JP3177900B2 - How to measure total bilirubin - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、生体液中の総ビリルビ
ンの測定方法に関する。更に詳しくは、総ビリルビンの
測定に先立ち、検体にアルカリ溶液を添加して、検体の
液性をアルカリ性に一定時間保持し、検体中の抱合型ビ
リルビンを予め脱抱合して非抱合型ビリルビンとした
後、検体中に存在する非抱合型ビリルビン量を測定する
ようにした総ビリルビンの測定方法に関するものであ
る。The present invention relates to a method for measuring total bilirubin in a biological fluid. More specifically, prior to the measurement of total bilirubin, an alkaline solution was added to the sample, the liquidity of the sample was kept alkaline for a certain period of time, and the conjugated bilirubin in the sample was previously unconjugated to give an unconjugated bilirubin. Thereafter, the present invention relates to a method for measuring total bilirubin in which the amount of unconjugated bilirubin present in a sample is measured.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ビリルビンは、ヘモグロビンの代謝によ
って生成し胆汁中に最も多く存在する黄色色素で、生体
液中では大別して非抱合型ビリルビン、及び抱合型ビリ
ルビンとして存在する。ビリルビンの測定は各種疾病診
断の指標となる重要な検査対象項目で、臨床診断の分野
においては日常的にその測定が行われている。例えば、
溶血性貧血、溶血性黄疸などの病態では、主に非抱合型
ビリルビン量が増大し、また閉塞性黄疸などの病態では
抱合型ビリルビン量が増大することが知られている。従
って、ビリルビンの測定は、臨床学的には総ビリルビン
と共に、前記個々（非抱合型ビリルビン、及び抱合型ビ
リルビン）のビリルビンに分別して定量することが必要
である。2. Description of the Related Art Bilirubin is a yellow pigment produced by the metabolism of hemoglobin and most frequently present in bile, and is roughly classified in biological fluids as unconjugated bilirubin and conjugated bilirubin. The measurement of bilirubin is an important test item that serves as an index for diagnosis of various diseases, and the measurement is routinely performed in the field of clinical diagnosis. For example,
It is known that in pathological conditions such as hemolytic anemia and hemolytic jaundice, the amount of unconjugated bilirubin mainly increases, and in pathological conditions such as obstructive jaundice, the amount of conjugated bilirubin increases. Therefore, the measurement of bilirubin is clinically required to be quantified separately from the total (unconjugated bilirubin and conjugated bilirubin) together with the total bilirubin.

【０００３】ビリルビンの測定方法としては、ビリルビ
ンとジアゾ試薬との反応により生成するアゾビリルビン
を比色定量する方法、ビリルビンオキシダーゼ等の酸化
酵素を用いた酵素的測定方法、高速液体クロマトグラフ
ィーによる測定方法等が知られている。すなわち、総ビ
リルビンの測定法としては特開昭５９−１７９９９号、
特開昭６０−２４９０６０号等、抱合型ビリルビンの測
定法としては特開昭６０−１５２９５５号、特開昭６２
−５８９９９号、特公昭６１−４４０００号、特開平２
−２３８８９７号等、非抱合型ビリルビンの測定法とし
ては、特開昭６０−１５４１６２号が開示されている。[0003] As a method for measuring bilirubin, a method for colorimetric determination of azobilirubin produced by the reaction of bilirubin with a diazo reagent, a method for enzymatic measurement using an oxidase such as bilirubin oxidase, and a method for measurement by high performance liquid chromatography Etc. are known. That is, as a method for measuring total bilirubin, JP-A-59-17999,
Japanese Patent Application Laid-Open Nos. 60-249060 and 60-29555 disclose methods for measuring conjugated bilirubin.
No. 58999, Japanese Patent Publication No. 61-44000,
Japanese Patent Application Laid-Open No. 60-154162 discloses a method for measuring unconjugated bilirubin, such as Japanese Patent No. 238897.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来か
ら知られているこれらの方法によっては、測定の基準と
なる個々の標準物質が複雑かつ多種類にわたるためもあ
って、個々のビリルビンを直接、正確に測定することは
困難である。また総ビリルビンの測定法に関しては、検
体中の抱合型ビリルビンを非抱合型ビリルビンに変え
て、元から存在していた非抱合型ビルビリンと共に測定
し、これを総ビリルビン量とする測定方法が存在する
が、抱合型ビリルビンを十分に非抱合型ビリルビンに変
える簡便・適切な方法が知られていなかったので、総ビ
リルビン量を迅速、かつ正確に測定することは困難であ
った。However, according to these conventionally known methods, each bilirubin can be directly and accurately measured because each standard substance used as a measurement standard is complicated and many kinds. It is difficult to measure. Regarding the method of measuring total bilirubin, there is a method of converting conjugated bilirubin in a sample to unconjugated bilirubin, measuring the amount together with the unconjugated bilirubin originally present, and using this as the total amount of bilirubin. However, since a simple and appropriate method for sufficiently converting conjugated bilirubin into unconjugated bilirubin was not known, it was difficult to measure the total amount of bilirubin quickly and accurately.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本願発明は、総ビリルビ
ンの測定に関し、以上の問題点を解決するためになされ
たもので下記の請求項により構成されている。 （１）検体中の総ビリルビン量を測定するに際し、検体
の液性をｐＨ１０よりも高く保持し、検体中の抱合型ビ
リルビンを予め脱抱合して非抱合型ビリルビンとした
後、検体中に存在する非抱合型ビリルビン量を測定する
ことを特徴とする総ビリルビンの測定方法。 Means for Solving the Problems The present invention relates to a total biliruby.
This was done to solve the above problems with respect to
And is constituted by the following claims. (1) When measuring the total amount of bilirubin in the sample,
PH of the solution is kept higher than pH 10 and the conjugated
Unconjugated bilirubin by pre-conjugation of Rilvin
Then, measure the amount of unconjugated bilirubin present in the sample
A method for measuring total bilirubin, comprising:

