JP3187832B2

JP3187832B2 - 抗原発現キメラタンパク質

Info

Publication number: JP3187832B2
Application number: JP50357692A
Authority: JP
Inventors: マスティコ，ロバート・アラン; ストックレイ，ピーター・ジョージ; タルボット，サイモン・ジョン
Original assignee: BTG International Ltd
Current assignee: BTG International Ltd
Priority date: 1991-01-24
Filing date: 1992-01-22
Publication date: 2001-07-16
Anticipated expiration: 2016-07-16
Also published as: AU1173792A; DE69231837D1; WO1992013081A1; GB9201372D0; EP0572433A1; KR100197819B1; FI110615B; NZ241373A; NO932644L; FI933328A0; FI933328A; CA2101070A1; IE920200A1; GB2253626B; DE69231837T2; JPH06504907A; NO313917B1; NO932644D0; KR930703449A; EP0572433B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、抗原提示キメラ蛋白質（antigen−present
ing chimaeric protein）に関し、特に、異質のエピト
ープを含有するウイルス蛋白質、そのような蛋白質の製
造方法、およびそれらのワクチンとしての使用に関す
る。

近年における組換えDNA技術の成長は、イムノゲン蛋
白質が同定され、クローン化され、適当な微生物ホスト
に発現されたワクチンを導入して、動物およびヒトにお
いて、有効な保護免疫を可能とする十分な量の蛋白質を
得ることを可能とした。このような技術の拡張として、
エピトープの免疫化性質を保持しつつ、適当なホストに
発現することが可能なキャリヤ蛋白質中にイムノゲンエ
ピトープのみを組み込むことが提案されている。かくし
て、Beesley et al.は、Biotechnology,8,1990,644−64
9において、足および口の病気のウイルス（foot and mo
uth disease virus）またはヒト胎盤性性腺刺激ホルモ
ンのエピトープがキャリヤとしてのＢ型肝炎コア蛋白質
のＮ−末端に融合されているキメラ蛋白質の製造を記載
している。キメラ蛋白質の発現は、E.coli中での発現が
全く十分でないことが判明していたので、酵母中で行わ
れた。

Pushko et al.により、Abstracts of VIIIth Interna
tional Congress of Virology,Berlin,August 26−31 1
990,p38−006において、RNA−ファージfrコート蛋白質
カプシド（RNA−pharge fr coat protein capsid）の一
定の未同定領域がカプシド形成能を失うことなく異質の
アミノ酸配列を受け取ることができることが示唆されて
いる。しかし、これらの研究者は、一定の未同定キメラ
構造を得るために、このようなアミノ酸配列をコート蛋
白質全体にランダムに挿入すること以上のことは何も示
していない。

異質のイムノゲンエピトープを有効かつ再生産可能に
発現することのできるキメラ蛋白質を製造するためのワ
クチン技術の発展の必要性があることは明らかであり、
これらの蛋白質は、十分に理解され、かつ、制御可能な
微生物ホスト、例えば、E.coli中での発現を含む組換え
技術によってなすことができる。天然のウイルス性のエ
ピトープは、当然のことながら、ウイルス殻または膜の
規則的な表面格子上に提示される。抗原提示のこの天然
形を模倣するシステムは、理論的には、特に、免疫応答
を引き出すのに有効であることを証明するはずである。
しかし、このような結果を達成するためには、クローン
化でき、そして発現する場合に、ウイルスの遺伝物質と
は独立に、カプシドを形成することができる微生物ウイ
ルスコート蛋白質を同定することが必要である。さら
に、カプシド形成に必須ではなく、異質のエピトープを
受け取るように、蛋白質の残りの部分とは独立に操作す
ることのできるコート蛋白質の特定の領域を同定するこ
とが必要である。

ウイルス蛋白質キャリヤの同定された類へのエピトー
プの挿入は、特に、微生物ホスト中のキメラ蛋白質の発
現後、異質のエピトープが蛋白質カプシドアセンブリの
表面に確実に提示されるように導くことができることが
判明した。

このような結果を達成することができることは決して
予測することができなかった。すべてのウイルスが自己
アセンブル（self assemble）するコート蛋白質を有す
るのではなく；さらに、このような自己アセンブリを予
測することは不可能である。さらにまた、動物ウイルス
と違って、微生物ウイルスは、免疫支配領域を有するこ
とを当然のこととして期待できず、したがって、微生物
ウイルスコート蛋白質の（もしあるとしたら）、どのよ
うな領域が免疫応答の誘導の理にかなった期待において
修飾されるか手引きとするものがない。

本発明に従えば、カプシドアセンブリの一部を形成す
ることができ、ファージMS−２のコート蛋白質のアミノ
酸配列、または、その保存修飾された変種、あるいは、
カプシド形成能を十分に保持するための十分な前記配列
または変種を含む、ファージ粒子全体のＸ線結晶解析に
よって決定されるようなＮ−末端β−ヘアピンに対応す
る蛋白質領域において異質のエピトープを挿入すること
によりそのアミノ酸配列が修飾されたキメラ蛋白質が提
供される。

