JP3215752B2 - 分析方法及び分析装置 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は分析方法及び分析装置に
係わり、特に、測定対象物を粒子で標識した後に、粒子
をフローセルに導いて計測し測定対象物の濃度を計測す
る分析方法及び分析装置に関する。

【０００２】

【従来の技術】感染症の診断には、病原性微生物の検出
同定が必須である。しかし、感染症の原因微生物を培養
によって検出同定するには時間がかかり、疾病の診断と
治療に間にあわないことが多い。

【０００３】そこで近年、核酸ハイブリダイゼーション
の技術を使用して、試料中の特定塩基配列の有無を調べ
ることにより、感染症の病原菌の特定並びに感染症の発
症前の診断が可能になってきた。

【０００４】即ち、ＤＮＡプローブを用いる方法であ
る。これは、検出対象とする核酸の塩基配列に相補的な
配列を有する一本鎖ＤＮＡ（これをＤＮＡプローブと呼
ぶ）を特異的な反応試薬として利用するものである。試
料中にＤＮＡプローブの塩基配列と相補的な塩基配列の
有無を検出することにより、目的病原菌の有無を判断で
きる。

【０００５】具体的な方法としては各種提案されてき
た。例えば日本臨床、４７巻、７３７−７５４（１９８
９）等に紹介されている。例としては、ドットハイブリ
ダイゼーション法と呼ばれる方法がある。これは、試料
を変性処理して得た一本鎖ＤＮＡ（ｓｓ−ＤＮＡ）を固
相に結合させ、この固相にラジオアイソトープを標識し
たｓｓ−ＤＮＡを作用させて固相のｓｓ−ＤＮＡとハイ
ブリットを形成させてから未反応の標識ｓｓ−ＤＮＡを
除去し、固相の放射能を測定する方法である。

【０００６】この方法の変法として、サンドウィッチハ
イブリダイゼーション法がある。この方法では、吸着に
よるバックグラウンドを下げることができ、不純なサン
プルを用いる場合に特に有効である。この方法では、識
別しようとする標識核酸に由来するＤＮＡフラグメント
を少なくとも２つ使用する。一方のＤＮＡフラグメント
は固相に結合させて、捕獲試薬として使用する。もう一
方のＤＮＡフラグメントは検出試薬として標識し、ハイ
ブリダイゼーション溶液に可容化した標本サンプルと一
緒に加える。標本サンプル中に、両方の試薬に相同的な
塩基配列が存在している場合には、その配列は、捕獲試
薬にも検出試薬にもハイブリダイズするはずである。ハ
イブリダイズしたか否かは、固相への標識を介して知る
ことができる。

【０００７】また、特公平３−７８１２０公報では制限
酵素を用いる方法が提案されている。この方法では、測
定対象である一本鎖ポリヌクレオチドを、標識物が結合
されかつ測定対象一本鎖ポリヌクレオチドと反応して二
本鎖ポリヌクレオチドを形成しえる一本鎖ポリヌクレオ
チドを結合した固相と溶液中で接触させて二本鎖ポリヌ
クレオチドを形成させて、形成した二本鎖ポリヌクレオ
チドに制限酵素を作用させてこの二本鎖ポリヌクレオチ
ドを切断し、溶液または固相の標識物を測定する。

【０００８】同様に、制限酵素又は選択可能な切断部位
を導入した試薬を用いる方法が特開平２−９２３００号
公報に示されている。

【０００９】一方、核酸分析との関連付けはないが、免
疫分析法でフィルターの下部に排出孔を設けた反応容器
を使用する方法が特開平２−２２８５６２号公報、特開
平２−２２８５６３号公報他に提案されている。この従
来技術は、固相上の試薬を洗浄する方法として、またＢ
／Ｆ分離（結合型の部分−bound −と遊離型の部分−fr
ee−との分離）の操作を簡単に行う方法として、反応容
器のフィルター上部から加圧し、フィルターの下に設け
られた排出孔を介して液体を排出する。

【００１０】また、核酸分析との関連付けはないが、特
開平４−２７３０６５号公報は、微粒子を標識体として
用いる高感度免疫分析方法を提案している。この従来技
術では、微粒子を標識体として用い、抗原抗体反応など
の特異反応により測定対象物量に比例した微粒子を反応
固相に捕獲した後、これを遊離させて、遊離液中の微粒
子数を計数することにより、測定対象物量を求める。遊
離体を含む被測定液をフローセル中に導入し、流れと直
交する方向から照射したレーザ光束中を微粒子が通過す
る際に発生するパルス状の蛍光を検出し、パルス数を数
えることにより、微粒子を計数する。この従来技術で
は、一旦反応固相上に捕捉された標識物すなわち微粒子
を遊離させてから計測するので、非特異的に固相に結合
する標識物の影響を免れることができた。微粒子を標識
とし、これを計数することにより、低濃度でも直線性の
高い検出を実現している。

【００１１】

【発明が解決しようとする課題】上記のとおり従来行な
われてきた核酸の検出法は、放射性アイソトープでラベ
ルされたＤＮＡプローブが広く使用されている。アイソ
トープを使用するとコストが高くなる上、取り扱う際の
安全性や廃棄の点を考慮しなくてはならない。また、従
来の技術であるドットハイブリダイゼーション法やサン
ドウィッチハイブリダイゼーション法では検出対象の核
酸の量が少ない場合に問題があり、その上、測定時に数
多くの作業工程を必要とし、測定の自動化という面から
見ると適しているとは言い難い。