【０００６】本願発明を以上のように構成する理由は、
アルカリ試薬をビリルビン含有検体に作用させて、抱合
型ビリルビンを非抱合型ビリルビンに精度良く変換し、
検体中の全てのビリルビンを非抱合型ビリルビンとする
ことによって、従来のビリルビン測定において最も困難
な標準物質に関わる問題点を解決するためである。すな
わち、アルカリ試薬をビリルビン含有検体に作用させ
て、抱合型ビリルビンを非抱合型ビリルビンに精度良く
変換し、その後さらにビリルビン酸化能を有する酸化剤
を作用させてこの非抱合型ビリルビンを酸化し、それに
伴う吸光度変化量を求めれば、既知濃度の非抱合型ビリ
ルビンのみを標準物質として、検体中の非抱合型ビリル
ビン、即ち総ビリルビンを精度良く測定できるのであ
る。The reason for configuring the present invention as described above is as follows.
An alkali reagent is allowed to act on a bilirubin-containing specimen to convert conjugated bilirubin to unconjugated bilirubin with high accuracy,
By making all bilirubin in a sample unconjugated bilirubin, it is possible to solve the problem associated with the most difficult standard substance in conventional bilirubin measurement. That is, an alkali reagent is applied to a bilirubin-containing specimen to convert conjugated bilirubin to unconjugated bilirubin with high precision, and then an oxidizing agent having a bilirubin oxidizing ability is further applied to oxidize this unconjugated bilirubin, thereby By determining the accompanying change in absorbance, the unconjugated bilirubin in the sample, that is, total bilirubin, can be accurately measured using only the known concentration of unconjugated bilirubin as a standard substance.

【０００７】本発明方法を好適に行うための総ビリルビ
ン測定試薬は、通常次の２試薬系で構成される。 第１試薬：抱合型ビリルビンを非抱合型ビリルビンに変
換するためのアルカリ溶液 第２試薬：第１試薬による検体液のアルカリ性を中性付
近例えばｐＨ６〜８程度に中和する中和剤（緩衝液）、
及び第１試薬によって生成した非抱合型ビリルビンを定
量するための酸化剤（例えばビリルビンオキシダーゼ
等）を主成分として構成する。[0007] The reagent for measuring total bilirubin for suitably carrying out the method of the present invention usually comprises the following two reagent systems. First reagent: an alkaline solution for converting conjugated bilirubin to unconjugated bilirubin Second reagent: a neutralizing agent (buffer solution) that neutralizes the alkali of the sample solution with the first reagent to near neutrality, for example, to a pH of about 6 to 8. ),
And an oxidizing agent (for example, bilirubin oxidase or the like) for quantifying unconjugated bilirubin generated by the first reagent.

