JP3201610B2

JP3201610B2 - 腫瘍を処置する方法

Info

Publication number: JP3201610B2
Application number: JP52853296A
Authority: JP
Inventors: ゲイルエイ．グランガー，
Original assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Current assignee: THE REGENTS OF THE UNIVERSITY OF CARIFORNIA
Priority date: 1995-03-17
Filing date: 1996-03-15
Publication date: 2001-08-27
Anticipated expiration: 2016-03-15
Also published as: CA2214503A1; ATE338813T1; MX9707077A; KR19980703072A; CA2214503C; EP0815204A4; BR9607894A; AU696572B2; US5837233A; WO1996029394A1; NO974275D0; EP0815204B1; US6136306A; DE69636514D1; JPH11501656A; NO974275L; AU5254796A; EP0815204A1

Description

【発明の詳細な説明】発明の背景本出願は、1995年３月17日出願の米国特許出願第08/4
06,388号の一部継続出願である。

1.発明の分野本発明は、腫瘍細胞増殖を阻害する方法に関する。さ
らに詳細には、本発明は、腫瘍に対して免疫学的に応答
する患者の能力を増強することによる腫瘍細胞増殖を阻
害する方法に関する。

2.関連技術の記載古典的な治療法は、高度の脳腫瘍（例えば、神経膠芽
腫）および多くの他のタイプの腫瘍（例えば、全身性黒
色腫）、ならびに頭部および首部のガンを有する患者の
症状をほとんど改変できずに行われてきた。切除可能な
一次腫瘍を有する患者は、一般に、手術、化学療法、ま
たは放射線照射後、１年以内に腫瘍の再発を経験してい
る。これらの腫瘍は、しばしば、さらなる従来の治療法
を施してもまたは施さなくても、迅速に進行する。従っ
て、これらの致命的な腫瘍についての新規の様式の治療
法の開発が必要とされる。

ガン治療の新規のファミリーは、免疫療法に基づいて
近年発達した。一般に、腫瘍免疫療法は、２つのアプロ
ーチのうちの１つを利用する:1）腫瘍を攻撃するように
患者の免疫系を活性化するために、種々の技術を利用す
る；または２）患者のリンパ系細胞を取り出し、そして
インビトロ技術によって活性化させて抗ガン活性を生じ
させ、次いで、活性化させた細胞を、患者に全身的に再
導入させた。これらの種々のタイプの免疫療法の臨床的
効果は、異なるガンのタイプを有する患者で評価され
る。しかし、これら両方のタイプの免疫療法に関連する
主要な問題の１つは、免疫療法剤が全身投与された場合
に観察された毒性である。この毒性を回避するために開
発された方法は、免疫療法剤の病変内（intralesiona
l）投与（例えば、腫瘍内に直接注射する）である。ガ
ン患者に対する免疫療法の種々の形態の病変内投与は、
免疫剤の全身投与に見られる毒性を生じない（M.Fletch
erら、Lymphokine Res.６:45、1987;H.Rabinowichら、C
ancer Res.47:173、1987;S.A.Rosenbergら、Science 23
3:1318、1989;およびG.Pizzら、Int.J.Cancer 34359、1
984）。

最近の研究は、異なるサイトカインを分泌するように
遺伝子操作された腫瘍細胞での動物の免疫化が、治療的
免疫応答の誘発を増強することを示した。サイトカイン
は、複雑な一連の反応を誘発すると考えられている。こ
の一連の反応は、以下の工程を包含する:a）腫瘍抗原の
増加された発現;b）宿主リンパ系細胞による腫瘍の炎症
および浸潤;c）腫瘍特異性免疫の誘発；およびｄ）腫瘍
を破壊する非特異性および特異性の両方の宿主抗腫瘍エ
フェクター機構の活性化。しかし、この技術は、最終的
に有用であると証明され得る、しかし、この技術は極め
て高価で、かつ時間を要するので、その適用は限られ得
る。

実験動物（主にマウス）における研究は、腫瘍内のサ
イトカインの慢性的放出が、宿主の抗腫瘍応答および腫
瘍緩解を誘発し得ることを示す。サイトカイン（例え
ば、インターロイキン２（IL−２）、腫瘍壊死因子（TN
F）、およびインターフェロンγ（INF−γ））の病変内
反復注射が、皮膚肉腫の緩解を引き起こすことが示され
ている（S.P.Creekmoreら、Resident and Staff Physic
ian 34:23−31、1988;P.Greenbergら、Basic and Tumor
Immunology（R.Herberman編）p.302、1983;E.Grimm
ら、Lymphokines、９:279−311、1984;G.Forniら、Lymp
hokines 14335−360、1987）。サイトカイン（例えば、
IL−２、IL−４、TNF、および顆粒性単核白血球コロニ
ー刺激因子（Granulocyte Monocyte Colony Stimulatin
g Factor）（GM−CSF））を分泌するように遺伝子操作
された動物腫瘍細胞の腫瘍内への注射が、宿主抗腫瘍免
疫を誘発することもまた示されている（E.Feronら、Cel
l 60、397−403、1990;P.Galumbekら、Science 254:713
−716、1991;A.Ascherら、J.of Immunol.146:3227−323
4、1991）。これらの後者の結果は、以前に非免疫原性
であると考えられていた腫瘍の処置においてさえも、得
られた。