驚くべきことに、このようなキメラ蛋白質は、適当な
微生物ホスト中に発現され、ファージRNAがなく、その
他の核酸夾雑物をほとんど含まないカプシドを生成す
る。

キメラコート蛋白質は、好ましくは、ファージMS−２
から誘導されるものであるが、E.coli中で複製すること
のできる関連RNAファージは、例えば、ファージR17、f
r、GA、ＱβおよびSPから誘導することもできる。物理
的構造がMS−２のそれに類似したこのようなRNA−ファ
ージは、コート蛋白質のアミノ酸残基において幾分かの
化学的変種を含み、したがって、MS−２コート蛋白質の
保存修飾変種である。現在では、実質的にコート蛋白質
全体がカプシドアセンブリに必要とされると考えられて
いるが、比較的小さな性質の欠失および／または挿入
は、カプシド形成能を保持したまま可能である。このよ
うな修飾配列を有する蛋白質は、本発明の範疇に含まれ
る。

上述したように、異質のエピトープは、アセンブリさ
れたカプシドにおいて、Ｎ−末端β−ヘアピンに対応す
る蛋白質の領域で挿入される。MS−２ファージ粒子の三
次元構造は、Valegard et al.によりNature,1990,345,3
6−41において発表されている。発表されたデータは、
第１に、コート蛋白質の構造は、その構造が現時点では
公知であるすべてがその他の球形RNAウイルスサプユニ
ットにおいて見いだされている８−ストランドβ−バレ
ルモチーフに関連していないことを示す。第２に、コー
ト蛋白質は、疑似当量のサプユニット間接触を示すが、
各蛋白質コンフォマーを固定するのを補助するその他の
仕組み、例えば、ポリペプチドの伸長したアームはな
い。コート蛋白質の構造は、３つの別個の領域に関して
は認められる。これらは、通常の意味のドメインではな
いが、独立の折り畳み単位を表すことができる。これら
の領域は、残基１〜20であり、これは、最も末端の放射
状特性を形成するファージの表面から突出するβ−ヘア
ピン構造を形成する。この領域には、疑似当量コンフォ
マー間の主要なコンフォメーションの変化のみの部位で
ある“FG−ループ（FG−loop）”を含む５つのβ−スト
ランドを形成する残基21〜94が続く。ついで、これらの
β−ストランドは、２つのα−ヘリックス、残基95〜12
5に続き、これらは、組み合わさり、コート蛋白質サプ
ユニットのダイマーを固定する。Valegard et al.は、M
S−２ウイルスの物理的構造にのみ関し、ウイルスの活
動様式を解明しようと試みていない。

上記説明したように、本発明は、異質のエピトープを
***したヘアピンに対応する領域に導入することによ
り、コート蛋白質アミノ酸配列の修飾を含む。したがっ
て、本発明のキメラ蛋白質は、アミノ酸残基１〜20の領
域で修飾される。このようなナンバーリングは、Fiers
によりNature,1976,260,500〜507において発表されたMS
−２の全コート蛋白質配列を引用したものである。好ま
しくは、異質のエピトープを挿入するための修飾は、ヘ
アピン領域の方向に向かうか、あるいは、その中間にお
いてなされる。コート蛋白質のグリシン14およびスレオ
ニン15残基の領域に異質のエピトープを導入することが
特に好ましい。特別な理論と結び付けようとするのでは
ないが、挿入されたエピトープに直ちにフランクする１
以上のグリシン残基の存在は、その後続の発現におい
て、エピトープにコンフォメーションの柔軟性を導入す
るのに有効である。

異質の挿入されたエピトープは、キメラ蛋白質におい
て所望されるイムニゲン性質に依存し、広範に変化す
る。したがって、本発明の１つの形態に従えば、ヒト病
原体インフルエンザウイルスの赤血球凝集素（あるい
は、エピトープを含む赤血球凝集素部分）から誘導され
る９−merペプチド配列は、MS−２コート蛋白質に加工
される。これとは別に、IgE介在アレルギー反応に対す
るワクチン化に有用なIgEの重鎖からのデカペプチド、
あるいは、それに関連したデカペプチドを導入してもよ
い。このようなデカペプチドは、国際特許出願公開公報
No.WO90/15878に記載され、特許請求されている。２〜
３のアミノ酸残基のみを有する比較的短い配列を挿入す
ることもでき、また、長いエピトープ、例えば、30以上
の残基を挿入することもでき、例えばヒトHIV １ウイ
ルスからのgp120の同定された８−mer免疫支配配列を含
む約24の残基のエピトープを挿入することができるとも
考えられる。エピトープの最大長さおよびエピトープの
性質は、カプシドアセンブリを形成するその能力を保持
する生成キメラ蛋白質に依存するであろうと理解され
る。エピトープの多重コピーまたは混合物、特に短いエ
ピトープのそれらは、カプシド形成能が保持される限り
導入してもよく、本発明は、コート蛋白質のＮ−末端β
−ヘアピン領域に異質のエピトープまたは複数の異質の
エピトープの多重コピーの導入を含むことを意図したも
のである。ヒトおよび獣医学の薬における重要なその他
の病原体からのエピトープおよび獣医学も挿入用に考え
られ、例えば、FMDV VPI蛋白質またはHIVp24から誘導
される。挿入されたエピトープは、挿入のエピトープ機
能に必須ではないさらなるアミノ酸によって、一端また
は両端で結合されると理解されるであろう。さらに、
‘エピトープ（epitope）’という用語は、ポスト翻訳
修飾（post translational modification）後のそれら
のエピトープ機能を示すことができる前駆体挿入を含む
ことを意図したものである。

