JP3173794B2 - タンパク質またはポリペプチド類とその製造法および中間化合物 - Google Patents
タンパク質またはポリペプチド類とその製造法および中間化合物Info
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 この発明は、生理活性物質として、またはその中間体
化合物として有用な新規なポリエチレングリコール誘導
体との結合において修飾されたタンパク質またはポリペ
プチド類、並びにその製造法と、中間化合物である反応
性ポリエチレングリコール誘導体に関するものである。
化合物として有用な新規なポリエチレングリコール誘導
体との結合において修飾されたタンパク質またはポリペ
プチド類、並びにその製造法と、中間化合物である反応
性ポリエチレングリコール誘導体に関するものである。
背景技術 近年 生理活性を持つタンパク質、ポリアミノ酸、ペ
プチド類が数多く見出され、それらの医薬品への応用が
期待されている。しかしながら、これらのタンパク質ま
たはペプチド類物質は、生体内に投与された際の血中半
減期が短く、十分な薬理効果が得られる例は極めて少な
い。そのため、これらの物質を医薬品として利用するた
めには、何らかの方法により生体内挙動を改善すること
が必要不可欠であると考えられている。
プチド類が数多く見出され、それらの医薬品への応用が
期待されている。しかしながら、これらのタンパク質ま
たはペプチド類物質は、生体内に投与された際の血中半
減期が短く、十分な薬理効果が得られる例は極めて少な
い。そのため、これらの物質を医薬品として利用するた
めには、何らかの方法により生体内挙動を改善すること
が必要不可欠であると考えられている。
生体内、特に血流中に投与された生理活性物質の多く
は、腎臓における糸球体濾過により体内から消失するこ
とが知られている。この糸球体濾過過程は、原理的に分
子篩の一種であると考えることができ、生体内に不可欠
な血漿タンパク質であるアルブミンの分子量（約６万）
よりも小さな分子量の物質は原則として***されること
になる。このため、本来糸球体濾過により生体内より消
失するタンパク質またはペプチド性薬物の生体内挙動を
改善するためには、各種化学修飾により薬物そのものの
分子量を増大させることが必要であると考えられてき
た。
は、腎臓における糸球体濾過により体内から消失するこ
とが知られている。この糸球体濾過過程は、原理的に分
子篩の一種であると考えることができ、生体内に不可欠
な血漿タンパク質であるアルブミンの分子量（約６万）
よりも小さな分子量の物質は原則として***されること
になる。このため、本来糸球体濾過により生体内より消
失するタンパク質またはペプチド性薬物の生体内挙動を
改善するためには、各種化学修飾により薬物そのものの
分子量を増大させることが必要であると考えられてき
た。
このようなタンパク質またはペプチド性薬物の生体内
挙動を改善する方法としては、従来、ポリエチレングリ
コール（以下PEGと記載することがある）に代表される
水溶性高分子による化学修飾が多く試みられてきた。こ
のPEGの歴史は古く、1859年に合成されて以来、各分野
において幅広く利用、研究されてきた物質であって、生
化学および医薬品の分野においても、このPEGはタンパ
ク質に対して物理的な立体障害以外の相互作用を与え
ず、高濃度PEG水溶液中でもタンパク質のCDスペクトル
に変化は認められないことが確認されている。このこと
は、PEGで修飾することによりタンパク質の高次構造は
破壊されないことを示している。また、たとえばイヌの
静脈に分子量4000のPEGの90mg/kg/dayで１年間投与して
も、体重、病理学的あるいは血液学的検査で異常は認め
られていない。さらにモルモットにPEGを投与してもア
レルギー症状を起こさないことから、その安全性が確認
されている。このため、以上の通りの特徴のある性質を
有するPEGでタンパク質を修飾することにより、免疫系
の認識はもちろんのこと、細網内皮系にも認識されにく
く、生体内寿命の長いタンパク質またはペプチド性薬物
の開発が可能になるものと期待されている。
挙動を改善する方法としては、従来、ポリエチレングリ
コール（以下PEGと記載することがある）に代表される
水溶性高分子による化学修飾が多く試みられてきた。こ
のPEGの歴史は古く、1859年に合成されて以来、各分野
において幅広く利用、研究されてきた物質であって、生
化学および医薬品の分野においても、このPEGはタンパ
ク質に対して物理的な立体障害以外の相互作用を与え
ず、高濃度PEG水溶液中でもタンパク質のCDスペクトル
に変化は認められないことが確認されている。このこと
は、PEGで修飾することによりタンパク質の高次構造は
破壊されないことを示している。また、たとえばイヌの
静脈に分子量4000のPEGの90mg/kg/dayで１年間投与して
も、体重、病理学的あるいは血液学的検査で異常は認め
られていない。さらにモルモットにPEGを投与してもア
レルギー症状を起こさないことから、その安全性が確認
されている。このため、以上の通りの特徴のある性質を
有するPEGでタンパク質を修飾することにより、免疫系
の認識はもちろんのこと、細網内皮系にも認識されにく
く、生体内寿命の長いタンパク質またはペプチド性薬物
の開発が可能になるものと期待されている。
また、タンパク質またはペプチド性薬物をPEGで修飾
する利点としては、次のことを挙げることができる。す
なわち、未変性のタンパク質が生理学的pH条件で不溶で
あるか、あるいは部分的にのみ可溶な場合、タンパク質
をPEGで修飾することにより生理学的pH条件での溶解性
を大きく改善することが可能となる。そして、未変性タ
ンパク質が示す免疫応答を低下させることも可能であ
る。このため、これまでにも、医薬品等への利用のため
に数多くの種類のタンパク質またはペプチド性薬物がPE
Gで修飾されてきた〔総論に関しては、Inada,Y.Yoshimo
to,T,Matsushima,A and Saito,Y.（1986）Trends Biote
chno.1,4:68−73参照〕。
する利点としては、次のことを挙げることができる。す
なわち、未変性のタンパク質が生理学的pH条件で不溶で
あるか、あるいは部分的にのみ可溶な場合、タンパク質
をPEGで修飾することにより生理学的pH条件での溶解性
を大きく改善することが可能となる。そして、未変性タ
ンパク質が示す免疫応答を低下させることも可能であ
る。このため、これまでにも、医薬品等への利用のため
に数多くの種類のタンパク質またはペプチド性薬物がPE
Gで修飾されてきた〔総論に関しては、Inada,Y.Yoshimo
to,T,Matsushima,A and Saito,Y.（1986）Trends Biote
chno.1,4:68−73参照〕。
たとえば、従来、タンパク質またはペプチド性薬物を
修飾するために利用されてきたPEG誘導体としては、２
−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−4,6−ジク
ロロトリアジン〔Abuchowski,A.,Van Es,T.,P alczuk,
N.C and Davis,F.F.（1977）J.Biol.Chem.252、3578−3
581〕;6−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−Ｓ
−カルボキサミドメチルジチオカーボネート〔King,T.
