JP3174355B2 - Base sequence of DTA gene and use thereof - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、配列表の配列番号１に
示したアミノ酸配列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラー
ゼ（以下、ＤＴＡと略す）活性を有するポリペプチドを
コードするＤＮＡ、そのＤＮＡとベクターＤＮＡとより
なる組換え体ＤＮＡ、その組換え体ＤＮＡで形質転換せ
しめられた形質転換体、及び該形質転換体を利用したＤ
ＴＡの製造法並びにＤ−スレオニン等のＤ−β−ヒドロ
キシアミノ酸の製造法に関する。特に本発明は、ＤＴＡ
のコード領域に対応するＤＮＡを遺伝子組換え操作する
ことにより、安定で且つ発現性に優れた組換え体ＤＮＡ
を与えると共に、ＤＴＡ生産性の優れた形質転換体を提
供する。また、こうして得られた形質転換体を利用する
ことにより、バイオインダストリーの分野のみでなく、
広範な応用の可能なＤＴＡを大量に製造することがで
き、さらには特に、医薬、農薬等の合成原料として有用
なＤ−スレオニンをはじめとしたＤ−β−ヒドロキシア
ミノ酸を効率よく製造することにも関する。The present invention relates to a DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and having D-threonine aldolase (hereinafter abbreviated as DTA) activity, and a DNA encoding the same. Recombinant DNA comprising vector DNA, transformant transformed with the recombinant DNA, and D using the transformant
The present invention relates to a method for producing TA and a method for producing D-β-hydroxyamino acids such as D-threonine. In particular, the present invention relates to DTA
Recombinant DNA which is stable and excellent in expression by genetically recombining DNA corresponding to the coding region of
And a transformant having excellent DTA productivity. In addition, by using the transformant thus obtained, not only in the field of bioindustry,
It is possible to produce a large amount of DTA that can be applied to a wide range of applications, and more particularly to efficiently produce D-β-hydroxy amino acids such as D-threonine, which is useful as a raw material for synthesis of medicines, agricultural chemicals, and the like. Also concerns.

【０００２】[0002]

【従来の技術及び発明が解決しようとする課題】Ｄ−ア
ミノ酸の研究が進むに従って、Ｄ−アミノ酸は抗生物
質、酵素阻害剤、除草剤等の各種医薬、農薬、その他の
各種の生理活性物質の合成原料として有用であることが
明らかにされ、その大量製造法が求められてきた。従来
Ｌ−アミノ酸及びＤ−アミノ酸それぞれの製造は、ＤＬ
−アミノ酸から繁雑な方法でもってラセミ体を光学分割
して製造することが一般的であった。2. Description of the Related Art As research on D-amino acids progresses, D-amino acids are used in various medicines such as antibiotics, enzyme inhibitors, herbicides, pesticides, and various other physiologically active substances. It has been shown to be useful as a raw material for synthesis, and a method for mass production thereof has been demanded. Conventionally, the production of each of L-amino acid and D-amino acid is performed by DL
-It has been common to produce racemates by optical resolution from amino acids by a complicated method.

【０００３】しかし、そのような方法は、不必要な他方
のアミノ酸をも製造するものであると共にそれを光学分
割しなければならないという著しい不利な点を有してい
た。このような点を解決するものとして、本発明者ら
は、自然界を広く検索した結果Ｄ−スレオニンアルドラ
ーゼ（ＤＴＡ）を見出すと共に（特公昭６４−１１２７
９号）、その酵素を使用すればグリシンとアセトアルデ
ヒドなどのアルデヒド化合物から選択的にＤ−スレオニ
ンなどのＤ体のβ−オキシアミノ酸を製造することが出
来ることを見出した（特開昭５８−１１６６９０号）。[0003] However, such a method has a significant disadvantage that it also produces the other unnecessary amino acid and that it has to be optically resolved. In order to solve such a problem, the present inventors have found D-threonine aldolase (DTA) as a result of extensive search in nature (Japanese Patent Publication No. 64-1127).
No. 9), and found that the use of the enzyme enables the selective production of D-form β-oxyamino acids such as D-threonine from aldehyde compounds such as glycine and acetaldehyde (JP-A-58-116690). issue).

【０００４】このようなＤＴＡを使用してＤ−β−オキ
シアミノ酸を効率よく製造するためには、大量のＤＴＡ
を安価に取得することが必要であった。従来この酵素を
大量に効率よく得るために、高生産菌株を土壌などから
得る試みが広範囲になされたり、あるいは既存の生産株
の人工突然変異によって育種改良することがなされてき
たが、満足のいく結果は得られていなかった。In order to efficiently produce D-β-oxyamino acid using such DTA, a large amount of DTA is required.
It was necessary to get the cheap. Conventionally, in order to efficiently obtain this enzyme in large quantities, attempts to obtain high-producing strains from soil or the like have been made extensively, or breeding and improvement have been made by artificial mutation of existing production strains. No results were obtained.

【０００５】このような状況のもとで、本発明者らは、
鋭意研究を行ない、その結果微生物よりＤＴＡ産生に関
与する遺伝子を遺伝子組換えの手法で大量に得ることを
可能にすると共に、その遺伝子を用いた組換えＤＮＡで
もって形質転換せしめたＤＴＡ高生産性の組換え微生物
を取得した。本発明者らは更に研究を進め、前記組換え
手法で得られたＤＴＡ産生に関与する遺伝子の塩基配列
の決定を試み、それに成功すると共に、ＤＴＡ産生に直
接関与する遺伝子部分を特定化した。そして更にこうし
て特定化されたＤＴＡ産生に直接関与する遺伝子部分
は、前記の組換えＤＮＡのほんの一部であること、そし
てこのように小断片化された遺伝子はそれ自体でＤＴＡ
をコードするものであることを知見するに至った。本発
明者らは更に研究を進めた結果このように小断片化され
たＤＴＡコードＤＮＡは、それを多コピー化することが
容易なこと、遺伝子発現制御配列との組み合わせが比較
的簡単になし得ること、その発現の制御が容易化しうる
こと、さらには高ＤＴＡ産生形質転換体の育種に使用で
きるなどの優れた利点を有すると共に、そのうちの塩基
配列を公知の手法で置換あるいは欠失あるいは付加する
ことが容易になるなどのことを見出して本発明を完成し
た。[0005] Under such circumstances, the present inventors:
After extensive research, it has become possible to obtain a large amount of genes involved in DTA production from microorganisms by means of genetic recombination techniques, and at the same time, to have high DTA productivity transformed by recombinant DNA using the genes. Was obtained. The present inventors proceeded with further research, attempted to determine the nucleotide sequence of a gene involved in DTA production obtained by the above-mentioned recombination technique, succeeded, and identified the gene portion directly involved in DTA production. Further, the gene portion directly involved in DTA production thus specified is only a small part of the above-mentioned recombinant DNA, and the gene thus fragmented is itself DTA-free.
It came to be understood that it codes. As a result of further studies by the present inventors, the DTA-encoding DNA fragmented in such a manner can be easily converted into multiple copies, and can be relatively easily combined with a gene expression control sequence. In addition, it has excellent advantages that its expression can be easily controlled and that it can be used for breeding high DTA-producing transformants, and the base sequence of which is substituted, deleted or added by a known method. The present invention has been completed by finding out that it becomes easier.

【０００６】即ち、本発明は、（１） 配列表の配列番
号１に示したアミノ酸配列を有し、Ｄ−スレオニンアル
ドラーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ、（２） 上記（１）のＤＮＡをベクターに組み込ん
でなる組換え体ＤＮＡ、（３） 上記（２）の組換え体
ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換体、（４） 上
記（３）の形質転換体を培養し、次に得られたＤＴＡを
採取することを特徴とするＤ−スレオニンアルドラーゼ
の製造法、及び（５） 上記（３）の形質転換体あるい
はその処理物を、グリシン及びアルデヒド化合物と反応
せしめ、生成したＤ−β−ヒドロキシアミノ酸を採取す
ることを特徴とするＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造
法に関する。That is, the present invention relates to (1) a DN having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and encoding a polypeptide having D-threonine aldolase activity.
A, (2) a recombinant DNA obtained by incorporating the DNA of (1) into a vector, (3) a transformant transformed with the recombinant DNA of (2), (4) ). A method for producing D-threonine aldolase, which comprises culturing the transformant and then collecting the obtained DTA, and (5) converting the transformant of (3) or a processed product thereof into glycine And a method for producing a D-β-hydroxy amino acid, which comprises reacting the compound with an aldehyde compound and collecting the generated D-β-hydroxy amino acid.

【０００７】本発明は、また、上記（１）のＤＮＡを用
いた高発現性の組換え体ＤＮＡ並びにその製造法、及び
上記（１）のＤＮＡを用いたＤＴＡ高産生形質転換体の
育種法をも提供する。[0007] The present invention also provides a highly expressing recombinant DNA using the above-mentioned DNA (1), a method for producing the same, and a method for breeding a DTA-high producing transformant using the above-mentioned DNA (1). Also provide.

【０００８】以下、本発明を更に詳細に説明する。 （１）ＤＴＡ合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡの単
離 本発明の配列表の配列番号１に示したアミノ酸配列を有
し、ＤＴＡ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮ
Ａ（以下、単にＤＴＡ遺伝子ともいう。）は、Ｄ−スレ
オニンアルドラーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤ
ＮＡから製造することができる。Hereinafter, the present invention will be described in more detail. (1) Isolation of DNA Carrying Gene Information Involved in DTA Synthesis DN having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing of the present invention and encoding a polypeptide having DTA activity
A (hereinafter, also simply referred to as the DTA gene) is a D-threonine aldolase that carries genetic information related to synthesis.
It can be manufactured from NA.