本発明は、また、本発明のキメラ蛋白質のカプシドア
センブリに拡張することもできる。このようなカプシド
は、生存ウイルスのRNAがなくとも“ファージエンプテ
イ（phage empties）として、E.coli中に発現できるこ
とが判明している。混合カプシドアセンブリの産生は、
例えば、インビボ（in vivo）でアセンブルされた均一
な試料のプライアデイスアセンブリ（prior disassembl
y）、及び続く混合物のリアセンブリによると考えられ
る。このようなカプシドアセンブリは、例えば、混合免
疫応答を生起することができ、したがって、ポピュレー
ションでウイルスエピトープの天然スペクトルに対して
免疫処置するためのワクチンとしての用途を見いだすこ
とができることを意図したものである。したがって、本
発明は、上記定義されたような１種以上のキメラ蛋白質
を含むワクチンに拡張することもできる。

本発明のキメラ蛋白質は、MS−２のコート蛋白質に対
応するcDNA配列またはこのようなコート蛋白質の保存修
飾変種、あるいは、カプシド形成能を保持するための十
分な前記蛋白質または変種に対応するcDNA配列の部位配
向変異誘発に適当な配列決定用ベクターへの導入、***
ヘアピンに対するcDNAコーデイングの領域における独特
な制限酵素認識部位の創出、従来の遺伝子工学技術によ
る制限部位での異質なエピトープを包含するオリゴヌク
レオチドの導入およびこのようにして修飾された遺伝子
の適当な発現ベクターへのサブクローン化、続く、適当
なホストにおける異質な遺伝子を保持する修飾されたベ
クターからの発現の誘導によって製造することができ
る。MS−２に対する適当なホストは、E.coliであり、こ
れは、発酵が比較的に容易であり、実施するのが安価で
あり、システムが十分に理解されているという長所を有
する。これとは別に、発現は、挿入された配列のポスト
翻訳処理が可能な異種なホスト、例えば酵母中で実施す
ることもできる。

好ましくは、制限酵素認識部位は、MS−２のコート蛋
白質のアミノ酸配列を参考にしてグリシン14およびスレ
オニン15に対応するcDNAコドンで創出される。好適に
は、Kpn1認識部位が創出される。このような部位は、Kp
n1による消化およびそれに続く外来なオリゴヌクレオチ
ドの存在中での結紮がエピトープのインフレーム（in−
frame）挿入を生じ、グリシンおよびスレオニン残基に
より両端でフランクされ、これが、エピトープのコンホ
メーション柔軟性を増大させ、インビボ（in vivo）中
で提示される場合には、これは、免疫認識において補助
するはずである。

配列ベクターは、部位配向突然変異誘導について公知
のものであればいずれでもよく、例えば、M13 mp 18
が挙げられる。cDNAは、標準逆転写技術（standard rev
erse transcription techniques）によってMS−２のRNA
から得られる。MS−２の出発RNAは、増殖中の生体か、
あるいは、市販の試料（Boehringer Manheim,Germanyか
ら入手可能）から得ることができる。E.coli中での発現
に使用される発現ベクトルは、好適には、必要なプロモ
ーター／インデューサー、例えば、IPTGによって誘導さ
れるタックプロモータ（tac promoter）と合わされたpG
W11である。

E.coli中での発現に続き、過剰に発現された細胞蛋白
質は、MS−２誘導コート蛋白質を得るために精製処理に
付される。適当な精製プロトコールは、可溶性の細胞蛋
白質を放出するための音波粉砕、遠心分離、生成した上
澄み液のDNアーゼＩ（DNase）による処理、硫酸アンモ
ニウム沈殿、アセンブルされたカプシドを得るための透
析およびサイズ分別、およびイムノアフィニテイクロマ
トグラフィのような技術を含む。精製プロトコールは、
導入された異質のエピトープの化学的な性質および物理
的な性質に基づき修飾を必要としうる。生成したカプシ
ドは、ゲル濾過および／またはシュークロース密度勾配
技術、配列によって確認された挿入物の同定により特徴
付け得る。電子鏡検法および蛋白質配列決定によって示
されるようにエンプテイカプシドとしての本質的に均一
なコート蛋白質を得ることが可能であることが見いださ
れ、これらのカプシドは、また、結晶化されている。

異質のエピトープが導入されたカプシドは、ウエスタ
ーンブロット技術（Western blot techniques）によ
り、異質のエピトープに対するモノクロナール抗体およ
びワイルドタイプのコート蛋白質に対する抗体を含有す
るポリクロナール血清の両者と反応することが示され
た。他方、ワイルドタイプのカプシドはポリクロナール
血清のみと反応する。

本発明のキメラ蛋白質およびアセンブルされたカプシ
ドは、当分野において有用ないずれかの方法において、
ワクチンとしての使用が考えられる。

したがって、例えば、カプシドは、アジュバントおよ
び／またはさらなる増強画分の存在または不在において
水性サスペンジョン中で用いられ、注射又は防護された
経口投与によって適用される。好適なアジュバントは、
ヒトおよび獣医学ワクチンにおいて従来使用されている
ものであり、例えば、不完全フロイントアジュバント、
水酸化アルミニウムゲルアジュバント“登録商標アルヒ
ドロゲル（Alhydrogel）”またはサポニンである。これ
とは別に、ワクチンは、徐放性のカプセルとして配合す
ることができる。さらなる物質、例えば、ムラミルジペ
プチドも免疫性認識を増強するために含ませることがで
きる。