P.and Weiner,C.（1980）Int.J.Peptide Protein Res.1
6,147−155〕;2−（アルコキシポリエチレングリコキ
シ）−Ｎ−スクシニミジルスクシネート〔Abuchowski,
A.,Kazo,G.M.,Verhoest,C.,Van Es,T.,Kafkewitz,D.,Vi
au,A.and Davis,F.（1984）Cancer Biochem.Biophys.7,
175−186〕;2−（アルコキシポリエチレングリコキシ）
カルボキシイミダゾール〔Beauchamp,C.O.,Gonias,S.
L.,Menapace,D.P.and Pizzo,S.V.（1983）Anal.Bioche
m.131,25−33〕;2−アルコキシポリエチレングリコキ
シ）−2,4,5−トリクロロベンゼン〔Versonese,F.M.,La
rgajolli,R.,Boccu,E.,Benassi,C.A.and Schiavon,O.
（1985）Applied Biochem.Biotech.11,141−152〕;2−
（アルコキシポリエチレングリコキシ）−４−ニトロベ
ンゼン〔Versonese,F,M.,Largajolli,R.,Boccu.E.,Bena
ssi,C.A,and Schiavon,O.（1985）Applied Biochem.Bio
tech.11,141−152〕;2−（アルコキシポリエチレングリ
コキシ）−2,2,2−トリフルオロエタン〔Delgado,C.,Pa
tel,J.N.,Francis,G.B.and Fisher,D.（1990）Biotech.
Applied Biochem.12,119−128〕;2−（アルコキシポリ
エチレンアルデヒド〔Andrews,B.A.,Head,D.M.,Dunthro
ne,P.and Asenjo,J.A.（1990）Biotech.Tech.4,49−5
4〕;2−アルコキシポリエチレングリコキシメチルエポ
キシド〔Andrews,B.A.,Head,D.M.Dunthrone,P.and Asen
jo,J.A.（1990）Biotech,Tech.4,49−54〕などがある。
修飾するために利用されてきたPEG誘導体としては、２
−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−4,6−ジク
ロロトリアジン〔Abuchowski,A.,Van Es,T.,P alczuk,
N.C and Davis,F.F.（1977）J.Biol.Chem.252、3578−3
581〕;6−（アルコキシポリエチレングリコキシ）−Ｓ
−カルボキサミドメチルジチオカーボネート〔King,T.
P.and Weiner,C.（1980）Int.J.Peptide Protein Res.1
6,147−155〕;2−（アルコキシポリエチレングリコキ
シ）−Ｎ−スクシニミジルスクシネート〔Abuchowski,
A.,Kazo,G.M.,Verhoest,C.,Van Es,T.,Kafkewitz,D.,Vi
au,A.and Davis,F.（1984）Cancer Biochem.Biophys.7,
175−186〕;2−（アルコキシポリエチレングリコキシ）
カルボキシイミダゾール〔Beauchamp,C.O.,Gonias,S.
L.,Menapace,D.P.and Pizzo,S.V.（1983）Anal.Bioche
m.131,25−33〕;2−アルコキシポリエチレングリコキ
シ）−2,4,5−トリクロロベンゼン〔Versonese,F.M.,La
rgajolli,R.,Boccu,E.,Benassi,C.A.and Schiavon,O.
（1985）Applied Biochem.Biotech.11,141−152〕;2−
（アルコキシポリエチレングリコキシ）−４−ニトロベ
ンゼン〔Versonese,F,M.,Largajolli,R.,Boccu.E.,Bena
ssi,C.A,and Schiavon,O.（1985）Applied Biochem.Bio
tech.11,141−152〕;2−（アルコキシポリエチレングリ
コキシ）−2,2,2−トリフルオロエタン〔Delgado,C.,Pa
tel,J.N.,Francis,G.B.and Fisher,D.（1990）Biotech.
