＮＡを測定することも、またＤＮＡ
／ＲＮＡハイブリッドを測定することも可能である。こ
れらの検出は一般的な測定法で検出可能である。核酸ポ
リメラーゼによる伸長反応、転写反応の際、添加するリ
ボキシヌクレオシトトリホスフェートまたはデオキシリ
ボヌクレオシドトリホスフェートとして³²Ｐ、ビオチン
化ヌクレオチドなどの標識物を用い、増幅産物中に標識
を取り込ませ、増幅産物中の標識を測定する。また標識
プライマーを用いて増幅産物中の標識を測定する方法、
標識プローブを用いて増幅された核酸を検出するなどの
方法がある。具体的な検出法として電気泳動による分
画、更にサザンブロット、ノーザンブロット、またドッ
トブロット、スロットブロット、サンドイッチハイブリ
ダイゼーションなどがある。定量的な測定をすることで
検査試料中の濃度を求めることも可能である。また内部
標準を用いる方法（特開62-205800 号公報) によって定
量性を向上させることも可能である。The nucleic acid amplified by the amplification method of the present invention can be detected as required. Detection of the amplified nucleic acid can be performed by measuring RNA copy, measuring double-stranded DNA having a promoter sequence,
/ RNA hybrids can also be measured. These can be detected by a general measuring method. At the time of extension reaction or transcription reaction by nucleic acid polymerase, a label such as ³² P or biotinylated nucleotide is used as a ribooxynucleoside triphosphate or deoxyribonucleoside triphosphate to be added, and a label is incorporated into the amplification product. Measure the label. In addition, a method for measuring the label in the amplification product using a labeled primer,
There is a method of detecting an amplified nucleic acid using a labeled probe. Specific detection methods include fractionation by electrophoresis, Southern blot, Northern blot, dot blot, slot blot, and sandwich hybridization. It is also possible to obtain the concentration in the test sample by performing a quantitative measurement. Further, it is possible to improve the quantitativeness by a method using an internal standard (Japanese Patent Application Laid-Open No. 62-205800).

【００３９】標識プライマー、標識プローブを用いる検
出方法では、標識物として放射性同位元素、酵素、蛍光
物質、発光物質など公知の標識物質を用いることができ
る。また本発明に用いる試薬を、自体公知の方法に従っ
て、前記したような、それぞれの試薬キットにすること
ができ、試薬自体の形態、濃度等は特に限定するもので
はない。In the detection method using a labeled primer or a labeled probe, a known labeling substance such as a radioisotope, an enzyme, a fluorescent substance, or a luminescent substance can be used as a labeling substance. Further, the reagents used in the present invention can be made into the respective reagent kits as described above according to a method known per se, and the form, concentration, etc. of the reagents are not particularly limited.

【００４０】[0040]

【発明の効果】かくして本発明によれば、複製ＲＮＡベ
ースの増幅系に必要なＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、
ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリ
メラーゼ、リボヌクレアーゼＨをいずれも、耐熱性酵素
とすることで標的核酸の増幅反応を核酸鋳型とプライマ
ー間の非特異ハイブリダイゼーションを生じさせないよ
う充分な高温で実施することが出来る。その結果として
非特異的増幅が生じず、特異性の高い増幅が可能とな
る。また、耐熱性酵素は低温では勿論のこと常温でも安
定であり、供給時にも保存時にも活性の低下が殆どな
く、不安定性の解消が可能である。さらに、リボヌクレ
アーゼＨを用いず加熱により変性を行う場合でも耐熱性
酵素を用いることで酵素群の失活を防止し酵素を逐次添
加することなく増幅が可能となる。Thus, according to the present invention, an RNA-dependent DNA polymerase required for a replication RNA-based amplification system,
DNA-dependent DNA polymerase, DNA-dependent RNA polymerase, and ribonuclease H are all heat-resistant enzymes, and the amplification reaction of the target nucleic acid must be performed at a sufficiently high temperature so that non-specific hybridization between the nucleic acid template and the primer does not occur. Can be done. As a result, non-specific amplification does not occur, and highly specific amplification becomes possible. Further, the thermostable enzyme is stable not only at a low temperature but also at a normal temperature. There is almost no decrease in the activity at the time of supply and at the time of storage, and the instability can be eliminated. Furthermore, even when denaturation is performed by heating without using ribonuclease H, the use of a thermostable enzyme prevents inactivation of a group of enzymes and enables amplification without successively adding enzymes.

【００４１】[0041]

【実施例】以下に、実施例および比較例を例示して本発
明をさらに詳しく説明する。なお、実施例中、ＲＮＡ依
存ＤＮＡポリメラーゼを逆転写酵素、ＤＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼをDNA polymerase、リボヌクレアーゼＨを
RNase H 、ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼをRNA polyme
raseと呼ぶ。参考例１ 各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI社DNA シンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミ
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成
した。手法はＡＢＩ社マニュアルに従って０．２μＭス
ケールで実施した。オリゴヌクレオチドの脱保護はアン
モニア水で５５℃１５〜１８時間実施した。精製は日立
製作所製ＨＰＬＣで逆相カラムにて実施した。 プロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド(1):本オ
リゴヌクレオチドはリンカーで連結されたプロモーター
領域、腸炎ビブリオ耐熱性溶血毒素 (VP-TDH)遺伝子の3
13 番目から326 番目のヌクレオチド配列に相補的な領
域から成っている（配列表配列番号１）。 オリゴヌクレオチド(2):VP-TDH遺伝子の179 番目から20
2 番目に相同的なオリゴヌクレオチド（２４mer)（配列
表配列番号２）。 オリゴヌクレオチド(3):VP-TDH遺伝子の254 番目から27
7 番目に相補的なオリゴヌクレオチド（２４mer)（配列
表配列番号３）。５’末端のリン酸基は³²Ｐが標識され
ている。The present invention will be described below in more detail by way of examples and comparative examples. In Examples, RNA-dependent DNA polymerase was replaced with reverse transcriptase, DNA-dependent DNA.
DNA polymerase and ribonuclease H
RNase H, DNA-dependent RNA polymerase for RNA polymerase
Call it rase. Reference Example 1 Synthesis of Various Oligonucleotides Using ABI DNA Synthesizer Model 391, various oligonucleotides having the following sequences were synthesized by the phosphoramidite method. The procedure was performed on a 0.2 μM scale according to the manual of ABI. Deprotection of the oligonucleotide was carried out with aqueous ammonia at 55 ° C. for 15 to 18 hours. Purification was carried out on a reverse phase column using HPLC manufactured by Hitachi, Ltd. Oligonucleotide having a promoter region (1): This oligonucleotide is a promoter region linked by a linker, 3 of the Vibrio parahaemolyticus thermotolerant hemolytic toxin (VP-TDH) gene.
It consists of a region complementary to the 13th to 326th nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing). Oligonucleotide (2): 179 to 20 of VP-TDH gene
Second homologous oligonucleotide (24mer) (SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing). Oligonucleotide (3): 254 to 27 of VP-TDH gene
Seventh complementary oligonucleotide (24mer) (SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing). The phosphate group at the 5 'end is labeled with ³² P.