【０００８】総ビリルビン測定用第１試薬の主成分とし
て使用する脱抱合能を発現させうるアルカリとしては、
例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリ
ウム、モノエタノールアミン、ジエタノールアミン、２
−エチルアミノエタノール、アンモニア等が挙げられ、
これらを単独あるいは複数を組合せて用いる。これらを
含む溶液の液性は、ｐＨ１０より高くなるように調製し
て使用する。上記に示したアルカリの濃度は、このｐＨ
の範囲であれば容易に選択し得る。この時ｐＨ１０．０
以下だと脱抱合能の発現が不十分あるいはしないので好
ましくない。アルカリの上限は、中和時の第２試薬の添
加量や脱抱合されたビリルビン自体の安定性を考慮し
て、約ｐＨ１４を目安として適宜調製することが好まし
い。すなわち、第１試薬は脱抱合能を十分発現させ得る
ことと、脱抱合後のビリルビンへ影響を与えないことを
達成できれば、任意にアルカリの種類、濃度およびｐＨ
範囲を設定できる。[0008] The alkali which can be used as a main component of the first reagent for measuring total bilirubin and which can exhibit deconjugation ability includes:
For example, sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, monoethanolamine, diethanolamine, 2
-Ethylaminoethanol, ammonia and the like,
These may be used alone or in combination. The pH of the solution containing these should be adjusted to be higher than pH10.
To use. The concentration of alkali shown above is
If it is in the range, it can be easily selected. At this time, pH 10.0
It is preferable that the amount is below because the expression of deconjugation ability is insufficient or not.
Not good . The upper limit of the alkali is preferably adjusted as appropriate, using about pH 14 as a guide, in consideration of the amount of the second reagent added during neutralization and the stability of deconjugated bilirubin itself. That is, if the first reagent can achieve sufficient expression of deconjugating ability and does not affect bilirubin after deconjugation, the type, concentration and pH of the alkali can be arbitrarily determined.
You can set the range.

【０００９】総ビリルビン測定用第２試薬に用いる酸化
剤としては、例えばビリルビンオキシダーゼ等の酸化
酵素、グルコースオキシダーゼ等の過酸化水素を生成
するオキシダーゼとそれらの基質及びペルオキシダーゼ
との混合物、ビリルビン酸化能を有する２価の銅イオ
ン若しくはその塩（例えば硫酸銅、塩化銅、硫酸第２鉄
など、過硫酸カリウムなどの過酸化物）、あるいはス
ルファニル酸と亜硫酸の塩酸溶液、２，４−ジクロロア
ニリン酸の混液などのジアゾ試薬を、いずれか単独でま
たは組合せて用いることができる。これらの酸化剤は、
酵素の場合０．０１〜３０ユニット／ｍｌ、好ましくは
０．０５〜１０ユニット／ｍｌ、過酸化物を用いる場合
は０．０１〜５０ｍＭ、好ましくは０．０５〜３０ｍ
Ｍ、金属イオンおよびその塩を用いる場合は０．０１〜
２０ｍＭ、好ましくは、０．０５〜５ｍＭ、更にジアゾ
試薬を用いる場合は、０．０５〜５ｍＭ、好ましくは
０．１〜２ｍＭの濃度範囲で使用できる。これらの成分
が上記範囲外の量で存在すると、非抱合型ビリルビンに
対する酸化反応の完結に長時間を要するか、試薬の劣化
が著しくなるか、或は試薬中に沈澱を生成する可能性が
あるため好ましくない。なお、酸化酵素の給源は限定さ
れるものではなく、種々の起源のものが使用される。例
えばラッカーゼはウルシ由来あるいはポリポーラス属な
どの微生物由来、ビリルビンオキシダーゼはミロセシウ
ム属若しくはエピタケ属由来のものが使用でき、又グル
コースオキシダーゼはアスペルギルス属由来のものなど
を使用すれば良い。The oxidizing agent used in the second reagent for measuring total bilirubin includes, for example, an oxidase such as bilirubin oxidase, an oxidase such as glucose oxidase that generates hydrogen peroxide, a mixture of the substrate and peroxidase, and a bilirubin oxidizing ability. Divalent copper ions or salts thereof (eg, copper sulfate, copper chloride, ferric sulfate, etc., peroxides such as potassium persulfate), or a hydrochloric acid solution of sulfanilic acid and sulfurous acid, or 2,4-dichloroanilic acid A diazo reagent such as a mixed solution can be used alone or in combination. These oxidants are
In the case of an enzyme, 0.01 to 30 units / ml, preferably 0.05 to 10 units / ml, and in the case of using a peroxide, 0.01 to 50 mM, preferably 0.05 to 30 m / ml.
When M, a metal ion and a salt thereof are used, 0.01 to
When a diazo reagent is used, it can be used in a concentration range of 20 to 5 mM, preferably 0.05 to 5 mM, preferably 0.1 to 2 mM. If these components are present in amounts outside the above ranges, the oxidation reaction to unconjugated bilirubin may take a long time, the deterioration of the reagent may be significant, or a precipitate may be formed in the reagent. Therefore, it is not preferable. The source of the oxidase is not limited, and various sources are used. For example, laccase may be derived from microorganisms such as urushi or polyporous genus, bilirubin oxidase may be derived from Myrocesium or Epitake, and glucose oxidase may be derived from Aspergillus.