【０００９】このＤ−スレオニンアルドラーゼの合成に
関与する遺伝情報を担うＤＮＡとしては、例えばキサン
トモナス属細菌から得られたものが挙げられる。このキ
サントモナス属細菌としてはＤＴＡ産生キサントモナス
属細菌株であれば特に限定されないが、特に好ましいも
のとしてはキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７を
あげることができる。[0009] Examples of the DNA carrying the genetic information involved in the synthesis of D-threonine aldolase include those obtained from bacteria of the genus Xanthomonas. The Xanthomonas bacterium is not particularly limited as long as it is a DTA-producing Xanthomonas bacterium strain, and particularly preferred is Xanthomonas oryzae IAM1657.

【００１０】また、このＤＮＡは、それが一旦単離取得
されたならば、慣用方法に従ってそのＤＮＡ中の塩基配
列の大部分あるいは一部分を利用して、それをプローブ
として用いて、他の生物を検索して、その生物の保有す
る遺伝子のうちに、ＤＴＡの合成に関与する遺伝情報を
担うものを見つけ出し、次にそのようにして同定された
遺伝子を遺伝子組換え技術の手法を応用して切り出し
て、それを大量に得、それをこのキサントモナス属細菌
に由来するものと同様に用いることは、当業者であれば
容易に理解し得るところのものである。Once the DNA is isolated and obtained, it can be used as a probe by utilizing most or a part of the base sequence in the DNA according to a conventional method, and used as a probe. Search and find out among the genes possessed by the organism those that carry the genetic information involved in the synthesis of DTA, and then cut out the genes identified in this way by applying genetic recombination technology Thus, it can be easily understood by those skilled in the art to obtain it in a large amount and use it in the same manner as that derived from the genus Xanthomonas.

【００１１】従って、本発明のＤ−スレオニンアルドラ
ーゼの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡ源として
は、キサントモナス属細菌のみでなく、上記したような
手法の適用できるグラム陰性あるいはグラム陽性細菌で
あってＤＴＡをコードする遺伝子を有するものがあげら
れる。この他にも、ＤＴＡ遺伝子を有するものであれ
ば、動物、植物、下等生物、高等生物の区別なく利用す
ることが可能である。ＤＴＡ遺伝子源として好ましい微
生物としてはキサントモナス属、アリスロバクター属、
シュードモナス属あるいは、アルカリゲネス属に属する
ものがあげられる。このようなものの代表的な例として
はキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７、アルカリ
ゲネス・ハエカリスＩＦＯ１２６６９、シュードモナス
ＤＫ−１９（微工研菌寄第６２００号）及びアリスロバ
クターＤＫ−１９（微工研菌寄第６２０１号）をあげる
ことができる。Therefore, the DNA source that carries the genetic information relating to the synthesis of D-threonine aldolase of the present invention is not only Xanthomonas bacteria but also Gram-negative or Gram-positive bacteria to which the above-mentioned technique can be applied. Those having a gene encoding DTA can be mentioned. In addition, any animal having a DTA gene can be used without distinction between animals, plants, lower organisms, and higher organisms. Preferred microorganisms as DTA gene sources include Xanthomonas spp., Arisrobacter spp.
Examples include those belonging to the genus Pseudomonas or the genus Alcaligenes. Representative examples of such a product include Xanthomonas oryzae IAM1657, Alcaligenes hayekaris IFO 12669, Pseudomonas DK-19 (Microtechnical Laboratories No. 6200) and Arisrobacter DK-19 (Microtechnological Laboratories No. 6201). ) Can be given.

【００１２】（２）ＤＴＡをコードするＤＮＡの塩基配
列の決定 次にキサントモナス属細菌由来のＤＴＡ産生に関与する
遺伝子を含むＤＮＡを例にあげて、ＤＴＡをコードする
ＤＮＡの単離及びその塩基配列の決定法について説明す
る。ここで使用しうるキサントモナス属細菌由来のＤＴ
Ａ産生に関与する遺伝子の供給株としては、具体的には
キサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７よりクローン
化されたＤＴＡ遺伝子を含む約３．５ＫｂのＳｍａＩ／
ＢｇｌII断片を組み込んだプラスミドＤＮＡをもつ形質
転換体大腸菌Ｃ６００（ｐＤＴ６４８）があげられる。(2) Determination of the base sequence of DNA encoding DTA Next, isolation of DNA encoding DTA and its base sequence are described by taking, as an example, a DNA containing a gene involved in DTA production derived from a bacterium belonging to the genus Xanthomonas. The method for determining is described. DT derived from Xanthomonas bacteria usable here
As a supply strain of a gene involved in A production, specifically, about 3.5 Kb of SmaI / about containing the DTA gene cloned from Xanthomonas oryzae IAM1657.
A transformant Escherichia coli C600 (pDT648) having a plasmid DNA into which a BglII fragment has been incorporated is exemplified.

【００１３】この株は工業技術院微生物工業技術研究所
に、微工研菌寄第１１０４９号（ＦＥＲＭ Ｐ−１１０
４９）として寄託されている。上記形質転換体からの組
換え体ＤＮＡおよび目的のＤＴＡ遺伝子を持つＤＮＡ断
片の調製は通常の方法を用いて行うことができる。This strain was supplied to the Institute of Microbial Industry and Technology by the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
49). Preparation of the recombinant DNA and the DNA fragment having the desired DTA gene from the above-mentioned transformant can be performed by a usual method.

【００１４】例えば、培地中で増殖させた該形質転換体
を収穫し、細胞壁をリゾチーム処理等の細胞破壊法とし
て知られた方法により壊し、次に核酸画分を分離した
後、密度勾配遠心などの方法により所望の画分に分け
る。こうして得られたプラスミドを含有する画分は、次
に適当な制限酵素で処理することにより、適度な断片に
することができると共にまた選択的に配列表の配列番号
１に示したアミノ酸配列を有し、ＤＴＡ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ断片とすることができ
る。For example, the transformant grown in a medium is harvested, the cell wall is broken by a method known as cell disruption such as lysozyme treatment, and then the nucleic acid fraction is separated, followed by density gradient centrifugation. The desired fraction is divided by the method described above. The fraction containing the plasmid thus obtained can be converted into an appropriate fragment by treating it with an appropriate restriction enzyme, and also selectively having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing. Alternatively, a DNA fragment encoding a polypeptide having DTA activity can be obtained.

【００１５】ＤＮＡの塩基配列を決定するのに適した程
度まで断片化されたＤＮＡは、次に当該分野でよく知ら
れた方法により処理されてその塩基配列を決定すること
ができる。ＤＮＡ断片のＤＮＡ塩基配列の決定法として
は、Ｍａｘａｍ−Ｇｉｌｂｅｒｔ法、ジデオキシ・シー
クエンス法、ジデオキシ・チェイン・ターミネーション
法等があげられる。このような方法の内には、適当な制
限酵素を作用させ、制限酵素地図を作製した上で、必要
な断片をサブクローン化する方法や、ショットガン・ク
ローニング法、ＰＣＲにより遺伝子を増幅する方法、核
酸分解酵素によりディリーションする方法などの様々な
手法が含まれていることはもちろんである。The DNA fragmented to an extent suitable for determining the nucleotide sequence of the DNA can then be treated by methods well known in the art to determine its nucleotide sequence. Methods for determining the DNA base sequence of the DNA fragment include the Maxam-Gilbert method, the dideoxy sequence method, the dideoxy chain termination method, and the like. Among such methods, there are a method in which an appropriate restriction enzyme is acted, a restriction enzyme map is prepared, and a necessary fragment is subcloned, a method in which a gene is amplified by a shotgun cloning method, or a PCR. Needless to say, various techniques such as a method of quenching with a nuclease are included.

【００１６】次に、こうしてＤＮＡ塩基配列の決定され
たＤＮＡのうちからＤＴＡ活性を有するポリペプチドを
コードしているＤＮＡ領域を決定する。このコード領域
決定のためには、先ず大量にＤＴＡ活性を有するポリペ
プチドを取得し、そのアミノ酸配列を決定し、そのアミ
ノ酸配列をコードしているＤＮＡ領域を探索決定する。
次にこうして決定されたＤＴＡ活性を有するポリペプチ
ドをコードするＤＮＡ領域を制限酵素で切り出し、再度
これを用いて発現ベクターを構築し、それを適当な宿主
中で発現させ、こうして得られた発現物の活性を検討し
て最終的に確認される。Next, a DNA region encoding a polypeptide having DTA activity is determined from the DNA whose DNA base sequence has been determined in this manner. In order to determine the coding region, first, a polypeptide having DTA activity is obtained in a large amount, its amino acid sequence is determined, and a DNA region encoding the amino acid sequence is searched and determined.
Next, the DNA region encoding the polypeptide having the DTA activity determined in this way is cut out with a restriction enzyme, an expression vector is again constructed using this, and expressed in an appropriate host, and the expression product thus obtained is obtained. The activity is finally confirmed after examination.

【００１７】上記のようにして構造解析されたＤＮＡか
ら、ＤＴＡをコードするＤＮＡ以外の領域を除くには、
様々な方法でＤＴＡの合成に不必要な領域を欠失させる
ことによってなすことができる。このような方法として
は、ＢＡＬ３１ヌクレアーゼやエキソヌクレアーゼIII
による欠失法、制限酵素切断サイトを利用した組換え法
などがあげられる。この際、本発明に従えば遺伝子の固
有のプロモーターを他のものに変更したり、部位特異的
変異を導入してプロモーターの強度を変化させること
が、現在の遺伝子操作技術を用いることにより、容易に
行いうる。従って、そのように一部を変更したＤＮＡ断
片であっても、ＤＴＡ活性を示すポリペプチドをコード
するＤＮＡを含むＤＮＡ断片であれば、全て本発明に含
まれることは明白である。To remove a region other than the DNA encoding DTA from the DNA subjected to the structural analysis as described above,
This can be done in various ways by deleting regions unnecessary for DTA synthesis. Such methods include BAL31 nuclease and exonuclease III
And a recombination method using a restriction enzyme cleavage site. At this time, according to the present invention, it is easy to change the promoter specific to the gene to another or to change the strength of the promoter by introducing a site-specific mutation by using current gene manipulation techniques. Can be performed. Therefore, it is apparent that even a DNA fragment partially modified as described above is included in the present invention as long as it is a DNA fragment containing a DNA encoding a polypeptide exhibiting DTA activity.