【００４２】実施例１ プロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド(1) とオ
リゴヌクレオチド(2)を用いた増幅反応 参考例１のオリゴヌクレオチド(1) とオリゴヌクレオチ
ド(2) を用い、腸炎ビブリオゲノムの増幅反応を実施
し、多数のＲＮＡを得た。反応条件を以下に示す。 反応液 50 μl 10mM Tris-HCl pH8.3 50mM KCl 6mM MgCl₂ 3mM MnCl₂ 0.6mM dNTP 1mM rNTP 20pmol オリゴヌクレオチド(1) 20pmol オリゴヌクレオチド(2) Tth-DNApolymerase (東洋紡績製) 60 単位 Tth-RNApolymerase (EPICENTRE 製) 2.5単位 Tth-RNase H (東洋紡績製) 2 単位 反応: ９３℃、 ３分 ６５℃、６０分 Example 1 Amplification Reaction Using Oligonucleotide (1) Having Promoter Region and Oligonucleotide (2) Amplification reaction of Vibrio parahaemolyticus genome using oligonucleotide (1) and oligonucleotide (2) of Reference Example 1. Was performed to obtain a large number of RNAs. The reaction conditions are shown below. Reaction solution 50 μl 10 mM Tris-HCl pH8.3 50 mM KCl 6 mM MgCl ₂ 3 mM MnCl ₂ 0.6 mM dNTP 1 mM rNTP 20 pmol Oligonucleotide (1) 20 pmol Oligonucleotide (2) Tth-DNApolymerase (Toyobo Co., Ltd.) 60 units Tth-RNApolymerase ( 2.5 units Tth-RNase H (manufactured by Toyobo) 2 units Reaction: 93 ° C, 3 minutes 65 ° C, 60 minutes

【００４３】実施例２ 合成したＲＮＡの測定 実施例１で合成したＲＮＡを希釈し、50μl づつナイロ
ン膜、GeneScreen plus(DuPont社製）にドットブロット
した。また対照としてVPのゲノム核酸を変性させて、50
μl ドットブロットした。ナイロン膜を６×ＳＳＣ（１
×ＳＳＣとは0.15M NaCl,0.015M クエン酸ナトリウム(p
H7.0) を意味する）、５×デーンハート液（１×デンハ
ート液とは0.02% フィコール、0.02% ポリビニルピロリ
ドン、0.02% 牛血清アルブミンを意味する）、１ｍＭ
ＥＤＴＡ、10μg の煮沸したサケ***ＤＮＡ (平均 500
塩基) を含む液100 μl 中で60℃、１時間プレハイブリ
ダイズした後、上記液に実施例１で調製したオリゴマー
(3) を加え、55℃１時間ハイブリダイズした。55℃の６
×SSC 中でナイロン膜を充分洗浄した後、乾燥させた。
Ｘ線フィルム（New AIF RX富士写真工業製）を密着さ
せ、−80℃で一昼夜感光させた。フィルムの感光度から
合成ＲＮＡを定量したところ対照のVPのゲノム核酸に比
べて約10⁶ 倍のＲＮＡが合成されていた。この結果、本
発明の増幅法が有効であることが示された。 Example 2 Measurement of Synthesized RNA The RNA synthesized in Example 1 was diluted, and dot-blotted on a nylon membrane, GeneScreen plus (manufactured by DuPont), 50 μl each. As a control, the VP genomic nucleic acid was
μl dot blot was performed. Nylon membrane is 6 × SSC (1
× SSC means 0.15M NaCl, 0.015M sodium citrate (p
H7.0)) 5 × Danehart solution (1 × Denhart solution means 0.02% Ficoll, 0.02% polyvinylpyrrolidone, 0.02% bovine serum albumin), 1 mM
EDTA, 10 μg of boiled salmon semen DNA (average 500
Base) at 60 ° C for 1 hour in 100 µl of a solution containing
(3) was added thereto, followed by hybridization at 55 ° C. for 1 hour. 6 at 55 ℃
After thoroughly washing the nylon membrane in × SSC, it was dried.
An X-ray film (New AIF RX manufactured by Fuji Photo Kogyo) was adhered and exposed at -80 ° C for 24 hours. About ¹⁰⁶ times the RNA than the sensitivity to the genomic nucleic acid in the control of the VP was quantitatively synthesized RNA of the film had been synthesized. As a result, it was shown that the amplification method of the present invention was effective.

【００４４】実施例３ ＲＮＡ鋳型からの例 プロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド(1) とオ
リゴヌクレオチド(2)を用いた増幅反応 参考例１のオリゴヌクレオチド(1) とオリゴヌクレオチ
ド(2) を用い、腸炎ビブリオｍＲＮＡの増幅反応を実施
し、多数のＲＮＡを得た。反応条件を以下に示す。 反応液 50 μl 10mM Tris-HCl pH8.3 50mM KCl 6mM MgCl₂ 3mM MnCl₂ 0.6mM dNTP 1mM rNTP 20pmol オリゴヌクレオチド(1) 20pmol オリゴヌクレオチド(2) Tth-DNApolymerase (東洋紡績製) 60 単位 Tth-RNApolymerase (EPICENTRE 製) 2.5単位 Tth-RNase H (東洋紡績製) 2 単位 反応: ６５℃、６０分 Example 3 Example from RNA template Amplification reaction using oligonucleotide (1) and oligonucleotide (2) each having a promoter region The oligonucleotide (1) and the oligonucleotide (2) of Reference Example 1 were used for enteritis. An amplification reaction of Vibrio mRNA was performed to obtain a large number of RNAs. The reaction conditions are shown below. Reaction solution 50 μl 10 mM Tris-HCl pH8.3 50 mM KCl 6 mM MgCl ₂ 3 mM MnCl ₂ 0.6 mM dNTP 1 mM rNTP 20 pmol Oligonucleotide (1) 20 pmol Oligonucleotide (2) Tth-DNApolymerase (Toyobo Co., Ltd.) 60 units Tth-RNApolymerase ( 2.5 units Tth-RNase H (manufactured by Toyobo) 2 units Reaction: 65 ° C, 60 minutes

【００４５】実施例４ 合成したＲＮＡの測定 実施例３で合成したＲＮＡを希釈し、実施例２と同様に
してフィルムの感光度から合成ＲＮＡを定量したところ
対照のVPのゲノム核酸に比べて約10⁷ 倍のＲＮＡが合成
されていた。この結果、本発明の増幅法が有効であるこ
とが示された。 Example 4 Measurement of Synthesized RNA The RNA synthesized in Example 3 was diluted, and the amount of synthesized RNA was quantified from the sensitivity of the film in the same manner as in Example 2. 10 ⁷ times of RNA have been synthesized. As a result, it was shown that the amplification method of the present invention was effective.

【００４６】実施例５ 酵素２種を使用 プロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド(1) とオ
リゴヌクレオチド(2)を用いた増幅反応 参考例１のオリゴヌクレオチド(1) とオリゴヌクレオチ
ド(2) を用い、腸炎ビブリオゲノムの増幅反応を実施
し、多数のＲＮＡを得た。反応条件を以下に示す。 反応液 50 μl 10mM Tris-HCl pH8.3 50mM KCl 6mM MgCl₂ 3mM MnCl₂ 0.6mM dNTP 1mM rNTP 20pmol オリゴヌクレオチド(1) 20pmol オリゴヌクレオチド(2) Tth-DNApolymerase (参考例４） 60 単位 Tth-RNApolymerase (EPICENTRE 製) 2.5単位 反応: ９５℃、 ３分の後、
６０℃、２０分 ７０℃、２０分 を４回繰り返す。 Example 5 Using Two Enzymes Amplification Reaction Using Oligonucleotide (1) and Oligonucleotide (2) Having Promoter Region Using the oligonucleotide (1) and the oligonucleotide (2) of Reference Example 1, enteritis was performed. An amplification reaction of the Vibrio genome was performed to obtain a large number of RNAs. The reaction conditions are shown below. Reaction solution 50 μl 10 mM Tris-HCl pH8.3 50 mM KCl 6 mM MgCl ₂ 3 mM MnCl ₂ 0.6 mM dNTP 1 mM rNTP 20 pmol Oligonucleotide (1) 20 pmol Oligonucleotide (2) Tth-DNA polymerase (Reference Example 4) 60 units Tth-RNA polymerase ( 2.5 units Reaction: 95 ℃, after 3 minutes,
Repeat 60 ° C, 20 minutes 70 ° C, 20 minutes 4 times.

【００４７】実施例６ 合成したＲＮＡの測定 実施例５で合成したＲＮＡを希釈し、実施例２と同様に
してフィルムの感光度から合成ＲＮＡを定量したところ
対照のVPのゲノム核酸に比べて約10⁶ 倍のＲＮＡが合成
されていた。この結果、本増幅法が有効であることが示
された。 Example 6 Measurement of Synthesized RNA The RNA synthesized in Example 5 was diluted, and the amount of the synthesized RNA was quantified from the sensitivity of the film in the same manner as in Example 2. 10 ⁶ times of RNA have been synthesized. As a result, it was shown that this amplification method was effective.

