JP3199405B2 - 肝細胞球状集塊化剤及び球状集塊化肝細胞の製造方法 - Google Patents

肝細胞球状集塊化剤及び球状集塊化肝細胞の製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、人工肝機能補助として
機能する肝実質細胞の集塊の形成に関与する、脂質が共
有結合したグリコサミノグリカンよりなる肝細胞球状集
塊化剤、及び該集塊化剤を培養基質とする容器で肝細胞
を培養する球状集塊化肝細胞の培養法に関する。
【０００２】
【従来の技術】肝臓は、動物の代謝を司る重要な臓器で
あり、その機能は肝臓の約７０％を示す肝実質細胞が担
っている。また、その機能は肝実質細胞のみで発揮され
るのではなく、非実質細胞や細胞外マトリックスとの相
互作用と、それらに基づく組織の構築によって発揮され
る。つまり、生体では肝実質細胞が互いに接着し合った
凝集集塊が形成されることによって生物活性を有する。
【０００３】本発明者らは、先に肝細胞の機能を保持し
た肝実質細胞の集塊化培養法について研究し、高度な肝
機能を維持し得る肝実質細胞の組織形態の再形成に係る
物質を明らかにし、更に該物質の存在下に肝実質細胞を
培養することにより長期間に亘り高度な機能を発現維持
し得る細胞集塊を形成し、ある程度の組織構築を再現す
ることを可能にした。
【０００４】すなわち、成熟ラットの肝臓からコラゲナ
ーゼ門脈還流法により取得した分離肝実質細胞を、培養
皿上に肝レチクリン線維由来のプロテオグリカンを塗布
固相化した培養皿に接種し、ＥＧＦ（上皮細胞増殖因
子）、インシュリン等のホルモン添加無血清培地（ＨＤ
Ｍ）で静置培養すると、図１に示すように、接種された
肝細胞は初め単層として基質に接着しているが、以後時
間の経過するに従い、互いに重なりあった多層島状とな
り、さらに収縮して球状の細胞集塊を形成し、培養皿表
面から離れ、培養液中に浮遊する球状集塊となることを
見い出した［CellStruct. Funct., 13, 179 (1988); Bi
ochem. Biophys. Res. Commun., 161, 385 (1989)］。
【０００５】上記レチクリン由来のプロテオグリカン
は、グリカン部分の構成がデルマタン硫酸、ヘパラン硫
酸及び未知の糖からなることが判明したが、コンドロイ
チン硫酸、デルマタン硫酸、ヘパラン硫酸、あるいはラ
ット肝臓から抽出したコラーゲンやフィブロネクチンの
ような接着性基質又は糖蛋白を固相化した基質では、肝
細胞は培養皿に接着伸展し、単層のままであり、集塊化
は起らなかった。
【０００６】また陽性荷電プラスチック製、例えばポリ
スチレン製ディシュの培養皿で肝細胞を培養すると、プ
ロテオグリカンを塗布した培養皿で培養した場合と同様
に浮遊した集塊となる。これはプラスチック皿上に接種
された細胞がプロテオグリカンを分泌し、これが皿に吸
着されるためと考えられている。［Exp. cell Res. 18
6, 227 (1990)] ［特開平１−２７７４８６号公報］。
【０００７】上記プロテオグリカンを培養基質として形
成された肝細胞は肝細胞が球状に集塊化したものであ
り、浮遊しており、比較的長期間培養してもその形態が
保持されている。また、肝細胞の単層培養物と比べてア
ルブミンの産生分泌能が高く、長期間一定のレベルを維
持していることから、肝細胞集塊化物は高度な肝特異的
分化機能を維持しており、また細胞集塊化物は、Ｈ3 −
チミジンの取り込み及び核ラベリングインデックスで測
定する限り、細胞増殖活性は殆んどない特性を示すこと
から、生体に極めて近い組織構築の可能性を示した［J.
Clin. ElectronMicroseopy 21, 5 (1988) ］。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上記レ
チクリン線維由来のプロテオグリカンの収量は多くな
く、調製も容易ではない。そこでプロテオグリカンに代
り、肝細胞の球状集塊化物を効率的に形成し、肝細胞の
分化機能の発現維持に効力を示す培養基質の開発が求め
られている。また、生体外で生体内と同様な機能を保持
したまま肝細胞を長期間培養することは、生物学的人工
肝機能補助装置の開発のためにも必要である。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、脂質が共有結
合したグリコサミノグリカンを含有する肝細胞球状集塊
化剤を提供するものである。本発明の該集塊化剤は、レ
チクリン線維由来のプロテオグリカンをはるかに超越す
る球状集塊形成効果と肝細胞の分化機能の発現維持を示
す。
【００１０】本発明の肝細胞球状集塊化剤は、グリコサ
ミノグリカン（以下、「ＧＡＧ」と略すこともある）と
脂質が共有結合によって結合した脂質結合ＧＡＧを含有
するものであればよい。特に脂質結合ＧＡＧは、ＧＡＧ
のカルボキシル基（ラクトンを含む）、ホルミル基、水
酸基または１級アミノ基と、脂質の１級アミノ基、カル
ボキシル基またはホルミル基との間で形成されるＣＯＮ
Ｈ結合、エステル結合またはＣＨ2 ＮＨ結合によって共
有結合したものが好ましい。とりわけ、以下の〜の
結合によって結合したものが好ましい。
【００１１】 還元末端が開裂されたグリコサミノグ
リカンのカルボキシル（ラクトンを含む）基と、脂質の
１級アミノ基とから形成されたＣＯＮＨ結合、 グリ
コサミノグリカンのウロン酸部分のカルボキシル基と、
脂質の１級アミノ基とから形成されたＣＯＮＨ結合、ま
たは 還元末端が開裂されたグリコサミノグリカンの
ホルミル基と、脂質の１級アミノ基とから形成されたＣ
Ｈ2 ＮＨ結合。
【００１２】上記結合に関与する１級アミノ基、カルボ
キシル基、ホルミル基、水酸基は、ＧＡＧまたは脂質に
元来存在するもの、これらに化学的処理を施すことによ
って形成されたもの、あるいは上記官能基を末端に具備
するスペーサー化合物をあらかじめこれらと反応させる
ことによって導入されたもののいずれであってもよい。
【００１３】脂質結合ＧＡＧとその原料化合物との関係
を模式的に示すと以下のとおりである。
【００１４】
【化２】
【００１５】
【化３】
【００１６】
【化４】
【００１７】本発明で用いる脂質結合グリコサミノグリ
カンは、その塩であることができ、好ましくはナトリウ
ム、カリウムのようなアルカリ金属塩；カルシウム、マ
グネシウムのようなアルカリ土類金属塩；トリアルキル
アミンのようなアミン塩；ピリジンのような有機塩基と
の塩であることができる。
【００１８】本発明で用いる脂質結合グリコサミノグリ
カンは、次のものを包含する。
【００１９】１．一般式
【００２０】
【化５】
【００２１】を有する脂質結合グリコサミノグリカン。
【００２２】上記式中、Ｐ1 は１級アミノ基を有する脂
質を示し、ＧＡＧはグリコサミノグリカン残基であっ
て、
【００２３】（１）ＧＡＧがヒアルロン酸、コンドロイ
チン、コンドロイチン硫酸Ａ、ＣもしくはＥ、デルマタ
ン硫酸、ヘパリン又はヘパラン硫酸から還元性末端のグ
ルクロン酸部分を除いたグリコサミノグリカン残基のと
き、或いはデルマタン硫酸から還元性末端のイズロン酸
部分を除いたグリコサミノグリカン残基のとき、ＧＡＧ
は４位に、Ｒ3 は３位に置換し、Ｒ2 はＣＯＯＨ基を示
し、Ｒ3 はＯＨ基を示す。
【００２４】（２）ＧＡＧがコンドロイチン硫酸Ｋ又は
コンドロイチンポリ硫酸から還元性末端のグルクロン酸
部分を除いたグリコサミノグリカン残基のとき、ＧＡＧ
は４位に、Ｒ3 は３位に置換し、Ｒ2 はＣＯＯＨ基を示
し、Ｒ3 はＯＳＯ3 Ｈ基を示す。
【００２５】（３）ＧＡＧがケラタン硫酸から還元性末
端のガラクトース部分を除いたグリコサミノグリカン残
基のとき、ＧＡＧは３位に、Ｒ3 は４位に置換し、Ｒ2
はＣＨ2 ＯＨ基を示し、Ｒ3 はＯＨ基を示す。