Applied Biochem.12,119−128〕;2−（アルコキシポリ
エチレンアルデヒド〔Andrews,B.A.,Head,D.M.,Dunthro
ne,P.and Asenjo,J.A.（1990）Biotech.Tech.4,49−5
4〕;2−アルコキシポリエチレングリコキシメチルエポ
キシド〔Andrews,B.A.,Head,D.M.Dunthrone,P.and Asen
jo,J.A.（1990）Biotech,Tech.4,49−54〕などがある。
さらにこのPEG誘導体による修飾に関しては、これま
でにも数多くの特許出願がなされている。その例として
は、たとえば特開昭61−178926号；特開昭61−249388
号；特開平１−316400号；特開平２−117920号；特開平
３−88822号；特開平５−117300号；特開平５−132431
号；特開平５−214092号；特開平５−503092号などがあ
り、これらはいずれもPEGの高い水溶性に着目したもの
であって、そのために、末端の構造は短鎖脂肪族である
ことを特徴としている。
でにも数多くの特許出願がなされている。その例として
は、たとえば特開昭61−178926号；特開昭61−249388
号；特開平１−316400号；特開平２−117920号；特開平
３−88822号；特開平５−117300号；特開平５−132431
号；特開平５−214092号；特開平５−503092号などがあ
り、これらはいずれもPEGの高い水溶性に着目したもの
であって、そのために、末端の構造は短鎖脂肪族である
ことを特徴としている。
しかしながら、一方で、PEG修飾によりタンパク質ま
たはペプチド性薬物の分子量を増大させて生体内挙動を
改善する方法は、利用できる薬物に制限があるものと考
えられる。例を挙げると、従来のPEG修飾により生体内
挙動の改善および薬理効果の増大が確認されているタン
パク質またはペプチド性薬物のほとんどが酵素に限られ
ている点である。そして、この原因としては酵素独特の
薬理効果発現機序のためと考えられている。
たはペプチド性薬物の分子量を増大させて生体内挙動を
改善する方法は、利用できる薬物に制限があるものと考
えられる。例を挙げると、従来のPEG修飾により生体内
挙動の改善および薬理効果の増大が確認されているタン
パク質またはペプチド性薬物のほとんどが酵素に限られ
ている点である。そして、この原因としては酵素独特の
薬理効果発現機序のためと考えられている。
生理活性を有する酵素は、生体に有害な物質もしくは
は腫瘍等の疾病部位において特異的に必要とされる物質
を代謝等の化学反応により特異的に消失させることによ
り効果を発現する。このため酵素のPEG修飾の場合は、
血中に酵素分子を長時間存在させるだけで薬理効果の増
大が可能となる。しかし、このようなPEG修飾により薬
物の分子量を増大させる方法は、酵素以外の全てのタン
パク質またはペプチド性薬物に対して普遍的に適用でき
る方法論ではないことも明らかである。
は腫瘍等の疾病部位において特異的に必要とされる物質
を代謝等の化学反応により特異的に消失させることによ
り効果を発現する。このため酵素のPEG修飾の場合は、
血中に酵素分子を長時間存在させるだけで薬理効果の増
大が可能となる。しかし、このようなPEG修飾により薬
物の分子量を増大させる方法は、酵素以外の全てのタン
パク質またはペプチド性薬物に対して普遍的に適用でき
る方法論ではないことも明らかである。
すなわち、生体内挙動の改善を必要とするタンパク質
またはペプチド性薬物が、薬理効果を発揮するためにレ
セプター等との結合を必要とする場合には、PEG修飾に
よる薬理効果の増大は期待できず、むしろ修飾に用いた
高分子PEGの立体的障害でレセプター結合が阻害される
ことにより、薬理効果が低下する場合が多い。たとえば
Ehrat,M.and Luisi,P.L.（1983）Biopolymer 22,569−5
73においては、薬理効果を発揮するためにレセプター等
と結合するインスリンをPEG修飾した場合、in vivoにお
ける薬理効果は未修飾インスリンの50％まで低下するこ
とが報告されている。
またはペプチド性薬物が、薬理効果を発揮するためにレ
セプター等との結合を必要とする場合には、PEG修飾に
よる薬理効果の増大は期待できず、むしろ修飾に用いた
高分子PEGの立体的障害でレセプター結合が阻害される
ことにより、薬理効果が低下する場合が多い。たとえば
Ehrat,M.and Luisi,P.L.（1983）Biopolymer 22,569−5
73においては、薬理効果を発揮するためにレセプター等
と結合するインスリンをPEG修飾した場合、in vivoにお
ける薬理効果は未修飾インスリンの50％まで低下するこ
とが報告されている。
このため、近年医薬品への応用が期待されているタン
パク質、ポリアミノ酸およびペプチド類の多くは、薬理
効果発現においてレセプター等との結合を必要条件とし
ていることから、今度は、レセプター等の薬理効果発現
部位との結合を阻害しない新規な薬物の生体内挙動改善
の方法、つまり新規な化学修飾のための手段と、この手
段により修飾された薬理活性物質からなる薬剤を実現す
ることが望まれていた。
パク質、ポリアミノ酸およびペプチド類の多くは、薬理
効果発現においてレセプター等との結合を必要条件とし
ていることから、今度は、レセプター等の薬理効果発現
部位との結合を阻害しない新規な薬物の生体内挙動改善
の方法、つまり新規な化学修飾のための手段と、この手
段により修飾された薬理活性物質からなる薬剤を実現す
ることが望まれていた。
発明の開示 この発明は、レセプター等との結合を阻害することの
ない、新しく化学修飾された生理活性物質とその薬剤、
並びにそのための新しい修飾手段を提供することを目的
としている。
ない、新しく化学修飾された生理活性物質とその薬剤、