J.M.Reddら（Cancer Immunology and Immunotherapy
34（５）:349、1992）は、ラットにおいて、ドナー同種
異系抗原に対して感作した同種異系リンパ球が、9L神経
膠芽腫を有するラットの脳内に同時注射した場合、腫瘍
形成を阻害し得ることを示した。別の研究において、ウ
イスターラット由来の正常脾臓細胞および同種免疫脾臓
細胞の両方を、フィッシャーラットの樹立された６日目
のT9脳腫瘍中に注射した。フィシャー同種異系抗原に対
して以前に免疫化したウイスターラット由来の正常なウ
イスター脾臓細胞の病変内注射は、フィシャーラットの
50％で腫瘍を治癒した。それに対して、未処理の動物お
よび非レスポンダー動物は、30日以内に死亡した。生存
者は完全に正常に見え、そして正常なラット中の同種異
系細胞の頭蓋内注射によって、３カ月にわたって挙動ま
たは生存において検出可能な変化は起こらなかった。処
置された腫瘍保有動物由来の脳の組織病理学的試験は、
以下を示した:a）単核細胞の浸潤（広範囲の腫瘍壊死、
２〜４日目で開始し、15日目までには全ての腫瘍が破壊
する）；または２）細胞浸潤（初期の腫瘍の破壊後、腫
瘍再増殖が進行し動物が死滅する）。正常脳組織におい
て損傷のないことは、これらの動物においていつでも明
らかであった。腫瘍緩解動物は、全身免疫を発達させ
た。なぜなら、それらは、生存可能な腫瘍での頭蓋内再
チャレンジに全体的に耐性であることが分かったからで
ある。ラットにおけるこれらの結果は興味深いが、非常
に関連性のない種（例えば、ヒト）において見られる理
論的な予測におけるそれらの値は、特に、腫瘍に対する
免疫学的応答に関して存在するかなりの種の相違点を考
慮すると非常に問題となる。

局在化し、かつ外科的にアクセス可能な腫瘍を有する
ヒト神経膠腫患者は、病変内免疫療法の論理上の候補で
ある。神経膠腫を有する成人患者における多施設第Ｉ相
研究は、IL−２を用いてインビトロで活性化した自家移
植の末梢血リンパ球の腫瘍内移植の利用が報告されてい
る。臨床的効果はほとんど認められない一方で、ネガテ
ィブな副作用はほとんど無く、そして過剰なレベルのIL
−２が細胞と共に同時投与された場合でのみ起こった
（K.S.Jacobsら、Cancer Res.、47:2101、1986;R.Merch
antら、Neurosurgery 23:725、1988）。これらの患者の
研究は、生存がサイトカインTNFを分泌する移植細胞の
能力に直接関連することを示した。血清または嚢腫液中
およびこれらの患者由来の腫瘍の一次培養物中のTNFお
よびIL−１の両方についてのインヒビターの発見は、腫
瘍細胞が、宿主抗腫瘍応答をブロックする薬剤で囲まれ
ていることを示唆する。これらのインヒビターは、サイ
トカイン活性化移植細胞に、その破壊を引き起こすのに
十分長く腫瘍中の活性を残存させるのを妨げ得る。この
概念は、ラットにおける脳腫瘍研究における発見によっ
て支持される。IL−２活性リンパ系細胞が、それぞれウ
イスターラットおよびフィシャーラットのC6およびT9神
経膠腫脳腫瘍中に移植された場合、組織病理学的試験
は、移植されたIL−２活性化リンパ系細胞が、４〜６日
目の腫瘍部位にのみ残存することを示した（W.Carson
ら、J.of Immunotherapy 10（２）131−140、1991）。

同種異系リンパ系細胞で処置された動物において腫瘍
緩解を引き起こす操作可能な機構は、腫瘍部位における
移植片対宿主および宿主対移植片反応を包含する。これ
らの強力な免疫学的反応は、腫瘍における高レベルの内
因性サイトカイン産生を刺激し得、局所的レベルのサイ
トカインインヒビターを克服し得、そして浸潤、補充、
ならびに特異的および非特異的両方の宿主抗腫瘍活性の
活性化をおそらく刺激し得る。腫瘍緩解動物は、腫瘍の
再チャレンジに対して耐性であることが見出された。し
かし、同様の方法に基づくどの処理が、ヒト腫瘍の処置
において効果的であると考えられるのに十分に、ヒト被
験体において同様の結果を達成し得るかどうかは、これ
まで知られていなかった。

従って、先行技術の限界を考慮すると、哺乳動物腫瘍
を処置する新規でかつより良好な方法が必要とされる。
特に、腫瘍内免疫療法の新規な方法は、個々の固体腫瘍
の緩解が救命となり得るヒトガン患者に必要とされる。

発明の要旨本発明は、哺乳動物において腫瘍を阻害する方法を提
供する。本発明の一般的な実行において、腫瘍患者の末
梢血単核細胞（peripheral blood mononuclear cell）
（PBMC）をインビトロで同時培養し、正常なドナー（好
ましくは、同種異系ドナー）由来の健全なリンパ球との
混合リンパ球細胞反応を誘発する。好ましくは、正常な
リンパ球は、腫瘍患者に関連しないドナー由来であり、
そして好ましくは、正常なリンパ球は、全血から白血球
搬出法により得られる。同時培養中、同種異系ドナーの
リンパ球は、患者の同種異系抗原に対して特に活性化さ
れる。本明細書中において、混合リンパ球培養により生
成された生きたアロ活性化ドナーリンパ球と患者リンパ
球との混合物を「MLC」という。MLC活性化細胞は、イン
ビトロにおいて一次免疫応答を誘発することが示されて
いるサイトカインの混合物を産生する。例えば、神経膠
芽腫の処置において、患者はヒトであり、そしてアロ活
性化リンパ球は、一次腫瘍部位で患者の脳に外科的に移
植され（必要に応じてMLC混合物として、同時培養由来
の患者のPBMCと共に）、自家移植の腫瘍細胞を攻撃する
ように患者の免疫系を誘発する。他のタイプの腫瘍の処
置においては、MLCは腫瘍部位、転移部位、または体腔
（例えば、腹膜）に注入される。必要に応じて、神経膠
芽腫以外の腫瘍の処置においては、MLCは末梢（例え
ば、非一次的腫瘍部位）に投与される。

本発明の１つの実施態様において、患者由来のリンパ
球との同時培養によって得られるアロ活性化ドナーのリ
ンパ球を、MLC混合物より単離し、そして（例えば、外
科的に除去される腫瘍の付近に）腫瘍の再発に対する防
御を所望する、または手術不能の腫瘍の処置を所望する
患者の腫瘍中に直接位置する移植として、病変内に投与
する。あるいは、アロ活性化ドナーリンパ球は、腫瘍の
処置において末梢的に、例えば、二次または転移腫瘍部
位に投与され得る。別の実施態様において、同種異系活
性化リンパ球を、患者由来のリンパ球と同時培養し、そ
してMLCの混合物を、混合物として末梢に移植または導
入する。