【００２６】（４）ＧＡＧがケラタンポリ硫酸から還元
性末端のガラクトース部分を除いたグリコサミノグリカ
ン残基のとき、ＧＡＧは３位に、Ｒ3 は４位に置換し、
Ｒ2はＣＨ2 ＯＳＯ3 Ｈ基を示し、Ｒ3 はＯＨ基を示
す。
【００２７】２．一般式
【００２８】
【化６】
【００２９】を有する脂質結合グリコサミノグリカン。
【００３０】上記式中、Ｐ1 は１級アミノ基を有する脂
質を示し、ＧＡＧはグリコサミノグリカン残基であっ
て、
【００３１】（１）ＧＡＧがヒアルロン酸、コンドロイ
チンから還元性末端のヘキサソミン部分を除いたグリコ
サミノグリカン残基のとき、Ｒ1 はＮＨＣＯＣＨ3 基を
示し、Ｒ3 はＯＨ基を示す。
【００３２】（２）ＧＡＧがコンドロイチン硫酸Ａもし
くはＫ、コンドロイチンポリ硫酸又はデルマタン硫酸か
ら還元性末端のヘキソサミン酸部分を除いたグリコサミ
ノグリカン残基のとき、Ｒ1 はＮＨＣＯＣＨ3 基を示
し、Ｒ3 はＯＨ基を示す。
【００３３】（３）ＧＡＧがケラタン硫酸又はケラタン
ポリ硫酸から還元性末端のガラクトース部分を除いたグ
リコサミノグリカン残基のとき、Ｒ1 及びＲ3 はＯＨ基
を示す。
【００３４】３．一般式
【００３５】
【化７】
【００３６】を有する脂質結合グリコサミノグリカン。
【００３７】上記式中、Ｐ1 は１級アミノ基を有する脂
質を示し、ＧＡＧはケラタン硫酸又はケラタンポリ硫酸
から還元性末端のガラクトース部分を除いたグリコサミ
ノグリカン残基を示す。
【００３８】４．一般式
【００３９】
【化８】
【００４０】を有する脂質結合グリコサミノグリカン。
【００４１】上記式中、Ｐ1 は１級アミノ基を有する脂
質を示し、ＧＡＧはグリコサミノグリカン残基であっ
て、
【００４２】（１）ＧＡＧがヒアルロン酸、コンドロイ
チン、コンドロイチン硫酸Ａ、ＣもしくはＥ、デルマタ
ン硫酸、ヘパリン、又はヘパラン硫酸から還元性末端の
グルクロン酸部分を除いたグリコサミノグリカン残基の
とき、或いはデルマタン硫酸から還元性末端のイズロン
酸部分を除いたグリコサミノグリカン残基のとき、ＧＡ
Ｇは４位に、Ｒ3 は３位に置換し、Ｒ1 はＯＨ基を示
し、Ｒ2 はＣＯＯＨ基を示し、Ｒ3 はＯＨ基を示す。
【００４３】（２）ＧＡＧがコンドロイチン硫酸Ｄから
還元性末端のグルクロン酸部分を除いたグリコサミノグ
リカン残基のとき、或いはヘパリン又はヘパラン硫酸か
ら還元性末端のイズロン酸部分を除いたグリコサミノグ
リカン残基のとき、ＧＡＧは４位に、Ｒ3 は３位に置換
し、Ｒ1 はＯＳＯ3 Ｈ基を示し、Ｒ2 はＣＯＯＨ基を示
し、Ｒ3 はＯＨ基を示す。
【００４４】（３）ＧＡＧがコンドロイチン硫酸Ｋから
還元性末端のグルクロン酸部分を除いたグリコサミノグ
リカン残基のとき、ＧＡＧは４位に、Ｒ3 は３位に置換
し、Ｒ1 はＯＨ基を示し、Ｒ2 はＣＯＯＨ基を示し、Ｒ
3 はＯＳＯ3 Ｈ基を示す。
【００４５】（４）ＧＡＧがコンドロイチンポリ硫酸か
ら還元性末端のグルクロン酸部分を除いたグリコサミノ
グリカン残基のとき、ＧＡＧは４位に、Ｒ3 は３位に置
換し、Ｒ1 およびＲ3 の少なくとも一つはＯＳＯ3 Ｈ基
を示し、他はＯＨ基を示し、Ｒ2 はＣＯＯＨ基を示す。
【００４６】（５）ＧＡＧがケラタン硫酸から還元性末
端のガラクトース部分を除いたグリコサミノグリカン残
基のとき、ＧＡＧは３位に、Ｒ3 は４位に置換し、Ｒ1
及びＲ3 はＯＨ基を示し、Ｒ2 はＣＨ2 ＯＨ基を示す。
【００４７】（６）ＧＡＧがケラタンポリ硫酸から還元
性末端のガラクトース部分を除いたグリコサミノグリカ
ン残基のとき、ＧＡＧは３位に、Ｒ3 は４位に置換し、
Ｒ1及びＲ3 はＯＨ基を示し、Ｒ2 はＣＨ2 ＯＳＯ3 Ｈ
基を示す。
【００４８】（７）ＧＡＧがヒアルロン酸又はコンドロ
イチンから還元性末端のヘキソサミン部分を除いたグリ
コサミノグリカン残基のとき、ＧＡＧは３位に、Ｒ3 は
４位に置換し、Ｒ1 はＮＨＣＯＣＨ3 基を示し、Ｒ2 は
ＣＨ2 ＯＨ基を示し、Ｒ3 はＯＨ基を示す。
【００４９】（８）ＧＡＧがコンドロイチン硫酸Ａもし
くはＫ又はデルマタン硫酸から還元性末端のヘキソサミ
ン部分を除いたグリコサミノグリカン残基のとき、ＧＡ
Ｇは３位に、Ｒ3 は４位に置換し、Ｒ1 はＮＨＣＯＣＨ
3 基を示し、Ｒ2 はＣＨ2 ＯＨ基を示し、Ｒ3 はＯＳＯ
3 Ｈ基を示す。
【００５０】（９）ＧＡＧがコンドロイチン硫酸Ｃ又は
Ｄから還元性末端のヘキソサミン部分を除いたグリコサ
ミノグリカン残基のとき、ＧＡＧは３位に、Ｒ3 は４位
に置換し、Ｒ1 はＮＨＣＯＣＨ3 基を示し、Ｒ2 はＣＨ
2 ＯＳＯ3 Ｈ基を示し、Ｒ3はＯＨ基を示す。
【００５１】（１０）ＧＡＧがコンドロイチン硫酸Ｅか
ら還元性末端のヘキソサミン部分を除いたグリコサミノ
グリカン残基のとき、ＧＡＧは３位に、Ｒ3 は４位に置
換し、Ｒ1 はＮＨＣＯＣＨ3 基を示し、Ｒ2 はＣＨ2 Ｏ
ＳＯ3 Ｈ基を示し、Ｒ3 はＯＳＯ3 Ｈ基を示す。
【００５２】（１１）ＧＡＧがコンドロイチンポリ硫酸
から還元性末端のヘキソサミン部分を除いたグリコサミ
ノグリカン残基のとき、ＧＡＧは３位に、Ｒ3 は４位に
置換し、Ｒ1 はＮＨＣＯＣＨ3 基を示し、Ｒ2 はＣＨ2
ＯＨ基でＲ3 はＯＳＯ3 Ｈ基を示すか、又はＲ2 はＣＨ
2 ＯＳＯ3 Ｈ基でＲ3 はＯＨ基もしくはＯＳＯ3 Ｈ基を
示す。
【００５３】（１２）ＧＡＧがヘパリンから還元性末端
のヘキソサミン部分を除いたグリコサミノグリカン残基
のとき、ＧＡＧは４位に、Ｒ3 は３位に置換し、Ｒ1 は
ＮＨＳＯ3 Ｈ基を示し、Ｒ2 はＣＨ2 ＯＳＯ3 Ｈ基を示
し、Ｒ3 はＯＨ基を示す。
【００５４】（１３）ＧＡＧがヘパラン硫酸から還元性
末端のヘキソサミン部分を除いたグリコサミノグリカン
残基のとき、ＧＡＧは４位に、Ｒ3 は３位に置換し、Ｒ
1 はＮＨＣＯＣＨ3 基又はＮＨＳＯ3 Ｈ基を示し、Ｒ2
はＣＨ2 ＯＨ基でＲ3 はＯＳＯ3 Ｈ基を示すか、又はＲ
2 はＣＨ2 ＯＳＯ3 Ｈ基でＲ3 はＯＨ基もしくはＯＳＯ
3 Ｈ基を示す。
【００５５】（１４）ＧＡＧがケラタン硫酸又はケラタ
ンポリ硫酸から還元性末端のヘキソサミン部分を除いた
グリコサミノグリカン残基のとき、ＧＡＧは４位に、Ｒ
3 は３位に置換し、Ｒ1 は、ＮＨＣＯＣＨ3 基を示し、
Ｒ2 はＣＨ2 ＯＳＯ3 Ｈ基を示し、Ｒ3 はＯＨ基を示
す。
【００５６】５．一般式
【００５７】
【化９】
【００５８】を有する脂質結合グリコサミノグリカン。
【００５９】上記式中、Ｐ2 は脂質を示し、ＧＡＧ、Ｒ
2 及びＲ3 は式（Ｉ）に記載と同じである。ｍは１〜８
を示し、ｋは１〜１０を示す。
【００６０】６．一般式
【００６１】
【化１０】
【００６２】を有する脂質結合グリコサミノグリカン。
【００６３】上記式中、ＧＡＧ、Ｒ1 及びＲ3 は式（I
I）に記載と同じであり、ｍ、ｋ及びＰ2 は式（Ｖ）に
記載と同じである。
【００６４】７．一般式
【００６５】
【化１１】
【００６６】を有する脂質結合グリコサミノグリカン。
【００６７】上記式中、ＧＡＧ、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 は
式（IV）に記載と同じであり、ｍ、ｋ及びＰ2 は式
（Ｖ）に記載と同じである。
【００６８】８．一般式
【００６９】
【化１２】
【００７０】を有する脂質結合グリコサミノグリカン。
ただし、上記式（VIII）は、グリコサミノグリカンの構
成二糖中、ウロン酸に脂質が結合していることを模式的
に示したものである。
【００７１】上記式中、Ｐ1は１級アミノ基を有する脂
質を示し、ｎはグリコサミノグリカンに存在するカルボ
キシ基の数以下の整数を示し（必ずしも構成二糖単位の
連続する全てのウロン酸に脂質が結合していることを示
すものではない。）、ＡはＧＡＧの種類によって特定さ
れるヘキソサミンまたはその硫酸エステルを示し、