【００１０】総ビリルビン測定用第１試薬及び第２試薬
には、上記の必須成分の他に、反応促進剤としての芳香
族カルボン酸、界面活性剤、緩衝液、キレート剤、通常
使用される賦活剤及び塩類を含むことができる。The first and second reagents for measuring total bilirubin include, in addition to the above essential components, an aromatic carboxylic acid as a reaction accelerator, a surfactant, a buffer, a chelating agent, and a commonly used activating agent. Agents and salts may be included.

【００１１】上記芳香族カルボン酸としては例えばｐ−
トルエンスルフォン酸、安息香酸などがあり、５〜７５
ｍＭ、好ましくは１０〜５０ｍＭの濃度範囲で使用でき
る。この範囲外の濃度では反応が完結するのに長時間を
要するか、試薬中に沈澱を生じる場合もあるため好まし
くない。As the aromatic carboxylic acid, for example, p-
Toluenesulfonic acid, benzoic acid, etc., 5-75
mM, preferably 10-50 mM. Concentrations outside this range are not preferred because it may take a long time for the reaction to be completed or may cause precipitation in the reagent.

【００１２】また上記界面活性剤としては陰イオン性界
面活性剤、非イオン性界面活性剤、陽イオン性界面活性
剤及び両性界面活性剤のいずれも使用できる。例として
はドデシル硫酸ナトリウム、コール酸あるいはポリオキ
シエチレングリコール、トリトンＸ−１００、ツイン８
０、塩化ラウリルピリジニウム、塩化ラウリルトリメチ
ルアンモニウム、Ｎ−ラウリル・ミリスチル−β−アミ
ノプロピオン酸、Ｎ−ラウリル−β−イミノ−ジプロピ
オン酸などがある。これらの界面活性剤は通常使用され
る０．０１〜１０％、好ましくは０．０５〜２％の濃度
範囲で使用できる。１０％を越えると試薬中に沈澱を生
じる可能性がある他、試薬の流動性が悪くなるため自動
分析機などへ適用できず好ましくない。As the above-mentioned surfactant, any of anionic surfactants, nonionic surfactants, cationic surfactants and amphoteric surfactants can be used. Examples include sodium dodecyl sulfate, cholic acid or polyoxyethylene glycol, Triton X-100, Twin 8
0, laurylpyridinium chloride, lauryltrimethylammonium chloride, N-lauryl-myristyl-β-aminopropionic acid, N-lauryl-β-imino-dipropionic acid and the like. These surfactants can be used in a commonly used concentration range of 0.01 to 10%, preferably 0.05 to 2%. If it exceeds 10%, a precipitate may be formed in the reagent, and the fluidity of the reagent deteriorates, so that it cannot be applied to an automatic analyzer or the like.

【００１３】上記第２試薬の緩衝液としては、第１試薬
の液性を中性付近に中和することができ、また使用する
酸化剤の至適ｐＨ付近に緩衝能をもつものを使用すれば
良い。第２試薬の緩衝液としては、酸化剤として例えば
ビリルビンオキシダーゼを用いたときはリン酸緩衝液
（ｐＨ７．０）、ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．０）など
がある。それら緩衝液の濃度としては２０ｍＭ〜２．５
Ｍ、好ましくは３０ｍＭ〜２Ｍ使用すれば良い。２０ｍ
Ｍ以下だと試薬に検体を加えた段階で設定したｐＨから
ずれる可能性が大きく、また３Ｍ以上であるとそれ自体
の調製が困難になり、また試薬中に沈澱を生じる場合も
あるため好ましくない。As the buffer solution of the second reagent, one which can neutralize the liquidity of the first reagent to near neutrality and has a buffering capacity near the optimum pH of the oxidizing agent to be used may be used. Good. Examples of the buffer of the second reagent include a phosphate buffer (pH 7.0) and a HEPES buffer (pH 7.0) when bilirubin oxidase is used as the oxidizing agent. The concentration of these buffers is 20 mM to 2.5
M, preferably 30 mM to 2M. 20m
If it is less than M, there is a great possibility that the pH will deviate from the set pH at the stage when the sample is added to the reagent. .