【００１２】また、特公平３−７８１２０号公報に記載
の従来技術では、一本鎖ポリヌクレオチドに付けた標識
物を反応により遊離させて測定している。しかし、遊離
した標識物の測定は反応液全体の測定対象物の濃度に依
存した形で行われるため、試料中の測定対象物がごく微
量であった場合に検出感度が落ちる。また、反応容器の
形状については言及しておらず、通常の有底の反応容器
を使用した場合には洗浄工程やＢ／Ｆ分離作業が繁雑と
なり、これも測定の自動化という面から見ると適してい
るとは言い難い。

【００１３】特開平２−９２３００号公報に記載の従来
技術も特公平３−７８１２０号公報と同じ問題がある。

【００１４】特開平２−２２８５６２及び特開平２−２
２８５６３に記載の従来技術では、フィルターの下に排
出孔を設けた反応容器を用いてフィルターの上部から加
圧し、排出孔を介して液を排出することにより、洗浄工
程及びＢ／Ｆ分離の操作を簡単にしている。しかし、遊
離した標識物の測定は、フィルターの上に残っている反
応液を反応容器ごと検出器の方へ持っていく方式であ
る。この方式では反応容器を収用できる様な特別な検出
器が必要な上、容器の壁を通して測定を行なうため感度
の方にも問題がある。

【００１５】特開平４−２７３０６５号公報に記載の従
来技術では、遊離した標識体微粒子を測定するのに、当
該微粒子を含む被測定液をフローセル中に導入し、光学
的に微粒子数を計測しているため、高感度の測定が可能
であるが、しかし、この従来技術でも有底の反応容器を
使用しているため、洗浄工程やＢ／Ｆ分離作業が繁雑と
なり、これも測定の自動化という面から見ると適してい
るとは言い難い。

【００１６】本発明の目的は、自動的かつ高感度で試料
中の核酸を測定することができる分析方法及び分析装置
を提供することである。

【００１７】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、本発明の分析方法は、（ａ）粒径の異なる２種類の
微小粒子であって、一方の微小粒子は標識物の付いた小
粒子で、他方の微小粒子は前記小粒子よりも大きな粒径
を持つ大粒子としたものを用意すること、（ｂ）前記２
種類の微小粒子を試料中の測定対象物を介して結合させ
ること、（ｃ）前記小粒子の粒径よりも大きく、前記大
粒子の粒径よりも小さな孔径を持つフィルターを用いて
未結合の小粒子を除去すること、（ｄ）測定対象物を介
して結合した小粒子と大粒子の結合物を特異的に切断す
ること、（ｅ）前記フィルターを用いて小粒子のみを分
別すること、（ｆ）その小粒子の標識物を測定すること
によって試料中の測定対象物の濃度を測定することを特
徴としている。

【００１８】また、上記目的を達成するため、本発明の
分析装置は、粒径の異なる２種類の微小粒子であって、
一方の微小粒子は標識物の付いた小粒子で、他方の微小
粒子は前記小粒子よりも大きな粒径を持つ大粒子とした
ものを用いて試料中の測定対象物の濃度を測定する分析
装置において、（ａ）少なくとも１つの反応室、前記反
応室の底部に配置され、前記小粒子の粒径よりも大き
く、前記大粒子の粒径よりも小さな孔径を持つフィルタ
ー、このフィルターの更に下方に設けられた液体流下抵
抗部材、前記反応室から前記フィルター及び液体流下抵
抗部材を通過した液体を排出する小孔を有する反応容器
と、（ｂ）前記反応容器が複数個配列されるターンテー
ブルと、（ｃ）前記反応容器の反応室に前記試料、前記
２種類の微小粒子を含む試薬、洗浄液及び結合部位を特
異的に切断する試薬を注入する分注供給手段と、（ｄ）
前記反応室と前記小孔との間に圧力差を発生させ、前記
反応室内の液体を前記小孔から排出する圧力差発生手段
と、（ｅ）前記小孔から排出された液体に含まれる前記
小粒子の標識物を計測し、試料中の測定対象物の濃度を
測定する計測手段とを備えることを特徴としている。

【００１９】上記分析装置において、前記計測手段は好
ましくは前記反応容器の小孔を介して液体が導入される
フローセルを有し、このフローセルを通る小粒子の標識
物に基づく光学的特性を測定して試料中の測定対象物の
濃度を測定する。また、好ましくは、前記反応容器の小
孔は反応容器の下端に設けられた排出ノズルに形成さ
れ、この排出ノズルは前記フローセルの注入室入口に直
接差し込まれる。