図面の簡単な説明図１は、MLC細胞の腫瘍内移植で処置された神経膠芽
腫患者の生存時間を示す。

図２は、腫瘍のサイズの減少を示すMRIスキャンを示
すグラフであり、９人の神経膠芽腫患者中２人の患者、
すなわち４×10⁹MLCの単回移植用量を受けた１人の患者
および６×10⁹MLCの単回移植用量を受けた１人が、それ
ぞれ、58週間および74週間にわたり腫瘍塊の進行性の縮
小を今日まで示し続けた。

発明の詳細な説明本発明は、哺乳動物における腫瘍を処置するための方
法を提供する。この方法は、患者の腫瘍関連抗原に対し
てドナーリンパ球を活性化するために、混合リンパ球
（MLC）反応において患者の単核細胞（好ましくは、末
梢血に由来する）とインビトロにおいて同時培養された
ドナーリンパ球の同種異系移植片を使用する。同種異系
移植片に対する対宿主性移植片応答および対移植片宿主
応答は、サイトカイン産生および組織破壊を生じる腫瘍
部位における強力な免疫学的反応を誘発すると考えられ
ている。この反応の間に、宿主のリンパ系細胞は、移植
片リンパ系細胞および組織の両方を外来であると同定
し、そして両方は局所的および全身的免疫応答により阻
害または破壊される。この宿主反応は、移植片リンパ系
細胞の移植部位のみで生じるのではなく、末梢でも（例
えば、二次的なまたは転移した腫瘍部位で）生じ得る。
さらに、移植されたドナーのリンパ球は、対宿主移植片
応答において腫瘍を免疫学的に攻撃する。従って、腫瘍
の中央における強力な免疫学的反応は、腫瘍部位に存在
し得るサイトカインインヒビターを克服する環境を生成
する。免疫学的反応の増加は、樹立された腫瘍または進
行性の転移の、増殖を阻害し、サイズを減少させ、そし
て／あるいはこれを根絶し、そして外科的に除去（debu
lk）された腫瘍の部位での再発を阻害する。従って、本
発明は、患者に本明細書に記載のアロ活性化細胞の生存
調製物を導入することにより、患者の腫瘍に対する全身
的な免疫応答を増強するための方法を提供する。

多数の研究により、混合リンパ球反応におけるインビ
トロ環境が、同種異系の抗原および腫瘍関連抗原に対す
る活性な一次免疫応答を促進することが示された（M.Ga
telyら、JNCI 69:1245,1982;S.Leeら、J.Experimental
Medicine 147:912,1978;J.Zarlingら、Nature 262:691,
1976）。本発明において、MLC反応は、患者自身の腫瘍
組織内で生じ、それにより患者がそれ自身の腫瘍に応答
するように刺激する。好ましくは、同時培養は、一般に
１〜５日間実施される。鍵となるサイトカインの放出は
同時培養の初期段階の間に起こるので、同時培養された
細胞が同時培養反応の初期段階に（通常、サイトカイン
のレベルが通常最高である反応の最初の48時間の間に）
移植されることが好ましい。この方法は、腫瘍組織へ直
接の鍵となるサイトカインの放出を生じる。その結果、
抗原認識およびこの抗原に対して指向される細胞媒介性
免疫性の発達を促す環境を作り出す。標準的な技術（例
えば、イムノアッセイに基づく技術）を用いて、MLC培
養上清中に存在する種々のサイトカイン（TNF、LTおよ
びγインターフェロンを含む）のレベルを測定し得る。
TNFおよびLTのレベルは、50〜150生物学的活性単位/ml
または500〜3500pg/ml上清で変化する。インビトロ同時
培養の結果、ドナー由来の健常同種異系リンパ系細胞
が、患者の同種異系抗原に対して特異的に活性化され
る。

一般に、移植された細胞は、腫瘍細胞と直接接触する
ことが可能になる。従って、本明細書において用いられ
る用語「移植」および「移植された」は、細胞が患者の
身体中に群として（任意に、凝固血清あるいは他の懸濁
液またはゲル様物質の濃厚化マトリックス内で）、配置
されることを意味する。

本発明の方法により処置され得る腫瘍の例は、以下を
包含する：脳腫瘍（例えば、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、脳室
上衣細胞腫、髄芽細胞腫、およびRNET（未分化神経外胚
葉性腫瘍））；膵臓腫瘍（例えば、膵管腺ガン）；肺腫瘍（例えば、小および大細胞腺ガン、扁平上皮ガ
ン、および気管支肺胞ガン）；結腸腫瘍（例えば、上皮腺ガン、およびこれらの腫瘍
の肝臓転移）；肝臓腫瘍（例えば、肝ガン、および胆管ガン）；乳ガン（例えば、管の腺ガンおよび小葉の腺ガン）；婦人科学的腫瘍（例えば、子宮頸の鱗状腺ガン、なら
びに子宮および卵巣上皮腺ガン）；前立腺腫瘍（例えば、前立腺ガン）；膀胱腫瘍（例えば、移行、扁平上皮ガン）； RES系の腫瘍（例えば、ＢおよびＴ細胞リンパ腫（小
節のおよび散在性の）、プラスマ細胞腫、ならびに急性
および慢性白血病）；皮膚腫瘍（例えば、悪性黒色腫）；および軟組織腫瘍（例えば、軟組織肉腫および平滑筋肉
腫）。

本発明の方法の１つの実施態様において、アロ活性化
ドナーリンパ球は、腫瘍部位に移植されて（必要に応じ
て、同時培養物からの患者のPBMCとともに）、自己腫瘍
細胞に対する患者の免疫系攻撃を補充および増強する。
例えば、本発明の１つの実施態様において、患者由来の
PBMCまたはPBMCの細胞溶解物との同時培養により得られ
たアロ活性化ヒトドナーリンパ球は、ヒトにおいて病変
内投与される（例えば、神経膠芽腫腫瘍の再発に対する
防御を所望する患者の脳に直接配置される移植物とし
て）。アロ活性化ドナーリンパ球は、外科的に除去され
た腫瘍、あるいは照射、化学療法、または他の適切な技
術により処置された腫瘍に近接して移植され得る。別の
好ましい実施態様において、同種異系活性化リンパ球
は、患者由来リンパ球と同時培養され、そして同時培養
された同種異系および自己細胞の混合物（本明細書にお
いて「MLC」として知られる）が病変内移植される。