【００７２】（１）ＧＡＧがヒアルロン酸、コンドロイ
チン、コンドロイチン硫酸Ａ、ＣもしくはＥ、又はデル
マタン硫酸のグリコサミノグリカン鎖のとき、Ｒ1 及び
Ｒ3はＯＨ基を示す。
【００７３】（２）ＧＡＧがコンドロイチン硫酸Ｄのグ
リコサミノグリカン鎖のとき、Ｒ1はＯＳＯ3 Ｈ基を示
し、Ｒ3 はＯＨ基を示す。
【００７４】（３）ＧＡＧがコンドロイチン硫酸Ｋのグ
リコサミノグリカン鎖のとき、Ｒ1はＯＨ基を示し、Ｒ3
はＯＳＯ3 Ｈ基を示す。
【００７５】（４）ＧＡＧがコンドロイチンポリ硫酸の
グリコサミノグリカン鎖のとき、Ｒ1 及びＲ3 の少なく
とも一つはＯＳＯ3 Ｈ基を示し、他はＯＨ基を示す。
【００７６】（５）ＧＡＧがヘパリン又はヘパラン硫酸
のグリコサミノグリカン鎖のとき、Ｒ1 はＯＨ基又はＯ
ＳＯ3 Ｈ基を示し、Ｒ3 はＯＨ基を示す。
【００７７】グリコサミノグリカンとしては、ヒアルロ
ン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンド
ロイチン硫酸Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチ
ン硫酸Ｅ、コンドロイチン硫酸Ｋ、コンドロイチンポリ
硫酸、デルマタン硫酸（コンドロイチン硫酸Ｂ）、ヘパ
リン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸、ケラタンポリ硫酸
が例示される。
【００７８】グリコサミノグリカンの分子量は好ましく
は１，０００〜１００万のものが用いられる。
【００７９】上記式（Ｖ）、（VI）又は（VII)で表わさ
れる脂質結合ＧＡＧを製造する際に原料として使用する
１級アミノ基を導入したＧＡＧは、後述の方法によって
ＧＡＧの還元末端を開裂させて得られるラクトン化ＧＡ
Ｇまたはアルデヒド化ＧＡＧとＮＨ2 −（ＣＨ2 ）m −
ＮＨ2 で表わされるアルキレンジアミンを反応させるこ
とによって製造することができる。このような１級アミ
ノ基を導入したＧＡＧは、上記アルキレンジアミンの代
りにリジンなどの２個のアミノ基を有するアミノ酸を反
応させることによっても得ることができる。また、アル
キレンジアミン、アミノ酸はＧＡＧのウロン酸部分のカ
ルボキシル基と反応させることもできる。
【００８０】上記式（Ｉ）、（II）、（III)、（IV）及
び（VIII) のＰ1 で示される脂質残基の原料である１級
アミノ基を有する脂質としては、下式（IX）で表わされ
るホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルセ
リン、ホスファチジルトレオニン、プラスマローゲンな
どの燐脂質が例示される。
【００８１】
【化１３】
【００８２】（式中、Ｒ4 及びＲ5 はそれぞれ水素、−
ＣＨ＝ＣＨＲ6 又は−ＣＯＲ7(Ｒ6及びＲ7 はＣ6 〜24
のアルキル基）であり（ただし、Ｒ4 とＲ5 が同時に水
素である場合を除く）、Ｙは−ＣＨ2 ＣＨ2 ＮＨ2 又は
【００８３】
【化１４】
【００８４】である）で示されるものが用いられる。特
にＲ4 及びＲ5 がともにパルミトイル（ヘキサデカノイ
ル）又はステアロイル（オクタデカノイル）のような−
ＣＯＲ7 であるか、Ｒ4 が−ＣＨ＝ＣＨＲ6 でＲ5 が−
ＣＯＲ7 であるものが好ましい。
【００８５】また、上記式（Ｖ）、（VI）及び（VII)の
Ｐ2 で示される脂質残基の原料である脂質としては、
【００８６】
【化１５】
【００８７】（式中、Ｒ8 及びＲ9 はそれぞれ水素、ア
ルキル基、−ＣＨ＝ＣＨＲ6 又は−ＣＯＲ7(Ｒ6 及びＲ
7 は前記と同じ）であり（ただし、同時に水素である場
合を除く）、Ｒ10はアルキル基、−ＣＨ＝ＣＨＲ6 又は
−ＣＯＲ7 （Ｒ6 及びＲ7 は前記と同じ）であり、Ｗは
−ＣＨ2 ＣＨ2 Ｎ+(ＣＨ3)3 又はイノシトール残基であ
る）
【００８８】で示されるものが用いられる。特にＲ8 及
びＲ9 がともにパルミトイル（ヘキサデカノイル）又は
ステアロイル（オクタデカノイル）のような−ＣＯＲ7
であるか、Ｒ8 が水素で、Ｒ9 が−ＣＯＲ7 である式
（Ｘ）又は（XI）の脂質、或いはＲ10が−ＣＯＲ7 であ
る式（XII)又は（XIII）の燐脂質が好ましい。
【００８９】上記式（Ｖ）、（VI）又は（VII)で表わさ
れる脂質結合ＧＡＧを製造する際に原料として使用する
カルボキシル基を導入した脂質（ＨＯＯＣ−（ＣＨ2 ）
k −ＣＯ−Ｐ2 ）は、後述の水酸基を有する脂質とジカ
ルボン酸（ＨＯＯＣ−（ＣＨ2 ）k −ＣＯＯＨ）または
その反応性誘導体を反応させることによって製造するこ
とができる。
【００９０】なお、前記（ニ）のアルデヒド化脂質は、
例えばグリセルアルデヒドの水酸基をアシル化またはエ
ーテル化することによって製造することができる。
【００９１】以下に、本発明の燐脂質又は脂質結合グリ
コサミノグリカンの製造法について詳しく説明する。
【００９２】還元末端限定酸化法 この方法は、グリコサミノグリカンの還元性末端のウロ
ン酸部分もしくはガラクトース部分又はヘキソサミン部
分を還元及び部分酸化することにより開裂させてアルデ
ヒド（ホルミル基）を形成させ、このアルデヒドと脂質
の１級アミノ基との間の還元的アルキル化反応により、
脂質結合グリコサミノグリカンを製造する方法である。
この方法を反応式で示せば次のとおりである。
【００９３】（Ａ）還元性末端糖のグルクロン酸又はイ
ズロン酸に反応する場合
【００９４】
【化１６】
【００９５】（Ｒ3 は前述と同じ、Ｐ1 は１級アミノ基
を有する脂質を示す）
【００９６】還元性末端がＣ−２にＯＨを有するＤ−グ
ルクロン酸又はＬ−イズロン酸である式（１）のヒアル
ロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コン
ドロイチン硫酸Ｃ、コンドロイトン硫酸Ｅ、コンドロイ
チン硫酸Ｋ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫
酸、ヘパリン又はヘパラン硫酸を原料として使用したと
き、上記反応式に従い、式（Ｉ）−ａの脂質結合グリコ
サミノグリカンが製造できる。
【００９７】（Ｂ）還元性末端糖のグルコサミン又はガ
ラクトサミンに反応する場合
【００９８】
【化１７】
【００９９】（式中、Ｒ3 は前述と同じ、Ｐ1 は１級ア
ミノ基を有する脂質を示す）
【０１００】還元性末端のＣ−６に水酸基（ＯＨ）を有
するグルコサミン又はガラクトサミンである式（４）の
ヒアルロン酸、コンドロイチン、コンドロイチン硫酸
Ａ、コンドロイチン硫酸Ｋ、コンドロイチンポリ硫酸又
はデルマタン硫酸を原料として使用したとき、上記反応
式に従い、式（II）−ａの脂質結合グリコサミノグリカ
ンが製造できる。
【０１０１】（Ｃ）還元性末端糖のガラクトースに反応
する場合
【０１０２】
【化１８】
【０１０３】（式中、Ｐ1 は１級アミノ基を有する脂質
を示す）
【０１０４】還元性末端糖がガラクトースである式
（７）のケラタン硫酸又はケラタンポリ硫酸を原料とし
て使用したとき、上記反応式に従い、式（Ｉ）−ｂ、
（II）−ｂ及び（III)の脂質結合グリコサミノグリカン
が製造できる。
【０１０５】上記（Ａ）、（Ｂ）又は（Ｃ）の方法にお
いては、先ず、上記式（１）、（４）又は（７）で示さ
れるグルコサミノグリカンを還元して還元性末端糖部分
を開裂させて式（２）、（５）又は（８）の化合物とす
る。
【０１０６】この還元に使用しうる還元剤としては、水
素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム
などの水素化ホウ素アルカリ塩等を用いることができ
る。
【０１０７】また、上記還元反応における溶媒は、水又
は０．０５M ホウ酸塩緩衝液（pH８．３）等を用いるこ