【００２０】

【００２１】

【００２２】

【００２３】

【作用】本発明の分析方法においては、粒径の異なる２
種類の微小粒子とそれらの粒径の中間の孔径を持つフィ
ルターを用い、２種類の微小粒子を試料中の測定対象物
を介して結合した後の未結合の小粒子はフィルターに通
すことで排出され（Ｂ／Ｆ分離）、また小粒子と大粒子
の結合物を切断した後の小粒子もフィルターに通すこと
で分別される（Ｂ／Ｆ分離）。また、洗浄液を注入すれ
ば、その洗浄液もフィルターを通して排出され、反応室
及びフィルターが洗浄される。このように、２種類の微
小粒子とそれらの粒径の中間の孔径を持つフィルターを
用いてＢ／Ｆ分離や洗浄工程を行なうため、容器を傾け
たりピペッティングノズルを用いて反応液や洗浄液を取
り出す等の操作が不要となり、Ｂ／Ｆ分離や洗浄工程が
極めて簡単となり、測定の自動化が容易となる。また、
分別した蛍光性の微小粒子は直接フローセルに導入する
ことができ、操作時間を短縮できる。更に、標識物をフ
ローセルで測定できるので、高感度な測定が可能とな
る。

【００２４】本発明の分析装置においては、試料と上記
２種類の微小粒子を含む試薬とを分注供給手段を用いて
反応容器の反応室に注入し、反応室中で２種類の微小粒
子を試料中の測定対象物を介して結合させ、次に圧力差
発生手段を用いて反応室と小孔との間に圧力差を発生さ
せ、未結合の小粒子を液体流下抵抗部材の抵抗に抗して
フィルターを通して除去する。このとき、分注供給手段
を用いて必要に応じて洗浄液を注入し、反応室及びフィ
ルターを洗浄する。次いで、接合部位を特異的に切断す
る試薬を分注供給手段を用いて反応室に注入し、小粒子
と大粒子の結合物を切断し、再び圧力差発生手段を用い
て切断後の小粒子を液体流下抵抗部材の抵抗に抗してフ
ィルターを通して分別する。このときも必要に応じ分注
供給手段を用いて洗浄液を注入する。このように分別さ
れた標識物の付いた微小粒子である小粒子は計測手段、
好ましくはフローセルに導入され、小粒子の標識物を計
測し、試料中の測定対象物の濃度が測定される。このよ
うに本発明の分析方法を実施できる。

【００２５】反応容器の小孔を反応容器の下端に設けら
れた排出ノズルに形成し、この排出ノズルをフローセル
の注入室入口に直接差し込むことにより、非測定液のフ
ローセルへの移送が容易となり、測定時間が短縮され
る。

【００２６】

【００２７】

【実施例】まず、本発明の分析方法の一実施例を図１に
より説明する。まず、標識物の付いた微小粒子４０１に
結合させたポリヌクレオチド（ＤＮＡプローブ）４０２
を含む第１の試薬と、標識物の付かない微小粒子４０３
に結合させたポリヌクレオチド（ＤＮＡプローブ）４０
４を含む第２の試薬とを準備する。ここで、第１及び第
２の試薬のポリヌクレオチド（ＤＮＡプローブ）４０
２，４０４としては、試料中の測定対象物であるサンプ
ルＤＮＡに対して相補的なヌクレオチド配列を持つが、
互いには相補的なヌクレオチド配列を持たないものを使
用する。また、第１の試薬の微小粒子４０１は小粒子と
し、第２の試薬の微小粒子４０３は第１の試薬の微小粒
子４０１よりも大きな粒径を持つ大粒子とする。標識物
の付いた微小粒子４０１としては蛍光性の微小粒子を用
いるのが好適である。

【００２８】このようにして第１及び第２の試薬を準備
した後、反応容器の反応室に試料と第１の試薬とを注入
し（図１）、試料中のサンプルＤＮＡ４０５と第１の
試薬中の蛍光粒子標識ＤＮＡプローブ４０２とをハイブ
リダイズして二本鎖を形成させる（図１）。次いで、
反応容器の反応室に第２の試薬を注入し（図１）、試
料中のサンプルＤＮＡ４０５と第２の試薬中の非蛍光粒
子結合ＤＮＡプローブ４０４とを更にハイブリダイズし
て二本鎖を形成させる（図１）。

【００２９】このようにして２種類の微小粒子４０１，
４０３をサンプルＤＮＡ４０５に結合した後、第１の試
薬中の微小粒子４０１の粒径よりも大きく、第２の試薬
中の微小粒子４０３の粒径よりも小さな孔径を持つフィ
ルター４０６を用いて、反応液をフィルター４０６に通
して排出させ、未結合の余剰蛍光粒子標識ＤＮＡプロー
ブ４０２を除去し、第１のＢ／Ｆ分離を行なう（図１
）。このとき、必要に応じて洗浄液を注入し、反応容
器及びフィルター４０６を洗浄する。これらの操作は、
今まで使用した反応容器にフィルター４０６と共に反応
液の排出を制御できる機構を設けて行なってもよいし、
フィルター４０６と排出開口を備えた別の反応室を用い
て行なってもよい。

【００３０】次いで、反応室に適当な制限酵素液を注入
して制限酵素４０７を作用させ、ハイブリダイゼーショ
ンによって形成した二本鎖部位を切断する（図１）。
これにより、フィルター４０６にトラップされた蛍光性
の微小粒子４０１が遊離し、遊離した蛍光性の微小粒子
４０１は上記と同様に反応液と共にフィルター４０６を
通して分別される（図１）。このようにして第２のＢ
／Ｆ分離を行なう。このときも、必要に応じて洗浄液を
添加する。

【００３１】このようにして分別された蛍光性微小粒子
４０１を含む排出液はフローセルに導入され、フローセ
ルを通る微小粒子に基づく蛍光を検出し、粒子数を計数
する。計数された粒子数に基づいて上記試料中の測定対
象物であるサンプルＤＮＡの濃度を演算することができ
る。