代表的な移植物は、治療量のアロ活性化ドナーリンパ
球を含む。本明細書において用いられる用語「治療量」
は、樹立された腫瘍の増殖を阻害し、サイズを減少さ
せ、そして／またはこれを根絶する、および／あるいは
外科的に除去されたまたは化学療法もしくは照射を用い
て処置された腫瘍の部位での腫瘍再発を防止するに十分
量の、MLCまたは混合リンパ球培養物から得られるドナ
ーアロ刺激リンパ系細胞を意味する。より一般的には、
治療量は、アロ活性化ドナー細胞の各バッチの能力；所
望の治療的または他の効果に必要とされる量、投与の様
式（すなわち、腫瘍または体腔中への直接移植によるか
あるいは静脈内のような末梢投与によるかのいずれ
か）；および一旦移植または投与されたときの身体によ
るMLCの除去または分解の速度により変化し得る。従来
の慎重な処方慣例に従って、有用な範囲の低い側の端付
近の投与量が最初用いられ得、そして投与量は、観察さ
れる応答から示されて、医師の通常の手順で、増加また
は減少される。しかし、一般に、直接移植のための単位
投与量は、約２×10⁹〜約６×10⁹のMLCを含む。例え
ば、脳腫瘍の処置において、移植され得る細胞の上限
は、約６×10⁹であることが見出された。あるいは、末
梢投与のための単位投与量は、通常約２×10⁹〜約２×1
0¹⁰のMLCを含む。

本発明は、MLCの単位投与量を含む組成物を保持する
無菌バイアルまたはその他の容器をさらに包含する。代
表的には、バイアルまたは容器は、ヒトにおける腫瘍の
処置における組成物の薬学的使用に関する情報を記載す
るラベル（例えば、本明細書に記載のようにそれに対し
て本発明の処置方法が有効である１以上の腫瘍を有する
ヒトの処置における組成物の使用についてのFDAの承
認）を有する。

ドナーからPBMCを得る任意の公知の方法が使用され得
るが、支持的アフェレーシスのために当該分野において
周知の白血球搬出法の技術を白血球搬出法装置の製造者
の説明書に従って利用して、ドナーPBMCを含有する約15
0〜300mlの白血球搬出法懸濁液を得ることが好ましい。
例えば、白血球搬出法は、Cobe 2997,Cobe Spectra
（Lakewood,CO）、Fenwall CS 3000（Deerfield,I
L）、またはHaemonetics（Braintree,MA）血球セパレー
ターを用いて実施され得る。一般に、リンパ球収量２〜
４×10⁹での２〜４時間の40〜50ml/分の流速が、総ドナ
ー血液容量7,000〜12,000mlを処理して、1ml未満の赤血
球を有する200〜250mlの白血球搬出法懸濁液を得るため
に使用され得る。例えば、Cobe 2997血球セパレーター
が使用される場合、遠心分離速度は、一般に約５×ｇで
あり、流速は約45ml/分までであり、そして採集速度は
2.5ml/分以下である。当業者は、リンパ球の収量が、使
用されるドナーおよび白血球搬出法の機械により変化す
ることを理解する。例えば、ドナーの前絶対（pre−abs
olute）リンパ球数が0.6×10⁹〜1.0×10⁹のレベル内に
ある場合、150mlほどのドナー白血球搬出法懸濁液が抜
かれ得る。

所望であれば、同時培養の間に患者由来抗原に対する
細胞の活性化を引き起こすために、そしてリンパ球増殖
をさらに刺激するために、ドナー細胞は、IL−２のよう
な刺激サイトカインと接触され得る。

ドナーPBMCは、ドナー血液画分から、単核細胞の破裂
を避けるように注意して、例えば、単核細胞を含有する
血液画分をHistopaque1.077のような細胞分離媒質を
通して350×ｇで７〜10分間遠心分離することにより得
られる。当業者は、容易に利用され得る他のPBMC細胞分
離技術を知る。ドナー血液は、代表的には、外科手術の
３〜７日前に、HIV、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎およびＣ型肝
炎ならびにVDRLについて予備スクリーニングされる。

十分な抗凝固剤（例えば２％クエン酸塩）が、ドナー
および患者の血液または血液画分に、引き抜く際の凝固
を防止するために添加される。当業者に公知の以下のよ
うな代替の抗凝固剤およびその混合物もまた、使用され
得る：抗凝固剤クエン酸デキストロース（anti−coagul
ant citrate dextrose）Ａ剤（ACDA）15ml/クエン酸100
ml;抗凝固剤クエン酸デキストロースＢ剤（ACDB）25ml/
クエン酸100ml;またはクエン酸リン酸デキストロース
（citrate phosphate dextrose）（CPD）14ml/クエン酸
100ml。

代表的には、全血を、本発明に従って処置されるべき
患者から、静脈穿刺のような当該分野に公知の方法を用
いて引き抜く。PBMCは、患者の全血から、通常Histopaq
ue1.077（Sigma,St.Louis,MO）のような細胞分離媒質
を通して遠心分離により単離され、そして細胞から患者
の血液中の凝固因子を取り除くために十分に洗浄され
る。

ドナーおよび患者の両方の血液または血液画分のサン
プルを、細胞の同時培養の前に無菌性を確実にするため
に十分に試験しなければならない。当業者により実施さ
れ得る血液成分の無菌性についての試験の代表的なもの
は、チオグリコレートブロス、トリプチックソイブロ
ス、および10％熱不活化ウシ胎児血清（FBS）（RPMI−1
0％）および１％Ｌ−グルタミンを含み、抗生物質を添
加しないRoswell Park Memorial Institute Tissue Cul
ture Medium（RPMI）のような増殖培地を用いる試験で
ある。このような増殖培地中の血球の培養物を利用する
無菌性試験は、本出願の実施例１に例示される。別の無
菌性試験は、当業者に公知である。