【００４８】参考例２ 各種オリゴヌクレオチドの合成 ABI社DNA シンセサイザー391 型を用いて、ホスホアミ
ダイト法にて下記配列のオリゴヌクレオチドを各種合成
した。手法はＡＢＩ社マニュアルに従って０．２μＭス
ケールで実施した。オリゴヌクレオチドの脱保護はアン
モニア水で５５℃１５〜１８時間実施した。精製は日立
製作所製ＨＰＬＣで逆相カラムにて実施した。 プロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド(1):本オ
リゴヌクレオチドはリンカーで連結されたプロモーター
領域、腸炎ビブリオ耐熱性溶血毒素 (VP-TDH)遺伝子の3
13 番目から326 番目のヌクレオチド配列に相補的な領
域から成っている（配列表配列番号１）。 オリゴヌクレオチド(3):VP-TDH遺伝子の254 番目から27
7 番目に相補的なオリゴヌクレオチド（２４mer)（配列
表配列番号３）。５’末端のリン酸基は³²Ｐが標識され
ている。 オリゴヌクレオチド(4):本オリゴヌクレオチドはリンカ
ーで連結されたプロモーター領域、VP-TDH遺伝子の179
番目から202 番目に相同的なオリゴヌクレオチド領域か
ら成っている（配列表配列番号４）。 Reference Example 2 Synthesis of Various Oligonucleotides Using ABI DNA synthesizer Model 391, various oligonucleotides having the following sequences were synthesized by the phosphoramidite method. The procedure was performed on a 0.2 μM scale according to the manual of ABI. Deprotection of the oligonucleotide was carried out with aqueous ammonia at 55 ° C. for 15 to 18 hours. Purification was carried out on a reverse phase column using HPLC manufactured by Hitachi, Ltd. Oligonucleotide having a promoter region (1): This oligonucleotide is a promoter region linked by a linker, 3 of the Vibrio parahaemolyticus thermotolerant hemolytic toxin (VP-TDH) gene.
It consists of a region complementary to the 13th to 326th nucleotide sequence (SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing). Oligonucleotide (3): 254 to 27 of VP-TDH gene
Seventh complementary oligonucleotide (24mer) (SEQ ID NO: 3 in the Sequence Listing). The phosphate group at the 5 'end is labeled with ³² P. Oligonucleotide (4): This oligonucleotide is a promoter region linked by a linker, 179 of the VP-TDH gene.
It consists of an oligonucleotide region that is homologous from the 2nd to the 202nd (SEQ ID NO: 4 in the Sequence Listing).

【００４９】実施例７ プロモーター領域を有するオリゴヌクレオチド(1) とオ
リゴヌクレオチド(4)を用いた増幅反応 参考例２のオリゴヌクレオチド(1) とオリゴヌクレオチ
ド(4) を用い、腸炎ビブリオゲノムの増幅反応を実施
し、多数のＲＮＡを得た。反応条件を以下に示す。 反応液 50 μl 10mM Tris-HCl pH8.3 50mM KCl 6mM MgCl₂ 3mM MnCl₂ 0.6mM dNTP 1mM rNTP 20pmol オリゴヌクレオチド(1) 20pmol オリゴヌクレオチド(4) Tth-DNApolymerase (東洋紡績製) 60 単位 Tth-RNApolymerase (EPICENTRE 製) 2.5単位 Tth-RNase H (東洋紡績製) 2 単位 反応: ９３℃、 ３分 ６５℃、６０分 Example 7 Amplification Reaction Using Oligonucleotide (1) Having Promoter Region and Oligonucleotide (4) Amplification Reaction of Vibrio parahaemolyticus Genome Using Oligonucleotide (1) and Oligonucleotide (4) of Reference Example 2 Was performed to obtain a large number of RNAs. The reaction conditions are shown below. Reaction solution 50 μl 10 mM Tris-HCl pH8.3 50 mM KCl 6 mM MgCl ₂ 3 mM MnCl ₂ 0.6 mM dNTP 1 mM rNTP 20 pmol Oligonucleotide (1) 20 pmol Oligonucleotide (4) Tth-DNApolymerase (Toyobo Co., Ltd.) 60 units Tth-RNApolymerase ( 2.5 units Tth-RNase H (manufactured by Toyobo) 2 units Reaction: 93 ° C, 3 minutes 65 ° C, 60 minutes

【００５０】実施例８ 合成したＲＮＡの測定 実施例７で合成したＲＮＡを希釈し、実施例２と同様に
してフィルムの感光度から合成ＲＮＡを定量したとこ
ろ、対照のVPのゲノム核酸に比べて約10⁹ 倍のＲＮＡが
合成されていた。この結果、本発明の増幅法が有効であ
ることが示された。 Example 8 Measurement of Synthesized RNA The RNA synthesized in Example 7 was diluted, and the amount of synthetic RNA was quantified from the light sensitivity of the film in the same manner as in Example 2. about 10 ⁹ times of RNA have been synthesized. As a result, it was shown that the amplification method of the present invention was effective.

【００５１】参考例３ ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが示すリボヌクレアー
ゼＨ活性 実施例３のｍＲＮＡを鋳型とし、オリゴヌクレオチド(T
DP-2) （配列表配列番号５）を用い、逆転写酵素として
SSII(super script II: M-MLV reverse transcriptase
のリボヌクレアーゼ活性をなくしたもの、BRL 社) を使
用し、cDNA/RNAハイブリッドを合成した。次にE.coliリ
ボヌクレアーゼＨおよびTth DNA ポリメラーゼ (東洋紡
績製) を添加し RNAを分解し、 cDNA の一本鎖をつく
り、 cDNAに相補的なプローブハイブリした。ハイブリ
ダイゼーションには東洋紡績製ALP標識プローブ (商品
番号PRB004) を用い、説明書に従って実施した。検出に
は特開平2-227099号明細書の記載の色彩色差計を用いて
定量化した。SSIIのみではハイブリッド 2本鎖のままで
プローブは反応しなかったが、E.coliリボヌクレアーゼ
ＨおよびTth DNA ポリメラーゼを添加したものは変性な
しでもプローブが反応し 1本鎖であることが証明され
た。これによりTth DNA ポリメラーゼがリボヌクレアー
ゼＨ活性を有することがわかった。 Reference Example 3 Ribonuclease H activity exhibited by DNA-dependent DNA polymerase Using the mRNA of Example 3 as a template, an oligonucleotide (T
DP-2) (SEQ ID NO: 5) as reverse transcriptase
SSII (super script II: M-MLV reverse transcriptase
A cDNA / RNA hybrid was synthesized using a DNA polymerase (BRL) which had lost its ribonuclease activity. Next, E. coli ribonuclease H and Tth DNA polymerase (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were added to decompose the RNA to form a single-stranded cDNA, and a probe hybridized to the cDNA was hybridized. Hybridization was carried out using a Toyobo ALP-labeled probe (product number PRB004) according to the instructions. The detection was quantified using a colorimeter described in JP-A-2-27099. The probe did not react with the hybrid double strand of SSII alone, but the probe with E. coli ribonuclease H and Tth DNA polymerase added reacted without denaturation, proving that the probe was single-stranded. This indicated that Tth DNA polymerase had ribonuclease H activity.

【００５２】反応条件および反応操作を以下に詳細に示
す。 反応条件 鋳型ＲＮＡ：腸炎ビブリオＴＤＨ毒素遺伝子ｍＲＮＡ プライマー：オリゴヌクレオチド(TDP-2) 反応液：10mM Tris HCl pH8.3 75mM KCl 6mM MgCl₂ 0.4/1.0mM d/rNTP 100 単位 SSII 操作: 以下の表１に従い実施した。The reaction conditions and operation are described in detail below. Reaction conditions Template RNA: Vibrio parahaemolyticus TDH toxin gene mRNA Primer: Oligonucleotide (TDP-2) Reaction solution: 10 mM Tris HCl pH 8.3 75 mM KCl 6 mM MgCl ₂ 0.4 / 1.0 mM d / rNTP 100 units SSII Procedure: Table 1 below Was carried out according to

【００５３】[0053]

【表１】 結果：その結果を表２に示す。Tth DNA ポリメラーゼ 6
0 単位のリボヌクレアーゼ活性は、E.coliリボヌクレア
ーゼ 1.5単位の約半分の活性を示した。[Table 1] Results: The results are shown in Table 2. Tth DNA polymerase 6
0 units of ribonuclease activity showed about half the activity of 1.5 units of E. coli ribonuclease.