免疫化投与の大きさおよび回数は、ヒトまたは獣医学
への適用の分野および防護が望まれる病原体にかなり依
存して変化することが理解されるであろうが、典型的な
ワクチンは、カプシド0.2〜5mgを用い、好適には、約0.
5mg用い、例えば、２〜４週間の間隔で１〜３投与量ワ
クチンを投与する。このような投与は、本発明を例示す
るためのもので、本発明を何ら限定するものではない。

例として上述したインフルエンザウイルスから誘導さ
れる９−merを取ると、典型的な患者は、水性サスペン
ジョンにおけるか、あるいは、水酸化アルミニウムサス
ペンジョンのようなアジュバントと混合した後、１回投
与か、例えば、２週間の間隔をおいた多数回投与とし
て、蛋白質0.2〜5mgの投与により免疫化されると考えら
れる。適当な接種ルート、例えば、皮下（s.c.）、筋肉
内、あるいは、皮膚内接種を実施することができる。こ
れとは別に、胃による消化に対して防護するための適当
に被覆された物質のタブレットを与えると腸粘膜の表面
で免疫された状態を刺激する。

抗原提示システムとしてMS−２および関連したファー
ジを用いる場合には、いくつかの長所があることが明ら
かである。したがって、空のコート蛋白質カプシドは、
E.coli中で比較的高収量で容易に発現し、この生成物
は、容易に精製され、アセンブルされたカプシドは、一
定の温度範囲、pHおよびイオン強度でかなりの安定性を
示す。何らかの理論と結びつけようとするつもりはない
が、本発明は、所定の位置でキャリヤカプシドの表面上
の規則的なアレイにエピトープを発現させ、これは、免
疫認識を最大とするであろうが、抗体分子の多座配位状
態の性質によると推定される。

MS−２システムは、球形バクテリオファージの表面上
に異質のペプチド配列を提示するためにかなり重要な用
途を有すると考えられる。このシステムは、糸状のバク
テリオファージの変種にわたって数多くの長所を有す
る。MS−２コート蛋白質は、アセンブリが核酸のエンカ
プシデーション（encapsidation）に付随する糸状のフ
ァージと違って、核酸の不在において、自己アセンブリ
を促進することができる。さらに、糸状のコート蛋白質
は、アセンブリが生起する前にポスト翻訳処理と膜挿入
とを受ける必要があり、他方、MS−２蛋白質は、未処理
である。MS−２システムは、また、異質のペプチド挿入
の効果をモデル化するコート蛋白質についての詳細な分
子モデルの長所を有する。MS−２キメラがエピトープの
所定のコンホメーションに対して特異な力価（titres）
を生成する見かけ上の能力は、これらが精製ワクチンの
製造用の安価でエレガントな方法を提供することを示唆
する。

以下の実施例は、本発明を例示するものである。

実施例１インフルエンザウイルスから誘導されるエ
ピトープの提示ａ） MS−２からのコート蛋白質cDNAを含む発現ベクタ
ーの調製 MS−２のコート蛋白質は、以下のようにして得た。フ
ァージMS−２を成長させ、RNAを精製し、続いて、オリ
ゴヌクレオチドプライマー配向逆転写により、シングル
ストランドのcDNAを生成させ、これを、オリゴプライマ
ーとクレノーポリメラーゼ（Klenow polymerase）とを
用いてダブルストランドcDNAに変換した。ついで、誘導
可能なタックプロモータのコントロール下にコート蛋白
質を入れてcDNAを、発現ベクター（pGW11）中にサブク
ローン化した。

ｂ）異質のエピトープを含む修飾された発現ベクター
の調製上記ａ）において得られたMS−２コート蛋白質のcDNA
は、発現ベクターpGW11から標準配列ベクトルM13mp18に
サブクローン化され、部位配向突然変異誘発用のシング
ルストランド基質を生成した。Kpn1制限部位は、MS−２
コート蛋白質のグリシン14とスレオニン15とに対応する
DNAコドンを修飾することにより導入した。ヒト病原体
インフルエンザウイルスの赤血球凝集素から誘導される
９−merペプチド配列に対するヌクレオチド配列は、Kpn
1による消化および続く結紮により導入した。このよう
にして修飾された遺伝子は、適当な発現ベクター（pGW1
1）にサブクローン化した。９−merアミノ酸配列YPYDVP
DYAにコード化されたオリゴヌクレオチドは、Wilson et
al.により（Molecular and Cell Biology,May 1988,21
59−2165およびCell,Vol.37,1984,767−778）に記載さ
れているように、抗原決定因子の一つを含むものとして
同定された。Kpn1部位を構成する上記オリゴヌクレオチ
ド部位配向突然変異誘発は、市販されている標準のキッ
トを用いて行った。さらに、標準技術（Maniatis et a
l.,“Molecular Cloning.A laboratory manual",2nd Ed
ition,（1989）,Cold Spring Harbor Press,CSH,New,Yo
rk）を用いて、DNA操作を行った。

生成したベクターを配列決定し、９−merに対するコ
ドンの挿入を示した。Kpn1部位の使用の結果、グリシン
およびスレオニンに対するさらに２つのコドンが前記挿
入の下流域で創出され、すなわち、全部で11のコドンが
挿入された。

ｃ） E.coliにおけるベクターの発現異質のエピトープコドンを導入したpGW11発現ベクタ
ーおよび導入しないpGW11発現ベクターをE.coli中に発
現し、細胞蛋白質を得、精製し、さらに、以下のように
特徴づけた。