【００１８】また、本発明のＤＴＡ活性を示すポリペプ
チドをコードするＤＮＡを含むＤＮＡ断片としては、Ｄ
ＴＡ活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡに加え
て、その遺伝子を生体内で発現させるのに重要な役割を
担う制御領域、例えば、遺伝子の転写プロモーター、リ
ボソーム結合部位、転写のターミネーターなどをコード
するＤＮＡをも含んだものがあげられる。The DNA fragment containing the DNA encoding the polypeptide having DTA activity of the present invention includes D
In addition to a DNA encoding a polypeptide exhibiting a TA activity, it encodes a control region that plays an important role in expressing the gene in vivo, such as a gene transcription promoter, ribosome binding site, transcription terminator, etc. Those containing DNA are also included.

【００１９】本発明に従えば、一旦そのＤＴＡ活性を有
するポリペプチドをコードするＤＮＡの塩基配列が明ら
かにされることにより、その機能を損なわない範囲でそ
の塩基の置換あるいは欠失を当該分野においてよく知ら
れた方法を適用して容易に行なうことができる。例え
ば、相当するアミノ酸をコードする遺伝暗号の縮重を利
用したもの、生物の遺伝暗号の利用率を考慮した変換あ
るいはＤＴＡの機能に悪影響を及ぼさないようなアミノ
酸配列の変換のための塩基の置換、付加または欠失処理
などがあげられる。更にまた、このような改変のうちに
は、ＤＴＡの活性中心のみを保存し、その他の部分を大
幅に変化させるようにそのＤＮＡの配列及び長さをかえ
ることも含まれる。したがって、本発明のＤ−スレオニ
ンアルドラーゼをコードするＤＮＡとしては、以上のよ
うな改変を施したものすべてが含まれることは当業者で
あれば容易に理解し得るところのものである。According to the present invention, once the nucleotide sequence of the DNA encoding the polypeptide having the DTA activity is determined, substitution or deletion of the nucleotide can be performed in the art without impairing its function. This can be easily performed by applying a well-known method. For example, conversion using the degeneracy of the genetic code encoding the corresponding amino acid, conversion in consideration of the utilization rate of the genetic code of an organism, or base substitution for amino acid sequence conversion that does not adversely affect the function of DTA , Addition or deletion treatment. Still further, such modifications include conserving only the active center of DTA and altering the sequence and length of the DNA such that the other portions are significantly altered. Therefore, it can be easily understood by those skilled in the art that the DNA encoding the D-threonine aldolase of the present invention includes all DNAs modified as described above.

【００２０】以上のような事情に鑑み、本発明のＤ−ス
レオニンアルドラーゼをコードするＤＮＡは、本発明の
思想を実質的に利用して得られ、本発明のＤＮＡと実質
的に同一の機能を有するものすべてを含有するものであ
る。In view of the above circumstances, the DNA encoding D-threonine aldolase of the present invention can be obtained by substantially utilizing the concept of the present invention, and has substantially the same function as the DNA of the present invention. It contains all that it has.

【００２１】（３）ＤＴＡ遺伝子を持つ組換え体ＤＮＡ
の作製 ＤＴＡの合成に関与する遺伝情報を担うＤＮＡを含む断
片から、適当な手段を施してＤＮＡ合成に不必要な領域
を欠失させたＤＮＡは、それを適当なベクターＤＮＡに
再び組み込むことにより、宿主細胞に再び導入すること
が出来る。本発明の上記ＤＴＡをコードするＤＮＡを宿
主細胞に導入し、そしてそれをその導入された宿主細胞
内で発現させるために用いられるベクターＤＮＡとして
は、適当な宿主細胞内で、ＤＴＡ遺伝子を発現できるも
のであれば特に制限なく使用し得る。(3) Recombinant DNA having DTA gene
Preparation of DNA from a fragment containing a DNA carrying the genetic information involved in the synthesis of DTA and deleting a region unnecessary for DNA synthesis by appropriate means, can be re-incorporated into an appropriate vector DNA. Can be reintroduced into the host cell. The vector DNA used to introduce the DNA encoding the DTA of the present invention into a host cell and express it in the host cell into which the DTA gene is introduced can express the DTA gene in an appropriate host cell. Anything can be used without particular limitation.

【００２２】このようなベクターＤＮＡとしては、上記
ＤＴＡをコードするＤＮＡを組み込むことの出来るもの
であり、組換えたベクターＤＮＡで宿主細胞を形質転換
できるものであり、そして得られた形質転換体の細胞内
で導入されたＤＴＡをコードするＤＮＡの発現ができる
ものであれば特に限定されず、如何なるものも使用する
ことが出来る。このようなベクターＤＮＡとしては、宿
主細胞中で自律複製可能であり、さらに組換え宿主細胞
のみを選別できるような適当な選択マーカーなどが付与
されたものがあげられる。さらにまた、このようなベク
ターＤＮＡは公知のベクターＤＮＡ等から当業者が容易
に製造し得るようなものであってもよい。Such a vector DNA is one into which the DNA encoding the above DTA can be incorporated, one into which host cells can be transformed with the recombinant vector DNA, and one of the resulting transformants. There is no particular limitation as long as it can express the DNA encoding DTA introduced into the cells, and any can be used. Examples of such vector DNAs include those that are capable of autonomous replication in a host cell, and are provided with an appropriate selection marker or the like so that only recombinant host cells can be selected. Furthermore, such a vector DNA may be one that can be easily produced by those skilled in the art from a known vector DNA or the like.

【００２３】このようなベクターＤＮＡとしては、例え
ばプラスミドベクター、ファージベクター、コスミドベ
クターから選ばれたものがあげられる。また、このよう
なベクターＤＮＡは他の宿主株との間で遺伝子交換が可
能なシャトルベクターであってもよいし、ランナウェイ
ベクターやスリーパーベクターなど遺伝子産物の発現効
率を向上せしめるために特別に工夫されたものであって
もよい。さらに、このようなベクターＤＮＡは、ｌａｃ
ＵＶ５プロモーター、ｔｒｐプロモーター、ｔａｃプロ
モーター、ｌｐｐプロモーター、ｔｕｆＢプロモータ
ー、ｒｅｃＡプロモーター、Ｐ_L プロモーター等の制御
因子を適宜付与されたものであってもよい。このような
形質発現などに係わる因子等を導入するためには、遺伝
子組換え技術の分野でよく知られた方法を適宜選択して
適用することにより行うことができる。Examples of such vector DNA include those selected from plasmid vectors, phage vectors and cosmid vectors. Such a vector DNA may be a shuttle vector capable of gene exchange with another host strain, or specially devised to improve the expression efficiency of a gene product such as a runaway vector or a sleeper vector. May be done. In addition, such vector DNAs are
UV5 promoter, trp promoter, tac promoter, lpp promoter, tufB promoter, recA promoter, may be one which is appropriately granted control factors such as P _L promoter. In order to introduce such factors relating to the expression of a trait or the like, a method well known in the field of gene recombination technology can be appropriately selected and applied.

【００２４】ここで使用することのできるベクターＤＮ
Ａの代表的なものは、宿主細胞によっても異なるが、ｐ
ＢＲ３２８（Ｍｕｒｏｏｋａ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａ
ｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９（７），４４０６（１９８
７））、ｐＲＫ２０１３などのヘルパープラスミドと共
に用いられるｐＲＫ２９０（Ｇ．Ｄｉｔｔａ，ｅｔ ａ
ｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳ
Ａ ７７（１２）、７３４７−７３５１（１９８０））
などがあげられる。The vector DN which can be used here
The typical example of A differs depending on the host cell.
BR328 (Murooka, et al., J. Ba.
cterol. , 169 (7), 4406 (198
7)), pRK290 (G. Ditta, et a) used with a helper plasmid such as pRK2013.
l. Proc. Natl. Acad. Sci. , US
A 77 (12), 7347-7351 (1980))
And so on.

【００２５】上記ベクターＤＮＡに、上記ＤＴＡをコー
ドするＤＮＡを組み込むには、まず、上記ベクターＤＮ
Ａに適当な制限酵素を作用させ、得られたベクターＤＮ
Ａ断片を、上記ＤＴＡをコードするＤＮＡ断片とを混合
し、これにＤＮＡリガーゼを作用させることによりなし
うる。この際、必要に応じ当該分野で知られたリンカー
付与、ブラントエンド化等の処理を加えることもでき
る。このようにして得られた組換え体ＤＮＡは次に適当
な宿主細胞の中に導入される。To incorporate the DNA encoding the DTA into the vector DNA, first, the vector DN
A is treated with an appropriate restriction enzyme to obtain the resulting vector DN.
The fragment A can be obtained by mixing the DNA fragment encoding DTA with the above-mentioned DTA and reacting it with DNA ligase. At this time, if necessary, a treatment known in the art, such as provision of a linker or blunt end, can be added. The recombinant DNA thus obtained is then introduced into a suitable host cell.