【００３２】以上のような分析方法によれば、粒径の異
なる２種類の微小粒子４０１，４０３とそれらの粒径の
中間の孔径を持つフィルター４０６を用いてＢ／Ｆ分離
や洗浄工程を行なうため、容器を傾けたりピペッティン
グノズルを用いて反応液や洗浄液を取り出す等の操作が
不要となり、Ｂ／Ｆ分離や洗浄工程が極めて簡単とな
る。このため、測定の自動化が容易となる。また分別し
た蛍光性の微小粒子４０１を直接フローセルに導入する
ことも可能であり、操作時間を短縮できる。また、標識
物をフローセルを用いて計数するので、高感度な測定が
可能となる。

【００３３】なお、以上の実施例で、蛍光粒子標識ＤＮ
Ａプローブ４０２を含む第１の試薬と非蛍光粒子結合Ｄ
ＮＡプローブ４０４を含む第２の試薬の注入順序は逆で
もよいし、同時でもよい。

【００３４】次に、以上の分析方法を実施するための装
置及びその分析方法に使用する反応容器の実施例を図２
〜図７により説明する。

【００３５】図２は本発明の分析方法を実施するための
自動分析装置の全体構成を示す概略図であり、図３〜図
５はその分析方法に使用する反応容器の構成を示す図で
ある。

【００３６】図１において、本実施例の自動分析装置は
４つのターンテーブル１，２，３，３５を有している。
ターンテーブル１には、血液などの試料を収容した複数
のサンプル容器３３がサークル状に配列されている。ま
た、ターンテーブル２には複数の反応容器３４ａがサー
クル状に配列され、ターンテーブル３上には複数の反応
容器３４ｂがサークル状に配列されている。更に、ター
ンテーブル３５は試薬テーブルであり、分析操作に必要
な各種の試薬液容器がサークル状に配列されている。す
なわち、核酸を測定対象とする分析項目Ａ，Ｂ，Ｃにそ
れぞれ対応する第１の試薬である蛍光性粒子標識プロー
ブ液を収容した容器９０ａ，９０ｂ，９０ｃと、第２の
試薬である粒子結合プローブ液を収容した容器３６ａ，
３６ｂ，３６ｃと、制限酵素液収容容器３８と、洗浄液
その他必要な緩衝液の容器等が試薬テーブル３５上に保
持されている。第２の試薬である粒子結合プローブ液に
含まれる粒子は、第１の試薬である蛍光性粒子標識プロ
ーブ液に含まれる蛍光性粒子よりも大きな粒径を有して
いる。

【００３７】ターンテーブル１，２，３５は、図示しな
いコントローラによって制御されるパルスモータ９１，
９２，９３によって所望のサンプル容器３３あるいは反
応容器３４ａあるいは試薬液容器を、ピペッティングノ
ズル４３による吸引位置あるいは吐出位置にて停止する
ように回転自在に構成されている。ターンテーブル３も
図示しないコントローラによって制御されるパルスモー
タ９４によって所望の反応容器３４ｂをターンテーブル
２上の反応容器３４ａと整合する位置にて停止するよう
に回転自在に構成されている。また、ターンテーブル２
には、ターンテーブル２を上下動させる駆動装置９５が
設けられている。

【００３８】反応容器３４ａは、図３に示すように、複
数の反応室３４１，３４２と複数の試料室３４３，３４
５を有し、反応室の１つである反応室３４１は底部が開
口しており、その開口した底部にフィルター３４６が配
置されている。反応容器３４ｂは、図４に示すように、
上部にキャップ３４７と下部に小孔３４８を持つ排出ノ
ズル３４８ａとを有している。キャップ３４７は反応容
器３４ａのフィルター３４６の下部開口部と図５に示す
ように結合可能であり、またその下部開口部に結合した
とき反応室３４１と小孔３４８との間に圧力差がなけれ
ば反応室３４１内の液が保持される液体流下抵抗部材と
しての構造を持つ。具体的には、キャップ３４７を弾性
のある素材で構成し、図４（Ｂ）に示すようにその素材
に十文字の切れ目を入れ、キャップ３４７の上下で圧力
差が生じるとその切れ目が開き、圧力差がなくなれば閉
じるような構造である。反応室３４１と小孔３４８との
間に発生させる圧力差は、本実施例では図２に示すよう
に加圧源１０２に接続された加圧装置１０１で反応室３
４１側から加圧することにより発生させる。

【００３９】フィルター３４６は、第１の試薬である蛍
光性粒子標識プローブ液に含まれる蛍光性粒子の粒径よ
り大きく、第２の試薬である粒子結合プローブ液に含ま
れる粒子の粒径より小さな孔径を有している。

【００４０】３９は自動ピペット機構であり、可動アー
ム４２に取り付けられた上記ピペッティングノズル４
３、可動アーム４２を水平回転させるための回転駆動部
４５、可動アーム４２を上下動するための上下駆動部４
４、チューブ４１を介してノズル４３に接続されたシリ
ンジポンプ４０、押出液を兼ねた洗浄液槽３７、ノズル
洗浄槽９６を備えている。可動アーム４２の動作に伴っ
てピペッティングノズル４３は、ターンテーブル１上の
試料吸入位置、ターンテーブル３５上の試薬吸入位置、
ターンテーブル２上の試料・試薬分注位置、及びノズル
洗浄槽９６の上を回転半径として回転することができ、
それぞれの位置で下降及び上昇することができる。