E.coliの標準実験室ストレイン（strain）を組換えMS
−２コート蛋白質遺伝子を保持する発現プラスミドでア
ンピシリン耐性に変換した。リッチな媒体中のこれらの
形質転換株の迅速な成長培養は、培養のO.D.₆₀₀が0.4〜
0.6である場合、IPTGの最終濃度1mMへの添加により誘導
された。細胞成長を一晩続け、細胞を遠心分離により収
穫し、中性バッファに再懸濁し、細胞を音波破砕して崩
壊させ、続いて、遠心分離により発現された組換え生成
物を含む上澄み液と細胞の崩壊物とを分離した。上澄み
液を硫酸アンモニウム沈殿法により分別し、生成物のペ
レットをバッファに再懸濁させ、シュークロース密度勾
配法、または、ゲル濾過クロマトグラフィ法、あるい
は、イムノアフィニティークロマトグラフィ法により、
大きさ基準で精製する。修飾されたタンパク質は、以
後、MS2−HAと称することとする。その配列は、最初の3
0残基にわたるＮ−末端アミノ酸配列により確認した。

実施例２ヒトIgEに関連したエピトープの提示実施例１のａ）、ｂ）およびｃ）に記載した技術を用
いて、国際特許出願公開公報No.WO90/15878に記載され
たようなマスト細胞（mast cell）のトリガ脱顆粒（tri
ggering degranulation）に応答するヒトIgEからの配列
に関連したデカペプチドをMS−２コート蛋白質に挿入
し、発現し、精製した。Kpn1制限部位に挿入したオリゴ
ヌクレオチドは、10−merアミノ酸配列FGFFGSGKTKをコ
ード化し、修飾されたコート蛋白質は、そのIgEデカペ
プチドとの関連性ゆえに、以後、MS2−IgE′と称す。実
施例１において記載したように、Kpn1部位の使用の結
果、グリシンおよびスレオニンに対するさらなる２つの
コドンが創出され、全挿入量が12のアミノ酸となる。Ig
E′−修飾MS−２コート蛋白質は、同定され、その活性
は以下に記載するように試験した。最初の30残基にわた
るＮ−末端アミノ酸配列は、挿入のための配列を確認し
た。

実施例３ HIVgp120から誘導されるエピトープの提示実施例１に記載した技術を用いて、以下に記載するよ
うな変法で、ヒトの免疫欠損ウイルスからのgp 120のV
3ループから誘導される24−merをMS−２コート蛋白質に
組み込み、発現および精製した。gp120挿入は、最初
に、アミノ酸配列NNTRKSIRIQRGPGおよびGPGRAFVTIGKIG
をコード化するオリゴヌクレオチドをアニーリングし、
クレノーポリメラーゼで処理することによりダブルスト
ランドとし、タンデムに結紮したフラグメントを生成す
るT₄ポリヌクレオチドキナーゼおよびDNAリガーゼで処
理し、ついで、Kpn1で消化し、ゲル精製し、適当に調製
された発現ベクターのアリコートにクローン化すること
によって生成した。挿入された24−merアミノ酸配列
は、NNTRKSIRIQRGPGRAFVTIGKIGであり、生成した修飾コ
ート蛋白質は、以後、MS2−gp 120と称す。Kpn1部位の
使用の結果として、２つのさらなるコドンが創出され、
全挿入アミノ酸は26個となることに注目すべきである。
gp 120修飾MS−２コート蛋白質は、以下に記載するよ
うに同定された。

実施例４ MS2−HAの免疫応答実施例１に従い得られ、シュクロース密度勾配を通し
て遠心分離により精製した修飾コート蛋白質の免疫応答
は、以下のように研究した。

異質のエピトープを挿入したコート蛋白質試料および
挿入しないコート蛋白質試料をウエスターンブロッテイ
ングに付し、以下の抗体でプローブした：１）完全フロイントのアジュバントの存在で無傷のフ
ァージ（intact phage）から精製した精製モノメリック
MS−２コート蛋白質で免疫化したニュージーランド白ウ
サギから得られた、ワイルドタイプのMS−２コート蛋白
質に対する抗体を含むポリクロナール血清。

２）９−merに対するマウスの抗ペプチドモノクロナ
ール抗体（Research Institute of Scripps Clinic,Cal
ifornia,USAから入手可能な12CA5）使用した処理操作
は、以下の通りであった。

９−merインサート（insert）を有するコート蛋白質
試料および有しないコート蛋白質試料をSDS−PAGEに付
し、ついで、ニトロセルロースペーパの上に移した。Ha
rlowおよびLaneの“Antibodies:A Laboratory Manual"
（1988）,Cold Spring Harbor Laboratory,New Yorkに
記載した方法を用い、ウエスターンブロットをｉ）また
はii）でプローブし、ホースラディッシュペルオキシダ
ーゼ−共役ヤキ抗ウサギまたは抗マウスIgGで、それぞ
れ、視覚化した。

ポリクロナール血清ｉ）は、コート蛋白質の両試料と
反応し、その他の蛋白質成分および精製したインフルエ
ンザ赤血球凝集素と極わずかの交差反応を有した。しか
し、モノクロナール抗体ii）は、本質的に、９−merペ
プチドエピトープを含有するコート蛋白質バンドとのみ
反応した。このことは、インビボ（in vivo）で自己ア
センブリすることができ、ワイルドタイプの蛋白質がキ
メラ９−mre蛋白質よりも幾分速く移動するSDS−PAGE上
で蛋白質試料の移動と全く一致するコート蛋白質物質中
のエピトープの存在を確認する。