【００５４】[0054]

【表２】 ΔＥ値：スポットの色彩、色素濃度を反映する値。無単
位。[Table 2] ΔE value: a value reflecting the color of the spot and the pigment concentration. No unit.

【００５５】参考例４ 好熱性細菌サーマス・サーモフィルス由来のリボヌクレ
アーゼＨの調製 ポリペプトン１．０％、酵母エキス０．５％、ＮａＣｌ
０．２％を含む培地（ｐＨ７．５）１００ｍｌを５００
ｍｌ容の坂口フラスコに移し、１２１℃で１５分間オー
トクレーブ滅菌を行った後、室温にて冷却した。そこへ
好熱性細菌サーマス・サーモフィルスＨＢ８(ATCC2763
4) を１白金耳接種し、７０℃にて２４時間振盪培養し
た。次に同組成の培地６Ｌを１０Ｌジャファーメンター
に移し、１２１℃で１５分間オートクレーブ滅菌を行
い、放冷後これに上記記載したフラスコにて培養した培
養液１００ｍｌを接種した。通気量２Ｌ／分、攪拌数４
００回転／分、温度７０℃の条件にて１０時間培養し
た。 Reference Example 4 Preparation of ribonuclease H derived from thermophilic bacterium Thermus thermophilus 1.0% polypeptone, 0.5% yeast extract, NaCl
100 ml of a medium (pH 7.5) containing 0.2%
The mixture was transferred to a ml Sakaguchi flask, autoclaved at 121 ° C. for 15 minutes, and then cooled at room temperature. There thermophilic bacteria Thermos thermophilus HB8 (ATCC2763
4) was inoculated with one platinum loop and cultured with shaking at 70 ° C. for 24 hours. Next, 6 L of a medium having the same composition was transferred to a 10 L jar fermenter, sterilized in an autoclave at 121 ° C. for 15 minutes, allowed to cool, and inoculated with 100 ml of a culture solution cultured in the flask described above. Aeration rate 2 L / min, number of stirring 4
Incubation was performed for 10 hours at a condition of 00 rotation / minute and a temperature of 70 ° C.

【００５６】培養液６リットルを遠心分離（８０００回
転／１０分間）にて集菌し、１０ｍＭ ２−メルカプト
エタノール、５％ グリセロールを含むＫ−リン酸バッ
ファーｐＨ７．５（以下バッファーＡと称する）に懸濁
した。超音波破砕機（海上電気製、１９ＫＨｚ）にて２
０分間処理し、再度遠心分離し細胞残渣を取り除いた上
清を回収した。6 liters of the culture solution is collected by centrifugation (8000 rpm / 10 minutes), and the mixture is added to a K-phosphate buffer pH 7.5 containing 10 mM 2-mercaptoethanol and 5% glycerol (hereinafter referred to as buffer A). Suspended. 2 with an ultrasonic crusher (Marikai Electric, 19KHz)
The cells were treated for 0 minutes, centrifuged again to remove cell debris, and the supernatant was recovered.

【００５７】上清液を硫酸アンモニウムによる塩析後、
バッファーＡに対し透析した。この液をバッファーＡに
て平衡化したＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂ（ファ
ルマシア社製）カラムクロマトグラフィーに供し、吸着
させる。バッファーＡにてカラムを洗浄後、０〜１．０
Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＡにて溶出したところ、
０〜０．５Ｍ ＮａＣｌ溶出画分にリボヌクレアーゼＨ
活性を得た。活性画分をバッファーＡに対し透析した。
この液をバッファーＡにて平衡化したフォスフォセルロ
ースＰ−１１（Ｗｈａｔｍａｎ社製）カラムクロマトグ
ラフィーに供し、吸着させる。バッファーＡにてカラム
を洗浄後、０〜１．０Ｍ ＮａＣｌを含むバッファーＡ
にて溶出したところ、０〜０．５Ｍ ＮａＣｌ溶出画分
にリボヌクレアーゼＨ活性を得た。活性画分をバッファ
ーＡに対し透析した。更に、この液をバッファーＡにて
平衡化したｎａｔｉｖｅＤＮＡセルロース（ファルマシ
ア社製）カラムクロマトグラフィーに供し、吸着させ
る。バッファーＡにてカラムを洗浄後、０〜１．０ＭＮ
ａＣｌを含むバッファーＡにて溶出したところ、０〜
０．５Ｍ ＮａＣｌ溶出画分にリボヌクレアーゼＨ活性
を得た。活性画分を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、３００ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．
１ｍＭ ＥＤＴＡ、１０％ グリセロールに対し透析し
た。更に、この液を１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．５）、３００ｍＭＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、０．１
ｍｌ ＥＤＴＡ、５０％ グリセロールに対し透析し酵
素標品を得た。なお、耐熱性リボヌクレアーゼＨ活性
は、以下の方法により測定した。まず、下記組成を有す
る試薬Ａ，Ｂ，ＣおよびＤを調製した。 （試薬） Ａ． １００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
８．３） ７５０ｍＭ 塩化カリウム ６０ｍＭ 塩化マグネシウム ３０ｍＭ 塩化マンガン Ｂ． １０４ｃｐｍ／２μｌ ポリＡ／ポリｄＴ^* Ｃ． ２０％ トリクロロ酢酸（２ｍＭ ピ
ロリン酸） Ｄ． １０μｇ／μｌ ＢＳＡAfter the supernatant was salted out with ammonium sulfate,
Dialysis was performed against buffer A. This solution is subjected to DEAE-Sepharose CL-6B (Pharmacia) column chromatography equilibrated with buffer A and adsorbed. After washing the column with buffer A,
When eluted with buffer A containing M NaCl,
Ribonuclease H was added to the 0-0.5M NaCl elution fraction.
Activity was obtained. The active fraction was dialyzed against buffer A.
This solution is subjected to column chromatography on phosphocellulose P-11 (Whatman) equilibrated with buffer A to be adsorbed. After washing the column with buffer A, buffer A containing 0 to 1.0 M NaCl
As a result, ribonuclease H activity was obtained in the fraction eluted with 0 to 0.5 M NaCl. The active fraction was dialyzed against buffer A. Further, this solution is subjected to native DNA cellulose (manufactured by Pharmacia) column chromatography equilibrated with buffer A to be adsorbed. After washing the column with buffer A, 0 to 1.0 MN
When eluted with buffer A containing aCl,
Ribonuclease H activity was obtained in the fraction eluted with 0.5 M NaCl. The active fraction was treated with 10 mM Tris-HCl (pH
7.5), 300 mM KCl, 1 mM DTT, 0.
Dialysis was performed against 1 mM EDTA, 10% glycerol. Further, this solution was added to 10 mM Tris-HCl (pH
7.5), 300 mM KCl, 1 mM DTT, 0.1
It was dialyzed against ml EDTA and 50% glycerol to obtain an enzyme preparation. In addition, the thermostable ribonuclease H activity was measured by the following method. First, reagents A, B, C and D having the following composition were prepared. (Reagent) A. 100 mM Tris-HCl (pH
8.3) 750 mM potassium chloride 60 mM magnesium chloride 30 mM manganese chloride 104 cpm / 2 μl poly A / poly dT ^* C. B. 20% trichloroacetic acid (2 mM pyrophosphate) 10 μg / μl BSA