【００４１】ターンテーブル１，２，３，３５及び自動
ピペット機構は反応恒温槽９８内に配置されている。

【００４２】以上の装置の動作は次の用である。まず、
サンプル容器３３内のサンプルの移送を、ピペッティン
グノズル４３によって行なう。即ち、ピペッティングノ
ズル４３によりサンプルの一定量が吸入され、サンプル
吐出位置に移送された反応容器３４ａ内の試料室３４３
内に吐出され、必要に応じて希釈をされた後、ピッペッ
ティングノズル４３によって、反応室３４２へ吐出され
る。

【００４３】パルスモータ９３は試薬テーブル３５を所
望の角度回転し、必要なタイミングで指定された試薬容
器をノズル４３による吸入位置に停止するように位置づ
ける。第１の試薬は、ノズル４３によって第１の試薬分
注位置で反応容器３４ａの反応室３４２内に注入される
（図１参照）。また、第２の試薬は、ノズル４３に
よって第２の試薬分注位置で反応容器３４ａの反応室３
４２内に注入される（図１参照）。

【００４４】いま、反応容器３４ａが第１試薬の分注位
置にくると、ノズル４３により第１の試薬が一定量吸入
されて分注位置に移送されている反応容器３４ａ内の反
応室３４２に分注する。この動作が終わると、ターンテ
ーブル２は反時計方向に３６０°＋反応容器１ピッチ
（１サイクル）分回転して停止する。いま、ターンテー
ブルの回転及び停止している間の時間を２０秒とする
と、２０秒を１サイクルとして上記の動作を繰り返す。
すなわち、第１の試薬が分注された特定の反応容器３４
ａは、上記サイクルが進むにつれてターンテーブル２が
停止している状態での位置が反応容器１ピッチ分ずつ反
時計方向に進むことになる。第１の試薬が分注された特
定の反応容器についてみたとき、ターンテーブル２が停
止している状態での位置が例えば反応容器１ピッチ分進
んだ位置で、第２の試薬を分注する。これにより、反応
容器３４ａ内の反応室３４２には、試料、第１試薬及び
第２試薬が分注され、反応が進行する。

【００４５】反応容器３４ａの反応室３４２中で反応さ
せた試料と粒子標識プローブと蛍光性粒子標識プローブ
とのハイブリダイゼーション反応液は、反応液分注位置
においてピペッティングノズル４３によって反応容器３
４ａの反応室３４１に注入される。フィルタ洗浄位置に
おいては、加圧装置１０１が作動して、フィルタ３４６
の孔径よりも小さな未反応の第１の試薬中の蛍光性粒子
プローブをフィルター３４６に通して反応容器外に排出
する（図１参照）。ノズル４３によって洗浄液を反応
室３４１に注入して加圧装置１０１を作動させることを
繰り返して、フィルター３４６の洗浄を徹底する。

【００４６】反応室３４１の洗浄を終了すると、図６に
示すように、容器結合位置において駆動装置９５の作動
でターンテーブル２が下降して、反応容器３４ａにター
ンテーブル３上の容器３４ｂを結合した後、駆動装置９
５が逆方向に作動してターンテーブル２を上昇させる。
その後、制限酵素液分注位置において、ノズル４３によ
って制限酵素液収容容器３８から制限酵素液が分注され
る（図１参照）。所定時間を経過した後に測定液取り
出し位置において駆動装置９５が作動してターンテーブ
ル２を加工させ、容器３４ｂの排出ノズル３４８ａを図
７に示すようにシースフローセル４７の注入室入口４８
に差し込み、加圧装置１０１が作動して測定液が小孔３
４８よりシースフローセル４７内に導入される（図１
参照）。

【００４７】シースフローセル４７の内部構成は、既知
のフローサイトメータで用いられているものと同様であ
るが、上方には特開平２−８０９３７号公報に示されて
いるものと同等の試薬注入室が開口されている。それゆ
え、小孔３４８を介して注入室入口４８から被測定液を
シースフローセル４７内に吐出することができる。そし
て、送液ポンプ９によってシース液槽６内のシース液が
一定流量で送液され、フローセル４７の内壁に沿って流
れ、廃液溜９５に排出される。フローセル４７内に導入
された被測定液は、シース液の流れの中央を流れる。

【００４８】レーザ光源４９は、発振波長が４８８ｎｍ
のアルゴンレーザを出射することができ、このレーザ光
束はビームエクスパンダ５０でビーム幅を広げられた
後、レンズ５１によって絞られ被測定液の流れに合焦点
するようにシースフローセル４７に照射される。フロー
セル４７からの蛍光の集光には顕微鏡用の対物レンズ５
２を用いている。光電検知器としてのフォトマルチプラ
イヤ５３の前に空間フィルタ５４及び波長選択フィルタ
５５を設け、散乱光及びラマン光を除去する。フォトマ
ルチプライヤ５３の出力をプリアンプ１８で増幅した
後、リニアアンプ１９で増幅し、下限波高弁別器２０ａ
及び上限波高弁別器２０ｂによりノイズを除去する。そ
の後２種の閾値の間にあるパルスをカウンタ５６で積算
する。