実施例５キメラMS−２蛋白質の同定Ａ） SDS−PAGEおよびウエスターンブロット分析 pGW11適当な発現ベクターを保持し、異質のエピトー
プコドンを挿入したE.coliの培養液および異質のエピト
ープコドンを挿入しないE.coliの培養液500mlを37℃で
O.D.₆₀₀がほぼ0.4〜0.6になるまで成長させ、固体のIPT
Gを1mMに添加することにより誘導し、インキュベーショ
ンを一晩続けた。細胞を遠心分離により収穫し、ペレッ
トを50mM Tris−HClおよび0.5％w/vサルコシル,pH6.5
で２〜3X体積に再懸濁し、ついで、細胞を音波破砕によ
り破壊した。音波破砕物は、すべて、ShaggerおよびJag
owの処理操作（Anal.Biochem.166,368−378）に従い、S
DS−PAGE（16.5％T:6％Ｃ）アクリルアミドゲルに負荷
した。95Vで８〜10時間電気泳動を行い、ついで、アク
リルアミドゲルを、メタノール：酢酸：水2:0.2:3中、
0.5％w/vクマシーブルー（Coomassie Blue）R250溶液で
８時間ステイン（stain）し、しかる後、同様の溶液で
染料を添加することなく、脱ステイン（destain）し
た。

その結果は、各々の場合において、主要な誘導ポリペ
プチドバンドがMS−２コート蛋白質および調製されたキ
メラに対して期待される分子量に対応することを確認し
た。

HarlowおよびLaneの（“Antibodies:A Laboratory Ma
nual"（1988）,Cold Spring Harbor Laboratory,New Yo
rk）に記載された処理操作に従い、上記したように調製
されたものと等価なゲルを0.2μｍのニトロセルロース
膜にブロット（blot）し、抗−MS2−コート蛋白質ウサ
ギポリクロナール抗体で処理し、続いて、ホースラデイ
ッシュペルオキシダーゼ−結合ヤギ抗ウサギIgGで処理
することによりタンパク質を視覚化した。結果を図１に
示す。図１において、レーンａ）は、ワイルドタイプの
MS−２コート蛋白質を示し、レーンｂ）は、MS−2HAを
示し、レーンｃ）は、MS2−IgE′を示し、さらに、レー
ンｄ）は、MS2−gpを示す。レーンｅ）は、分子量マー
カートラック（BRL Ltd.から市販されている）として含
まれる。明確なバンドは、43,29,18,14,6.2および3.4kD
a分子量をそれぞれ表す。

上記のようにウエスターンブロットを作成し、MS2−H
AおよびMS2−IgE′トランスファーをHA9−merまたは挿
入されたIgE′10−merに関連したIgE10merにそれぞれ配
向したマウスまたはラットのモノクロナール抗体でプロ
ーブした。これらのモノクロナールは、Dr.I.A.Wilson,
Scripps Research Institute,La Jolla,Californiaまた
はDr.D.R.Stanworth,University of Birmingham,UKから
それぞれ入手した。MS2−gp120トランスファーは、ヤギ
ポリクロナール抗gp120（Repligen Corp.,Boston.USAか
ら入手した）でプローブした。視覚化のためには、ウサ
ギ抗マウスIgG,抗ラットまたは抗ヤギIgGと結合したホ
ースラデッシュペルオキシダーゼをそれぞれ使用した。
この結果は、期待されるキメラに対する異質な免疫反応
性を示した。抗IgEモノクロナール抗体は、MS2−IgE′
キメラと交差反応することに注目すべきである。

Ｂ）電子顕微鏡写真以下の点で異なるが、上記Ａ）におけるように、細胞
を調製した。

細胞を30℃で成長させた。初期の上澄みをイムノアフ
ィニテイカラムにかける前に、４℃で20mMのリン酸ナト
リウム,pH7.4に対して直接透析し、ついで、これをもっ
ぱら透析バッファですすぎ、しかる後、同一のバッファ
＋100mMのNaClですすぎ、MS2蛋白質を20mM酢酸、20mM
NaClに溶離した。溶離した蛋白質は、1MのTris−HCl,pH
9.0で直ちにpH7.0に調整し、硫酸アンモニウム沈殿法に
より濃縮し、10mMのTris−HCl、100mMのNaCl,pH7.0に再
懸濁させ、しかる後、同様なバッファに対して透析し、
Sugiyama et al.（J.Mol.Biol.,166,1967,368−379）の
ネガテイブステイニングプロトコールを用いて電子鏡検
法用に調製した。顕微鏡写真は、JEM−1200機器を用
い、76kVの加速電圧で作成した。

イムノアフィニテイカラムは、製造者の指針に従い、
登録商標Affigel−Hz（Bio Rad）に共有結合的に結合さ
せたアフィニテイ精製ウサギの抗−MS2−CPポリクロナ
ールIgGsからなる。

結果は、図２〜図５に示す。このうち、図２は、ワイ
ルドタイプのMS2カプシドを示し、図３は、MS2−HAカプ
シドを示し、図４は、MS2−IgE′カプシドを示し、さら
に、図５は、MS2−gp120カプシドを示す。