とができる。
【０１０８】また還元反応温度は、通常１０〜３０℃、
好ましくは１５〜２５℃で行うことができる。
【０１０９】還元剤の使用量は、その種類等によっても
異なるが、一般には式（１）、（４）又は（７）の化合
物１モルに対して５〜５０当量、好ましくは２５〜３０
当量の範囲である。
【０１１０】得られる式（２）、（５）又は（８）の化
合物を次いで部分的に酸化すると、式（３）、（６）、
（９）、（１０）又は（１１）のアルデヒド化合物が生
成する。
【０１１１】この酸化反応に使用しうる酸化剤として
は、過ヨウ素酸ナトリウム、過ヨウ素酸カリウムなどの
過ヨウ素酸アルカリ塩等を用いることができる。
【０１１２】酸化剤の使用量は、式（２）、（５）又は
（８）の化合物１モルに対して１〜１０当量、好ましく
は３〜６当量の範囲である。
【０１１３】酸化反応温度は、０〜１０℃、好ましくは
０〜４℃の範囲で行うことができる。
【０１１４】生成した（３）、（６）、（９）、（１
０）又は（１１）のアルデヒド化合物は、それ自体既知
の還元的アルキル化法に従い、脂質の１級アミノ基と反
応させることができ、これによって本発明の球状集塊化
剤として有効な一般式（Ｉ）、（II）又は（III)で示さ
れる脂質結合グリコサミノグリカンを得ることができ
る。
【０１１５】上記反応に用いることのできる脂質として
は、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジル
セリン、ホスファチジルトレオニン、エタノールアミン
プラスマロゲン、セリンプラスマロゲン等を挙げること
ができる。
【０１１６】上記還元的アルキル化反応は、水、０．０
５M リン酸緩衝液（pH７．０）又はジメチルホルムアミ
ドのような溶媒中において、式（３）、（６）、
（９）、（１０）又は（１１）のアルデヒド化合物とク
ロロホルム等に溶解した脂質とを混合して均一な溶液に
し、通常１５〜６０℃の温度で反応させ、それと同時に
又はその後に、例えばシアノ水素化ホウ素ナトリウム等
の還元剤を用いて還元することにより一般式（Ｉ）、
（II）又は（III)の化合物を製造することができる。
【０１１７】還元末端ラクトン化法 この方法は、グリコサミノグリカンの還元性末端ウロン
酸部分もしくはガラクトース部分又はヘキソサミン部分
を酸化することにより該末端糖部分を開裂させ、更にラ
クトンを形成させて、このラクトンと脂質の１級アミノ
基との反応により脂質結合グリコサミノグリカンを製造
する方法である。この方法を反応式で示せば次のとおり
である。
【０１１８】
【化１９】
【０１１９】（式中、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 は前述と同
じ、Ｐ1 は１級アミノ基を有する脂質を示す）
【０１２０】本方法において、先ず、式（１２）で示さ
れるグリコサミノグリカンを酸化して還元性末端部分を
開裂させ、式（１３）のカルボキシ化合物とする。
【０１２１】式（１２）のヒアルロン酸、コンドロイチ
ン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸Ｃ、コ
ンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コンドロ
イチン硫酸Ｋ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマタン硫
酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸又はケラタ
ンポリ硫酸を原料として使用することができる。
【０１２２】この酸化に使用しうる酸化剤としては、ヨ
ウ素、臭素等を用いることができる。
【０１２３】酸化剤の使用量は、式（１２）の化合物１
モルに対して２〜２０当量、好ましくは５〜１５当量の
範囲である。
【０１２４】酸化反応における溶媒は、水又は０．０５
M リン酸緩衝液（pH７．０）等を用いることができる。
【０１２５】酸化反応温度は、０〜４０℃、好ましくは
１５〜２０℃で行うことができる。
【０１２６】生成する式（１３）の化合物は、次いで酸
で処理することにより式（１４）のラクトン化合物にす
ることができる。
【０１２７】ここで用いることのできる酸としては、強
酸性陽イオン交換樹脂、例えばダウエックス５０（商品
名；ダウ・ケミカル社製）、アンバーライトＩＲ１２０
（商品名；オルガノ（株）製）等を挙げることができ
る。
【０１２８】得られる式（１４）のラクトン化合物は、
次いで１級アミノ基を有する脂質と反応させることによ
り、前記一般式（IV）の脂質結合グリコサミノグリカン
を製造することができる。
【０１２９】上記反応に用いることのできる脂質として
は、前記還元末端限定酸化法において例示したものを用
いることができる。
【０１３０】式（１４）のラクトン化合物と脂質との反
応は、水、０．０５M リン酸緩衝液（pH７．０）又はジ
メチルホルムアミド等に溶解した式（１４）のラクトン
化合物と、クロロホルム等に溶解した脂質とを混合して
均一な溶液にし、５〜８０℃、好ましくは３０〜６０℃
の温度で反応させることにより一般式（IV）の化合物を
製造することができる。
【０１３１】還元末端アミン法 この方法は、前記式（３）、（６）、（９）もしくは
（１０）のアルデヒド化合物又は（１４）のラクトン化
合物にアルキレンジアミンを反応させ、末端に１級アミ
ノ基が導入されたグリコサミノグリカン誘導体とし、次
にこの１級アミノ基をもつグリコサミノグリカン誘導体
とカルボキシル基が導入された脂質誘導体とを反応さ
せ、アミノ基とカルボキシル基との結合により、脂質結
合グリコサミノグリカンを製造する方法である。
【０１３２】この方法を反応式で示せば次のとおりであ
る。
【０１３３】
【化２０】
【０１３４】（式中、Ｒ1 、Ｒ2 及びＲ3 は前述と同
じ、Ｐ2 は脂質を示す）
【０１３５】グリコサミノグリカン誘導体式（１５）又
は（１６）は、式（３）、（６）、（９）又は（１０）
の化合物とアルキレンジアミンとを前記還元末端限定酸
化法と同様に還元剤の存在下、還元的アルキル化法によ
って反応させることによって得られる。また、グリコサ
ミノグリカン誘導体式（１７）は、式（１４）の化合物
とアルキレンジアミンとを前記還元末端ラクトン化法に
おける脂質との反応と同様に反応させることによって得
られる。
【０１３６】この反応に使用できるアルキレンジアミン
としては一般式
【０１３７】ＮＨ2 −（ＣＨ2)m −ＮＨ2
【０１３８】（式中、ｍは１〜８の整数）
【０１３９】で示される化合物を用いることができる。
【０１４０】還元剤としては、シアノ水素化ホウ素ナト
リウム等を用いることができる。
【０１４１】還元剤の使用量は、上記反応に使用するグ
ルコサミノグリカンのモル数の１０〜１００倍モル量で
ある。
【０１４２】反応溶媒は、水又は０．０５M リン酸緩衝
液等を用いることができる。
【０１４３】反応温度は、０〜６０℃、好ましくは４〜
２５℃で行う。
【０１４４】また、カルボキシル基をもつ脂質誘導体
は、グリセロール骨格に水酸基をもつ脂質とジカルボン
酸又はその反応性誘導体（酸無水物、ハロゲン化物な
ど）とを反応させて得られる。
【０１４５】この反応に使用できる脂質としては、モノ
アシルグリセロール、ジアシルグリセロール、リゾホス
ファチジルコリン又はリゾホスファチジルイノシトー
ル、水酸基を有するエテール脂質もしくは燐脂質等を用
いることができる。
【０１４６】ジカルボン酸又はその反応性誘導体として
は、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、フマル酸、マ
レイン酸、テレフタル酸又はその酸無水物、ハロゲン化
物（塩化物など）を用いることができる。
【０１４７】縮合剤を使用する場合、１−エチル−３−
（ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド、ジシク
ロヘキシルカルボジイミド等を用いることができる。
【０１４８】反応溶媒としては、クロロホルム、アセト
アニリド、ジメチルホルムアミド等を用いることができ
る。
【０１４９】反応温度は、縮合剤の存在下でジカルボン
酸を使用するときは０〜６０℃を、また無水ジカルボン
酸を使用するときは２０〜８０℃で行うことができる。
【０１５０】還元末端に１級アミノ基をもつグリコサミ
ノグリカン誘導体とカルボキシル基をもつ脂質誘導体と
を反応させる方法は、先ず該脂質誘導体をペプチド化学
の分野でよく知られている方法に従って該脂質誘導体の
カルボキシル基を活性化し、次いで該グリコサミノグリ
カン誘導体と反応させる方法で行うことができる（「ペ
プチド合成の基礎と実験」、泉屋信夫、脇道典ら著、昭
和６０年、丸善（株）発行）。
【０１５１】上記脂質誘導体のカルボキシル基を活性化
する方法としては、上記脂質誘導体とＮ−ヒドロキシス
クシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、Ｎ−ヒドロキシ
ベンゾトリアゾール、Ｎ−ヒドロキシピペリジン、２，
４，５−トリクロロフェニルノール等とを縮合剤の存在
下で反応させ、該カルボキシ基を活性エステルに変える
方法で行うことができる。
【０１５２】反応溶媒としては、クロロホルム、アセト
ニトリル、ジメチルホルムアミド又は該溶媒の混合液を
用いることができる。
【０１５３】縮合剤としては、１−エチル−３−（ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド等を用いることができる。
【０１５４】反応温度は、０〜６０℃で行う。
【０１５５】上記方法によって得られたカルボキシル基
が活性化された上記脂質誘導体と、１級アミノ基をもつ
グリコサミノグリカン誘導体（１５）（１６）又は（１
７）とを反応させれば、脂質結合グリコサミノグリカン
（Ｖ）、（VI）又は（VII)を得ることができる。
【０１５６】上記反応溶媒としては、クロロホルム、ア
セトニトリル、ジメチルホルムアミド又は該溶媒の混合
液を用いることができる。
【０１５７】また、反応温度は、０〜６０℃で行う。
【０１５８】縮合剤使用法 ケラタン硫酸及びケラタンポリ硫酸以外のグリコサミノ
グリカンはＤ−グルクロン酸又はＬ−イズロン酸を含有
し、これらのウロン酸はＣ−５にカルボキシル基を有す
る。
【０１５９】この方法は、ウロン酸のカルボキシル基と
脂質の１級アミノ基とを縮合剤の存在下で反応させ、脂
質結合グリコサミノグリカンを製造する方法である。
【０１６０】この方法を反応式で示せば次のとおりであ
る。なお、下記反応式はグリコサミノグリカン中のウロ
ン酸部分における反応のみに着目し、模式的に示したも
のであり、また必ずしも構成二糖単位の連続する全ての
ウロン酸に脂質が結合することを示すものではない。
【０１６１】
【化２１】
【０１６２】（式中、Ｒ1 、Ｒ3 、Ａ及びＰ1 は前述と
同じ）
【０１６３】本方法で原料として用いることのできるグ
リコサミノグリカン（１８）は、ヒアルロン酸、コンド
ロイチン、コンドロイチン硫酸Ａ、コンドロイチン硫酸
Ｃ、コンドロイチン硫酸Ｄ、コンドロイチン硫酸Ｅ、コ
ンドロイチン硫酸Ｋ、コンドロイチンポリ硫酸、デルマ
タン硫酸、ヘパリン又はヘパラン硫酸である。
【０１６４】脂質としては、前記還元末端限定酸化法に
おいて例示したものを用いることができる。
【０１６５】縮合剤としては、ジエチルカルボジイミ
ド、ジイソプロピルカルボジイミド、メチルプロピルカ
ルボジイミド、ジシクロヘキシルカルボジイミド、ヘキ
サメチレンカルボジイミド、ヘプタメチレンカルボジイ
ミド、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピ
ル）カルボジイミド、１−シクロヘキシル−３−（２−
モルホリノエチル）カルボジイミド・メソ−ｐ−トルエ
ンスルホネート、１−ｔ−ブチル−３−（３−ジメチル
アミノプロピル）カルボジイミド、ジフェニルカルボジ
イミド、４，４′−ジニトロジフェニルカルボジイミ
ド、ジ−ｐ−トリルカルボジイミド又はビス（トリメチ
ルシリル）カルボジイミド等を挙げることができる。
【０１６６】縮合剤の使用量は、脂質の使用モル量の１
０〜１００倍モル量を用いることができる。
【０１６７】溶媒としては、ジメチルホルムアミド、ク
ロロホルム又は該溶媒の混合液等を用いることができ
る。
【０１６８】反応温度は、４〜６０℃、好ましくは１５
〜２５℃で行う。
【０１６９】グリコサミノグリカン活性化法 この方法は、上記縮合剤使用法と同様に、ウロン酸のカ
ルボキシル基を、脂質の１級アミノ基と結合させること
により、脂質結合グリコサミノグリカン（VIII）を製造
する方法であって、反応に際してカルボキシル基を活性
化する方法である。
【０１７０】本方法で使用することのできるグリコサミ
ノグリカン及び脂質としては、上記縮合剤使用法と同様
のものを用いることができる。
【０１７１】カルボキシ基を活性化する方法としては、
ペプチド化学の分野でよく知られている方法に従って、
グリコサミノグリカンのウロン酸部分のカルボキシ基を
活性化することができる（「ペプチド合成の基礎と実
験」前記）。
【０１７２】活性化する方法としては、例えばグリコサ
ミノグリカンにＮ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニ
トロフェノール、Ｎ−ヒドロキシベンゾトリアゾール、
Ｎ−ヒドロキシピペリジン、２，４，５−トリクロロフ
ェノール等を縮合剤の存在下で反応させて、該カルボキ
シル基を活性エステルに変えることができる。
【０１７３】ウロン酸部分のカルボキシル基はそのアミ
ン、有機塩基、アルカリ金属等との塩として反応させる
こともできる。
【０１７４】アミンとしては、トリ（ｎ−ブチル）アミ
ン、トリエチルアミン等を、有機塩基としてはピリジン
等を、アルカリ金属としてはナトリウム、カリウム等を
挙げることができる。
【０１７５】反応溶媒としては、ジメチルホルムアミ
ド、ピリジン、ジメチルスルホキシド等を用いることが
できる。
【０１７６】縮合剤としては、１−エチル−３−（ジメ
チルアミノプロピル）カルボジイミド、ジシクロヘキシ
ルカルボジイミド等を用いることができる。
【０１７７】反応温度は、０〜６０℃、好ましくは４〜
２０℃で行う。
【０１７８】上記方法によって得られた、カルボキシル
基が活性化されたグリコサミノグリカンを脂質と反応さ
せれば、一般式（VIII）の脂質結合グリコサミノグリカ
ンを得ることができる。
【０１７９】上記反応は、ジメチルホルムアミド、クロ
ロホルム又は該溶媒の混合液の溶液において、上記活性
化グリコサミノグリカンと脂質とを０〜９０℃、好まし
くは２５〜６０℃で反応させる。
【０１８０】また、本発明の一般式（Ｉ）〜（VIII）で
示される脂質結合グリコサミノグリカンの脂質の含有量
は、０．００５〜５０％，好ましくは２〜１０％の範囲
である。
【０１８１】以上に述べた各種の方法で製造される脂質
結合グリコサミノグリカンの分離、精製方法としては、
反応液に酢酸ナトリウム飽和エタノールを加えて生じた
沈澱物をろ取することで未反応の脂質を除き、さらに該
沈澱物を疎水クロマトに負荷し、酢酸アンモニウム、塩
化アンモニウム、塩化ナトリウム等の塩の水溶液で洗浄
することで未反応のグリコサミノグリカンを除去する。
この後、該疎水クロマトに吸着した脂質結合グリコサミ
ノグリカンを１０〜５０％メタノール水溶液で溶出する
方法で行うことができる。
【０１８２】上記脂質が結合したグリコサミノグリカン
の製造例は、特願平２−１９３８１６号明細書もまた参
照される。