【００２６】（４）複数のＤＴＡ遺伝子を持つ組換え体
ＤＮＡの作製 同一のプラスミド上に複数のＤＴＡ遺伝子、すなわち上
記ＤＴＡをコードするＤＮＡを組み込めば、より良好な
結果が得られる。複数のＤＴＡ遺伝子を組み込む際のそ
の様式は、固有のプロモーターを持つＤＴＡ遺伝子が複
数個導入されていてもよいし、複数のＤＴＡ遺伝子がポ
リシストロニックに転写されるオペロンとして導入され
ていてもよいし、またこれらの組み合わせであってもよ
い。(4) Preparation of Recombinant DNA Having a Plurality of DTA Genes A better result can be obtained by incorporating a plurality of DTA genes, ie, DNAs encoding the above DTA, into the same plasmid. The manner of incorporating a plurality of DTA genes may be such that a plurality of DTA genes having unique promoters may be introduced, or a plurality of DTA genes may be introduced as an operon to be transcribed polycistronically. Or a combination of these.

【００２７】固有のプロモーターを持つＤＴＡ遺伝子を
導入する方法では、導入可能な任意の位置にランダムに
導入してもよいし、一群のクラスターとして導入しても
よい。その際、遺伝子を導入する順序や遺伝子の方向性
は特に問題とはならない。また、ＤＴＡ遺伝子をオペロ
ンとして導入する方法では、プロモーターからの転写方
向に対してＤＴＡ遺伝子をタンデムに配置することが望
ましい。いずれの方法においてもＤＴＡ遺伝子を効率よ
く発現させるために重要な役割を担う制御領域、例えば
遺伝子の転写プロモーター、リボソーム結合部位、転写
のターミネーターなどをコードするＤＮＡが適当な位置
に配置されていることが必要であることは言うまでもな
い。In the method of introducing a DTA gene having a unique promoter, the DTA gene may be introduced randomly at any position where it can be introduced, or may be introduced as a group of clusters. At this time, the order of introducing the genes and the direction of the genes are not particularly problematic. In the method of introducing the DTA gene as an operon, it is desirable to arrange the DTA gene in tandem with respect to the direction of transcription from the promoter. In any method, a DNA encoding a control region that plays an important role in efficiently expressing the DTA gene, for example, a DNA encoding a gene transcription promoter, a ribosome binding site, a transcription terminator, and the like, is arranged at an appropriate position. Needless to say, it is necessary.

【００２８】導入する遺伝子の数に特に制限はなく、組
換え体ＤＮＡ及びそれを含む形質転換体の安定性を損な
わない範囲であればよい。組換え体ＤＮＡを作製する場
合、このための技術としては制限酵素による切断、リガ
ーゼによる連結、化学合成ＤＮＡの利用、ヌクレアーゼ
による欠失、部位特異的変異による塩基置換など、通常
の遺伝子操作で用いられる技術を適宜選択して適用する
ことにより行なうことができるが、この際に、プロモー
ターの変更やその他のＤＴＡ遺伝子を発現させるための
塩基配列の改変を行ってもよい。このようにして得られ
た組換え体ＤＮＡは次に適当な宿主細胞の中に導入され
る。The number of genes to be introduced is not particularly limited, and may be any range as long as the stability of the recombinant DNA and the transformant containing the same is not impaired. In the case of producing recombinant DNA, techniques used for this purpose include conventional gene manipulation such as restriction enzyme digestion, ligation using ligase, use of chemically synthesized DNA, nuclease deletion, and base substitution due to site-specific mutation. The technique can be carried out by appropriately selecting and applying the technique to be used. In this case, the promoter may be changed or the base sequence for expressing other DTA genes may be modified. The recombinant DNA thus obtained is then introduced into a suitable host cell.

【００２９】（５）組換え体ＤＮＡの宿主細胞への導入 上記のようにして作製した組換え体ＤＮＡを導入するた
めの宿主細胞としては、上で得られた組換えベクターで
もって形質転換されて、ＤＴＡ遺伝子を発現させること
ができるようなものであれば、特に制限なく使用するこ
とが出来る。このような宿主細胞としては、本発明の目
的に沿ってＤＴＡ遺伝子の発現を達成し得る限り、グラ
ム陰性菌あるいはグラム陽性菌の区別なく、さらには、
下等細胞あるいは高等細胞の区別なく、動物由来細胞で
あろうと植物由来細胞であろうと使用できる。(5) Introduction of Recombinant DNA into Host Cells As host cells into which the recombinant DNA prepared as described above is introduced, the host is transformed with the recombinant vector obtained above. As long as it can express the DTA gene, it can be used without particular limitation. As such a host cell, as long as the expression of the DTA gene can be achieved for the purpose of the present invention, Gram-negative bacteria or Gram-positive bacteria can be distinguished.
The cells can be used regardless of whether they are animal-derived cells or plant-derived cells, regardless of whether they are lower cells or higher cells.

【００３０】ここで使用することのできる宿主細胞とし
ては、本発明のＤＴＡをコードするＤＮＡの発現が達成
され得るものがあげられ、このような宿主細胞として
は、大腸菌、キサントモナス属細菌、アセトバクター属
細菌、シュードモナス属細菌、グルコノバクター属細
菌、アゾトバクター属細菌、リゾビウム属細菌、アルカ
リゲネス属細菌、クレブシエラ属細菌、サルモネラ属細
菌及びセラチア属細菌から選ばれたものがあげられる。Examples of the host cell that can be used herein include those capable of achieving expression of the DNA encoding the DTA of the present invention. Examples of such host cells include Escherichia coli, Xanthomonas bacteria, and Acetobacter. Genus, Pseudomonas, Gluconobacter, Azotobacter, Rhizobium, Alcaligenes, Klebsiella, Salmonella, and Serratia.

【００３１】ここで使用することの好ましい宿主細胞と
しては、例えば大腸菌及びキサントモナス属細菌があげ
られる。上記組換え体ＤＮＡを用いて上記宿主細胞を形
質転換などをするにあたっては、ＤＮＡ組換技術におい
て広く知られた方法を適用して行うことができる。この
ような方法としては、宿主細胞をコンピテント（ｃｏｍ
ｐｅｔｅｎｔ）状態にして形質転換用緩衝液中で組換え
体ＤＮＡと混合するとか、ヘルパー・プラスミドを用い
て接合伝達により移入するなどの方法があげられる。Preferred host cells for use herein include, for example, Escherichia coli and bacteria of the genus Xanthomonas. Transformation of the above host cells using the above recombinant DNA can be performed by applying a method widely known in the art of DNA recombination. Such methods include host cells being made competent (com
and mixing with the recombinant DNA in a transformation buffer, or transferring by conjugative transfer using a helper plasmid.

【００３２】（６）形質転換体によるＤＴＡの製造 本発明により得られたＤＴＡ産生形質転換体は、それを
栄養培地中で培養せしめられ、次に得られた培養物をそ
のままＤＴＡ含有物として、あるいは培養物中からＤＴ
Ａを単離して、Ｄ−スレオニンあるいはその誘導体の合
成に用いることが出来る。ＤＴＡ産生形質転換体は、適
当な栄養培地中で培養することにより、それを大量に得
ることができる。培養に用いられる培地は微生物の生育
に必要な炭素源、窒素源、無機物質等を含む通常の培地
である。更に、ビタミン、アミノ酸等の有機微量栄養素
を添加すると望ましい結果が得られる場合が多い。培養
は、好気的条件下でｐＨ４〜１０、温度２０〜６０℃の
任意の範囲に制御して１〜１０日間培養を行えばよい。
形質転換体を用いる場合、使用する菌株に応じてアンピ
シリン、クロラムフェニコール等の抗生物質を培養液に
添加してもよい。(6) Production of DTA Using Transformant The DTA-producing transformant obtained according to the present invention is cultured in a nutrient medium, and the resulting culture is directly used as a DTA-containing substance. Alternatively, DT from the culture
A can be isolated and used for the synthesis of D-threonine or a derivative thereof. DTA-producing transformants can be obtained in large amounts by culturing them in an appropriate nutrient medium. The medium used for the culture is a usual medium containing a carbon source, a nitrogen source, an inorganic substance, and the like necessary for the growth of the microorganism. Further, the addition of organic micronutrients such as vitamins and amino acids often provides desirable results. The cultivation may be carried out under aerobic conditions at pH 4 to 10 and at a temperature in the range of 20 to 60 ° C. for 1 to 10 days.
When a transformant is used, an antibiotic such as ampicillin or chloramphenicol may be added to the culture solution depending on the strain used.

【００３３】大量に培養して得たＤＴＡ産生形質転換体
の細胞あるいはその培養液よりのＤＴＡの単離精製にあ
たっては、特公昭６４−１１２７９号に記載の方法と類
似の方法が使用できるほか、その産生量が非常に高いこ
とからより簡便な方法が利用できる。このような方法を
行うには、まず、生物体を機械的方法、酵素処理方法、
自己溶解法、超音波処理法などの方法によって破壊し、
粗抽出液を得、ついでこれを硫酸アンモニウム、リン酸
ナトリウムなどの塩析剤あるいはアセトン又はエタノー
ルなどの溶媒による蛋白質沈澱法、電気泳動法、ゲル濾
過法あるいは分子ふるいクロマトグラフィー法、限外濾
過法、逆相クロマトグラフィー法、高速液体クロマトグ
ラフィー法、イオン交換クロマトグラフィー法、アフィ
ニティクロマトグラフィー法、吸着クロマトグラフィー
法、などの方法を単独あるいは適宜組み合わせて用いて
適用することにより行うことが出来る。For isolation and purification of DTA from cells of a DTA-producing transformant obtained by culturing in a large amount or a culture thereof, a method similar to that described in JP-B 64-11279 can be used. Since the production amount is very high, a simpler method can be used. In order to carry out such a method, first, an organism is subjected to a mechanical method, an enzymatic treatment method,
Destruction by methods such as self-dissolution method, sonication method,
A crude extract was obtained, and then this was subjected to protein precipitation using a salting-out agent such as ammonium sulfate or sodium phosphate or a solvent such as acetone or ethanol, electrophoresis, gel filtration or molecular sieve chromatography, ultrafiltration, The method can be carried out by applying a method such as a reversed phase chromatography method, a high performance liquid chromatography method, an ion exchange chromatography method, an affinity chromatography method, an adsorption chromatography method or the like, alone or in an appropriate combination.