並びにそのための新しい修飾手段を提供することを目的
としている。
この発明は、以下を提供する： （ａ）分子中の少なくと１個のアミノ基に、次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ− 〔式中、R1は置換基を有してもよいコレステリル基、ｎ
は任意に変わりうる10〜100の整数をそれぞれ示す）で
表されるポリエチレングリコールオキシ基を結合してな
るタンパク質またはポリペプチド類； （ｂ）タンパク質またはポリペプチド類と次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−R2 〔式中、R1は置換基を有してもよいコレステリル基、R2
は次式（ａ）、（ｂ）および（ｃ） （式中、R3はOH、アルコキシ基、アシルオキシ基、ハロ
ゲン原子またはR1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−を示す）のい
ずれかを示し、ｎは任意に変わりうる10〜100の整数を
示す）〕で表される反応性ポリエチレングリコールとを
反応させることからなる分子中の少なくとも１個のアミ
ノ基に、次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ− で表されるポリエチレングリコールオキシ基を結合して
なるタンパク質またはポリペプチド類の製造法； 並びに （ｃ）次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−R2 〔式中、R1は置換基を有してもよいコレステリル基、R2
は次式（ａ）、（ｂ）および（ｃ） （式中、R3はOH、アルコキシ基、アシルオキシ基、ハロ
ゲン原子またはR1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−、ｎは任意に
変わりうる10〜100の整数を示す）〕のいずれかで表さ
れるポリエチレングリコール誘導体。
は任意に変わりうる10〜100の整数をそれぞれ示す）で
表されるポリエチレングリコールオキシ基を結合してな
るタンパク質またはポリペプチド類； （ｂ）タンパク質またはポリペプチド類と次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−R2 〔式中、R1は置換基を有してもよいコレステリル基、R2
は次式（ａ）、（ｂ）および（ｃ） （式中、R3はOH、アルコキシ基、アシルオキシ基、ハロ
ゲン原子またはR1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−を示す）のい
ずれかを示し、ｎは任意に変わりうる10〜100の整数を
示す）〕で表される反応性ポリエチレングリコールとを
反応させることからなる分子中の少なくとも１個のアミ
ノ基に、次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ− で表されるポリエチレングリコールオキシ基を結合して
なるタンパク質またはポリペプチド類の製造法； 並びに （ｃ）次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−R2 〔式中、R1は置換基を有してもよいコレステリル基、R2
は次式（ａ）、（ｂ）および（ｃ） （式中、R3はOH、アルコキシ基、アシルオキシ基、ハロ
ゲン原子またはR1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−、ｎは任意に
変わりうる10〜100の整数を示す）〕のいずれかで表さ
れるポリエチレングリコール誘導体。
すなわち、この発明は、生理活性を持つタンパク質、
ポリアミノ酸およびポリペプチド類の生体内挙動を改善
するための新規PEG誘導体についての検討から導かれた
ものであって、末端にコレステロール構造を有する新規
PEG誘導体を用いる場合には、血中の高分子成分との相
互作用が実現されて薬物の生体内挙動が改善されるとの
知見に基づいて完成されたものであり、従来用いられて
きたタンパク質またはペプチド性薬物のPEG修飾におけ
る問題点である薬物とレセプター等との結合阻害を解消
し、高い薬理活性を示す製剤の開発を可能としている。
ポリアミノ酸およびポリペプチド類の生体内挙動を改善
するための新規PEG誘導体についての検討から導かれた
ものであって、末端にコレステロール構造を有する新規
PEG誘導体を用いる場合には、血中の高分子成分との相
互作用が実現されて薬物の生体内挙動が改善されるとの
知見に基づいて完成されたものであり、従来用いられて
きたタンパク質またはペプチド性薬物のPEG修飾におけ
る問題点である薬物とレセプター等との結合阻害を解消
し、高い薬理活性を示す製剤の開発を可能としている。
図面の簡単な説明 図１は、PEG誘導体修飾インスリンの血中成分と相互
作用インビトロ試験結果を示す。
作用インビトロ試験結果を示す。
図２は、PEG誘導体修飾のSODの血中成分と相互作用イ
ンビトロ試験結果を示す。
ンビトロ試験結果を示す。
図３は、PEG誘導体修飾インスリンの生体内挙動イン
ビボ試験結果を示す。
ビボ試験結果を示す。
図４は、PEG誘導体修飾SODの生体内挙動インビボ試験
結果を示す。
結果を示す。
図５は、PEG誘導体修飾SODの薬理作用インビボ試験結
果を示す。
果を示す。
発明を実施するための最良の形態 この発明のタンパク質またはポリペプチド類は、末端
に前記の通りのコレステロール構造を有する反応性PEG
誘導体およびその生理活性物質修飾体を結合したもので
ある。
に前記の通りのコレステロール構造を有する反応性PEG
誘導体およびその生理活性物質修飾体を結合したもので
ある。
ポリエチレングリコールオキシ基におけるR1は、化学
修飾作用を阻害しない限り任意の置換基を有していても