混合リンパ球培養を実施し得る前に、代表的には、全
血から単離されたPBMCは、単位容積あたりの生存細胞数
を測定するために分析される。これは、例えば、生存お
よび死滅細胞の間を区別する染色を用い、そしてNeubau
erチャンバー中の細胞を計数することにより実施され得
る。この使用のための代表的な染色は、トリパンブルー
およびEosin Y色素である（その両方は、湿潤調製物に
おいて使用され得る）。別の染色は、当業者に公知であ
る。一般に、生存細胞の濃度は、単位容量あたりの生存
細胞の所定の濃度を達成するために、PBMCの調製物を希
釈することにより標準化される。当業者は幾分より高い
またはより低い数を選択し得るが、一般に、混合リンパ
球培養を実施する目的のために、生存細胞の数は約10⁷
細胞/mlの濃度で固定されことが好ましい。代表的には
ドナー細胞は、患者の細胞に比較して10:1〜20:1の割合
で培養される。

哺乳動物（すなわち、ヒト）細胞を用いる混合リンパ
球培養を実施するための標準的な技術は当該分野におい
て周知であり、そして本出願の実施例１に例示される。
例えば、Current protocols in Immunology、J.E.Colig
anら編,John Wiley ＆ Sons,Inc.,1994,7.10節ならびに
M.Gatelyら、前出;S.Leeら、前出；およびJ.Zarlingら
前出を参照のこと（これらはその全体が本明細書に参考
として援用される）。患者のスティミュレーター細胞の
ドナーのレスポンダー細胞に対する応答（バック刺激
（back stimulation））をブロックするために、当該分
野で周知なように、患者の細胞の増殖能を減少または除
去するために、細胞の混合前、同時培養の間に、患者の
細胞を照射するか、またはDNA結合剤（例えば、マイト
マイシンＣ）で処理することが好ましい。本発明におい
て、ドナーリンパ細胞は、代表的には、少なくとも48時
間、そして好ましくは１〜５日間、患者のPBMCと短期間
混合リンパ球培養で同時培養される。インビトロ同時培
養の結果として、無関係なドナー由来の健常リンパ系細
胞が、患者の腫瘍関連抗原に対して特異的に活性化され
る。

非経口または静脈内投与のための調製物は、代表的に
は、生理学的に適合性のキャリア」中に含まれる。本発
明の実施において利用される細胞は生存しているので、
生理学的に適合性のキャリアは、細胞の生存性を損なわ
ない（すなわち、低張性であり、そして生理学的pHにあ
る）キャリアである。そのようなキャリアは、無菌水性
塩溶液、懸濁液および乳濁液を包含し、これらは、生理
食塩水および緩衝化媒質、リンガーデキストロース、デ
キストロースおよび塩化ナトリウム、ならびに乳酸加リ
ンガー液を包含する。静脈内ビヒクルは、液体および栄
養補充物、電解質補充物（例えば、リンガーデキストロ
ースに基づく補充物）などを包含する。非静脈内経路に
よる投与のためには、キャリアは凝固血漿、好ましくは
患者の凝固血漿の形態であり得る。あるいは、キャリア
は、無血漿の、生理学的に適合性、生分解性固体または
半固体（例えば、ゲル、懸濁液、または水溶性ゼリー）
であり得る。アカシア、メチルセルロースおよびその他
のセルロース誘導体、アルギネートナトリウムならびに
トラガカント懸濁液またはゲルが、本発明の実施におけ
るキャリアとしての使用のために適切である。例えば、
カルボキシメチルセルロースナトリウム2.5％、トラガ
カント1.25％およびグアーゴム0.5％。

腫瘍部位での移植の好ましい方法において、同時培養
されたリンパ球を、同時培養上清から（同時培養の少な
くとも48時間後）、外科手術の際に遠心分離により採集
する。採集された細胞を、２回注射用生理食塩水で洗浄
し、そして前日に患者から得られた無血小板、カルシウ
ム除去血漿中に再懸濁する。血漿中の細胞を外科手術に
運び、血漿をカルシウム（好ましくは、グルコネートカ
ルシウムの形態で）を添加することによりカルシウム再
添加し、その結果、血漿を凝固し、細胞を自己血漿凝塊
中に包埋する。次いで、患者の腫瘍を外科的に除去し、
そして凝塊を無菌的に細かく切り、腫瘍部位中に移植す
る。

以下の実施例は、本発明が実施され得る様式を例示す
る。しかし、この実施例は例示の目的のためであり、本
発明がその中のどの特定の材料にも条件にも限定される
とみなされないことが理解される。

実施例１ A.混合リンパ球細胞（MLC）培養手順 1.無関係なドナーからのレスポンダーPBMCの採集末梢血単核細胞（PBMC）を、患者に無関係な正常健常
ドナーからの白血球搬出法により採集した。ドナーを、
分画を有する全血球算定（CBC）、Ａ、B,およびＣ型肝
炎、VDRL、ならびにHIV−１について試験するために前
スクリーニングした。

PBMCを含有する約150〜300mlの白血球搬出懸濁物を、
製造者の説明書に従って支持アフェレーシスのための標
準的な献血手順を用いて各ドナーから採取した。白血球
搬出法を、Fenwall CS 3000（Deerfield、IL）血球セパ
レーターを用いて行った。２〜４×10⁹のリンパ球収量
での２〜４時間の40〜50ml/分の流速は、7,000〜12,000
mlの全ドナー血液容量を処理して、1ml未満の赤血球を
含む200〜250mlの白血球搬出懸濁物を生じた。Cobe 299
7血球セパレーターを使用した場合、遠心分離速度速度
は５×ｇ、流速は45ml/分まで、そして採集速度は、2.5
ml/分以下であった。

しかし、ドナーの前絶対リンパ球数が0.6×10⁹〜1.0
×10⁹の範囲である場合、150ml程少ない白血球搬出生成
物が取り出された。最終生成物についてのヘマトクリッ
トは3.5％であった。少なくとも１つの全血液容量は、8
0％のリンパ球採集の効率で処理された。