【００３４】（７）Ｄ−β−オキシアミノ酸の製造 こうして得られた組換えＤＴＡは特開昭５８−１１６６
９０号に記載されたようにしてグリシンとアセトアルデ
ヒドなどのアルデヒド化合物からＤ−スレオニンなどの
Ｄ体のβ−オキシアミノ酸を製造する際に、従来自然界
に見出されている非組換え微生物のＤＴＡと同様にして
用いることができるが、本発明によれば大量かつ高純度
でそのＤＴＡを製造しうるものであることから、こうし
て得られたＤＴＡを用いることにより目的Ｄ−スレオニ
ン類を製造する方法としては大変に優れている。(7) Production of D-β-oxyamino acid The recombinant DTA thus obtained is disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No. 58-1166.
No. 90, when a D-form β-oxyamino acid such as D-threonine is produced from glycine and an aldehyde compound such as acetaldehyde, DTA of a non-recombinant microorganism conventionally found in nature is used. Although it can be used in the same manner, according to the present invention, the DTA can be produced in a large amount and with high purity. Therefore, the method of producing the target D-threonine by using the DTA thus obtained is Is very good.

【００３５】また、従来自然界に見出されているＤＴＡ
生産性微生物では、Ｌ−アロスレオニンアルドラーゼを
も同時に産生しているために、グリシンとアルデヒド類
からＤ−β−オキシアミノ酸類を製造しようとする場
合、Ｌ−アロ−β−オキシアミノ酸の副生を避けるため
にＬ−アロスレオニンアルドラーゼを分離するか、選択
的に不活性化させることが必要であった。本発明に従っ
て組換えにより得られた微生物では、ＤＴＡのみを大量
に製造することが出来るので、Ｄ−スレオニン類を製造
する際に、宿主の産生するＬ−アロスレオニンアルドラ
ーゼ活性を除去するという繁雑な操作を大巾に省くこと
が出来る。Further, DTA conventionally found in the natural world
Since L-arothreonine aldolase is also produced simultaneously in a producing microorganism, when producing D-β-oxyamino acids from glycine and aldehydes, by-products of L-allo-β-oxyamino acid are produced. It was necessary to separate or selectively inactivate L-arothreonine aldolase in order to avoid. In the microorganism obtained by recombination according to the present invention, DTA alone can be produced in large quantities, so that when producing D-threonines, the complicated method of removing L-arothreonine aldolase activity produced by the host is required. Operation can be largely omitted.

【００３６】この方法で用いられるアルデヒド化合物と
しては一般式Ｒ−ＣＨＯ（式中Ｒは水素原子、置換又は
非置換の脂肪族基、脂環式基、芳香族基、又複素環式基
を表わす）で示されるアルデヒド化合物があげられる。
本方法で使用される酵素は、酵素活性を発揮し得る形態
であればよく、必ずしも単離されたものに限定されな
い。また該酵素は、半精製品でもよく粗抽出液、さらに
は培養物、生物体、凍結乾燥生物体、アセトン乾燥生物
体、あるいはそれら生物体の磨砕物等であってもよい。
さらにそれは、酵素自体あるいは生物体のまま公知の手
段で固定化されて用いられてもよい。The aldehyde compound used in this method is represented by the general formula R-CHO (where R represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted aliphatic group, an alicyclic group, an aromatic group, or a heterocyclic group). )).
The enzyme used in the present method may be in any form capable of exhibiting the enzyme activity, and is not necessarily limited to an isolated one. The enzyme may be a semi-purified product, a crude extract, a culture, an organism, a lyophilized organism, an acetone-dried organism, or a ground product of such organism.
Furthermore, it may be used by immobilizing the enzyme itself or the organism as it is by a known means.

【００３７】また、反応温度は１０〜７０℃、好ましく
は２０〜５０℃である。反応時のｐＨは６〜９．５、好
ましくは７〜８に維持する。本反応はバッチ方式で行っ
てもよく、連続方式で行っもよい。更に、本反応は任意
の時間だけ反応を行わせることによってなしうるが、好
適には１〜５０時間、より好ましくは５〜３０時間反応
を行うのがよい。反応終了後は、適宜濃縮、遠心分離、
濾過などの処理を施して懸濁物等を除去してから、イオ
ン交換樹脂処理、晶析等で精製し、必要に応じ活性炭な
どで脱色処理することにより、目的Ｄ−β−ヒドロキシ
アミノ酸を得ることが出来る。The reaction temperature is 10 to 70 ° C., preferably 20 to 50 ° C. The pH during the reaction is maintained at 6 to 9.5, preferably 7 to 8. This reaction may be performed in a batch mode or a continuous mode. Further, this reaction can be carried out by allowing the reaction to proceed for an arbitrary time, but it is preferable to carry out the reaction preferably for 1 to 50 hours, more preferably 5 to 30 hours. After completion of the reaction, concentration, centrifugation,
After subjecting to a treatment such as filtration to remove the suspension and the like, the product is purified by ion-exchange resin treatment, crystallization, etc., and if necessary, decolorized with activated carbon or the like to obtain the desired D-β-hydroxy amino acid. I can do it.

【００３８】本方法で使用される酵素は、天然のＤＴＡ
のペプチド配列と一致するもののみに限定されず、遺伝
子変換及び遺伝子組換えの手法で得られるＤＴＡ活性を
示すものすべてを言うものと解すべきである。従って、
本方法で使用できる組換えＤＴＡは、天然のＤＴＡのペ
プチド配列中のアミノ酸の欠失したもの、あるいはその
ペプチド配列中のアミノ酸が他のアミノ酸で置き換えら
れたものをも包含する。The enzyme used in the present method is a natural DTA
It is to be understood that the present invention is not limited to those which correspond to the peptide sequence described above, but refers to all that show the DTA activity obtained by the gene conversion and recombination techniques. Therefore,
Recombinant DTA that can be used in the present method also includes those in which amino acids in the peptide sequence of natural DTA have been deleted, or those in which amino acids in the peptide sequence have been replaced with other amino acids.

【００３９】本発明に従って、配列表の配列番号１に示
したアミノ酸配列を有し、ＤＴＡ活性を有するポリペプ
チドをコードするＤＮＡを用いて、それをベクターに組
み込んで得られた組換え体ＤＮＡは、それを宿主に導入
して形質転換体を得ても、その形質転換体の生育が親の
宿主の生育に比べて劣ることが少ないばかりでなく、そ
の導入された組換え体ＤＮＡも安定に保持され、欠失あ
るいは脱落により活性を失なうというような欠点がな
い。さらにまた、配列表の配列番号１に示したアミノ酸
配列を有し、ＤＴＡ活性を有するポリペプチドをコード
するＤＮＡは、それが小型のものであることから、その
取り扱いが容易なばかりでなく、ベクター中に複数個組
み込んだり、あるいは強力な発現活性を有する制御配列
と組み合わせることが可能となった。According to the present invention, a recombinant DNA obtained by incorporating a DNA having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and encoding a polypeptide having DTA activity into a vector, However, even if a transformant is obtained by introducing it into a host, the growth of the transformant is not only inferior to the growth of the parent host, but also the introduced recombinant DNA is stably produced. It does not have the drawback that it is retained and loses its activity due to deletion or omission. Furthermore, DNA having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing and encoding a polypeptide having DTA activity is not only easy to handle due to its small size, but also a vector. It has become possible to incorporate a plurality of them into the same or to combine them with a control sequence having a strong expression activity.

【００４０】本発明に従って得られた形質転換体は、優
れた生育性を示すと共に高いＤＴＡ生産性を示すことが
でき、更に安定にＤＴＡ生産性を保持するために有用で
ある。また、本発明に従えば、大量のＤＴＡ生産が可能
であり、またその生産されたＤＴＡの単離精製も容易と
なり、高純度のＤＴＡ製品が得られる。こうして得られ
たＤＴＡを利用することにより、優れたＤ−スレオニン
をはじめとするＤ−β−ヒドロキシアミノ酸の製造法が
提供される。The transformant obtained according to the present invention can exhibit excellent growth and high DTA productivity, and is useful for stably maintaining DTA productivity. Further, according to the present invention, a large amount of DTA can be produced, and the produced DTA can be easily isolated and purified, so that a high-purity DTA product can be obtained. By utilizing the DTA thus obtained, a method for producing excellent D-β-hydroxy amino acids including D-threonine is provided.