【００５８】^* 〔³H〕にてラベルされた基質ポリＡ／ポ
リｄＴの調製方法 ポリＡ（ファルマシア製：コード２７─４１１０−０
１）１００ｍｇを１０ｍｌの滅菌水にて溶解した。ポリ
ｄＴ（ファルマシア製：コード２７−７８３４−０１）
５ユニットを２００μｌのＴＥバッファーにて溶解し
た。〔³H〕ポリＡ（アマーシャム製：コードＴＲＫ．４
８０ １０μＣｉ）を先に調製したポリＡ溶液５０μｌ
にて溶解した。５０サンプル分の基質調製のために、こ
こで調製した〔³H〕ポリＡ＋ポリＡを５０万ｃｐｍ相当
量を取り出し、先に調製したポリｄＴ溶液２０μｌ（１
９ｐｍｏｌ／μｌ）と混合した。５倍濃度のアニーリン
グバッファー（５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ−ＫＯＨ〔ｐＨ
８．０〕、５００ｍＭ ＫＣｌ）２０μｌ、および滅菌
水を加え１００μｌとした。この溶液を６５℃にて１０
分間加熱後、室温にて冷却し基質溶液とした。 ^* Method for Preparing Substrate Poly A / Poly dT Labeled with [ ³ H] Poly A (Pharmacia: Code 27 # 4110-0)
1) 100 mg was dissolved in 10 ml of sterilized water. Poly dT (Pharmacia: Code 27-7834-01)
Five units were dissolved in 200 μl of TE buffer. ^[3 H] poly A (Amersham Corporation: Code TRK.4
80 10 μCi) to 50 μl of the previously prepared poly A solution
Was dissolved. In order to prepare a substrate for 50 samples, an equivalent amount of 500,000 cpm of [ ³ H] poly A + poly A prepared here was taken out, and 20 μl (1
9 pmol / μl). A 5-fold concentration of annealing buffer (50 mM Hepes-KOH [pH
8.0], 20 μl of 500 mM KCl) and sterilized water to make 100 μl. This solution is heated at 65 ° C for 10
After heating for minutes, the mixture was cooled at room temperature to obtain a substrate solution.

【００５９】次いで、試薬Ａ２．５μｌ、試薬Ｂ２μｌ
および滅菌水１９．５μｌをマイクロチューブに加え、
攪拌後、酵素１μｌを加え、６０℃にて２０分間反応し
た。その後氷冷し、試薬Ｄ２５μｌおよび試薬Ｃ５０μ
ｌを加えて攪拌した。更に１０分間氷冷した後、遠心分
離（１２０００回転、１０分間）にて、酸不溶性画分を
分離した。この上清の酸可溶性画分を５０μｌ採取し、
液体シンチレーションカウンター（パッカード社製）で
計測し、遊離〔³H〕を測定した。酵素活性の１単位は、
この条件下で１分間当たり１μｍｏｌの酸可溶性物質を
遊離する酵素量とした。Next, 2.5 μl of reagent A and 2 μl of reagent B
And 19.5 μl of sterile water are added to the microtube,
After stirring, 1 μl of the enzyme was added and reacted at 60 ° C. for 20 minutes. Thereafter, the mixture was cooled on ice, and 25 µl of reagent D and 50 µl of reagent C were used.
and stirred. After further ice-cooling for 10 minutes, the acid-insoluble fraction was separated by centrifugation (12,000 rotations, 10 minutes). 50 μl of the acid-soluble fraction of the supernatant was collected,
The free [ ³ H] was measured using a liquid scintillation counter (manufactured by Packard). One unit of enzyme activity is
Under these conditions, the amount of the enzyme that released 1 μmol of the acid-soluble substance per minute was determined.

【００６０】（１）分子量 上記酵素標品を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにて既知の分子量マ
ーカーと同時に泳動した。既知の分子量マーカーとの比
較から、分子量は約８５，０００〜９５，０００と推定
された（図３）。(1) Molecular weight The above enzyme preparation was electrophoresed simultaneously with a known molecular weight marker by SDS-PAGE. From comparison with known molecular weight markers, the molecular weight was estimated to be about 85,000-95,000 (FIG. 3).

【００６１】（２）熱安定性 上記酵素標品をｐＨ８．０で６０℃〜９０℃で２時間処
理後、その残存活性を測定した。熱処理後の残存活性
は、７５℃にて２時間反応後においても、５０％以上認
められた（図４）。(2) Thermostability The above enzyme preparation was treated at pH 8.0 at 60 ° C. to 90 ° C. for 2 hours, and its residual activity was measured. 50% or more of the residual activity after the heat treatment was observed even after the reaction at 75 ° C. for 2 hours (FIG. 4).

【００６２】（３）至適ｐＨ 上記酵素標品をｐＨ７．５〜ｐＨ９．５にて作用させ、
その至適ｐＨを求めた。ｐＨの調整は試薬ＡのｐＨを変
動させて行った。その結果、至適ｐＨはｐＨ７．５〜
９．３付近であった（図５）。 （４）ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ圧政 本酵素はリボヌクレアーゼＨ活性以外に、ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼ活性を有しており、その活性１に対
し、約５倍以上であった。ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラー
ゼ活性の定義は、７０℃での活性測定条件下でｓｓＤＮ
Ａ／プライマーを基質として、３０分間に１０ｎモルの
ｄＴＮＰを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素量を１単位と
した。(3) Optimum pH The above enzyme preparation is allowed to act at pH 7.5 to pH 9.5,
The optimum pH was determined. The pH was adjusted by changing the pH of the reagent A. As a result, the optimum pH is pH 7.5 to
It was around 9.3 (FIG. 5). (4) DNA-dependent DNA polymerase This enzyme, in addition to ribonuclease H activity,
It had NA polymerase activity, which was about 5 times or more the activity 1. The definition of DNA-dependent DNA polymerase activity is defined as ssDN under the condition of measuring the activity at 70 ° C.
Using A / primer as a substrate, the amount of the enzyme that incorporates 10 nmol of dTNP into the acid-insoluble precipitate in 30 minutes was defined as 1 unit.

【００６３】（５）ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆
転写酵素）活性 本酵素はリボヌクレアーゼＨ活性以外に、ＲＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）活性を有しており、そ
の活性はリボヌクレアーゼＨ１に対し、約０．１以下で
あった。ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）
活性の定義は、７０℃での活性測定条件でポリ（Ａ）オ
リゴ（ｄＴ）を基質として、３０分間に１０ｎモルのｄ
ＴＴＰを酸不溶性沈殿物に取り込む酵素量を１単位とし
た。(5) RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase) activity In addition to ribonuclease H activity, this enzyme
It had NA polymerase (reverse transcriptase) activity and its activity was about 0.1 or less against ribonuclease H1. RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase)
The activity is defined as 10 nmol d / 30 minutes using poly (A) oligo (dT) as a substrate under the condition of activity measurement at 70 ° C.
The amount of the enzyme that incorporates TTP into the acid-insoluble precipitate was defined as one unit.

【００６４】[0064]

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：64 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 特徴を表す記号：promoter 存在位置：1..30 特徴を決定した方法：S 他の特徴：プロモーター配列 存在位置：31..40 特徴を決定した方法:S 他の特徴：複製開始点を含むスペーサー配列 存在位置：41..64 他の特徴：腸炎ビブリオTDH 遺伝子の 313番目から 326
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 CTTGACAAAA AGGAGGGGGA TTGATAGCAT GGCTTTTCTG GACACCGCTG CCATTGTATA GTCT 64[Sequence Listing] SEQ ID NO: 1 Sequence length: 64 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics Characteristic symbol: Promoter Position: 1..30 Characterized method: S Other characteristics: Promoter sequence Location: 31..40 Characterized method: S Other characteristics: Spacer sequence containing origin of replication Location: 41 .. 64 Other features: 313 to 326 of the Vibrio parahaemolyticus TDH gene
It has a sequence complementary to the th sequence. Array CTTGACAAAA AGGAGGGGGA TTGATAGCAT GGCTTTTCTG GACACCGCTG CCATTGTATA GTCT 64

【００６５】配列番号：２ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..24 他の特徴：腸炎ビブリオTDH 遺伝子の 179番目から 202
番目の配列と相同的な配列を有する。 配列 CTGACTTTTG GACAAACCGT AATG 24SEQ ID NO: 2 Sequence length: 24 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1..24, etc. Features: Vibrio parahaemolyticus TDH gene from 179 to 202
It has a sequence homologous to the second sequence. Sequence CTGACTTTTG GACAAACCGT AATG 24