【００１４】キレート剤としてはエチレンジアミン四酢
酸などのポリアミノカルボン酸あるいはクエン酸などの
オキシカルボン酸などを０．０１〜１００ｍＭ、好まし
くは０．０５〜５０ｍＭを適宜使用することができる。As the chelating agent, a polyaminocarboxylic acid such as ethylenediaminetetraacetic acid or an oxycarboxylic acid such as citric acid may be used in an amount of 0.01 to 100 mM, preferably 0.05 to 50 mM.

【００１５】賦活剤としてはポリエチレングリコール、
アルブミン、糖類などを使用できる。ポリエチレングリ
コールを用いる場合は０．０１〜１０％、好ましくは
０．０５〜２％、アルブミンを用いる場合は０．０１〜
５０ｍＭ、好ましくは０．０５〜１０ｍＭ、糖類を用い
る場合は１〜１００ｍＭ、好ましくは５〜５０ｍＭを適
宜使用することができる。As the activator, polyethylene glycol,
Albumin, sugars and the like can be used. 0.01 to 10%, preferably 0.05 to 2% when using polyethylene glycol, and 0.01 to 2% when using albumin.
50 mM, preferably 0.05 to 10 mM, and when saccharides are used, 1 to 100 mM, preferably 5 to 50 mM can be appropriately used.

【００１６】更に、塩類としては、例えば塩化ナトリウ
ム、塩化アンモニウム、硫酸カリウムなどを１〜１００
ｍＭの範囲で使用しても良い。Further, as the salts, for example, sodium chloride, ammonium chloride, potassium sulfate and the like are 1 to 100.
It may be used in the range of mM.

【００１７】さらに本発明の総ビリルビン測定用標準物
質は、既知濃度の非抱合型ビリルビンを含むものであ
る。濃度としては０．０１〜２ｍＭ、好ましくは０．０
２〜１ｍＭである。この非抱合型ビリルビンとしては、
通常市販されている非抱合型ビリルビン（第一薬品社
製、シグマ社製など）あるいはブタ、ウマ、ヒトなどの
胆嚢から採取、精製したものを使用できる。標準物質と
してはこれら非抱合型ビリルビンを単独にまたはポリエ
チレングリコール、アルブミン、糖類、キレート剤、塩
類などの安定化剤あるいは賦活剤を適宜添加して調製で
きる。添加する場合はポリエチレングリコール、アルブ
ミン、糖類などをそれぞれ０．０１〜３０％、０．０１
〜５０ｍＭ、１〜３００ｍＭ、キレート剤としてエチレ
ンジアミン四酢酸などのポリアミノカルボン酸あるいは
クエン酸などのオキシカルボン酸などを０．０１〜１０
０ｍＭ、塩類として塩化ナトリウム、塩化アンモニウ
ム、硫酸カリウムなどを１〜５００ｍＭの濃度範囲で使
用できる。また市販の高ビリルビンコントロール標準血
清を使用することもできるが、その場合非抱合型ビリル
ビンのみを含みかつその含量が正確であることが望まし
い。Further, the standard substance for measuring total bilirubin of the present invention contains a known concentration of unconjugated bilirubin. The concentration is 0.01 to 2 mM, preferably 0.02 mM.
2-1 mM. As this unconjugated bilirubin,
Normally, commercially available unconjugated bilirubin (manufactured by Dai-ichi Yakuhin, Sigma, etc.) or those collected and purified from gallbladders of pigs, horses, and humans can be used. The standard substance can be prepared by using these unconjugated bilirubins alone or by appropriately adding a stabilizer or activator such as polyethylene glycol, albumin, a saccharide, a chelating agent, or a salt. When added, polyethylene glycol, albumin, saccharides and the like are each 0.01 to 30%, 0.01 to 30%.
５０50 mM, 1-300 mM, and a polyaminocarboxylic acid such as ethylenediaminetetraacetic acid or an oxycarboxylic acid such as citric acid as a chelating agent.
0 mM, and salts such as sodium chloride, ammonium chloride, and potassium sulfate can be used in a concentration range of 1 to 500 mM. A commercially available high-bilirubin control standard serum can also be used, but in this case, it is desirable that only the unconjugated bilirubin be contained and its content be accurate.