【００４１】[0041]

【実施例】【Example】

実施例１ ＤＴＡ遺伝子の塩基配列の決定 組換え体ＤＮＡの調製は、以下説明するようにＢｉｒｎ
ｂｏｉｍ＆Ｄｏｌｙの方法（Ｔ．Ｍａｎｉａｔｉｓ，ｅ
ｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，９
０）に従って行った。ＤＴＡ遺伝子を保持する組換え体
プラスミドＤＮＡを持つ形質転換体ＤＫ−ＥＣ６００
（ｐＤＴ６４８）（微工研菌寄第１１０４９号）を１０
０μｇ／mlのアンピシリンを含む４００mlのＬＢ培地で
一晩培養した。培養液から菌体を集菌し、４mg／mlのリ
ゾチームを含む４mlのグルコース溶液（５０ｍＭグルコ
ース，５ｍＭトリス，１０ｍＭＥＤＴＡ；ｐＨ８．０）
に懸濁して室温で反応させた。８mlのアルカリＳＤＳ溶
液（０．２Ｎ ＮａＯＨ，１％ＳＤＳ）および６mlの酢
酸カリウム溶液（５Ｍ酢酸カリウム；ｐＨ４．８）を順
次添加して穏やかに混和してから氷水中に５分間置い
た。１５，０００rpm で２０分間遠心して沈澱を除去し
た後、１０．８mlのイソプロピルアルコールを添加して
氷中に１０分間静置し、次に１５，０００rpm で２０分
間遠心して上澄みを除去した。８０％エタノール水溶液
を添加して再度遠心した後、減圧下で乾燥した。Example 1 Determination of base sequence of DTA gene Recombinant DNA was prepared by Birn as described below.
The method of boim & Doly (T. Maniatis, e.
t al. , Molecular Cloning, 9
0). Transformant DK-EC600 having recombinant plasmid DNA carrying DTA gene
(PDT648) (Microbial Lab. No. 11049)
The cells were cultured overnight in 400 ml of LB medium containing 0 μg / ml of ampicillin. Cells are collected from the culture solution and 4 ml of a glucose solution containing 4 mg / ml of lysozyme (50 mM glucose, 5 mM Tris, 10 mM EDTA; pH 8.0).
And reacted at room temperature. 8 ml of an alkaline SDS solution (0.2 N NaOH, 1% SDS) and 6 ml of a potassium acetate solution (5 M potassium acetate; pH 4.8) were sequentially added, mixed gently, and then placed in ice water for 5 minutes. After removing the precipitate by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes, 10.8 ml of isopropyl alcohol was added, the mixture was allowed to stand on ice for 10 minutes, and then the supernatant was removed by centrifugation at 15,000 rpm for 20 minutes. After 80% ethanol aqueous solution was added and centrifuged again, it was dried under reduced pressure.

【００４２】ＴＥ緩衝液１０mlを加えて沈澱ペレットを
静かに溶解してから１０mg／mlエチジウム・ブロマイド
１mlを添加し、これに１０．５ｇの塩化セシウムを加え
て静かに溶解した。この溶液を１２，０００rpm で５分
間遠心して沈澱を除去した後、分離用超遠心機（ロータ
ーＲＰＶ４５Ｔ）を用いて４５，０００rpm で１６〜２
０時間遠心分離した。紫外線照射下で閉環状ＤＮＡを含
む画分１mlを注射器で抜取り、ＮａＣｌ飽和イソプロピ
ルアルコールで少なくとも５回処理してエチジウム・ブ
ロマイドを抽出除去した。The precipitate pellet was gently dissolved by adding 10 ml of TE buffer, and then 1 ml of 10 mg / ml ethidium bromide was added, and 10.5 g of cesium chloride was added thereto and gently dissolved. This solution was centrifuged at 12,000 rpm for 5 minutes to remove the precipitate, and then 16 to 2 rpm at 45,000 rpm using an ultracentrifuge for separation (Rotor RPV45T).
Centrifuged for 0 hours. Under ultraviolet irradiation, 1 ml of the fraction containing the closed circular DNA was extracted with a syringe, and treated with NaCl saturated isopropyl alcohol at least five times to extract and remove ethidium bromide.

【００４３】ＴＥ緩衝液２ml、エタノール６mlを順次加
え、−２０℃で１０分間冷却後、１５，０００rpm で２
０分間遠心し、析出・沈澱させた。８０％エタノール水
溶液で洗浄後減圧下に乾燥して４００μリットルのＴＥ
緩衝液に溶解した。ｐＤＴ６４８からＤＴＡ遺伝子を含
む約３．５ＫｂのＳｍａＩ／ＢｇｌII断片を含むＤＮＡ
断片を調製し、エチジウム・ブロマイドを含む１％アガ
ロース・ゲル電気泳動で分離した。目的のＤＮＡ断片を
含むゲルを紫外線照射下で切り出し、常法に従い、ゲル
内部からＤＮＡ断片を抽出・回収した。2 ml of TE buffer and 6 ml of ethanol were sequentially added, and after cooling at -20 ° C. for 10 minutes, 2 ml at 15,000 rpm.
The mixture was centrifuged for 0 minutes to precipitate and precipitate. After washing with an 80% aqueous ethanol solution, it is dried under reduced pressure, and 400 μl of TE
Dissolved in buffer. DNA containing SmaI / BglII fragment of about 3.5 Kb containing DTA gene from pDT648
Fragments were prepared and separated by 1% agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide. The gel containing the target DNA fragment was cut out under ultraviolet irradiation, and the DNA fragment was extracted and recovered from the inside of the gel according to a conventional method.

【００４４】３．５ＫｂのＳｍａＩ／ＢｇｌII断片の一
部を制限酵素で除去したＤＮＡ断片を用いて組換え体Ｄ
ＮＡを作製した。これを導入して得た形質転換体のＤＴ
Ａ活性を調べたところ、ＳｍａＩ／ＥｃｏＴ２２Ｉの約
２．５Ｋｂ上にＤＴＡ遺伝子が局在していることが見い
出された。そこで、代表的な４塩基認識の制限酵素を用
いて詳細な制限酵素切断地図を作製した。そのうちの代
表的な制限酵素切断地図を図１に示す。ＳｍａＩ／Ｅｃ
ｏＴ２２Ｉ ＤＮＡ断片を図１に示した制限酵素で切断
し、Ｍ１３ファージを用いたジデオキシ法により塩基配
列を決定した。この配列を配列表の配列番号１に示す。
決定した塩基配列は２０５３塩基対からなり、下記する
ようにしてＤＴＡ遺伝子の全領域が含まれていることが
確認された。Using a DNA fragment obtained by removing a part of the 3.5 Kb SmaI / BglII fragment with a restriction enzyme,
NA was prepared. DT of transformant obtained by introducing this
When the A activity was examined, it was found that the DTA gene was located about 2.5 Kb above SmaI / EcoT22I. Therefore, a detailed restriction enzyme cleavage map was prepared using a representative restriction enzyme that recognizes four bases. FIG. 1 shows a typical restriction enzyme cleavage map. SmaI / Ec
The oT22I DNA fragment was digested with the restriction enzyme shown in FIG. 1, and the nucleotide sequence was determined by the dideoxy method using M13 phage. This sequence is shown as SEQ ID NO: 1 in the sequence listing.
The determined nucleotide sequence was composed of 2053 base pairs, and it was confirmed that the entire region of the DTA gene was included as described below.

【００４５】塩基配列中には、７５５番目のＡＴＧから
はじまり、１８９２番目のＴＧＡで終わる１１３７塩基
対のＤＴＡに対応するオープンリーディングフレームが
存在する。ＤＴＡのＮ末端アミノ酸を決定するために、
精製酵素のＮ末端アミノ酸配列を次のようにして決定し
た。ＤＴＡ遺伝子を含む形質転換体ＤＫ−ＸＣ３３１１
（ｐＤＴ６４８）（微工研菌寄第１０９７９号）の培養
菌体を超音波破砕後、１ｍＭ塩化マンガン、０．０１ｍ
ＭＰＬＰを含む１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ５．
５）中５５℃で３０分間熱処理した。遠心後上澄をＤＥ
ＡＥイオン交換クロマトグラフィーおよびゲル・パーミ
エーションクロマトグラフィーにより、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動で単一バンドを与えるまで精製し
た。ＤＴＡ活性画分を分取し、逆相カラムクロマトグラ
フィーで単一ピークを与えることを確認した後、プロテ
ィン・シーケンサー（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ４７７Ａ）によりＮ末端の１２個のアミノ酸残基
の配列を決定した。In the nucleotide sequence, there is an open reading frame corresponding to 1137 base pairs of DTA starting from the 755th ATG and ending at the 1892th TGA. To determine the N-terminal amino acid of DTA,
The N-terminal amino acid sequence of the purified enzyme was determined as follows. Transformant DK-XC3311 containing DTA gene
(PDT648) After crushing the cultured cells of (Microtechnological Laboratory No. 10979) with ultrasonic waves, 1 mM manganese chloride, 0.01 m
10 mM HEPES buffer containing MPLP (pH 5.
5) Heat treatment at 55 ° C. for 30 minutes. After centrifugation, remove supernatant
Purified by AE ion exchange chromatography and gel permeation chromatography until SDS polyacrylamide electrophoresis gave a single band. The DTA-active fraction was collected and confirmed to give a single peak by reverse phase column chromatography, and then subjected to a protein sequencer (Applied Biosystem).
The sequence of the N-terminal 12 amino acid residues was determined by ems477A).

【００４６】このアミノ酸配列は、オープン・リーディ
ング・フレームから推定されたＤＴＡのアミノ酸配列中
のＮ末端付近に見い出され、塩基配列上７６７番目から
コードされる１２残基のアミノ酸配列と完全に一致し
た。これにより、ＤＴＡは塩基配列上７６７番目から１
８９１番目までにコードされ、Ｖａｌではじまる、３７
５個のアミノ酸残基からなる分子量３９，３００のタン
パク質であると推定されるが、その分子量はＳＤＳ Ｐ
ＡＧＥにより決定された分子量４２，０００と良好な一
致を示した。This amino acid sequence was found near the N-terminus in the amino acid sequence of DTA deduced from the open reading frame, and was completely consistent with the amino acid sequence of 12 residues encoded from the 767th position in the nucleotide sequence. . As a result, DTA is 1st from the 767th position in the base sequence.
Coded up to 891, starting with Val, 37
The protein is estimated to be a protein consisting of 5 amino acid residues and having a molecular weight of 39,300.
Good agreement with the molecular weight of 42,000 determined by AGE.