よいコレステリル基を示しており、たとえば、その置換
基としては、アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル
基、アルコキシル基等の適宜なものとしてもよい。
修飾作用を阻害しない限り任意の置換基を有していても
よいコレステリル基を示しており、たとえば、その置換
基としては、アルキル基、アルケニル基、ヒドロキシル
基、アルコキシル基等の適宜なものとしてもよい。
このポリエチレングリコールオキシ基に結合するR2に
ついては、前記の通りのR3のいずれかの部分構造とする
ことができ、このR3におけるハロゲン原子とは、塩素、
臭素、沃素等を意味してもいる。また、R3は、OH、アル
コキシ基、アシルオキシ基等であってもよい。そして、
ｎは、任意に変わりうる正の整数として、約500以下と
すること、好ましくは200以下、さらには10〜100程度と
するのが好ましい。
ついては、前記の通りのR3のいずれかの部分構造とする
ことができ、このR3におけるハロゲン原子とは、塩素、
臭素、沃素等を意味してもいる。また、R3は、OH、アル
コキシ基、アシルオキシ基等であってもよい。そして、
ｎは、任意に変わりうる正の整数として、約500以下と
すること、好ましくは200以下、さらには10〜100程度と
するのが好ましい。
この発明における前記のPEG誘導体より修飾されたタ
ンパク質またはポリペプチド類の製造法について説明す
ると、タンパク質またはポリペプチド類の使用割合1mol
に対して次式の反応性PEG誘導体を1molもしくはそれ以
上の使用割合において反応させればよい。
ンパク質またはポリペプチド類の製造法について説明す
ると、タンパク質またはポリペプチド類の使用割合1mol
に対して次式の反応性PEG誘導体を1molもしくはそれ以
上の使用割合において反応させればよい。
R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−R2 反応溶媒としては、反応に関与しない溶媒であれば特
に制限されないが、たとえばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液が好まし
い溶媒として挙げられる。またタンパク質またはポリペ
プチド類を失活させることなく、反応に関与しないアセ
トニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミド等の有機溶媒を添加してもよい。また、前記の反応
性PEG誘導体とタンパク質またはポリペプチド類を反応
溶媒に加える順序はどちらが先になってもよく、また同
時であってもよい。
に制限されないが、たとえばリン酸緩衝液、ホウ酸緩衝
液、トリス酸緩衝液、酢酸緩衝液などの緩衝液が好まし
い溶媒として挙げられる。またタンパク質またはポリペ
プチド類を失活させることなく、反応に関与しないアセ
トニトリル、ジメチルスルホキシド、ジメチルホルムア
ミド等の有機溶媒を添加してもよい。また、前記の反応
性PEG誘導体とタンパク質またはポリペプチド類を反応
溶媒に加える順序はどちらが先になってもよく、また同
時であってもよい。
もちろん、反応溶媒は使用しなくてもよい。
反応温度はタンパク質またはポリペプチド類が変性し
ない温度であれば、いずれでもよいが約０゜〜40℃の範
囲が好ましい。
ない温度であれば、いずれでもよいが約０゜〜40℃の範
囲が好ましい。
反応時間は約0.5〜72時間で充分であり、通常は約１
〜24時間程度で反応は充分に進行する。
〜24時間程度で反応は充分に進行する。
反応後は、透析、塩析、限外ろ過、イオン交換クロマ
トグラフィー、電気泳動などの通常のタンパク質または
ポリペプチド類の精製法で精製し、目的とする化学修飾
されたタンパク質またはポリペプチド類を得ることがで
きる。また、アミノ基の修飾の程度は、たとえば酸分解
のあと、アミノ酸分析によって確認することができる。
トグラフィー、電気泳動などの通常のタンパク質または
ポリペプチド類の精製法で精製し、目的とする化学修飾
されたタンパク質またはポリペプチド類を得ることがで
きる。また、アミノ基の修飾の程度は、たとえば酸分解
のあと、アミノ酸分析によって確認することができる。
前記の反応性PEG誘導体については、コレステリン
（別名コレステロール）に存在する３位の水酸基に対
し、ポリエチレンオキシドを反応させて得られたポリエ
チレングリコールモノコレステロールエーテル（以下、
Ｃ−PEG誘導体と略記する）を出発原料として製造する
ことができる。
（別名コレステロール）に存在する３位の水酸基に対
し、ポリエチレンオキシドを反応させて得られたポリエ
チレングリコールモノコレステロールエーテル（以下、
Ｃ−PEG誘導体と略記する）を出発原料として製造する
ことができる。
この、Ｃ−PEGについては市販品（たとえば日本エマ
ルジョン株式会社製）、もしくはこれを合成して使用す
ることができる。
ルジョン株式会社製）、もしくはこれを合成して使用す
ることができる。
すなわち、まず最初に、Ｃ−PEG誘導体を、反応に関
与しない溶媒であれば特に制限されないが、たとえばア
セトニトリル、トルエン、キシレン、ベンゼン、テトラ
ヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジ
メチルホルムアミドなどの有機溶媒中に溶解もしくは懸
濁させたのち、下記一般式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）
で表される化合物のいずれかを、Ｃ−PEG誘導体の使用
割合1molに対し、1molもしくはそれ以上の割合で使用し
て反応させることができる。
与しない溶媒であれば特に制限されないが、たとえばア
セトニトリル、トルエン、キシレン、ベンゼン、テトラ
ヒドロフラン、ジオキサン、ジメチルスルホキシド、ジ