【００１８】検体中の総ビリルビンの測定方法として
は、脱抱合能を有するアルカリ試薬によって、抱合型ビ
リルビンを含む検体中の全てのビリルビンを非抱合型ビ
リルビンに変換した後、ＨＰＬＣによってこれを直接測
定するか、酸化酵素を含む試薬若しくはジアゾ試薬によ
ってこれをそれぞれ酸化、アゾ化非抱合型ビリルビンに
変換し、特定吸収波長に於ける吸光度変化量を測定すれ
ばよい。また本測定方法においては、抱合型ビリルビン
を含む検体中の全てのビリルビンを非抱合型ビリルビン
に変換することで、標準物質として非抱合型ビリルビン
のみを使用することが可能である。As a method for measuring the total bilirubin in a sample, all the bilirubins in the sample, including the conjugated bilirubin, are converted into unconjugated bilirubin using an alkaline reagent having a deconjugating ability, and then directly measured by HPLC. Alternatively, these may be converted to oxidized and azotized unconjugated bilirubin by a reagent containing an oxidase or a diazo reagent, respectively, and the change in absorbance at a specific absorption wavelength may be measured. In this measurement method, all the bilirubin in the sample containing the conjugated bilirubin is converted into the unconjugated bilirubin, so that only the unconjugated bilirubin can be used as the standard substance.

【００１９】総ビリルビンの測定方法として具体的に
は、例えば次の様にすれば良い。まず、上記の総ビリル
ビン測定用試薬の第１試薬１．０ｍｌを分光計のセル室
内にて予備加温後、各種ビリルビンを含む検体（血清な
ど）適当量を加えて１〜１０分間反応させ、検体中の抱
合型ビリルビンをすべて非抱合型ビリルビンに変換し、
４５０ｎｍにおける吸光度を測定する。次に上記の総ビ
リルビン測定用試薬の第２試薬０．２５ｍｌを添加して
さらに１〜１０分間反応させて非抱合型ビリルビンをす
べて酸化させ、４５０ｎｍにおける吸光度を測定し、こ
の値と先に測定した吸光度の液量補正値とから吸光度変
化量（Ａ）を求める。次に既知濃度の非抱合型ビリルビ
ンを含む標準物質を同様に測定し吸光度変化量（Ｂ）求
める。検体を作用させて求めた吸光度変化量とから、下
記の数式により検体中の総ビリルビン含量を求めること
ができる。 検体中の総ビリルビン濃度（ｍｇ／ｄｌ） ＝（Ａ／Ｂ）×標準物質中の非抱合型ビリルビン濃度
（ｍｇ／ｄｌ） なお、予備加温温度、反応温度は２５℃、３０℃、３７
℃などが適当である。また、検体量としては０．００１
〜０．１ｍｌが好ましい。測定波長は４５０ｎｍに限定
されるものではなく、４００ｎｍ〜４８０ｎｍの任意の
波長を選ぶことができる。また第１試薬、第２試薬、検
体の液量は適宜変化させることができる。The specific method for measuring the total bilirubin may be, for example, as follows. First, after preliminarily heating 1.0 ml of the first reagent for measuring the total bilirubin in the cell chamber of the spectrometer, an appropriate amount of a sample (such as serum) containing various bilirubins is added and reacted for 1 to 10 minutes. Convert all conjugated bilirubin in the sample to unconjugated bilirubin,
The absorbance at 450 nm is measured. Next, 0.25 ml of the second reagent for measuring the total bilirubin was added and reacted for 1 to 10 minutes to oxidize all the unconjugated bilirubin, and the absorbance at 450 nm was measured. The amount of change in absorbance (A) is determined from the corrected liquid amount of the absorbance. Next, a standard substance containing a known concentration of unconjugated bilirubin is measured in the same manner, and the absorbance change (B) is determined. The total bilirubin content in the sample can be determined from the absorbance change amount obtained by allowing the sample to act, using the following equation. Total bilirubin concentration in sample (mg / dl) = (A / B) x unconjugated bilirubin concentration in standard substance (mg / dl) The preheating temperature and reaction temperature were 25 ° C, 30 ° C, and 37 ° C, respectively.
C is appropriate. The sample volume is 0.001
~ 0.1 ml is preferred. The measurement wavelength is not limited to 450 nm, and any wavelength between 400 nm and 480 nm can be selected. The liquid volumes of the first reagent, the second reagent, and the sample can be appropriately changed.

【００２０】なお、本発明では検体中の抱合型ビリルビ
ンのみを含む場合、抱合型ビリルビンの非抱合型ビリル
ビンの変換後の非抱合型ビリルビン量は抱合型ビリルビ
ン量に相当し、従って前述の第２試薬を作用させた時の
吸光度変化量は、検体中の抱合型ビリルビン量に対応す
る。In the present invention, when only the conjugated bilirubin in the sample is contained, the amount of the unconjugated bilirubin after the conversion of the conjugated bilirubin into the unconjugated bilirubin corresponds to the amount of the conjugated bilirubin. The change in absorbance when the reagent is acted on corresponds to the amount of conjugated bilirubin in the sample.