【００４９】トランス９６及び高圧電源９７を介してフ
ォトマルチプライヤ５３には高電圧が印加される。試料
番号、計数結果、検量線、蛍光測定のヒストグラム、等
はディスプレイ５７，プリンタ２２，フロッピーディス
ク５８に出力する。またインターフェイス５９を介し
て、パーソナルコンピュータとも通信できる。

【００５０】次に、核酸分析を一例にとり具体例を説明
する。核酸分析のそれぞれの測定対象項目に関する反応
の過程は似通っているので、ここではＨＢＶ（Ｂ型肝炎
ウイルス）の場合を例にとって、反応容器内における分
析操作過程を説明する。分析項目は、操作開始後に加え
られる粒子プローブの種類によって特定される。

【００５１】蛍光性粒子標識プローブ液容器９０ａに
は、蛍光性物質としてのクマリン誘導体が含有されてい
る蛍光標識ラテックス粒子（直径０．１ｕｍ）に一本鎖
ＨＢＶ−ＤＮＡプローブタイプ１を結合させた蛍光標識
ラテックス粒子試薬を準備しておく。一方、粒子結合プ
ローブ液容器３６ａには、一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプロー
ブタイプ２を固定化したラテックス粒子試薬（直径０．
９ｕｍ）を準備しておく。それぞれの一本鎖ＨＢＶ−Ｄ
ＮＡプローブ（一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプローブタイプ１
と一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプローブタイプ２）は、測定対
象の核酸成分に対して相補的なヌクレオチド配列を持つ
が、互いには相補的なヌクレオチド配列を持たないもの
を使用した。

【００５２】制限酵素液としては、蛍光標識ラテックス
粒子に結合させた一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプローブタイプ
１と測定対象の核酸成分がハイブリダイズして形成した
二本鎖ＤＮＡを切断する制限酵素として、例えばＨａｅ
III を準備しておく。

【００５３】分析操作が開始されると、ノズル４３によ
り蛍光標識ラテックス粒子試薬を試薬テーブル３５上の
容器６０ａからノズル４３で一定容量吸入し、対応する
反応容器３４ａ内の反応室３４２に吐出することによっ
て、当該反応容器をＨＢＶ分析用であることを特定す
る。

【００５４】このようにして準備された反応容器３４ａ
の反応室３４２には、次いでサンプル容器３３からノズ
ル４３によって分取された試料が添加される。試料中の
ＨＢＶ−ＤＮＡは，一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプローブタイ
プ１を結合させた蛍光標識ラテックス粒子と反応する。
この反応を１５分間行わせた。

【００５５】次に、ラテックス粒子試薬液容器３４ａか
らラテックス粒子試薬をノズル４３で一定量吸入し、対
応する反応容器３４ａの反応室３４２に吐出する。反応
容器３４ａは所定温度（３７℃）のもとで一定時間（１
５分間）ターンテーブル上で反応を維持する。これによ
り、先のハイブリダイズ反応物にさらに一本鎖ＨＢＶ−
ＤＮＡプローブタイプ２が反応する。

【００５６】ターンテーブル２上の反応液分注位置で
は、反応容器３４ａの反応室３４１の上部に加圧装置１
０１が配置されている。該位置に反応容器３４ａが移送
されると、ピペッティングノズル４３によって反応液を
反応容器３４ａの反応室３４１に注入する。フィルター
３４６は孔径０．６ｕｍ、直径１０ｍｍのメンブレンフ
ィルタを使用した。フィルタ洗浄位置においては、ノズ
ル４３によって洗浄液を反応容器３４ａ内の反応室３４
１に注入して加圧装置１０１を作動させることを繰り返
した。次いで、ターンテーブル３の回転により反応容器
４３ｂがターンテーブル２上の対応する反応容器３４ａ
の反応室３４１と結合した後、試薬テーブル３５の回転
により吸入位置に制限酵素液容器３８が位置付けられ、
その容器３８内の制限酵素ＨａｅIII を含む液がピペッ
ティングノズル４３により一定量吸入され、ターンテー
ブル２上の対応する反応容器３４ａの反応室３４１に吐
出される。反応室３４１では、蛍光標識ラテックス粒子
に結合させた一本鎖ＨＢＶ−ＤＮＡプローブタイプ１と
測定対象の核酸成分がハイブリダイズして形成した二本
鎖ＤＮＡが、所定の切断箇所で切断される。これによ
り、反応室３４１内の液に蛍光標識ラテックス粒子が浮
遊する。これらの遊離体を含む被測定液は、測定液取り
出し位置において、加圧装置１０１が作動して測定液が
とりだされてシースフローセル４７に吐出される。

【００５７】本発明の分析方法で使用される反応容器の
他の実施例を図８に示す。この実施例では、反応容器６
０は図３〜図５に示したものと異なり一体構造をしてい
る。即ち、反応容器６０はフィルター３４６を備えた容
器部と、液体流下抵抗部材としてのキャップ３５５及び
小孔６０７を持つ排出ノズル６０７ａを備えた容器部と
が一体になっている。本実施例ではこのように２つの容
器部が一体であるため、ターンテーブル３は不要とな
る。