実施例６インビボにおけるMS2−HAの抗原性マウスにおけるMS2−HA構造の免疫抗原性を試験する
ために、実施例１に記載したようにして、MS2−HAを
得、シュクロース密度勾配法で精製、すなわち、初期細
胞画分の可溶性上澄み液から精製した。

アセンブルしたMS2−HAを含有するプールした画分を
硫酸アンモニウムで沈殿させ、遠心分離により沈殿物を
収集し、ついで、選択または−20℃に貯蔵したバッファ
中で再懸濁した。マウスの（TUXCS Number One）のグル
ープを総構築物（挿入したHA9−merがこの投与重量の9/
140である）の5ng〜500μｇの投与量範囲s.c.免疫化し
た。投与量は、1:1混合物としてアジュバント（アルヒ
ドロゲル）を含有した。ブースター投与量は、分析用の
血液の試料を取った後７日または14日の間隔で与えた。
最も低い投与量でさえも、抗原としての対MS2−HA（す
なわち、“セルフ（self）"ELISA分析により測定される
ように、幾分かの免疫反応性があった。しかし、著しい
応答は、大量の投与についてのみ見られ、42日後におい
てもなお増大した。42日力価についての投与応答曲線を
図６に示す。

MS2−HAの500μｇで免疫化したマウスからの42日試料
を特異性対挿入ペプチドについて分析した。これは、セ
ルフまたはキャリヤ、すなわち、抗原としてワイルドタ
イプのMS−２カプシドエンプテイを用いるELISA分析に
より再度なされる。結果は、図７に示す。一連の滴定を
通じて、セルフに対する分析については高い値である。
50％飽和での力価は、セルフについて、1:7,500であ
り、MS2−キャリヤについて1:3,200であり、挿入物に対
して非常に特異な抗体力価が生成することが示される。
生成した血清は、また、非常に少ないが、キーホールリ
ンペットヘモシアニン（KLH）と結合したHA9−merペプ
チドと交差反応した。これは、多分、この場合、ペプチ
ドがただ単に線状のフラグメントとして存在するからで
ある。

上述のように精製したアルヒドロケルアジュバントを
有する、あるいは、有しないMS2−HAで免疫化したBalb
Ｃマウスとアジュバントを有する、あるいは、有しな
いワイルドタイプのMS−２との54日間出血（bleeding）
についてさらなる免疫抗原性分析をELISAによって行っ
た。比較のため、分析は、アルヒドロゲルアジュバント
を有するおよび有しないKLHに結合したHA9−merペプチ
ドとアジュバントを有するおよび有しないでHA9−mer配
列のみを包含する合成ペプチドとで免疫化されたBalb
Ｃからの54日出血についても行った。500μｇの投与摂
生を用いた。使用する場合、アルヒドロゲルを1:1混合
物として用いた。その結果を以下の表１に示す。与えら
れた力価は“セルフ（self）”および“キャリヤ（carr
ier）”に対してである。MS2−HAおよびワイルドタイプ
のMS−２を有する注射については、“セルフ（self）”
はMS2−HA構築物であり、他方、“キャリヤ（carrie
r）”は、ワイルドタイプMS−２である。KLH構築物を有
する注射については、“セルフ（self）”は、KLH−HA9
−mer構築物であり、“キャリヤ（carrier）”は、KLH
である。HA9−merペプチドのみを有する注射について
は、“セルフ（self）”はHA9−merペプチドのみであ
り、“キャリヤ（carrier）”はない。

表１に示した結果は、明瞭に、MS2−HA構築物におい
て構成的に発現される抗体応答の特異性を示す。さら
に、構成的に発現される異質のペプチド、例えば、HA9
−merに対して、非常に特異な抗体応答を達成するため
に、必ずしも、アジュバントまたはキャリヤ、例えば、
KLHを使用する必要がないらしいことも示されている。

実施例７インビボにおけるMS2−IgE′の抗原性ラットにおけるMS2−IgE′構築物の免疫抗原性を試験
するために、MS2−IgE′の試料を以下のように調製し
た：細胞を30℃で成長させ、使用した再懸濁バッファが50
mM Hepes＋100mM NaCl＋10mM DTT＋5mM EDTA,pH7.4
であった以外は、実施例5Aに記載したように前記構築物
の溶解産物を調製した。溶解産物は、遠心分離により透
明にした。

遠心分離ペレットを同様の単離バッファに再懸濁した
後、以下の抽出処理操作を行った。酢酸マグネシウムを
添加して6mMとしたDNアーゼ（DNaee）Ｉ（10μg/μｌ）
で再懸濁ペレットを処理した。37℃で30分後、NaClを添
加して50mMとし20分間37℃でソルトエクストラクション
（salt extracion）を行った。次に、試料を４℃で20分
間10,000rpmで遠心分離し、ペレットを同様の再懸濁バ
ッファ（RS）に再懸濁させ、１％v/vトライトンＸ−100
＋0.05％w/vナトリウムデオキシコレートを添加した。
マグネテイックスターラを用い、混合物を氷上60分間休
みなく撹拌した。ついで、混合物を遠心分離し、上記の
ようにRS中に再懸濁させた。このサスペンジョンにフル
オロトリクロロメタンを1:1となるように添加し、マグ
ネテイックスターラを用いて、混合物を４℃で15分間休
みなく撹拌した。混合物を４℃で30分間3,000rpmで遠心
分離し、頂部溶解層（SL）を吸引し、氷上で貯蔵し、他
方界面相は、再懸濁し、この処理操作を５回繰り返し
た。プールしたSLは、硫酸アンモニウム濃縮し、遠心分
離して、さらなる分析のために４℃で貯蔵した。上記調
製した物質を用い、以下の２つのスケジュールに従い、
２匹のオスウイスターラット（male Wister rats）200g
を免疫化した。