【００４７】実施例２ 組換え体ＤＮＡの作製 塩基配列上６４０番目のＡｌｕＩサイトから１９１１番
目のＳａｌＩサイトまでの約１２７０残基のＤＮＡ断片
をファージベクターＭ１３ｍｐ１８のＳｍａＩサイトと
ＳａｌＩサイトの間に組み換えた。常法に従って調製し
た組換え体ＤＮＡを制限酵素ＰｓｔＩで切断して平滑末
端化後ＢａｍＨＩリンカー存在下でＴ４ＤＮＡ Ｌｉｇ
ａｓｅにより連結し、次にそれでもってＪＭ１０９を形
質転換した。常法にしたがって選抜した形質転換体から
調製した組換え体ＤＮＡを制限酵素ＫｐｎＩで切断して
平滑末端化後ＢｇｌIIリンカー存在下で閉環し、次にこ
うして得られたベクターでＪＭ１０９を再度形質転換し
た。この形質転換体から得られた組換え体ＤＮＡを制限
酵素ＢｇｍＨＩとＢｇｌIIで切断し、エチジウム・ブロ
マイドを含む１％アガロース・ゲル電気泳動で分離し、
約１．２Ｋｂの目的のＤＮＡ断片を含むゲルを紫外線照
射下で切り出した。常法に従い、ゲル内部からＤＮＡ断
片を抽出・回収した。Example 2 Preparation of Recombinant DNA A DNA fragment of about 1270 residues from the AluI site at position 640 to the SalI site at position 1911 on the base sequence was recombined between the SmaI site and SalI site of the phage vector M13mp18. . Recombinant DNA prepared according to a conventional method was cleaved with a restriction enzyme PstI and blunt-ended, and then T4 DNA Lig was added in the presence of a BamHI linker.
ligated, and then transformed JM109 with it. Recombinant DNA prepared from a transformant selected in accordance with a conventional method was cut with a restriction enzyme KpnI, blunt-ended, closed in the presence of a BglII linker, and then JM109 was again transformed with the vector thus obtained. . The recombinant DNA obtained from this transformant was cut with restriction enzymes BgmHI and BglII, and separated by 1% agarose gel electrophoresis containing ethidium bromide.
A gel containing the target DNA fragment of about 1.2 Kb was cut out under ultraviolet irradiation. The DNA fragment was extracted and recovered from the inside of the gel according to a conventional method.

【００４８】プラスミド・ベクターｐＢＲ３２８を制限
酵素ＢａｍＨＩで切断し、ＣＩＰ（フォスファターゼ
（ベーリンガーマンハイム社製））による脱リン酸化
後、上で調製した１．２ＫｂのＢａｍＨＩ／ＢｇｌII断
片と混合してＴ４ＤＮＡ Ｌｉｇａｓｅで連結した。こ
うして得られたベクターで大腸菌Ｃ６００のコンピテン
トセルを形質転換し、この形質転換体から得られた組換
え体ＤＮＡの構造を制限酵素で切断後のＤＮＡの電気泳
動パターンにより確認した。このプラスミドをｐＤＴ６
５１と命名した。The plasmid vector pBR328 was digested with the restriction enzyme BamHI, dephosphorylated with CIP (phosphatase (Boehringer Mannheim)), mixed with the 1.2 Kb BamHI / BglII fragment prepared above, and mixed with T4 DNA Ligase. Connected. E. coli C600 competent cells were transformed with the vector thus obtained, and the structure of the recombinant DNA obtained from this transformant was confirmed by the electrophoresis pattern of the DNA after digestion with restriction enzymes. This plasmid is called pDT6
51.

【００４９】実施例３ 複数個の遺伝子を組み込んだ組換え体ＤＮＡ 上で得た形質転換体からプラスミドｐＤＴ６５１を調製
した。ｐＤＴ６５１をＢａｍＨＩで切断、ＣＩＰによる
脱リン酸化後、上で作製したＤＴＡ遺伝子を含む約１．
２ＫｂのＢａｍＨＩ／ＢｇｌII断片を混合後、Ｔ４ＤＮ
Ａ Ｌｉｇａｓｅで連結して大腸菌Ｃ６００のコンピテ
ントセルに形質転換した。Example 3 A plasmid pDT651 was prepared from a transformant obtained on a recombinant DNA having a plurality of genes incorporated therein. After pDT651 was digested with BamHI and dephosphorylated with CIP, about 1.
After mixing the 2 Kb BamHI / BglII fragment, T4DN
The cells were ligated with A Ligase and transformed into competent cells of Escherichia coli C600.

【００５０】得られた組換え体ＤＮＡの構造を、制限酵
素で切断後のＤＮＡの電気泳動パターンにより解析し、
２番目に導入されたＤＴＡ遺伝子が最初に導入されたＤ
ＴＡ遺伝子と同一方向にタンデムに挿入されたものを選
択し、ｐＤＴ６５２と命名した。以下、同様の組換え操
作を繰り返し、ＤＴＡ遺伝子が３個または４個同一方向
にタンデムに挿入された組換え体ＤＮＡを作製し、それ
ぞれｐＤＴ６５３、ｐＤＴ６５４と命名した。The structure of the obtained recombinant DNA was analyzed by an electrophoresis pattern of the DNA after digestion with restriction enzymes,
The second introduced DTA gene is the first introduced D
One inserted in tandem with the TA gene in the same direction was selected and named pDT652. Hereinafter, the same recombination operation was repeated to produce recombinant DNAs in which three or four DTA genes were inserted in the same direction in tandem, and were named pDT653 and pDT654, respectively.

【００５１】実施例４ ＤＴＡ生産菌の育種 以下、上で作製した組換え体ＤＮＡをキサントモナス属
細菌に移入してＤＴＡ産生株を育種した例を具体的に示
す。宿主菌、キサントモナス・シトリーＩＦＯ３３１１
を５０mlのＬＢ培地に接種し、３７℃で２時間４５分培
養した。集菌後直ちに１０mlのコンピテント調製用緩衝
液（５０ｍＭ ＣａＣｌ₂ 、１０ｍＭ ＲｂＣｌ₂ 、
０．１Ｍ ＭＯＰＳ；ｐＨ６．５）に懸濁し、氷中３０
分間静置した。遠心によって上澄みを除去後２．５mlの
同一緩衝液に再懸濁し、氷中で３０分間以上静置した。Example 4 Breeding of DTA-producing Bacteria Hereinafter, an example in which the recombinant DNA prepared above was transferred to a bacterium of the genus Xanthomonas to breed a DTA-producing strain will be specifically described. Host bacteria, Xanthomonas citri IFO 3311
Was inoculated into 50 ml of LB medium and cultured at 37 ° C. for 2 hours and 45 minutes. Immediately after collection, 10 ml of a competent preparation buffer (50 mM CaCl ₂ , 10 mM RbCl ₂ ,
0.1M MOPS; pH 6.5) and suspended in ice for 30 minutes.
Let stand for minutes. After removing the supernatant by centrifugation, the suspension was resuspended in 2.5 ml of the same buffer, and allowed to stand on ice for 30 minutes or more.

【００５２】１０μｇのｐＤＴ６５１〜６５４をそれぞ
れ個別に含む微量遠心チューブに１００μリットルの形
質転換緩衝液（１０％ポリエチレングリコール（分子量
１０００）、１ｍＭ ＥＤＴＡ、１ｍＭ ＭＯＰＳ；ｐ
Ｈ７．２）、２００μリットルのコンピテント・セルを
採取し、混合後氷中に３０分間静置した。３７℃の水浴
で２分間加温した後、０．８mlのＬＢ培地を添加し、３
７℃で１時間培養した。５０μｇ／mlのクロラムフェニ
コールを含むＬＢ寒天培地に０．１mlずつ培養液を塗布
し、一昼夜３７℃で培養した。こうしてｐＤＴ６５１，
ｐＤＴ６５２，ｐＤＴ６５３及びｐＤＴ６５４の各ベク
ターをそれぞれ保有する形質転換体を得た。In a microcentrifuge tube individually containing 10 μg of pDT651-654, 100 μl of a transformation buffer (10% polyethylene glycol (molecular weight: 1000), 1 mM EDTA, 1 mM MOPS;
H7.2), 200 μl of competent cells were collected, mixed, and allowed to stand in ice for 30 minutes. After heating in a 37 ° C. water bath for 2 minutes, 0.8 ml of LB medium was added, and
The cells were cultured at 7 ° C for 1 hour. 0.1 ml of the culture solution was applied to LB agar medium containing 50 μg / ml of chloramphenicol, and cultured at 37 ° C. overnight. Thus pDT651,
A transformant having each of the vectors pDT652, pDT653 and pDT654 was obtained.

【００５３】得られたクロラムフェニコール耐性株が目
的のプラスミドを保持していることを確認し、このうち
それぞれ１株をＤＴＡ活性測定に供した。形質転換体を
５０μｇ／mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地１
００mlに接種し、３７℃で一晩培養した。集菌後、活性
測定用緩衝液（０．０１ｍＭ ＰＬＰ、５ｍＭ ＭｎＣ
ｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ、０．０１Ｍ トリス；ｐＨ７．０）で
洗浄し凍結乾燥した。凍結乾燥菌体４０mgを同緩衝液１
mlに懸濁し、さらに０．００７８％になるまで希釈し
た。あらかじめ保温しておいた基質溶液（５０ｍＭＤ−
スレオニン、２ｍＭ ＭｎＣｌ₂ ・４Ｈ₂ Ｏ、０．０１
ｍＭ ＰＬＰ、０．２Ｍ トリス；ｐＨ７．０）０．２
mlを加えた。It was confirmed that the obtained chloramphenicol-resistant strains contained the desired plasmid, and one strain of each strain was subjected to DTA activity measurement. LB medium 1 containing 50 μg / ml chloramphenicol
Then, the mixture was inoculated into 00 ml and cultured at 37 ° C. overnight. After collection, the activity measurement buffer (0.01 mM PLP, 5 mM MnC
l ₂ · 4H ₂ O, 0.01M Tris; washed and freeze dried pH 7.0). 40 mg of freeze-dried cells was added to the same buffer 1
The suspension was then diluted to 0.0078%. A substrate solution (50 mM D-
Threonine, 2 mM MnCl ₂ .4H ₂ O, 0.01
mM PLP, 0.2 M Tris; pH 7.0) 0.2
ml was added.