メチルホルムアミドなどの有機溶媒中に溶解もしくは懸
濁させたのち、下記一般式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）
で表される化合物のいずれかを、Ｃ−PEG誘導体の使用
割合1molに対し、1molもしくはそれ以上の割合で使用し
て反応させることができる。
［Ｘは塩素、臭素、沃素等のハロゲン原子を示す。］ トリメチルアミン、トリエチルアミン等の有機塩基触
媒をＣ−PEG誘導体の使用割合１モルに対し、１モルも
しくはそれ以上の割合で使用することができる。
媒をＣ−PEG誘導体の使用割合１モルに対し、１モルも
しくはそれ以上の割合で使用することができる。
水素化ナトリウム、水酸化ナトリウム、水酸化カリウ
ム、無水炭酸ナトリウム等の無機塩基を使用してもよ
く、この場合には、先にＣ−PEG誘導体とともに前記の
溶媒中において、Ｃ−PEG誘導体の水酸基の水素をナト
リウムにより置換させたのち、前記一般式（ａ）、
（ｂ）および（ｃ）の化合物を添加して反応させるのが
好ましい。
ム、無水炭酸ナトリウム等の無機塩基を使用してもよ
く、この場合には、先にＣ−PEG誘導体とともに前記の
溶媒中において、Ｃ−PEG誘導体の水酸基の水素をナト
リウムにより置換させたのち、前記一般式（ａ）、
（ｂ）および（ｃ）の化合物を添加して反応させるのが
好ましい。
反応温度としては、約０゜〜300℃の範囲が望まし
く、特に約10゜〜150℃の範囲が好ましい。
く、特に約10゜〜150℃の範囲が好ましい。
また、反応時間は数分〜24時間程度でよい。
生成した化合物は、抽出、濃縮、再結晶、再沈殿、カ
ラムクロマトグラフィー、蒸留などの通常の化学的処理
によって精製され、前記の反応性PEG誘導体を得ること
ができる。
ラムクロマトグラフィー、蒸留などの通常の化学的処理
によって精製され、前記の反応性PEG誘導体を得ること
ができる。
また、この発明に使用する水溶性のPEG誘導体はその
構造上水酸基を有しているポリエチレングリコール、ポ
リエチレングリコールのホモポリマー類、さらに好まし
くは、水溶性高分子である、ポリエチレングリコールお
よびそれらの誘導体から選択されることが好ましい。
構造上水酸基を有しているポリエチレングリコール、ポ
リエチレングリコールのホモポリマー類、さらに好まし
くは、水溶性高分子である、ポリエチレングリコールお
よびそれらの誘導体から選択されることが好ましい。
この発明に使用する水溶性のPEG誘導体の分子量は特
に限定されないが、100〜100,000であることが好まし
い。さらには、500〜10,000であることが好ましい。
に限定されないが、100〜100,000であることが好まし
い。さらには、500〜10,000であることが好ましい。
そして、この発明で、末端にコレステロール構造を有
するPEG誘導体により修飾されるタンパク質またはペプ
チド類の修飾部位は、アミノ基、特に１級アミノ基であ
ることが好ましい。
するPEG誘導体により修飾されるタンパク質またはペプ
チド類の修飾部位は、アミノ基、特に１級アミノ基であ
ることが好ましい。
末端にコレステロール構造を有するPEG誘導体により
修飾される生理活性物質は、この発明において特にその
種類に限定はないが、特にタンパク質またはペプチド性
薬物である場合は、サブスタンスＰ（視床下部ホルモ
ン）；コルチコトロピン、リポトロピン、メラノトロピ
ン、バソプレッシン（神経下垂体ホルモン）；パラチロ
イドホルモン（甲状腺ホルモン）；サイモポエチン（胸
腺ホルモン）；インスリン、グルカゴン（膵臓ホルモ
ン）；神経成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長
因子、ヒト形質転換発育因子、成長ホルモン放出因子す
なわちCRF、繊維芽細胞増殖因子（成長因子）；セクレ
チン、コレシストキニン、バソアクティブインスチナル
ペプチド、モチリン（胃腸管ホルモン）；ゴナトロピン
（絨毛腺ホルモン）；性腺刺激ホルモン放出ホルモン
（性腺刺激ホルモン）；レラキシン（卵巣ホルモン）；
血液凝固因子イ因子およびウ因子（血友病因子）；スト
レプトキナーゼ、フェブリノリシン、デオキシリボヌク
レアーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（以下、SOD
と略記）、ビリルビンオキシダーゼ、エラスターゼ、ア
スパラギナーゼ（酵素）；組織プラスミノーゲン活性化
因子即ちｔ−PA、ウロキナーゼ（線溶因子）；リンホカ
イン（たとえばインターロイキン）、インターフェロ
ン、顆粒球・コロニー刺激因子即ちＧ−CSF、マクロフ
ァージ・コロニー刺激因子即ちＭ−CSF、顆粒球マクロ
ファージ・コロニー刺激因子即ちGM−CSF（刺激因
子）；エリスロポエチン（増血因子）、カルシトニン、
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ca調節ホルモン）；
心房性ナトリウム利尿ペプチド（利尿ホルモン）；モノ
クローナルおよびポリクローナル抗体；免疫原；酵素阻
害因子；ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジンを含む各
種ポリアミノ酸類；ウィルス由来の細胞膜融合性ペプチ
ド類；スヒストン、プロタミン（遺伝子結合性タンパク
質）および上記タンパク質またはペプチド性薬物と同様
の生理活性を有する類似構造物質が好ましい。これらの
タンパク質またはペプチド性薬物は、それらの天然源ま
たは遺伝子工学的処理を受けた細胞から単離されるか、
あるいは種々のin vitro合成方法を経て作り出されても
よい。なお、上記例示における（ ）内はタンパク質ま
たはペプチド性薬物の主たる用途を示すものである。ま
た、この発明のタンパク質またはペプチド類にはポリア
ミノ酸と総称される各種のアミノ酸が包含されることは