【０１８３】本発明の肝細胞球状集塊化剤として用いら
れる脂質結合グリコサミノグリカンの内、式（IV）で表
わされる燐脂質結合グリコサミノグリカンが好適に用い
られる。内でもホスファチジルエタノールアミンと還元
末端が開裂されたコンドロイチン硫酸Ｃとが共有結合し
たものが最も好適に用いられる。
【０１８４】上記肝細胞球状集塊化剤を用いて肝実質細
胞を培養するには、脂質結合グリコサミノグリカンを培
養基質として、肝実質細胞を公知の方法で培養すること
により、球状集塊化肝細胞が得られる。すなわち、具体
的には培養容器の細胞との接触面に上記球状集塊化剤を
塗布して培養する方法が採用できる。
【０１８５】培養容器としては、好ましくは前記公知の
陽性荷電プラスチックディシュ、例えばポリスチレン製
ディシュであるプライマリア３８０１または３８０２
（商標名、ベクトン・デッキンソン社）が用いられる
（特開平１−２９６９８２号公報参照）。該容器の表面
に脂質が結合したグリコサミノグリカンの溶液（１０μ
g/ml 〜１０mg/ml 程度）を培養基質として塗布し、コ
ートした後、単離肝細胞を播種し（１×１０4 〜１×１
０6 細胞/ml 程度）、インシュリン、ＥＧＦ等を含むホ
ルモン添加無血清培地（ウイリアムス＃Ｅ培地等）中で
約３７℃で培養する。培地は適宜新しい培地と交換して
６時間〜数日間培養する。肝細胞は初め単層を形成する
が、次第に多層島状の半集塊を形成し、更に集塊が進む
と球状に凝集して集塊化し、培養皿から離れて培養液中
に浮遊するようになる。このようにして形成した球状集
塊の直径は５０〜１５０μm 、好ましくは７０〜１２０
μm であり、また細胞数は５０〜３００個、好ましくは
７０〜２５０個により形成される。球状集塊化肝細胞
は、例えば培養液を５０×Ｇ、１分間の遠心分離を行う
ことによって回収することができる。
【０１８６】脂質結合グリコサミノグリカンの存在下で
は、肝細胞の培養基質との接着が阻害され、集塊化する
ものと考えられ、集塊化の活性は、脂質結合グリコサミ
ノグリカンが、新生ハムスター腎細胞（ＢＨＫ細胞）等
のフィブロネクチン基質への接着を阻害する接着阻害率
と相関がある。
【０１８７】上記接着阻害活性の大きい脂質結合グリコ
サミノグリカンほど低濃度で集塊を形成する。好ましく
は細胞接着阻害活性が後記実施例に記載の方法で測定さ
れる５０％阻害に必要な濃度（ＩＣ50）として４００μ
g/ml以下であるものが用いられる。一方グリコサミノグ
リカン自体を用いても集塊化せず、また陽性荷電プラス
チックの培養容器などのみ又は従来のプロテオグリカン
と比べて、脂質結合グリコサミノグリカンを培養基質と
することによって、はるかに短時間で集塊効果を示した
ことは全く意外であり、肝細胞の実用的培養が可能とな
った。
【０１８８】かくして得られる肝細胞の集塊化物は、ア
ルブミンの産生分泌能が高く、肝特異的分化機能を維持
していることが確認された。また集塊化物はＨ3 −チミ
ジンの取り込みがほとんどないことから細胞増殖は抑制
されており、ガンのような増殖と区別された。
【０１８９】
【発明の効果】本発明により、肝特異的機能を維持し、
長時間安定に集塊化し、浮遊した球状集塊化肝細胞を効
率的に得ることができる。脂質が共有結合したグリコサ
ミノグリカンは、プロテオグリカンと異なり、人工的に
容易に製造できる細胞外マトリックスであるので、人工
肝機能補助装置の開発の助けになるものである。
【０１９０】
【実施例】以下に本発明の実施例を示す。
【０１９１】参考例 還元末端ラクトン化法による燐脂質結合グリコサミノグ
リカンの製造
【０１９２】（１）還元末端酸化グリコサミノグリカン
の製造 １）還元末端酸化ヒアルロン酸の製造 ５００mgのヒアルロン酸（鶏冠由来、ＭＷ１万：ＨＡ
１）を水１０mlに溶解し、０．１M ヨウ素のメタノール
溶液５mlを加えて室温で６時間反応させた。その後、反
応液に０．１N 水酸化カリウムを約５ml加えて遊離のヨ
ウ素の色を消失させた。この溶液に酢酸カリウム飽和エ
タノールを加えて生じた沈澱をろ取し、充分にエタノー
ルで洗浄し、減圧乾燥した。
【０１９３】これによりロット番号４００の還元末端酸
化ヒアルロン酸（カリウム塩）４２３mgを得た。
【０１９４】ソモジーネルソン法による還元糖の有無：
無
【０１９５】２）還元末端ラクトンヒアルロン酸の製造 ４００mgのロット番号４００の還元末端酸化ヒアルロン
酸を水１０mlに溶解し、強酸性イオン交換樹脂（Dowex
５０（Ｈ+)）５０mlに１時間を要して通過させ、還元末
端ラクトンヒアルロン酸３９０mgを含む水溶液を得た。
【０１９６】ソモジーネルソン法による還元糖の有無：
無
【０１９７】上記の水溶液をトリ−ｎ−ブチルアミンで
中和し、凍結乾燥して還元末端ラクトンヒアルロン酸の
トリ−ｎ−ブチルアミン塩（ロット番号５００）４００
mgを得た。
【０１９８】３）他の還元末端ラクトングリコサミノグ
リカンの製造方法 コンドロイチン（ＭＷ１．５万：ＣＨ）、コンドロイチ
ン硫酸Ｃ（ＭＷ１万：ＣＳ（Ｓ１）、ＭＷ３万：ＣＳ
（Ｓ３）及びＭＷ６万：ＣＳ（Ｓ６））、デルマタン硫
酸（ＭＷ１．５万：ＤＳ）、ヘパリン（ＭＷ１．５万：
Ｈｅｐ）、及びヘパラン硫酸（ＭＷ１．５万：ＨＳ）
【０１９９】を原料として、上記１）に準じて表１の条
件で還元末端酸化グリコサミノグリカンを製造した。ひ
きつづき、上記２）に準じて表２の条件で還元末端ラク
トングリコサミノグリカンを製造した。
【０２００】
【表１】
【０２０１】
【表２】
【０２０２】（２）Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノ
ールアミン・ジパルミトイル（ＰＰＥＡＤＰ）結合グリ
コサミノグリカンの製造 １）Ｌ−（α−ホスファチジル）エタノールアミン・ジ
パルミトイル結合ヒアルロン酸の製造
【０２０３】
【化２２】
【０２０４】４００mgのロット番号５００の還元末端ラ
クトンヒアルロン酸を２００mlのジメチルホルムアミド
に溶解し、２７．６mgのＰＰＥＡＤＰのクロロホルム溶
液を加えて、７０℃で２時間反応させ、クロロホルムを
溜去し、過剰の酢酸ナトリウム水溶液を加えてナトリウ
ム塩にしてから、酢酸ナトリウム飽和エタノールを加え
た。生じた沈澱をろ取し、０．３M 酢酸アンモニウム溶
液に溶解し、疎水クロマトカラム（ＴＳＫgel フェニル
トヨパール６５０M （東ソー（株）製）４００ml）に吸
着し、充分に０．３M 塩化アンモニウム水溶液で洗浄
し、３０％メタノール水溶液で溶出した。素通り及び洗
浄画分に未反応ヒアルロン酸が溶出され、３０％メタノ
ール水溶液による溶出画分に目的とする本品が溶出し
た。３０％メタノール水溶液溶出画分を減圧下濃縮し、
透析で脱塩後、凍結乾燥して精製し、ロット番号６００
の目的物３６mgを得た。
【０２０５】 リン含量：０．３０％ ＰＰＥＡＤＰ含量：６．４４％ ヒアルロン酸含量：８２．３７％
【０２０６】２）その他のＬ−（α−ホスファチジル）
エタノールアミン・ジパルミトイル結合グリコサミノグ
リカンの製造 表２に示した還元末端ラクトングリコサミノグリカンと
ＰＰＥＡＤＰとを表３に示した条件で、上記（１）−
２）の方法に準じて反応させ、表３のＰＰＥＡＤＰ結合
グリコサミノグリカンを製造した。得られた生成物の分
析値を表４に示した。
【０２０７】
【表３】
【０２０８】
【表４】
【０２０９】実施例１ １）培養容器（ディシュ）への燐脂質結合グリコサミノ
グリカンの塗布（コート） 各種濃度（１〜１００μg/ml）の下記表５の燐脂質結合
グリコサミノグリカンをハンクス（Hanks'）溶液（Pro
c. Soc. Exp. Biol. Med., 71, 196(1949) ）に溶解
後、２mlづつポリスチレン製ディシュ（Primaria３８０
２、ベクトン・ディッキンソン社販売、６０mm）に加