【００６６】配列番号：３ 配列の長さ：24 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..24 他の特徴：腸炎ビブリオTDH 遺伝子の254 番目から277
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 CAGGTACTAA ATGGTTGACA TCCT 24SEQ ID NO: 3 Sequence length: 24 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1..24, etc. Features: Vibrio parahaemolyticus TDH gene 254 to 277
It has a sequence complementary to the th sequence. Sequence CAGGTACTAA ATGGTTGACA TCCT 24

【００６７】配列番号：４ 配列の長さ：64 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..30 特徴を決定した方法:S 他の特徴：プロモーター配列 存在位置：31..40 特徴を決定した方法:S 他の特徴：複製開始点を含むスペーサー 存在位置：41..64 他の特徴：腸炎ビブリオTDH 遺伝子の 179番目から 202
番目の配列と相同的な配列を有する。 配列 CTTGACAAAA AGGAGGGGGA TTGATAGCAT GGCTTTTCTG CTGACTTTTG GACAAACCGT AATG 64SEQ ID NO: 4 Sequence length: 64 Sequence type: Number of nucleic acid strands: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acids Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1..30 Characteristics Determined method: S Other characteristics: Promoter sequence Location: 31..40 Characterized method: S Other characteristics: Spacer including origin of replication Location: 41..64 Other characteristics: Vibrio parahaemolyticus TDH 179 to 202 of the gene
It has a sequence homologous to the second sequence. Sequence CTTGACAAAA AGGAGGGGGA TTGATAGCAT GGCTTTTCTG CTGACTTTTG GACAAACCGT AATG 64

【００６８】配列番号：５ 配列の長さ：22 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成DNA 配列の特徴 存在位置：1..22 他の特徴：腸炎ビブリオTDH 遺伝子の 483番目から 504
番目の配列と相補的な配列を有する。 配列 ACTACCACTC TCATATGCTT CT 22SEQ ID NO: 5 Sequence length: 22 Sequence type: Number of nucleic acid chains: Single strand Topology: Linear Sequence type: Other nucleic acid Synthetic DNA Sequence characteristics Location: 1..22 Others Features: 483 to 504 of Vibrio parahaemolyticus TDH gene
It has a sequence complementary to the th sequence. Sequence ACTACCACTC TCATATGCTT CT 22

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】標的核酸がＲＮＡである場合の本発明の増幅法
の工程図である。FIG. 1 is a process chart of the amplification method of the present invention when a target nucleic acid is RNA.

【図２】標的核酸がＤＮＡである場合の本発明の増幅法
の工程図である。FIG. 2 is a process chart of the amplification method of the present invention when the target nucleic acid is DNA.

【図３】サーマス・サーモフィルス由来のリボヌクレア
ーゼＨのＳＤＳ−ＰＡＧＥの泳動パターンを示す図であ
る。FIG. 3 is a view showing an SDS-PAGE electrophoresis pattern of ribonuclease H derived from Thermus thermophilus.

【図４】サーマス・サーモフィルス由来のリボヌクレア
ーゼＨの熱安定性を示すグラフである。FIG. 4 is a graph showing thermostability of ribonuclease H from Thermos thermophilus.

【図５】サーマス・サーモフィルス由来のリボヌクレア
ーゼＨの至適ｐＨを示すグラフである。FIG. 5 is a graph showing the optimum pH of ribonuclease H derived from Thermos thermophilus.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特表 平４−507197（ＪＰ，Ａ) 国際公開92／8800（ＷＯ，Ａ１) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，30 （1991）ｐ．7661−7666 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)────────────────────────────────────────────────── ─── Continuation of the front page (56) References Tokuhyo Hei 4-507197 (JP, A) International Publication 92/8800 (WO, A1) Biochemistry, 30 (1991) p. 7661-7666 (58) Fields surveyed (Int. Cl. ⁷ , DB name) C12Q 1/68 C12N 15/09 ZNA BIOSIS (DIALOG) MEDLINE (STN)