言うまでもない。
修飾される生理活性物質は、この発明において特にその
種類に限定はないが、特にタンパク質またはペプチド性
薬物である場合は、サブスタンスＰ（視床下部ホルモ
ン）；コルチコトロピン、リポトロピン、メラノトロピ
ン、バソプレッシン（神経下垂体ホルモン）；パラチロ
イドホルモン（甲状腺ホルモン）；サイモポエチン（胸
腺ホルモン）；インスリン、グルカゴン（膵臓ホルモ
ン）；神経成長因子、上皮成長因子、インスリン様成長
因子、ヒト形質転換発育因子、成長ホルモン放出因子す
なわちCRF、繊維芽細胞増殖因子（成長因子）；セクレ
チン、コレシストキニン、バソアクティブインスチナル
ペプチド、モチリン（胃腸管ホルモン）；ゴナトロピン
（絨毛腺ホルモン）；性腺刺激ホルモン放出ホルモン
（性腺刺激ホルモン）；レラキシン（卵巣ホルモン）；
血液凝固因子イ因子およびウ因子（血友病因子）；スト
レプトキナーゼ、フェブリノリシン、デオキシリボヌク
レアーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ（以下、SOD
と略記）、ビリルビンオキシダーゼ、エラスターゼ、ア
スパラギナーゼ（酵素）；組織プラスミノーゲン活性化
因子即ちｔ−PA、ウロキナーゼ（線溶因子）；リンホカ
イン（たとえばインターロイキン）、インターフェロ
ン、顆粒球・コロニー刺激因子即ちＧ−CSF、マクロフ
ァージ・コロニー刺激因子即ちＭ−CSF、顆粒球マクロ
ファージ・コロニー刺激因子即ちGM−CSF（刺激因
子）；エリスロポエチン（増血因子）、カルシトニン、
カルシトニン遺伝子関連ペプチド（Ca調節ホルモン）；
心房性ナトリウム利尿ペプチド（利尿ホルモン）；モノ
クローナルおよびポリクローナル抗体；免疫原；酵素阻
害因子；ポリ−Ｌ−リジン、ポリ−Ｄ−リジンを含む各
種ポリアミノ酸類；ウィルス由来の細胞膜融合性ペプチ
ド類；スヒストン、プロタミン（遺伝子結合性タンパク
質）および上記タンパク質またはペプチド性薬物と同様
の生理活性を有する類似構造物質が好ましい。これらの
タンパク質またはペプチド性薬物は、それらの天然源ま
たは遺伝子工学的処理を受けた細胞から単離されるか、
あるいは種々のin vitro合成方法を経て作り出されても
よい。なお、上記例示における（ ）内はタンパク質ま
たはペプチド性薬物の主たる用途を示すものである。ま
た、この発明のタンパク質またはペプチド類にはポリア
ミノ酸と総称される各種のアミノ酸が包含されることは
言うまでもない。
そして、この発明で、末端にコレステロール構造を有
するPEG誘導体により修飾される生理活性物質中の修飾
箇所の数は特に限定されないが、１〜100箇所であるこ
とが好ましい。さらに望ましくは１〜10箇所であること
が好ましい。
するPEG誘導体により修飾される生理活性物質中の修飾
箇所の数は特に限定されないが、１〜100箇所であるこ
とが好ましい。さらに望ましくは１〜10箇所であること
が好ましい。
この発明においては、上記の通りの特有の化学構造を
有する反応性PEG誘導体によりタンパク質またはペプチ
ド類を修飾するため、高い生理活性を有する薬剤物質
を、レセプター等との結合阻害を生じさせることなく、
これら物質の生体内挙動を効果的に改善する。
有する反応性PEG誘導体によりタンパク質またはペプチ
ド類を修飾するため、高い生理活性を有する薬剤物質
を、レセプター等との結合阻害を生じさせることなく、
これら物質の生体内挙動を効果的に改善する。
実施例 以下、実施例を示し、さらに詳しくこの発明の構成お
よび効果について説明する。
よび効果について説明する。
実施例１ 〔末端にコレステロール構造を有する新規PEG誘導体
（活性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエ
ーテル）の合成〕 （１） ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル
（ｎ＝10、平均分子量800、9.5g）とクロロギ酸ｐ−ニ
トロフェニル（0.6g）をトルエン（50ml）に溶解させた
後、トリエチルアミン（0.3g）を加え室温で18時間攪拌
し、析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。得
られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、ギ酸ｐ−ニト
ロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステ
ロールエーテル（化合物:A）7.1gを得た（収率75％）。
（活性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエ
ーテル）の合成〕 （１） ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル
（ｎ＝10、平均分子量800、9.5g）とクロロギ酸ｐ−ニ
トロフェニル（0.6g）をトルエン（50ml）に溶解させた
後、トリエチルアミン（0.3g）を加え室温で18時間攪拌
し、析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。得
られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、ギ酸ｐ−ニト
ロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステ
ロールエーテル（化合物:A）7.1gを得た（収率75％）。
融点23℃ 元素分析:C54H91NO15 （２） ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル
（ｎ＝20、平均分子量1200、6.0g）と無水コハク酸（0.