【００２１】なお、第２試薬で非抱合型ビリルビンを酸
化してその吸光度減少より定量する代わりに、ジアゾ試
薬によってアゾ色素を生成させて定量することも可能で
ある。また、第１試薬と検体を作用させた後、ＨＰＬＣ
にて直接抱合型ビリルビンを分析定量することもでき
る。Instead of oxidizing unconjugated bilirubin with the second reagent and quantifying it based on the decrease in absorbance, azo dyes can be formed with a diazo reagent and quantified. After reacting the sample with the first reagent, HPLC
The conjugated bilirubin can also be directly analyzed and quantified by the above method.

【００２２】[0022]

【作用】本発明の総ビリルビン量測定用試薬により、検
体中の抱合型ビリルビンを非抱合型ビリルビンに変換
し、次いでこの非抱合型ビリルビンと検体中にもとより
存在した非抱合型ビリルビンとを酸化させ、生じた吸光
度変化量より検体中の総ビリルビン量を求めることがで
きる。The reagent for measuring the amount of total bilirubin of the present invention converts conjugated bilirubin in a sample into unconjugated bilirubin, and then oxidizes the unconjugated bilirubin and the unconjugated bilirubin originally present in the sample. The total amount of bilirubin in the sample can be determined from the resulting change in absorbance.

【００２３】以下に、本発明を実施例により詳述する
が、本発明はこれによって限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to Examples, but the present invention is not limited thereto.

【実施例】【Example】

＜脱抱合能の確認＞予め３７℃に加温しておいた表１に
示す各第１試薬１ｍｌに、ヒト管理血清２５μｌを加え
て３７℃、５分間加温した後、第２試薬として１Ｍ−Ｂ
ＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）２５０μｌを加えて３７℃、
５分間加温する。対象として、第１試薬に代えて生理食
塩水を用いて同様の操作を行った。これらの各反応溶液
１００μｌを以下の条件によってＨＰＬＣ分析を行っ
た。その結果を表１および図１に示す。 （ＨＰＬＣ分析条件） カラム：リクロソルブＲＰ−８ 溶離液：（Ａ液）５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ２．０）
と２−メトキシエタノールの混液（９５：５） （Ｂ液）イソプロピルアルコールと２−メトキシエタノ
ールの混液（９５：５）１０００ｍｌにリン酸を２５ｍ
ｌ添加した液。 条 件：Ａ液→Ｂ液８０％リニアグラジェント（１６
分） Ｂ液８０％（８分） Ｂ液８０％→Ａ液リニアグラジェント（６分） 温 度：４１℃ 流 速：１ｍｌ／ｍｉｎ 検 出：４５０ｎｍ<Confirmation of Deconjugation Ability> To 1 ml of each first reagent shown in Table 1 previously heated to 37 ° C., 25 μl of human control serum was added, and the mixture was heated at 37 ° C. for 5 minutes. -B
Add 250 μl of ES buffer (pH 6.0) and add
Warm for 5 minutes. As a target, the same operation was performed using physiological saline instead of the first reagent. 100 μl of each of these reaction solutions was subjected to HPLC analysis under the following conditions. The results are shown in Table 1 and FIG. (HPLC analysis conditions) Column: Lichrosolve RP-8 Eluent: (Solution A) 50 mM phosphate buffer (pH 2.0)
(95: 5) Mixed solution of isopropyl alcohol and 2-methoxyethanol (95: 5) 25 ml of phosphoric acid in 1000 ml
l Added liquid. Conditions: Solution A → Solution B 80% linear gradient (16
Min) 80% of solution B (8 minutes) 80% of solution B → linear gradient of solution A (6 minutes) Temperature: 41 ° C Flow rate: 1 ml / min Detection: 450 nm

【００２４】[0024]

【表１】 ＜表１中の記号の説明＞ 「◎」は脱抱合能が十分発現する。 「○」は脱抱合能が発現する。 「△」は脱抱合能の発現が不十分である。 「×」は脱抱合能が発現しない。 ｐＨは調製した後の実測値を示す。[Table 1] <Explanation of symbols in Table 1> “◎” indicates that the deconjugate ability is sufficiently expressed. “O” indicates deconjugation ability. “△” indicates insufficient expression of deconjugation ability. “X” indicates that the ability to deconjugate does not appear. The pH indicates an actually measured value after preparation.