使用した抗凝固剤は、２％のクエン酸、またはACDA−
15ml/クエン酸−100ml;ACDB−25ml/クエン酸−100ml;あ
るいはCPD−14ml/クエン酸−100mlの比のクエン酸／抗
凝固剤のいずれかであった。最高の生成物純度を得るた
めに、細胞セパレーター由来の実際のかつ最終的な生成
物が、自己血漿中の細胞の純粋な濃縮物として輸送され
た。細胞を洗浄せず、そしてアルブミンを添加しなかっ
た。

2.ドナー細胞の調製白血球搬出生成物を、免疫療法のために同種異系混合
リンパ球細胞（MLC）の産生のためにMC Oncology Resea
rch Laboratoryに輸送した。

細胞を、白血球搬出パックから２つまたは３つの250m
lの遠心分離チューブに流し出し、遠心分離中に行われ
るべき無菌性試験のために3mlを取り出しそして別にし
た。細胞濃縮物をリン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で希
釈し、そして2,000rpmで７分間遠心分離した。遠心分離
を２回繰り返して全部で３回行い、細胞を洗浄しドナー
の血清中の凝固因子を除いた。

白血球懸濁物から取り出した3mlからの３つの1mlのア
リコートを、無菌性試験のために滅菌したキャップをし
たチューブに入れた。第１の1mlのアリコートを、チオ
グリコレート培地（Difco,Detroit,MI）に添加した（30
〜35℃、48時間）；第２の1mlをトリプチックソイブロ
ス（tryptic soy broth）（Difco,Detroit,MI）に添加
した（25〜30℃、48時間）；そして第３の1mlを10％熱
不活化FBS（RPMI−10％）および１％Ｌ−グルタミン酸
を含むが、抗生物質を含まないRPMI 1640（GIBCO,Gaith
ersburg,MD）に添加した。

細胞を、PBS中で150gで10分間２回スピン洗浄して、
血小板を除いた。細胞はスラリーでペレットではないの
で、上清を非常に注意深く捨てた。細胞を、２％熱不活
化FBS（２％AIM V）を補充したAIM V（GIBCO,Gaithersb
urg,MD）中に再懸濁して420mlとし、そしてＴ−175cm²
フラスコ中に入れた。

患者の血液またはドナーの血液を、滅菌生理食塩水で
1:1に希釈した。細胞の分離のために、35mlの細胞懸濁
物を、それぞれの50mlチューブ中に15mlのHistopaque
1.077懸濁媒質（Sigma,St.Louis,MO）上に注意深く上層
し、そして250gで45分間遠心分離した。遠心分離をゆっ
くり開始し、そして最大速度まで徐々に加速した。遠心
分離後、Histopaque懸濁媒質と血漿層との間の単核細
胞を含有する界面を、25mlの滅菌ピペットで注意深く採
集し、清潔な50mlの遠心分離チューブに入れ、２％のAI
M V培地で1:1に希釈し、そして550gで７〜10分間遠心分
離して細胞ペレットを形成させた。細胞を、Histopaque
懸濁媒質に最少の時間維持した。なぜなら、Histopaq
ue懸濁媒質は細胞に対して毒性であるからである。

上清を捨て、ペレットを２％のAIM Vに再懸濁して２
つの50ml遠心分離チューブに分けて全容量40mlとし、そ
して550gで５分間遠心分離した。洗浄後、上清を捨て
た。洗浄工程を２回繰り返して全部で３回行った。最後
の洗浄後、各チューブ内の細胞を50mlの２％AIM Vに再
懸濁した。１つのチューブ当たり1mlのアリコートの再
懸濁細胞を、２％のAIM Vで1:10の比で希釈し、次いで
さらに、死細胞を生存細胞と区別するためにTrypan Blu
e（Sigma,St.Louis,MO）で1:1に希釈し、そして生存細
胞をヘマチトメーターで計数した。細胞を、２％のAIM
Vで２×10⁶/mlとした。

3.腫瘍患者からのスティミュレーターPBMCの採集 200〜400mlの末梢血細胞を、静脈穿刺により各神経膠
芽腫患者から抜き取り、そして250mlの遠心分離チュー
ブに入れ、スピン中に行われるべき無菌性試験のために
3mlを取り出し、そして別にした。遠心分離チューブ中
の血球を、生理食塩水で希釈し、そして550gで７分間遠
心分離した。遠心分離を２回繰り返し、全部で３回行
い、細胞を洗浄し患者の血清中の凝固因子を取り除い
た。無菌性試験を上記のように行った。

細胞を、血小板を取り除くために生理食塩水中150gで
10分間の遠心分離により２回洗浄し、上清を非常に注意
深く捨て、そして420mlの細胞をＴ−175cm²フラスコ中
に生理食塩水で再懸濁した。

15mlのHistopaque1.077細胞懸濁媒質を、12個の50m
l遠心分離チューブに添加し、そして生理食塩水中に懸
濁された35mlの細胞を、各々の50mlチューブ中のHistop
aque1.077の上に上層した。細胞懸濁物を、最初はゆ
っくりとそして徐々に速度を増大して250gで45分間スピ
ンした。

遠心分離後、Histopaque懸濁媒質と血漿層との間の
界面にある単核細胞を、25mlの滅菌ピペットで２つの25
0mlの遠心分離チューブに注意深く採集し、そして２％
のAIM Vで最終容量250mlに希釈した。希釈した単核細胞
を、550gで７〜10分間遠心分離した。洗浄するために、
上清を捨て、次いで細胞ペレットを２％のAIM Vで再懸
濁し、そして、550gで５分間遠心分離した。洗浄工程
を、全部で３回繰り返した。

最後の洗浄工程後、細胞を50mlの２％AIM Vに再懸濁
し、１つのチューブ当たり細胞1mlの懸濁物を、２％のA
IM Vで1:10で希釈し、そして、上記のようにTrypan Blu
e中の1:1希釈における計数により生存細胞数を決定し
た。