【００５４】３０℃で２時間反応させた後、０．４mlの
１Ｎ塩酸を加え反応を停止させた。遠心後上澄み液を
０．２２μのメンブランフィルターで濾過した。各プラ
スミドＤＮＡを持つキサントモナス・シトリーＩＦＯ３
３１１の形質転換体のＤＴＡ活性を、宿主及び遺伝子供
与体と比較して表１に示す。After reacting at 30 ° C. for 2 hours, 0.4 ml of 1N hydrochloric acid was added to stop the reaction. After centrifugation, the supernatant was filtered through a 0.22 µ membrane filter. Xanthomonas citri IFO3 with each plasmid DNA
The DTA activity of the 311 transformant is shown in Table 1 in comparison with the host and gene donor.

【００５５】[0055]

【表１】 [Table 1]

【００５６】実施例５ ＤＴＡ高生産によるＤ−スレオニンの製造 上で育種したＤＴＡ高生産性の形質転換体を５０μｇ／
mlのクロラムフェニコールを含むＬＢ培地５００mlに接
種し、３７℃で一晩培養した。集菌後、０．９％食塩水
を加えて洗浄し凍結乾燥した。Example 5 Production of D-Threonine by High DTA Production
The cells were inoculated into 500 ml of LB medium containing ml of chloramphenicol, and cultured at 37 ° C. overnight. After collection, the cells were washed with 0.9% saline and freeze-dried.

【００５７】アセトアルデヒド５０ｍＭ、グリシン５０
ｍＭ、０．１ｍＭ ＰＬＰおよび１０ｍＭメルトカプト
エタノールを含むｐＨ８．０の０．１Ｍトリス塩酸緩衝
液５００mlよりなる基質溶液に上記乾燥菌体１ｇを加え
３０℃で２０時間反応させた。反応終了後、ＤＮＡ供与
体であるキサントモナス・オリゼーＩＡＭ１６５７およ
び形質転換体ＤＫ−ＸＣ３３１１（ｐＤＴ６４８）と比
較して、溶液中のＤ−スレオニンを定量したところ表２
に示す結果を得た。Acetaldehyde 50 mM, glycine 50
1 g of the dried cells was added to a substrate solution consisting of 500 ml of 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 8.0) containing mM, 0.1 mM PLP and 10 mM meltcaptoethanol, and reacted at 30 ° C. for 20 hours. After completion of the reaction, D-threonine in the solution was quantified in comparison with DNA donor Xanthomonas oryzae IAM1657 and transformant DK-XC3311 (pDT648).
Were obtained.

【００５８】[0058]

【表２】 [Table 2]

【００５９】反応液をＨ⁺ 型のＤｏｗｅｘ５０Ｗ×８を
５００ml充填したカラムに通液し、水洗後０．２Ｎアン
モニアで溶離してスレオニン区分からグリシン区分を分
離した。スレオニン区分を濃縮後活性炭で脱色し、脱色
液にエタノールを添加して結晶を得た。この結晶につい
てＮＭＲ、赤外線吸収スペクトル、元素分析、及び比旋
光度を測定して、この結晶がＤ−スレオニンであること
を確認した。また、ストレプトコッカス・ハエカリスＩ
ＦＯ３１８１を用いたバイオ・アッセイ法により、反応
液中にはＬ−体がまったく含まれていないことを確認し
た。The reaction solution was passed through a column packed with 500 ml of H ⁺ type Dowex 50W × 8, washed with water and eluted with 0.2N ammonia to separate the glycine section from the threonine section. After the threonine fraction was concentrated, the color was decolorized with activated carbon, and ethanol was added to the decolorized solution to obtain crystals. NMR, infrared absorption spectrum, elemental analysis, and specific rotation were measured for this crystal, and it was confirmed that this crystal was D-threonine. In addition, Streptococcus flycaris I
The bioassay method using FO3181 confirmed that the reaction solution contained no L-isomer at all.

【００６０】[0060]

【発明の効果】微生物より単離したＤＴＡ産生遺伝子を
含むＤＮＡの塩基配列を解析することにより、ＤＴＡ産
生に必要で、ベクターに組み込むための遺伝子断片を大
幅に小型化するとともに、複数個の遺伝子のベクターへ
の導入を可能にした。これにより、形質転換体の生育及
び導入した組換え体ＤＮＡの安定性を向上せしめるとと
もにＤＴＡの生産性をも大幅に改善せしめることができ
た。As described above, by analyzing the nucleotide sequence of DNA containing a DTA-producing gene isolated from a microorganism, the gene fragment necessary for DTA production and for integration into a vector can be significantly reduced, and a plurality of genes can be obtained. Was introduced into the vector. As a result, the growth of the transformant and the stability of the introduced recombinant DNA were improved, and the productivity of DTA was also significantly improved.

【配列表】 [Sequence list]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】ＤＴＡ遺伝子を有するＳｍａｌ−ＥｃｏＴ２２
１断片の制限酵素地図の代表例を示す。FIG. 1. Smal-EcoT22 having DTA gene
A representative example of a restriction map of one fragment is shown.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:64） (Ｃ１２Ｐ 13/08 Ｃ１２Ｒ 1:64） (72)発明者 三好 照三 東京都町田市旭町３丁目５番１号 電気 化学工業株式会社総合研究所内 (56)参考文献 特開 平３−139283（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 15/09 ZNA ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ（Ｇ ＥＮＥＴＹＸ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ)──────────────────────────────────────────────────の Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI C12R 1:64) (C12P 13/08 C12R 1:64) (72) Inventor Terumo Miyoshi 3-5 Asahimachi, Machida-shi, Tokyo No. 1 Inside the Research Institute of Denki Kagaku Kogyo Co., Ltd. (56) References JP-A-3-139283 (JP, A) (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁷ , DB name) C12N 15/09 ZNA BIOSIS ( DIALOG) GenBank / EMBL / DDBJ (G ENETYX) MEDLINE (STN)

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡ。1. A DNA having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and encoding a polypeptide having D-threonine aldolase activity. 【請求項２】 配列表の配列番号１に示した塩基配列か
らなる請求項１記載のＤＮＡ。Wherein one nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
Ranaru claim 1 DNA according. 【請求項３】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで
なる組換え体ＤＮＡ。3. A recombinant DNA obtained by incorporating a DNA having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and encoding a polypeptide having D-threonine aldolase activity into a vector. 【請求項４】 配列表の配列番号１に示した塩基配列か
らなるＤＮＡをベクターに組み込んでなる組換えＤＮＡ
である請求項３記載の組換え体ＤＮＡ。Wherein one nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1
Recombinant DNA comprising incorporating a Ranaru DNA in the vectors
The recombinant DNA according to claim 3, which is: 【請求項５】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡあるいは配列表の配列番
号１に示した塩基配列からなるＤＮＡを複数個ベクター
に組み込んでなる請求項３記載の組換え体ＤＮＡ。5. A has the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, a plurality of DNA comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 of DNA or the sequence listing that encodes a polypeptide having D- threonine aldolase activity The recombinant DNA according to claim 3, which is incorporated into a single vector. 【請求項６】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで
なる組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換
体。6. A trait obtained by transforming a recombinant DNA obtained by incorporating a DNA having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and encoding a polypeptide having D-threonine aldolase activity into a vector. Convertible. 【請求項７】 請求項４または５のいずれかに記載の組
換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換体である
請求項６記載の形質転換体。7. The transformant according to claim 6, which is a transformant transformed with the recombinant DNA according to claim 4. 【請求項８】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸配
列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込んで
なる組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換体
を培養し、次に得られたＤ−スレオニンアルドラーゼを
採取することを特徴とするＤ−スレオニンアルドラーゼ
の製造法。8. A trait obtained by transforming a recombinant DNA obtained by incorporating a DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and having a D-threonine aldolase activity into a vector. A method for producing D-threonine aldolase, which comprises culturing the transformant and collecting the obtained D-threonine aldolase. 【請求項９】 該形質転換体が請求項７記載のものであ
る請求項８記載の製造法。9. The method according to claim 8, wherein the transformant is the one according to claim 7. 【請求項１０】 配列表の配列番号１に示したアミノ酸
配列を有し、Ｄ−スレオニンアルドラーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードするＤＮＡをベクターに組み込ん
でなる組換え体ＤＮＡで形質転換せしめられた形質転換
体あるいはその形質転換体処理物を、グリシン及びアル
デヒド化合物と反応せしめ、生成したＤ−β−ヒドロキ
シアミノ酸を採取することを特徴とするＤ−β−ヒドロ
キシアミノ酸の製造法。10. A trait obtained by transforming a recombinant DNA obtained by incorporating a DNA encoding a polypeptide having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 of the sequence listing and having D-threonine aldolase activity into a vector. A process for producing a D-β-hydroxy amino acid, comprising reacting a transformant or a processed product of the transformant with a glycine and an aldehyde compound, and collecting the generated D-β-hydroxy amino acid. 【請求項１１】 該形質転換体が請求項７記載のもので
ある請求項１０記載の製造法。11. The method according to claim 10, wherein the transformant is the one according to claim 7.