Claims (12)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 反応媒体中で実質的に一定の温度で標的
核酸配列のコピー数を増加させる方法であって、下記工
程を含み、耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅法に
おいて、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性
リボヌクレアーゼＨおよび耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼとして、一つの耐熱性酵素を用いることを特徴
とする標的核酸配列の増幅法。 工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第
一鋳型ＲＮＡに、第一鋳型の核酸配列（ＲＮＡ）に対し
て十分に相補的な配列およびその５’末端側にプロモー
ター配列を有する第一プライマーをハイブリダイズさ
せ、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長さ
せて、第一鋳型ＲＮＡに相補的な第二鋳型である第一プ
ライマー伸長物（ＤＮＡ）を得る； 工程２：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特
異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨにより、第一
鋳型ＲＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二
鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る； 工程３：一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、第二鋳型の核酸配
列（ＤＮＡ）に相補的な核酸配列を有する第二プライマ
ーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相補的な第二
プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このようにして標的
核酸配列の上流に機能可能なプロモーター配列を有する
二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；（ここで第一プライ
マーまたは第二プライマーの核酸配列は標的核酸配列に
対して十分に相補的または相同的であり、第一プライマ
ーの３’末端は相補的鎖上の第二プライマーの３’末端
に向けられる） 工程４：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列（第一鋳型ＲＮ
Ａ）と相補的な配列をもつ一本鎖の第三鋳型ＲＮＡを生
成させる； 工程５：一本鎖の第三鋳型ＲＮＡに、前記第二プライマ
ーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長させて、第三鋳型ＲＮＡに相補的な
第四鋳型である第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得
る； 工程６：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特
異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨにより、第三
鋳型ＲＮＡから第四鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第二
鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る； 工程７：一本鎖の第四鋳型ＤＮＡに、前記第一プライマ
ーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長し、第四鋳型ＤＮＡに相補的な第一
プライマー伸長物（ＤＮＡ）および前記第一プライマー
のプロモーター配列に相補的な第四鋳型ＤＮＡ伸長物を
得、このようにして標的核酸配列の上流に機能可能なプ
ロモーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させ
る；（ここで第一プライマーまたは第二プライマーの核
酸配列は標的核酸配列に対して十分に相補的または相同
的であり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第
二プライマーの３’末端に向けられる） 工程８：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列（第一鋳型ＲＮ
Ａ）と相補的な配列を有する一本鎖の第三鋳型ＲＮＡの
コピーを増加させる；そして、 工程９：必要により前記ＲＮＡコピーを用いて前記工程
５から工程８を必要な回数繰り返す。1. A method for increasing the copy number of a target nucleic acid sequence at a substantially constant temperature in a reaction medium, comprising the steps of: RNA-dependent DNA polymerase, heat resistance
Ribonuclease H and thermostable DNA-dependent DNA poly
A method for amplifying a target nucleic acid sequence, comprising using one thermostable enzyme as a merase . Step 1: The single-stranded first template RNA obtained by denaturing the target nucleic acid as necessary has a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence (RNA) of the first template and a promoter sequence at the 5 ′ end thereof The first primer is hybridized and extended with a thermostable RNA-dependent DNA polymerase to obtain a first primer extension (DNA) that is a second template complementary to the first template RNA; Step 2: RNA / DNA hybrid Step 3: Separating the second template DNA from the first template RNA to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA) by a thermostable ribonuclease H that specifically decomposes only the RNA of step 3; A second primer having a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence (DNA) of the second template is hybridized to the two template DNA, and the resulting DNA is subjected to heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase. To obtain a second primer extension (DNA) complementary to the second template DNA, thus producing a double-stranded DNA intermediate having a functionally operable promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence; (Where the nucleic acid sequence of the first or second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 'end of the first primer is the 3' end of the second primer on the complementary strand Step 4: The target nucleic acid sequence (first template RN) is converted from the double-stranded DNA intermediate using a heat-resistant DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence.
A) generating a single-stranded third template RNA having a sequence complementary to A); Step 5: hybridizing the second primer to the single-stranded third template RNA, and using a heat-resistant RNA-dependent DNA polymerase Elongation to obtain a second primer extension (DNA), which is a fourth template complementary to the third template RNA; Step 6: With heat-resistant ribonuclease H, which specifically degrades only RNA of the RNA / DNA hybrid, Separating the fourth template DNA from the third template RNA to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA); Step 7: allowing the first primer to hybridize to the single-stranded fourth template DNA, First primer extension (DNA) that is extended by a sex DNA-dependent DNA polymerase and is complementary to the fourth template DNA and complementary to the promoter sequence of the first primer Obtaining a fourth template DNA extension, thus producing a double-stranded DNA intermediate having a functionally operable promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence (where the nucleic acid sequence of the first or second primer is Is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, the 3 'end of the first primer is directed to the 3' end of the second primer on the complementary strand) Step 8: Recognizing the promoter sequence The target nucleic acid sequence (first template RN) from the double-stranded DNA intermediate using a heat-resistant DNA-dependent RNA polymerase capable of
A) increasing the copy of the single-stranded third template RNA having a sequence complementary to A); and step 9: repeating steps 5 to 8 as many times as necessary using the RNA copy. 【請求項２】反応媒体中で標的核酸配列のコピー数を増
加させる方法であって、下記工程を含み、耐熱性酵素を
用いる標的核酸配列の増幅法において、耐熱性ＲＮＡ依
存ＤＮＡポリメラーゼ、耐熱性リボヌクレアーゼＨおよ
び耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼとして、一つの
耐熱性酵素を用いることを特徴とする標的核酸配列の増
幅法。 工程１：標的核酸を必要により変性処理した一本鎖の第
一鋳型ＤＮＡに、第一鋳型の核酸配列に対して十分に相
補的な配列およびその５’末端側にプロモーター配列を
有する第一プライマーをハイブリダイズさせ、耐熱性Ｄ
ＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼにより伸長し、第一鋳型Ｄ
ＮＡに相補的な第二鋳型である第一プライマー伸長物
（ＤＮＡ）を得る； 工程２：第一鋳型ＤＮＡから第二鋳型ＤＮＡを分離して
一本鎖の第二鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る； 工程３；一本鎖の第二鋳型ＤＮＡに、第二鋳型の核酸配
列（ＤＮＡ）に相補的な核酸配列（ＤＮＡ）を有する第
二プライマーをハイブリダイズさせ耐熱性ＤＮＡ依存Ｄ
ＮＡポリメラーゼにより伸長し、第二鋳型ＤＮＡに相補
的な第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得、このように
して標的核酸配列の上流に機能可能なプロモーター配列
を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；（ここで第
一プライマーまたは第二プライマーの核酸配列は標的核
酸配列に対して十分に相補的または相同的であり、第一
プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プライマーの
３’末端に向けられる） 工程４：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列（第一鋳型ＤＮ
Ａ）と相補的な配列を有する一本鎖の第三鋳型ＲＮＡの
コピーを増加させる； 工程５：一本鎖の第三鋳型ＲＮＡに、前記第二プライマ
ーをハイブリダイズさせ、耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼにより伸長させて、第三鋳型ＲＮＡに相補的な
第四鋳型である第二プライマー伸長物（ＤＮＡ）を得
る； 工程６：ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのＲＮＡのみを特
異的に分解する耐熱性リボヌクレアーゼＨにより、第三
鋳型ＲＮＡから第四鋳型ＤＮＡを分離して一本鎖の第四
鋳型核酸（ＤＮＡ）を得る； 工程７：一本鎖の第四鋳型ＤＮＡに、第一プライマーを
ハイブリダイズさせ、耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリメラ
ーゼにより伸長し、第四鋳型ＤＮＡに相補的な第一プラ
イマー伸長物（ＤＮＡ）および前記第一プライマーのプ
ロモーター配列に相補的な第四鋳型ＤＮＡ伸長物を得、
このようにして標的核酸配列の上流に機能可能なプロモ
ーター配列を有する二本鎖ＤＮＡ中間体を生成させる；
（ここで第一プライマーまたは第二プライマーの核酸配
列は標的核酸配列に対して十分に相補的または相同的で
あり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プ
ライマーの３’末端に向けられる） 工程８：前記プロモーター配列を認識することができる
耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二
本鎖ＤＮＡ中間体から前記標的核酸配列と相補的な配列
を有する一本鎖の第三鋳型ＲＮＡのコピーを増加させ
る；そして、 工程９：必要により前記ＲＮＡコピーを用いて前記工程
５から工程８を必要な回数繰り返す。2. A method of increasing the copy number of the target nucleic acid sequence in a reaction medium, comprising the following steps in the amplification method of a target nucleic acid sequence using thermostable enzymes, Yi thermostable RNA
DNA polymerase, thermostable ribonuclease H and
And heat-resistant DNA-dependent DNA polymerase
A method for amplifying a target nucleic acid sequence, comprising using a thermostable enzyme . Step 1: a first primer having a sequence sufficiently complementary to the nucleic acid sequence of the first template and a promoter sequence at the 5′-terminal side of the single-stranded first template DNA obtained by denaturing the target nucleic acid as necessary And heat resistance D
Extended by NA-dependent DNA polymerase, the first template D
Obtain a first primer extension (DNA) that is a second template complementary to NA; Step 2: separating the second template DNA from the first template DNA to obtain a single-stranded second template nucleic acid (DNA) Step 3: a second primer having a nucleic acid sequence (DNA) complementary to the nucleic acid sequence (DNA) of the second template is hybridized to the single-stranded second template DNA,
Extension with NA polymerase to obtain a second primer extension (DNA) complementary to the second template DNA, thus producing a double-stranded DNA intermediate having a functional promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence (Where the nucleic acid sequence of the first or second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 ′ end of the first primer is 3 ′ of the second primer on the complementary strand. Step 4: Directing the target nucleic acid sequence (first template DN) from the double-stranded DNA intermediate using a heat-resistant DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence
A) increasing the copy of the single-stranded third template RNA having a sequence complementary to A); Step 5: hybridizing the second primer to the single-stranded third template RNA to obtain a thermostable RNA-dependent DNA Extending with a polymerase to obtain a second primer extension (DNA) that is a fourth template complementary to the third template RNA; Step 6: heat-resistant ribonuclease H that specifically degrades only RNA of RNA / DNA hybrid Separating the fourth template DNA from the third template RNA to obtain a single-stranded fourth template nucleic acid (DNA); Step 7: allowing the first primer to hybridize to the single-stranded fourth template DNA, The first primer extension (DNA), which is extended by a thermostable DNA-dependent DNA polymerase and is complementary to the fourth template DNA, and the promoter sequence of the first primer The resulting complement specific fourth template DNA elongation product,
Thus, a double-stranded DNA intermediate having a functional promoter sequence upstream of the target nucleic acid sequence is generated;
(Where the nucleic acid sequence of the first or second primer is sufficiently complementary or homologous to the target nucleic acid sequence, and the 3 'end of the first primer is the 3' end of the second primer on the complementary strand Step 8: a single-stranded DNA having a sequence complementary to the target nucleic acid sequence from the double-stranded DNA intermediate using a thermostable DNA-dependent RNA polymerase capable of recognizing the promoter sequence. Step 9: increasing the number of copies of the template RNA; and step 9: repeating steps 5 to 8 as many times as necessary using the RNA copy. 【請求項３】試薬の逐次添加を行わず、工程１〜９を実
施する請求項１または請求項２に記載の耐熱性酵素を用
いる標的核酸配列の増幅法。3. The method for amplifying a target nucleic acid sequence using a thermostable enzyme according to claim 1 or 2, wherein steps 1 to 9 are carried out without successive addition of reagents. 【請求項４】第二鋳型の核酸配列に対して相補的な核酸
配列を有する第二プライマーが５’末端側にプロモータ
ー配列を有する請求項１〜請求項３いずれか１項に記載
の耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の増幅法。4. The heat resistance according to any one of claims 1 to 3, wherein the second primer having a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template has a promoter sequence on the 5 'end side. A method for amplifying a target nucleic acid sequence using an enzyme. 【請求項５】耐熱性ＲＮＡ依存ＤＮＡポリメラーゼ、耐
熱性リボヌクレアーゼＨおよび耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡ
ポリメラーゼとして、下記理化学的性質を有するサーマ
ス・サーモフィルス由来の酵素を用いる請求項１〜４い
ずれか１項に記載の耐熱性酵素を用いる標的核酸配列の
増幅法。 （１）次の反応を触媒する。 ＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡを合成する。ＲＮＡ／
ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡのみに特異的にかつエンド的に作
用してＤＮＡ一本鎖を生じさせる。ＤＮＡを鋳型とし
て、ＤＮＡを合成する。 （２）分子量：８５，０００〜９５，０００（３）熱安
定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持
する。 （４）至適ｐＨ：約７．５〜９．３5. A thermostable RNA-dependent DNA polymerase,
Thermophilic ribonuclease H and thermostable DNA-dependent DNA
A method for amplifying a target nucleic acid sequence using a thermostable enzyme according to any one of claims 1 to 4, wherein an enzyme derived from Thermos thermophilus having the following physicochemical properties is used as a polymerase. (1) catalyze the next reaction. DNA is synthesized using RNA as a template. RNA /
It acts specifically and endogenously only on DNA double-stranded RNA to generate a DNA single strand. DNA is synthesized using the DNA as a template. (2) Molecular weight: 85,000 to 95,000 (3) Thermal stability: After treatment at 75 ° C. for 2 hours, 50% or more activity is maintained. (4) Optimum pH: about 7.5 to 9.3 【請求項６】請求項１〜５いずれか１項に記載される標
的核酸配列を増幅産物である一本鎖ＲＮＡ、二重鎖ＤＮ
ＡまたはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドに、必要により変
性処理を行った後、標識プローブをハイブリダイズさ
せ、ハイブリダイズした標識プローブの標識またはハイ
ブリダイズしない標識プローブの標識を検出することを
特徴とする標的核酸配列の検出法。6. A single-stranded RNA or a double-stranded DN which is an amplification product of the target nucleic acid sequence according to any one of claims 1 to 5.
A or a DNA / RNA hybrid, if necessary, after denaturation treatment, followed by hybridization of a labeled probe, and detection of a label of a hybridized labeled probe or a label of a non-hybridized labeled probe. Detection method. 【請求項７】 特定の核酸配列を増幅するためのキット
であって、 （ａ）第一鋳型の核酸配列に対して十分に相補的な配列
およびその５’末端側にプロモーター配列を有する第一
プライマー、 （ｂ）第二鋳型の核酸配列に対して相補的な核酸配列を
有する第二プライマー、 （ｃ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリボ
ヌクレアーゼＨ活性を有する耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポ
リメラーゼ、 （ｄ）耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、 （ｅ）リボヌクレオシドトリホスフェートおよび （ｆ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを
含み、 ただし、第一プライマーまたは第二プライマーの核酸配
列は標的核酸配列に対して十分に相補的または相同的で
あり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プ
ライマーの３’末端に向けられるキット。7. A kit for amplifying a specific nucleic acid sequence, comprising: (a) a first sequence having a sequence sufficiently complementary to a nucleic acid sequence of a first template and a promoter sequence at the 5 ′ end thereof; A primer, (b) a second primer having a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template, (c) a thermostable DNA-dependent DNA polymerase having RNA-dependent DNA polymerase activity and ribonuclease H activity, (d) A thermostable DNA-dependent RNA polymerase, (e) ribonucleoside triphosphate and (f) deoxyribonucleoside triphosphate, wherein the nucleic acid sequence of the first primer or the second primer is sufficiently complementary to the target nucleic acid sequence or Homologous, the 3 'end of the first primer is the 3' end of the second primer on the complementary strand Kit that is directed. 【請求項８】 特定の核酸配列を増幅するためのキット
であって、 （ａ）第一鋳型の核酸配列に対して十分に相補的な配列
およびその５’末端側にプロモーター配列を有する第一
プライマー、 （ｂ）第二鋳型の核酸配列に対して相補的な核酸配列お
よびその５’末端側にプロモーター配列を有する第二プ
ライマー、 （ｃ）ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびリヌ
クレアーゼＨ活性を有する耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮＡポリ
メラーゼ、 （ｄ）耐熱性ＤＮＡ依存ＲＮＡポリメラーゼ、 （ｅ）リボヌクレオシドトリホスフェートおよび （ｆ）デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートとを
含み、 ただし、第一プライマーまたは第二プライマーの配列は
標的核酸配列配列に対して十分に相補的または相同的で
あり、第一プライマーの３’末端は相補的鎖上の第二プ
ライマーの３’末端に向けられるキット。8. A kit for amplifying a specific nucleic acid sequence, comprising: (a) a first nucleic acid sequence having a sequence sufficiently complementary to a nucleic acid sequence of a first template and a promoter sequence at the 5 ′ end thereof; A primer, (b) a second primer having a nucleic acid sequence complementary to the nucleic acid sequence of the second template and a promoter sequence at the 5 'end thereof, (c) having an RNA-dependent DNA polymerase activity and a nuclease H activity A thermostable DNA-dependent DNA polymerase, (d) a thermostable DNA-dependent RNA polymerase, (e) ribonucleoside triphosphate and (f) deoxyribonucleoside triphosphate, wherein the sequence of the first primer or the second primer is a target nucleic acid. The sequence is sufficiently complementary or homologous to the sequence, and the 3 ′ end of the first primer is Kits directed to the 3 'end of the second primer on complementary strands. 【請求項９】ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およ
びリヌクレアーゼＨ活性を有する耐熱性ＤＮＡ依存ＤＮ
Ａポリメラーゼが、下記理化学的性質を有するサーマス
・サーモフィルス由来の酵素である請求項７〜８いずれ
か１項に記載の特定の核酸配列を増幅するためのキッ
ト。 （１）次の反応を触媒する。 ＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡを合成する。ＲＮＡ／
ＤＮＡ二本鎖のＲＮＡのみに特異的にかつエンド的に作
用してＤＮＡ一本鎖を生じさせる。ＤＮＡを鋳型とし
て、ＤＮＡを合成する。 （２）分子量：８５，０００〜９５，０００（３）熱安
定性：７５℃、２時間処理後、５０％以上の活性を保持
する。 （４）至適ｐＨ：約７．５〜９．３9. A thermostable DNA-dependent DN having RNA-dependent DNA polymerase activity and nuclease H activity.
The kit for amplifying a specific nucleic acid sequence according to any one of claims 7 to 8, wherein the A polymerase is an enzyme derived from Thermus thermophilus having the following physicochemical properties. (1) catalyze the next reaction. DNA is synthesized using RNA as a template. RNA /
It acts specifically and endogenously only on DNA double-stranded RNA to generate a DNA single strand. DNA is synthesized using the DNA as a template. (2) Molecular weight: 85,000 to 95,000 (3) Thermal stability: After treatment at 75 ° C. for 2 hours, 50% or more activity is maintained. (4) Optimum pH: about 7.5 to 9.3 【請求項１０】 さらにカリウムイオン、マグネシウム
イオンおよびマンガンイオンを含有する請求項７〜８い
ずれか１項に記載の核酸配列を増幅するためのキット。10. The kit for amplifying a nucleic acid sequence according to claim 7, further comprising a potassium ion, a magnesium ion and a manganese ion. 【請求項１１】 マグネシウムイオンとマンガンイオン
の比率が１：１〜４：１であり、デオキシリボヌクレオ
シドトリホスフェート（ｄＮＴＰ）とリボヌクレオシド
トリホスフェート（ｒＴＮＰ）の比率が１：１０〜１
０：１である請求項１０に記載の核酸配列を増幅するた
めのキット。11. The ratio of magnesium ion to manganese ion is from 1: 1 to 4: 1, and the ratio of deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) to ribonucleoside triphosphate (rTNP) is from 1:10 to 1: 1.
The kit for amplifying a nucleic acid sequence according to claim 10, wherein the ratio is 0: 1. 【請求項１２】請求項７〜１０いずれか１項に記載の核
酸配列を増幅するためのキットが、さらに検出プローブ
を含有することを特徴とする特定の核酸配列を検出する
ためのキット。12. A kit for detecting a specific nucleic acid sequence, wherein the kit for amplifying a nucleic acid sequence according to any one of claims 7 to 10 further comprises a detection probe.