細胞の採集のための上記の手順および無菌性の証明
は、無菌性および品質管理についてのState of Califor
ia for GMPにより承認された。

4.ドナーの白血球での患者の単核細胞（PBMC）のアロ活
性化単離した患者のPBMCを、AIM V中に10⁷細胞/mlで再懸
濁し、患者の細胞懸濁物1ml当たり50μｇのMitomycin C
（Bristol−Mayer Squibb,Princeton,NJ）を添加した。
そしてPBMCの懸濁物を、レスポンダー細胞に対するステ
ィミュレーター細胞の応答（バック刺激）をブロックす
るために、37℃で１時間インキュベートした。１時間の
インキュベーション後、過剰のマイトマイシンＣを別の
遠心分離（250g、５分間）により細胞から洗浄し、そし
て細胞をAIM−Ｖ中に再懸濁した。患者のPBMCをマイト
マイシン処理した後、細胞を20:1〜10:1のドナー：患者
細胞の比でドナー培養物（上記で得られた）に添加し
た。

同時培養のために、ドナーおよびマイトマイシンＣ処
理した患者のPBMC懸濁物を、患者中に再移植するための
PBMCを培養するために特に設計された、密封された滅菌
Fenwal組織培養システム中においた。細胞を、製造者の
説明書に従ってFenwal細胞転移ユニットおよびポンプを
介して密封されたシステム内を通過させ、そして37℃の
インキュベーター中で48時間培養した。

5.アロ活性化された細胞の無菌性試験細胞懸濁物の移植の２日前に、以下の３つの無菌性試
験を行った。10mlの無菌アリコートを各組織培養バッグ
から取り出し、無菌のキャップをした15mlの遠心分離チ
ューブに入れ、そして450gで10分間遠心分離した。各チ
ューブ内で、ペレットを3.0mlのPBSに再懸濁した。1ml
のアリコートの細胞懸濁物を、2mlのチオグリコレート
ブロス（thioglycollate broth）、トリプチックソイブ
ロス、またはRPMI−10％を含有する３つの無菌のキャッ
プをしたチューブにそれぞれ添加し、そして48時間イン
キュベートした。各細胞懸濁物を、移植の前に微生物の
増殖の徴候を検出するために顕微鏡により調べた。

手術当日に、それらの培地から細胞を遠心分離し、生
理食塩水で２回洗浄し、前日の患者から得られた血小板
非含有の、カルシウム除去された血漿に再懸濁した。細
胞を血漿中で手術室に運び、次いで血漿をグルコン酸カ
ルシウムの添加によりカルシウムに再添加して、腫瘍ベ
ッドへの移植の直前に凝固するようにした。

手術当日に、採集した細胞ペレットの一滴を再び顕微
鏡下で無菌性について試験した。凝固の直前に、100μ
ｌのアリコートの細胞懸濁物を、無菌のキャップをした
チューブ中の抗生物質、チオグリコレート、およびトリ
プチックソイブロスを含まない各2mlの各RPMI−10％に
添加した。次いでサンプルを、手術後４日間インキュベ
ートし、そしてこの最後の無菌性試験の連続記録（runn
ing log）を継続した。

上記の方法により産生される細胞移植（Cyto−implan
t）は、ヒトガン患者における使用のためにFDA承認を受
けた（IND−BB 6288）。

B.混合リンパ球細胞培養物の病変内移植ヒト第１相試験を、再発性神経膠芽腫を罹患した患者
におけるアロ活性化された同種異系リンパ系細胞の病変
内注射の効果を試験するために開始した。再発性のグレ
ード３およびグレード４の神経膠芽腫の総数９人の患者
についてこの試験を行った。上記のステップ３において
混合リンパ球培養物から得られたMLCを、外科手術時に
除去された腫瘍中に病変内移植した。３人の患者を、２
×10⁹、４×10⁹、および６×10⁹のMLCの３種類の細胞用
量でそれぞれ試験した。患者を臨床的に追跡し、そして
磁気共鳴画像法（MRI）スキャンを、移植後各患者に対
して種々の月単位の間隔で行い、疾患の進行をモニター
した。

全ての患者が、手術後の１〜２ヶ月間に頭痛および吐
き気を訴えた。最高の細胞用量を受容した患者は、最も
多数の症状を示した。最高の用量を受容した全ての患者
および低用量の各１人を含む５人の患者のうちの４人
は、移植後１〜３ヶ月間にわたってMRIスキャンにおい
て腫瘍増強領域の50％またはそれより多くのの縮小を示
した。MRIスキャンの結果を図１に示す。これは、MLC細
胞の腫瘍内移植で処置した神経膠芽腫患者の生存期間を
測定する。２人の患者（１人は４×10⁹のMLCの単回移植
用量を受容し、そして１人は６×10⁹のMLCの単回移植用
量を受容した）は、それぞれ58週間および74週間にわた
って腫瘍塊の進行性の縮小を今日まで継続した。これら
の２人の患者はまた、Karnofskyスコアにおいて著しい
改善を示した。MRIスキャンの結果を図２に示す。これ
は、MLC移植からの時間の関数として腫瘍体積の縮小を
測定する。

実施例２第Ｉ相研究を、全身性黒色腫の２人の患者において行
った。患者およびドナーのリンパ球の混合培養物を、実
施例１に記載のように調製した。患者を、皮膚腫瘍への
２×10⁹のMLC細胞の病変内注射により処置した。どちら
の患者もネガティブな効果を示さなかった。第１の患者
は、注射された皮膚腫瘍の壊死および崩壊および離れた
転移での炎症を示した。第２の患者は注射した腫瘍で炎
症を示したが、この投与量レベルでは壊死は示さなかっ
た。これらの患者の処置は進行中である。

実施例３ヒト第Ｉ相臨床研究を、膵臓ガンの患者におけるMLC
細胞の腫瘍内移植の効果を試験するために行った。不治
の、処置し得ない膵臓ガンを有する４人の患者が、４×
10⁹のMLC細胞の病変内移植を受けた。毒性がほとんど見
られないか、または全く毒性が見られなかった。腫瘍塊
の縮小が起こり、そして生存期間の延長が観察された。
３人の患者は、50％より多い腫瘍塊の縮小を示した。３
番の患者において、この腫瘍のマーカーであるCA−19−
９の血清レベルは、２ヶ月間にわたって206の最高値か
ら86に減衰した。処置の７ヶ月後、処置した患者の２人
は仕事に復帰し、腫瘍の臨床的な症状を有さず、そして
全体的に通常の生活を行っている。