第１のスケジュール:MS2−IgE′構築物のサスペンジ
ョン0.25mlを０日および14日目にs.c.注射した。36日目
に、構築物サスペンジョンとアルヒドロゲル（室温で20
分間インキュベートした）との2:1混合物0.75mlをs.c.
注射した。21日、48日および70日目にELISA分析用にテ
イブリーデイング（tail bleeding）に従い血清を得
た。

第２のスケジュール：構築物サスペンジョンとアルヒ
ドロゲル（室温で20分間インキュベートした）との2:1
混合物0.35mlを０日と14日目にs.c.注射した。36日目
に、構築物サスペンジョンとアルヒドロゲルとの混合物
0.75mlを皮下注射した。21日、48日および70日目にテイ
ブリーデイングに従い、ELISA分析用に血清を得た。

“セルフ（self）”（この場合MS2−IgE′）に対する
応答およびキャリヤMS−２に対する応答を決定すること
により、上記のように得られた血清を注射した免疫原MS
2−IgE′に対するELISAによりチエックした。最も高い
力価は、セルフ（それぞれ、第１のスケジュール,70日
ブリード、および第２のスケジュール,70日ブリード）
に対して、1:50,000および1:70,000であり、キャリヤ
（それぞれ、第１のスケジュール,70日ブリード，およ
び第２のスケジュール,70日ブリード）に対して、1:10,
000および1:20,000であった。

この結果は、抗体応答の特異性がMS2−IgE′構築物に
おいて構成的に発現されるIgE′ペプチドに対して得ら
れたことを示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩＡ６１Ｐ 31/16 Ａ６１Ｐ 31/16 31/18 31/18 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 15/09 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ //(Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者ストックレイ，ピーター・ジョージイギリス国ウエスト・ヨークシャーエルエス29・９エイエックス，イルクレイ，キングズ・ロード，ビーチウッド・グローヴ１ (72)発明者タルボット，サイモン・ジョンイギリス国サマーセットビーエイ16・０キューエヌ，ストリート，グリーン・レーン 36 (56)参考文献Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ．345（1990) ｐ．36−41 ＭｏｌｅｋｕｌｙａｒｎａｙａＢｉｏｌｏｇｉｙａ，Ｖｏｌ．22［３］（1988）ｐ．731−740 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 19/00 A61K 39/00 - 39/44 A61P 31/16 A61P 31/18 C12N 1/21 C12N 15/62 C12P 21/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】カプシドアセンブリの一部を形成すること
ができ、かつ、ファージMS−２のコート蛋白質のアミノ
酸配列、または、その保存修飾変種、あるいは、カプシ
ド形成能を保持するに十分な前記配列または変種を含
み、そのアミノ酸配列がコート蛋白質のＮ−末端***β
−ヘアピンに対応する領域の異質のエピトープを挿入す
ることにより修飾されたキメラ蛋白質。
【請求項２】ファージMS−２のコート蛋白質のアミノ酸
配列を含む請求項１に記載のキメラ蛋白質。
【請求項３】前記異質のエピトープがMS−２のコート蛋
白質配列を参考にしてアミノ酸残基１〜20の領域に挿入
された請求項１または２に記載のキメラ蛋白質。
【請求項４】前記異質のエピトープがグリシン14および
スレオニン15の領域に挿入された請求項３に記載のキメ
ラ蛋白質。
【請求項５】前記異質のエピトープのすぐ上流および下
流領域に１以上のグリシン残基を含む請求項１〜４のい
ずれか１項に記載のキメラ蛋白質。
【請求項６】前記請求項のいずれか１項に記載のキメラ
蛋白質またはこのような蛋白質の混合物を含むカプシ
ド。
【請求項７】MS−２のコート蛋白質に対応するcDNA配
列、または、このようなコート蛋白質の保存修飾された
変種に対応するcDNA配列、あるいは、カプシド形成能を
保持するに十分な前記蛋白質または変種の部位配向突然
変異誘発に好適な配列ベクターへの導入、***ヘアピン
に対するcDNAコーテイングの領域における独特な制限酵
素認識部位の創出、前記抑制部位に異質のエピトープを
包含し、このように修飾された遺伝子を適当な発現ベク
ターにサブクローン化するオリゴヌクレオチドの導入、
続く前記異質の遺伝子を適当なホストに保持する前記修
飾された発現ベクターからの発現の誘導を含む請求項１
〜５のいずれか１項に記載のキメラ蛋白質、または、請
求項６に記載のカプシドを製造する方法。
【請求項８】前記ホストが、E.coliである請求項７に記
載の方法。
【請求項９】請求項１〜６のいずれか１項に記載のキメ
ラ蛋白質に対するDNAコーテイングを含む発現ベクタ
ー。
【請求項１０】請求項９の発現ベクターにより変換され
るホスト。
【請求項１１】請求項１〜５のいずれか１項に記載の蛋
白質、または、請求項６に記載のカプシドを含むワクチ
ン。