【００２５】[0025]

【実施例】【Example】

＜血清中の総ビリルビンの測定＞総ビリルビン量既知
（２２．５ｍｇ／ｄｌ）のヒト血清を生理食塩水で、希
釈率０／１０から１０／１０の各希釈列を調製し、サン
プルとした。また、第１試薬として０．１Ｎ ＮａＯＨ
および第２試薬としてビリルビンオキシダーゼ１０Ｕ／
ｍｌを含む１Ｍ ＢＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）をそれぞ
れ調製した。各サンプル８μｌに第１試薬３２０μｌを
加え、３７℃で５分間加温し、次いで第２試薬８０μｌ
を加え、３７℃で５分間加温した後、波長４５０ｎｍに
おける吸光度を測定した。標準として、９．４３ｍｇ／
ｄｌの非抱合型ビリルビン溶液を用い、同様の操作を行
った。また、サンプルに代えて蒸留水を用いて同様の操
作を行い、このときの吸光度をブランク値とした。結果
を図２に示す。図２の結果の通り、本法による検量線は
直線性を示し、また、別途行った従来法（酵素法）との
相関も良好であった。<Measurement of Total Bilirubin in Serum> Human serum having a known total bilirubin amount (22.5 mg / dl) was diluted with physiological saline to prepare dilution series at dilution ratios of 0/10 to 10/10, and used as samples. Also, 0.1N NaOH is used as the first reagent.
And as a second reagent, 10 U of bilirubin oxidase /
ml of 1M BES buffer (pH 6.0) was prepared. To 8 μl of each sample, add 320 μl of the first reagent, warm at 37 ° C. for 5 minutes, then 80 μl of the second reagent
After heating at 37 ° C. for 5 minutes, the absorbance at a wavelength of 450 nm was measured. As a standard, 9.43 mg /
The same operation was performed using dl of an unconjugated bilirubin solution. The same operation was performed using distilled water instead of the sample, and the absorbance at this time was used as a blank value. The results are shown in FIG. As shown in FIG. 2, the calibration curve obtained by this method showed linearity, and the correlation with the conventional method (enzyme method) separately performed was also good.

【００２６】[0026]

【発明の効果】本願発明の総ビリルビンの測定方法は以
上のように構成したので、検体中の抱合型ビリルビンを
予め脱抱合して非抱合型ビリルビン容易に変えることが
でき、検体中に存在する非抱合型ビリルビン量を簡便か
つ正確に測定することができるという効果を有する。As described above, the method for measuring total bilirubin of the present invention is constituted as described above, so that conjugated bilirubin in a sample can be easily deconjugated in advance to easily change unconjugated bilirubin and present in the sample. This has the effect that the amount of unconjugated bilirubin can be measured simply and accurately.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】検体を（ａ）アルカリ未処理のもの、（ｂ）ア
ルカリ処理したもの、（ｃ）ビリルビンオキシダーゼ処
理をしたもの、各々のＨＬＰＣによる分析結果を示すチ
ャート図である。FIG. 1 is a chart showing HLPC analysis results of (a) a sample not treated with alkali, (b) a sample treated with alkali, and (c) a sample treated with bilirubin oxidase.

【図２】本願発明の総ビリルビンの測定方法における検
量線を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing a calibration curve in the method for measuring total bilirubin of the present invention.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 黒坂 啓介 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ 株式会社中央研究所内 (72)発明者 近藤 仁司 京都府宇治市宇治小桜23番地 ユニチカ 株式会社中央研究所内 (56)参考文献 特開 平４−134266（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−187400（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/48 - 33/98 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuing on the front page (72) Inventor Keisuke Kurosaka 23 Uji Kozakura, Uji City, Kyoto Prefecture Unitika Central Research Laboratory Co., Ltd. 56) References JP-A-4-134266 (JP, A) JP-A-3-187400 (JP, A) (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁷ , DB name) G01N 33/48-33/98

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】検体中の総ビリルビン量を測定するに際
し、検体にアルカリ溶液を添加して、検体の液性をｐＨ
１０よりも高く保持し、検体中の抱合型ビリルビンを予
め脱抱合して非抱合型ビリルビンとした後、検体中に存
在する非抱合型ビリルビン量を測定することを特徴とす
る総ビリルビンの測定方法。 1. A method for measuring the total amount of bilirubin in a sample.
And add an alkaline solution to the sample to adjust the liquidity of the sample to pH.
Keep higher than 10 to predict conjugated bilirubin in the sample.
After unconjugation to unconjugated bilirubin
Measuring the amount of unconjugated bilirubin present
Method for measuring total bilirubin.