え、４℃で１晩かけてコートした。
【０２１０】コート後、ディシュをハンクス溶液で２回
洗浄した。ホルモン添加無血清培地（ＨＤＭ）に単離肝
細胞を３×１０5 細胞／mlの濃度で懸濁し、４mlずつ播
種した。以下、常法にしたがって培養を行い、１日目、
２日目に顕微鏡観察、写真撮影を行った。
【０２１１】２）成熟ラット単離肝細胞の採取法及び培
養法 成熟ラット肝細胞初代培養は、Seglenらの方法（Method
s in Cell Biology, Vol. XIII, pp.29 〜83(1976), Ac
ademic Press）に従い肝実質細胞を得た。７週齢、Spra
gue-Dawleyラット( 体重１５０〜２００g)の腹腔中にネ
ンブタール（商標名、アボット・ラボラトリーズ社）１
０mg（５０mg/ml を２００μl)を注射し、麻酔をかけ
た。麻酔が効いたら、開腹し門脈にカテーテルをつない
だチューブを通し、前灌流液を３０ml/minの流速で流
し、下大静脈を縛った後、上大静脈から同様にチューブ
を通し灌流液を循環し、２〜３分間前灌流を行った。灌
流が充分に行われてから、灌流液を３７℃に保温した
０．０５％コラゲナーゼ灌流液に交換し、７〜１０分間
コラゲナーゼ灌流を行った。灌流終了後、肝臓を摘出
し、氷上で冷却しながら、冷細胞洗浄液（ハンクス溶
液）中にて、ナイフでほぐすように細切し、細胞を回収
した。
【０２１２】細胞懸濁液を５０×Ｇで１分間遠心し、上
清を注意深く吸引した後、底に固まっている細胞をウイ
リアムス（Williams）＃Ｅ培地で同様に２回、５０×Ｇ
で１分間ずつ遠心を行った。この遠心操作で肝実質細胞
を非実質細胞（類洞内皮細胞、クッパー（Kupffer)細
胞、脂肪摂取細胞（伊東細胞））から分離することがで
きた。
【０２１３】分離した肝実質細胞は細胞数、生存率
（０．６％トリパンブルーを用いた色素排除試験によ
る）を算定後、小出らの変法（Cell Struct. Funct., 1
3, 179〜188(1988) ）にもとづくEnatのＨＤＭ培地（１
０μg インシュリン、０．１μM ＣｕＳＯ4 ・５Ｈ2
Ｏ、３nM Ｈ2 ＳｅＯ3 、５０pM ＺｎＳＯ4 ・７Ｈ2
Ｏ、５０ng/ml ＥＧＦ（上皮細胞増殖因子、宝酒造
（株））；５０μg/mlリノール酸、１００U/mlペニシリ
ンＧ、１００U/mlストレプトマイシン及び１μg/ml殺菌
剤を含むウイリアムス＃Ｅ培地）に３×１０5 cells/ml
の濃度になるように希釈し、ＰＰＥＡＤＰ結合グリコサ
ミノグリカンをコートした６０mmポリスチレン製ディシ
ュ（Primaria３８０２，６０mm）に４mlずつ播種し、５
％ＣＯ2 、９５％空気、３７℃、１００％湿度下で培養
した。培地は６時間目、１日目、３日目にそれぞれ半量
ずつ新しい培地と交換した。
【０２１４】（結果） １０μg/mlの濃度で、ＣＳ（Ｓ３）−ＰＰＥＡＤＰ（ロ
ット６０２−２）（以下、「ＣＳ−ＰＰＥＡＤＰ」と略
す）をコートしたディシュで集塊化の促進が顕著にみら
れた。１日目には１０μg/mlの濃度で多層島状の半集塊
状形態が観察された。２日目になると１０μg/mlでは、
ほとんど集塊化し培地中を浮遊していた。一方、集塊化
はＣＳ（Ｓ３）やＰＰＥＡＤＰのみをそれぞれコートし
た場合ではみられず、また、ＣＳ−ＰＰＥＡＤＰの濃度
を１００μg/mlに上げても効果の増加はみられなかっ
た。コントロールの陽性荷電プラスチックディシュ（未
処理）では集塊化に至るまでにさらに２〜３日かかり、
その場合でも完全に浮遊した球状集塊の割合は少なかっ
た。
【０２１５】各種ＰＰＥＡＤＰ結合グリコサミノグリカ
ンを用いて行った上記試験によって集塊化の度合を観察
した結果を表５に示す。
【０２１６】
【表５】
【０２１７】また、フィブロネクチンを予め塗布した培
養皿に表５の化合物を塗布した培養皿を使用し、新生ハ
ムスター腎細胞（ＢＨＫ２１細胞）の上記培養皿への接
着を表５の化合物が阻害する接着阻害効果を調べた。
【０２１８】各種ＰＰＥＡＤＰ結合グリコサミノグリカ
ンの接着阻害効果を表す濃度曲線は図２のとおりであ
り、ＣＳ−ＰＰＥＡＤＰ、ＤＳ−ＰＰＥＡＤＰ、ＨＳ−
ＰＰＥＡＤＰ、ＨＡ−ＰＰＥＡＤＰ、ＣＨ−ＰＰＥＡＤ
Ｐの順に阻害活性が高く、これより算出したＩＣ50を表
６に示す。
【０２１９】
【表６】
【０２２０】以上の結果から、本発明の各種球状集塊剤
による肝細胞の球状集塊化能とフィブロネクチン基質に
対する接着阻止能とは相関することが示唆された。
【０２２１】実施例２ ＣＳ−ＰＰＥＡＤＰ、陽性荷電プラスチック製培養容器
及びコラーゲンを培養基質として形成される球状集塊に
ついて肝特異的機能維持と、増殖に対する影響を検討し
た。
【０２２２】１）成熟ラット肝細胞初代培養 実施例１と同様に肝細胞を単離後、３×１０5 細胞／ml
の濃度に調整して細胞懸濁液を得た。
【０２２３】２）培養基質のコート １０μg/mlのＣＳ−ＰＰＥＡＤＰを含有するハンクス溶
液１mlを３５mmポリスチレン製陽性荷電プラスチックデ
ィシュ（Primaria３８０１；ベクトン・ディッキンソン
社販売）に、また、０．０３％のコラーゲン（セルマト
リックスＩＣ、（株）高研製）を含有する０．０２N 酢
酸１mlを３５mmポリスチレン製ディシュ（Falcon３００
１；ベクトン・ディッキンソン社販売）に、それぞれ４
℃で１夜かけてコートし、使用時にウイリアムス培地で
２回洗浄後、細胞を播種した。
【０２２４】３）増殖能の測定− 3Ｈ−チミジンを用い
た複製ＤＮＡ合成活性の測定 上記（１）で単離した肝細胞懸濁液を上記（２）で調製
したＣＳ−ＰＰＥＡＤＰ処理ディシュ、陽性荷電プラス
チックディシュ又はコラーゲン処理ディシュに１．５ml
ずつ播種し、実施例１と同様に培養した。培養した細胞
をラベル１日前に新しい培地と交換し、２４時間後に１
μＣｉの3Ｈ−チミジンを加え、３７℃で２４時間培養
を続けた。 3Ｈ−チミジン添加２４時間後、培地を除去
し、氷冷燐酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞を洗浄
後、１mlの冷１０％トリクロル酢酸（ＴＣＡ）を加え、
細胞を固定した。１時間冷蔵庫に放置後、ＴＣＡを吸引
除去し、１mlの１N ＮａＯＨを加え、３７℃で１時間イ
ンキュベートして肝細胞を完全に溶解した。細胞溶解液
のうち１００μl をとりＤＮＡ定量用に残し、残りを小
試験管に移し、これに０．３mlの１００％ＴＣＡを加
え、１０分間氷冷後、１０，０００rpm で２０分間遠心
した。上清を除去後、沈澱に０．５mlの１０％ＴＣＡを
加え、沸騰水浴上で１５分間煮沸した。冷却後、１０，
０００rpm で２０分間遠心し、上清０．３mlをシンチレ
ーションバイアルに取り、３mlのシンチレーターを加
え、混合後、トリチウム（ 3Ｈ）の放射能を液体シンチ
レーションカウンターで測定した。
【０２２５】４）肝特異的機能の指標としてのアルブミ
ン分泌量の測定 アルブミン分泌量の測定は、酵素免疫法（ＥＩＡ法）に
より、ポリスチレンビーズを用いたサンドイッチ法で測
定した。
【０２２６】抗ラットアルブミン抗体ＩｇＧ分画（Capp
el社製）を、０．１M トリス塩酸緩衝液／０．１５M Ｎ
ａＣｌ溶液で１０μg/mlに希釈した。これにポリスチレ
ンビーズ（１／４”φ、PIERCE）を４個／mlになるよう
に加え、室温下でゆっくり撹拌しながら脱気操作を２時
間行った。脱気後、４℃で１夜放置した。ビーズをＰＢ
Ｓで３回洗浄後、５０mMリン酸緩衝液（pH７．４）／
０．１５M ＮａＣｌ／０．１％ゼラチン／０．０２％ア
ジ化ナトリウム溶液に移し、この抗ラットアルブミン抗
体結合ビーズは４℃で保存した（２〜３ヶ月保存可）。
【０２２７】試料（２４時間、一定条件下で肝細胞を培
養した培養上清１．５mlのうち５μl を３点取って、上