【００５８】更に、反応容器の他の実施例として、図９
及び図１０に示すような反応容器３４ａ，３４ｃを用い
てもよい。この実施例では、反応容器３４ｃは容器の壁
面に小孔３５１を形成した排出ノズル３５１ａを備えて
いる。この場合、図２に示す自動分析装置において、加
圧装置１０１に加えて吸引装置が必要となる。この吸引
装置は、２つの容器３４ａ，３４ｃが図９に示すように
結合されているとき容器３４ｃの小孔３５１を持つ排出
ノズル３５１ａに接続され、小孔３５１から吸引するこ
とにより、液体流下抵抗部材であるキャップ３５０の前
後に圧力差を発生させ、反応室３４１内の反応液を容器
３４ｃ内に移動させる。

【００５９】本実施例の反応容器３４ａ，３４ｃを用い
た図２に示す自動分析装置の動作は次のようである。

【００６０】まず、サンプル容器３３内のサンプルの移
送は、ピペッティングノズル４３によって行なわれる。
ピペッティングノズル４３によりサンプルの一定量が吸
入され、サンプル吐出位置に移送された反応容器３４ａ
内の試料室３４３内に吐出され、必要に応じて希釈をさ
れた後、ピッペッティングノズル４３によって、反応室
３４２へ吐出される。

【００６１】パルスモータ９３は試薬テーブル３５を所
望の角度回転し、必要なタイミングで指定された試薬容
器をノズル４３による吸入位置に停止するように位置づ
ける。すなわち、第１の試薬は、ノズル４３によって第
１の試薬分注位置で反応容器３４ａの反応室３４２内に
注入される。また、第２の試薬は、ノズル４３によって
第２の試薬分注位置で反応容器３４ａの反応室３４２内
に注入される。

【００６２】反応容器３４ａの反応室３４２中で反応さ
せた試料と粒子標識プローブと蛍光性粒子標識プローブ
とのハイブリダイゼーション反応液は、反応液分注位置
においてピペッティングノズル４３によって反応容器３
４ａの反応室３４１に注入される。フィルタ洗浄位置に
おいては、加圧装置１０１が作動して、フィルタ３４６
の孔径よりも小さな未反応の第１の試薬中の蛍光性粒子
プローブをフィルター３４６に通して反応容器外に排出
する。ノズル４３によって洗浄液を反応室３４１に注入
して加圧装置１０１を作動させることを繰り返して、フ
ィルター３４６の洗浄を徹底する。

【００６３】反応室３４１の洗浄を終了すると、図６に
示すように、容器結合位置において駆動装置９５の作動
でターンテーブル２が下降して、反応容器３４ａにター
ンテーブル３上の容器３４ｃを結合した後、駆動装置９
５が逆方向に作動してターンテーブル２を上昇させる。
その後、制限酵素液分注位置において、ノズル４３によ
って制限酵素液収容容器３８から制限酵素液が分注され
る。所定時間を経過した後に図示しない吸引装置が排出
ノズル３５１ａに接続され、小孔３５１より吸引を行な
うことによって、反応室３４１内の反応液を容器４３ｃ
の方へ移動させる。その後、容器３４ａと容器３４ｃは
分離し、容器３４ｃは測定液取り出し位置へ移動する。
測定液取り出し位置において、測定液がノズル４３によ
り容器３４ｃより取り出され、シースフローセル４７内
に導入される。

【００６４】反応容器の更に他の実施例として、図１１
及び図１２に示すような反応容器３４ａと反応容器３４
ｆとの組み合わせでもよい。この場合、反応容器３４ｆ
は吸引孔３５３を持つノズル３５３ａと排出のための小
孔３５４を持つ排出ノズル３５４ａとが別になってお
り、測定液は小孔３５３が吸引されることによりキャッ
プ３５２の抵抗にうち勝って小孔３５４から取り出さ
れ、シースフローセル４７内に導入される。

【００６５】また、図１１及び図１２に示す反応容器
は。図８に示す場合と同様、図１３に示す反応容器６０
のようにフィルター３４６を備えた容器部と、液体流下
抵抗部材としてのキャップ３５６及び小孔６０８，６０
９をそれぞれ持つノズル６０８ａ，６０９ａを備えた容
器部とが一体になっていてもよく、この場合は、やはり
ターンテーブル３は不要となる。

【００６６】また、反応容器の試料室の１つ、例えば反
応容器３４ａの試料室３４５に蛍光性粒子標識プローブ
液または粒子結合プローブ液を保存液と共に入れておく
こともできる。この場合、第１の試薬もしくは第２の試
薬の収容容器は入らなくなり、かつ測定時間の更なる短
縮が可能となる。

【００６７】

【発明の効果】本発明によれば、粒径の異なる２種類の
微小粒子とそれらの粒径の中間の孔径を持つフィルター
を用いてＢ／Ｆ分離や洗浄工程を行なうので、容器を傾
けたりピペッティングノズルを用いて反応液や洗浄液を
取り出す等の操作が不要となり、Ｂ／Ｆ分離や洗浄工程
が極めて簡単となり、測定の自動化が容易となる。ま
た、分別した蛍光性の微小粒子は直接フローセルに導入
することができ、操作時間を短縮できる。更に、標識物
をフローセルで測定できるので、高感度な測定が可能と
なる。