本発明の上記の記載は、説明および理解の目的のため
に例示される。種々の改変が本発明の意図および範囲か
ら逸脱することなく行われ得ることが理解されるべきで
ある。従って、以下の請求の範囲は、全てのこのような
改変を包含すると解釈されることが意図される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 35/26 ＢＩＯＳＩＳ（ＳＴＮ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＥＭＢＡＳＥ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】腫瘍を有するヒト患者を処置するため、ま
たはヒトにおける抗腫瘍免疫学的応答の誘導のための薬
学的組成物の調製方法であって、該方法は以下の工程：ａ）エクスビボにおいて、ヒトドナー由来のリンパ球を
患者由来の白血球と、該ドナーリンパ球をアロ活性化す
るように同時培養する工程；およびｂ）該同時培養の開始後であって、回収された細胞が該
患者の固形腫瘍ベッドにおける移植に際して該腫瘍の処
置に有効である時期または該患者における該腫瘍に対す
る応答を誘導する時期に該細胞を回収し、それらをヒト
に投与するために調製する工程、を包含する、方法。
【請求項２】前記同時培養される細胞が、該同時培養さ
れる細胞の移植が前記患者において腫瘍に対する応答を
誘導する時期に回収される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】前記同時培養される細胞が、前記固形腫瘍
ベッドにおける該同時培養される細胞の単回移植がガン
の処置に有効である時期に回収される、請求項１または
２に記載の方法。
【請求項４】前記工程ａ）における培養する工程が、培
養開始後約48時間の期間、または該培養された細胞によ
るインターフェロンγ（INF−γ）の分泌が最高である
時点付近まで行われる、請求項１〜３のいずれかに記載
の方法。
【請求項５】前記腫瘍が、黒色腫、膵臓ガン、肝臓ガ
ン、結腸ガン、前立腺ガン、および乳ガンからなる群か
ら選択される悪性疾患である、請求項１〜４のいずれか
に記載の方法。
【請求項６】請求項１〜５のいずれかに記載の方法によ
り調製される薬学的組成物であって、ヒト患者における
腫瘍を処置するため、または抗腫瘍免疫学的応答の誘導
のための、アロ活性化されたヒトドナーリンパ球を含有
する、薬学的組成物。
【請求項７】１つ以上の以下の特徴：ｉ）約２×10⁹と２×10¹⁰との間のドナー起源の培養リ
ンパ球を含有する； ii）約１×10⁸と２×10⁹との間の患者起源の培養白血球
を含有する； iii）外因的に添加されたリンパ球増殖剤を実質的に含
まない；または iv）生理食塩水、緩衝化媒質、および凝固血漿からなる
群から選択される生理学的に適合性のキャリアを含有す
る、を有する、請求項６に記載の薬学的組成物。
【請求項８】請求項６または７に記載の薬学的組成物の
調製のために適切な細胞集団の調製方法であって、該方
法は以下の工程：ａ）ヒト患者から白血球を得る工程；ｂ）該ヒト患者に対して同種異系であるヒトドナーから
リンパ球を得る工程；ｃ）エクスビボにおいて、該ドナーリンパ球を、該患者
白血球と、該ドナーリンパ球をアロ活性化するように同
時培養する工程；ｄ）該同時培養された細胞を、回収された細胞が該患者
の固形腫瘍ベッドへの移植に際して該腫瘍の処置に有効
である時期に培養物から回収する工程；ｅ）該回収された細胞から培養培地を洗浄する工程；お
よびｆ）該洗浄された細胞がヒト投与のために十分に無菌で
あることを確認する工程、を包含する、方法。
【請求項９】１つ以上の以下の特徴：ｉ）工程ａ）において前記ヒト患者から少なくとも約２
×10⁸の白血球を得ること； ii）工程ｂ）において白血球搬出法によって前記ヒトド
ナーから白血球を得ること； iii）工程ｂ）において前記ヒトドナーから少なくとも
約２×10⁹のリンパ球を得ること； iv）工程ｃ）の前に細胞懸濁媒質の層を通して遠心分離
することにより、前記ヒトドナー由来のリンパ球を調製
すること；ｖ）工程ｃ）の前に前記患者白血球の増殖をブロックす
ること； vi）工程ｃ）において前記ドナーリンパ球を前記患者白
血球と約10:1〜20:1の比で同時培養すること； vii）工程ｄ）において前記細胞を培養の開始後約48時
間で、または前記培養細胞によるINF−γの分泌が最高
である時期に回収すること；または viii）工程ｆ）の完了後に、ヒト投与に適切な、約２×
10⁹と２×10¹⁰との間または約２×10⁹と６×10⁹との間
の同時培養された細胞を生成すること、を組み入れた、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】前記腫瘍が、黒色腫、膵臓ガン、肝臓ガ
ン、結腸ガン、前立腺ガン、および乳ガンからなる群か
ら選択される悪性疾患である、請求項８または９に記載
の方法。
【請求項１１】ヒト患者における腫瘍を処置するため、
または抗腫瘍免疫学的応答の誘導のための薬学的組成物
の調製のための、腫瘍を有するヒト患者由来の白血球に
対してアロ活性化されたヒトドナーリンパ球を含有する
細胞集団であって、請求項８〜10のいずれかに記載の方
法によって得られる細胞集団の使用。
【請求項１２】前記薬学的組成物の投与が、前記患者の
固形腫瘍の事前の切除または部分切除を伴うかまたは伴
わない、該固形腫瘍ベッドの中または周囲への移植を包
含する、請求項11に記載の使用。
【請求項１３】１つ以上の以下の特徴：ｉ）前記薬学的組成物の前記固形腫瘍ベッドの中または
周囲への単回移植が前記腫瘍の処置に有効である； ii）前記薬学的組成物の前記固形腫瘍ベッドの中または
周囲への単回移植が抗腫瘍免疫学的応答の誘導に有効で
ある；または iii）前記薬学的組成物の前記固形腫瘍ベッドの中また
は周囲への単回移植がそのように処置された患者の期待
寿命のメジアンの延長に有効である、を有する、請求項11または12に記載の使用。