記リン酸緩衝液で希釈して用いた）あるいは標準ラット
アルブミン溶液１００μl に、５００μl の上記リン酸
緩衝液を加え、それに抗ラットアルブミン抗体結合ビー
ズを１個加え、室温で４時間撹拌しながらインキュベー
トした。次にビーズを５分間、３回、ＰＢＳ／０．０５
％ツイーン２０溶液で洗浄後、０．１％ゼラチンを含む
ＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０溶液で１×１０4 倍に
希釈した抗ラットアルブミン抗体ＩｇＧ−パーオキシダ
ーゼ標識体（Cappel社製）５００μl を加え、４℃でゆ
っくり撹拌しながら１夜インキュベートした。ビーズを
５分間、３回、ＰＢＳ／０．０５％ツイーン２０溶液で
洗浄後、５分間、１回、ＰＢＳで洗浄し、１mlの発色試
薬（５０mgのｏ−フェニレンジアミンと１０μl の３０
％Ｈ2 Ｏ2 を１００mlの０．１M トリス塩酸緩衝液（pH
７．４）に溶解）を加え、室温下３０分間ゆっくり撹拌
しながら、インキュベートした。３０分後、１．３N 硫
酸を１ml加え、反応を停止させた。発色を波長４９２nm
の吸光度によって測定した。
【０２２８】５）ＤＮＡ定量 ８０μl の各試料（１N ＮａＯＨ溶液）を酢酸で中和
後、エタノールで沈澱させ、この沈澱を１００μl の１
N ＮＨ4 ＯＨ溶液に溶解後、減圧下乾燥した。乾燥試料
に１００μl のＤＡＢＡ試薬（０．４g ジアミノ安息香
酸（ＤＡＢＡ）・２ＨＣｌ／１ml蒸留水、暗褐色に着色
しているときは１０〜２０mgのノーリットＡ（商標名、
ナカライ・テスク社；活性炭）で脱色後使用）を加え、
よく撹拌後、パラフィルムで密封し、６０℃の温浴中で
３０分間加熱した。冷却後、２mlの０．６N ＨＣｌＯ4
を加え、よく撹拌後、１０，０００rpm で５分間遠心
し、蛍光光度計を用い励起波長４１５nm、測定波長５１
５nmで上清の吸光度を測定した。
【０２２９】（結果） ＣＳ−ＰＰＥＡＤＰをコートしたディシュでは、培養後
１日目で細胞の凝集が始まり、２日目には大部分が浮遊
した球状集塊を形成した。１日目の凝集は細胞が単にく
っつき合ったような形態で表面に凹凸があったが、２日
目以降には集塊内の組織化が進み、平滑な表面になっ
た。陽性荷電プラスチックディシュでは、集塊形成はＣ
Ｓ−ＰＰＥＡＤＰ処理ディシュの場合よりも半日から１
日遅い程度であった。それでも、多層島状の半集塊から
徐々に浮遊しはじめ、ディシュの大半から浮遊するには
さらに１日近く遅れた。コラーゲンをコートしたディシ
ュでは、培養後６時間ごろから接着し伸展し始め、１日
目にはきれいな単層を形成した。培養を続けて行くと細
胞は増え続け、細胞密度が増加したが、４日目を過ぎる
と細胞層が収縮を初め、５日目にはディシュの辺縁部か
らきれいにはがれてしまい、小さな浮遊した膜のような
ものを形成した。
【０２３０】このときの 3Ｈ−チミジンの取り込みを表
７に示す。
【０２３１】
【表７】
【０２３２】ＣＳ−ＰＰＥＡＤＰ処理ディシュ、陽性荷
電プラスチックディシュ（未処理）、コラーゲン処理デ
ィシュの順に増殖が抑えられているのが判る。コラーゲ
ン処理ディシュの５日目では 3Ｈ−チミジンの取り込み
が大きく減少しているのは、単層の細胞層が収縮し、三
次元的構造を取り、細胞密度が高くなったためであろ
う。
【０２３３】肝特異的機能の指標としてのアルブミン分
泌量の測定は、設定した条件下で、２０〜１，０００ng
/ml の濃度のラットアルブミン量が定量的に測定可能で
あった。この測定法を用いて、各培養条件下のＤＮＡ当
り２４時間に分泌されるアルブミン量を測定した結果を
図３に示す。ＣＳ−ＰＰＥＡＤＰを基質として用いた場
合、培養早期に球状集塊を形成し、未処理の陽性荷電プ
ラスチックディシュを基質として用いた場合よりも有意
に肝機能維持の亢進の傾向がみられた。表７の3Ｈ−チ
ミジンの取り込み、細胞形態の観察の結果を考え合わせ
ると、早期の球状集塊形成が主な原因であると思われ
る。またコラーゲンを基質として用いた場合は、培養早
期に機能維持の低下が進んだ。
【０２３４】以上のように、本発明の球状集塊化剤を用
いた場合、球状集塊形成によって、良好な肝特異的機能
維持が可能であることが示唆された。
【図面の簡単な説明】
【図１】肝実質細胞の集合の３形態を示す。
【図２】フィブロネクチンおよび各種燐脂質結合グリコ
サミノグリカンをコートした培養皿へのＢＨＫ−２１細
胞の接着率を示すグラフ。
【図３】ＣＳ−ＰＰＥＡＤＰ等をコートして得た肝細胞
球状集塊化物のアルブミン産生分泌能を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−277486（ＪＰ，Ａ) ＢＩＯＣＨＥＭＩＣＡＬ ＡＮＤ Ｂ ＩＯＰＨＹＳＩＣＡＬ ＲＥＳＥＡＲＣ Ｈ ＣＯＭＭＵＮＩＣＡＴＩＯＮＳ，Ｖ ｏｌ．161，Ｎｏ．１，（1989），ｐ. 385−391 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28 C08B 37/08 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)

Claims (10)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 脂質が共有結合したグリコサミノグリカ
    ンを含有する肝細胞球状集塊化剤であって、該グリコサ
    ミノグリカンが、コンドロイチン硫酸またはデルマタン
    硫酸である、肝細胞球状集塊化剤。
  2. 【請求項２】 該脂質がリン脂質である、請求項１記載
    の肝細胞球状集塊化剤。
  3. 【請求項３】 該脂質がホスファチジルエタノールアミ
    ンである、請求項２記載の肝細胞球状集塊化剤。
  4. 【請求項４】 該グリコサミノグリカンが、還元末端が
    開裂されたグリコサミノグリカンである、請求項１〜３
    いずれか１項記載の肝細胞球状集塊化剤。
  5. 【請求項５】 脂質が共有結合したグリコサミノグリカ
    ンが、還元末端が開裂されたグリコサミノグリカンのカ
    ルボキシル基（ラクトンを含む）、ホルミル基もしくは
    １級アミノ基、または導入されたスペーサーの前記基で
    脂質と結合している、請求項４記載の肝細胞球状集塊化
    剤。
  6. 【請求項６】 脂質が共有結合したグリコサミノグリカ
    ンが、脂質の１級アミノ基、カルボキシル基もしくはホ
    ルミル基、または導入されたスペーサーの前記基で還元
    末端が開裂されたグリコサミノグリカンと結合してい
    る、請求項４記載の肝細胞球状集塊化剤。
  7. 【請求項７】 脂質が共有結合したグリコサミノグリカ
    ンの細胞接着阻害活性が、細胞接着を５０％阻害する濃
    度（ＩＣ50）として４００μg/ml以下である請求項１〜
    ６いずれか１項記載の肝細胞球状集塊化剤。
  8. 【請求項８】 細胞接着を５０％阻害する濃度（Ｉ
    Ｃ50）が１．４９μg/ml以下であることを特徴とする、
    請求項７記載の肝細胞球状集塊化剤。
  9. 【請求項９】 脂質が共有結合したグリコサミノグリカ
    ンが、グリコサミノグリカンを酸化することによって還
    元末端を開裂させ、次いで該開裂還元末端部分にラクト
    ンを形成させた後、脂質の１級アミノ基と反応させるこ
    とによって得ることができる、請求項１〜８いずれか１
    項記載の肝細胞球状集塊化剤。
  10. 【請求項１０】 脂質が共有結合したコンドロイチン硫
    酸又はデルマタン硫酸を培養基質として肝実質細胞を培
    養することを特徴とする、球状集塊化肝細胞の製造法。
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