【００６８】また、本発明によれば、反応容器の小孔を
反応容器の下端に設けられた排出ノズルに形成し、この
排出ノズルをフローセルの注入室入口に直接差し込んで
計測を行なうので、測定時間を短縮できる。

【００６９】

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の一実施例による分析方法の操作手順を
説明する図である。

【図２】本発明の一実施例による分析装置の全体構成を
示す概略図である。

【図３】図２に示す装置で使用される反応容器の一実施
例を示す図で、（Ａ）は縦断面図、（Ｂ）は上面図であ
る。

【図４】図２に示す装置で使用される反応容器の一実施
例を示す図で、（Ａ）は縦断面図、（Ｂ）は上面図であ
る。

【図５】図３に示す容器と図４に示す容器を結合した状
態を示す縦断面図である。

【図６】図３に示す容器と図４に示す容器を結合する操
作手順を示す図で、（Ａ）は結合前の状態、（Ｂ）は結
合時の状態、（Ｃ）は結合後の状態を示す。

【図７】図３及び図４に示す反応容器の排出ノズルをフ
ローセルに差し込む様子を示す縦断面図である。

【図８】本発明の他の実施例による反応容器の縦断面図
である。

【図９】本発明の更に他の実施例による反応容器の縦断
面図である。

【図１０】図９に示す反応容器の下方部分の断面図であ
る。

【図１１】本発明の更に他の実施例による反応容器の縦
断面図である。

【図１２】図１１に示す反応容器の下方部分の断面図で
ある。

【図１３】本発明の更に他の実施例による反応容器の縦
断面図である。

【符号の説明】

１，２，３ ターンテーブル ３３ サンプル容器 ３４ａ，３４ｂ 反応容器 ３５ ターンテーブル（試薬テーブル） ３６ａ，３６ｂ，３６ｃ 蛍光性粒子標識プローブ液容
器 ３８ 制限酵素液収容容器 ４２ 可動アーム ４３ ピペッティングノズル ４６ コントローラ ４７ シースフローセル ４８ 注入室入口 ５６ カウンタ ９０ａ，９０ｂ，９０ｃ 粒子標識プローブ液容器 ９４ ノズル洗浄槽 １０２ コンプレッサー ４０１ サンプルＤＮＡ ４０２ 蛍光粒子標識ＤＮＡプローブ ４０３ 非蛍光粒子標識ＤＮＡプローブ ４０４ フィルター ４０５ 制限酵素

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−317594（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−113896（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−98257（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−16764（ＪＰ，Ａ) 特開 平４−273065（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12Q 1/68 G01N 33/543

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 （ａ）粒径の異なる２種類の微小粒子で
   あって、一方の微小粒子は標識物の付いた小粒子で、他
   方の微小粒子は前記小粒子よりも大きな粒径を持つ大粒
   子としたものを用意すること、（ｂ）前記２種類の微小
   粒子を試料中の測定対象物を介して結合させること、
   （ｃ）前記小粒子の粒径よりも大きく、前記大粒子の粒
   径よりも小さな孔径を持つフィルターを用いて未結合の
   小粒子を除去すること、（ｄ）測定対象物を介して結合
   した小粒子と大粒子の結合物を特異的に切断すること、
   （ｅ）前記フィルターを用いて小粒子のみを分別するこ
   と、（ｆ）その小粒子の標識物を測定することによって
   試料中の測定対象物の濃度を測定することを特徴とする
   分析方法。
2. 【請求項２】 粒径の異なる２種類の微小粒子であっ
   て、一方の微小粒子は標識物の付いた小粒子で、他方の
   微小粒子は前記小粒子よりも大きな粒径を持つ大粒子と
   したものを用いて試料中の測定対象物の濃度を測定する
   分析装置において、 （ａ）少なくとも１つの反応室、前記反応室の底部に配
   置され、前記小粒子の粒径よりも大きく、前記大粒子の
   粒径よりも小さな孔径を持つフィルター、このフィルタ
   ーの更に下方に設けられた液体流下抵抗部材、前記反応
   室から前記フィルター及び液体流下抵抗部材を通過した
   液体を排出する小孔を有する反応容器と、 （ｂ）前記反応容器が複数個配列されるターンテーブル
   と、 （ｃ）前記反応容器の反応室に前記試料、前記２種類の
   微小粒子を含む試薬、洗浄液及び結合部位を特異的に切
   断する試薬を注入する分注供給手段と、 （ｄ）前記反応室と前記小孔との間に圧力差を発生さ
   せ、前記反応室内の液体を前記小孔から排出する圧力差
   発生手段と、 （ｅ）前記小孔から排出された液体に含まれる前記小粒
   子の標識物を計測し、試料中の測定対象物の濃度を測定
   する計測手段とを備えることを特徴とする核酸分析装
   置。
3. 【請求項３】 請求項２記載の分析装置において、前記
   計測手段は前記反応容器の小孔を介して液体が導入され
   るフローセルを有し、このフローセルを通る小粒子の標
   識物に基づく光学的特性を測定して試料中の測定対象物
   の濃度を測定することを特徴とする分析装置。
4. 【請求項４】 請求項３記載の分析装置において、前記
   反応容器の小孔は反応容器の下端に設けられた排出ノズ
   ルに形成され、この排出ノズルは前記フローセルの注入
   室入口に直接差し込まれることを特徴とする分析装置。