6g）、ピリジン（0.5ml）をジクロロメタン（30ml）に
溶解させ３日間還流した。その後析出した不純物を濾別
して濾液をエバポレートした、得られた残渣を蒸留水
（50ml）に溶解した後、クロロホルム（50ml）で抽出を
行ない、得られた有機層をエバポレートすることにより
ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテルコ
ハク酸エステルを得た。次に、得られたポリエチレング
リコールモノコレステロールエーテルコハク酸エステル
およびＮ−コハク酸イミド（0.6g）をジメチルホルムア
ミド（100ml）に溶解した。反応系を０℃に冷却した
後、ジメチルホルムアミド（5ml）に溶解したジクロロ
ヘキシルカルボジイミド（0.7g）を滴下して室温で24時
間攪拌を続けた。析出した不純物を濾別して濾液を減圧
濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムで精製
し、Ｎ−コハク酸イミド活性化ポリエチレングリコール
モノコレステロールエーテル（化合物:B）4.8gを得た
（収率78％）。
（ｎ＝20、平均分子量1200、6.0g）と無水コハク酸（0.
6g）、ピリジン（0.5ml）をジクロロメタン（30ml）に
溶解させ３日間還流した。その後析出した不純物を濾別
して濾液をエバポレートした、得られた残渣を蒸留水
（50ml）に溶解した後、クロロホルム（50ml）で抽出を
行ない、得られた有機層をエバポレートすることにより
ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテルコ
ハク酸エステルを得た。次に、得られたポリエチレング
リコールモノコレステロールエーテルコハク酸エステル
およびＮ−コハク酸イミド（0.6g）をジメチルホルムア
ミド（100ml）に溶解した。反応系を０℃に冷却した
後、ジメチルホルムアミド（5ml）に溶解したジクロロ
ヘキシルカルボジイミド（0.7g）を滴下して室温で24時
間攪拌を続けた。析出した不純物を濾別して濾液を減圧
濃縮した後、得られた残渣をシリカゲルカラムで精製
し、Ｎ−コハク酸イミド活性化ポリエチレングリコール
モノコレステロールエーテル（化合物:B）4.8gを得た
（収率78％）。
融点33℃ 元素分析:C75H135NO26 （３） ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル
（ｎ＝30、平均分子量1700、4.5g）とクロロギ酸ｐ−ニ
トロフェニル（0.6g）をトルエン（50ml）に溶解させた
後、トリエチルアミン（0.3g）を加えて室温で18時間攪
拌し、析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。
得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、ギ酸ｐ−ニ
トロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレス
テロールエーテル（化合物:C）3.8gを得た（収率81
％）。
（ｎ＝30、平均分子量1700、4.5g）とクロロギ酸ｐ−ニ
トロフェニル（0.6g）をトルエン（50ml）に溶解させた
後、トリエチルアミン（0.3g）を加えて室温で18時間攪
拌し、析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。
得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、ギ酸ｐ−ニ
トロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレス
テロールエーテル（化合物:C）3.8gを得た（収率81
％）。
融点36℃ 元素分析:C94H171NO39 （４） 無水ベンゼン（100ml）に無水炭酸ナトリウム（2.5
g）とシアヌルクロライド（1.3g）を溶解させた後、ポ
リエチレングリコールモノコレステロールエーテル（ｎ
＝30、平均分子量1700、4.5g）を加えて室温で24時間攪
拌した。トリエチルアミン（0.3g）を加え室温で18時間
攪拌した。析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮し
た。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、シアヌ
ルクロライド活性化ポリエチレングリコールモノコレス
テロールエーテル（化合物:D）3.4gを得た（収率76
％）。
g）とシアヌルクロライド（1.3g）を溶解させた後、ポ
リエチレングリコールモノコレステロールエーテル（ｎ
＝30、平均分子量1700、4.5g）を加えて室温で24時間攪
拌した。トリエチルアミン（0.3g）を加え室温で18時間
攪拌した。析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮し
た。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、シアヌ
ルクロライド活性化ポリエチレングリコールモノコレス
テロールエーテル（化合物:D）3.4gを得た（収率76
％）。
融点38℃ 元素分析:C90H167N3O31Cl2 （５） 無水ベンゼン（100ml）に無水炭酸ナトリウム（2.5
g）とシアヌルクロライド（1.3g）を溶解させた後、ポ
リエチレングリコールモノコレステロールエーテル（ｎ
＝30、平均分子量1700、9.0g）を加えて室温で24時間攪
拌した。トリエチルアミン（0.3g）を加え室温で18時間
攪拌した。析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮し
た。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、２本型
シアヌルクロライド活性化ポリエチレングリコールモノ
コレステロールエーテル（化合物:E）5.8gを得た（収率
63％）。
g）とシアヌルクロライド（1.3g）を溶解させた後、ポ
リエチレングリコールモノコレステロールエーテル（ｎ
＝30、平均分子量1700、9.0g）を加えて室温で24時間攪
拌した。トリエチルアミン（0.3g）を加え室温で18時間
攪拌した。析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮し
た。得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、２本型
シアヌルクロライド活性化ポリエチレングリコールモノ
コレステロールエーテル（化合物:E）5.8gを得た（収率
63％）。
融点37℃ 元素分析:C177H334N3O62Cl （６） ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテル
（ｎ＝100、平均分子量4700、12.5g）とクロロギ酸ｐ−
ニトロフェニル（0.6g）をトルエン（50ml）に溶解させ
た後、トリエチルアミン（0.3g）を加え室温で18時間攪
拌し、析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。
得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、ギ酸ｐ−ニ
トロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレス
テロールエーテル（化合物:F）9.8gを得た（収率78
％）。
（ｎ＝100、平均分子量4700、12.5g）とクロロギ酸ｐ−
ニトロフェニル（0.6g）をトルエン（50ml）に溶解させ
た後、トリエチルアミン（0.3g）を加え室温で18時間攪
拌し、析出した不純物を濾別して濾液を減圧濃縮した。
得られた残渣をシリカゲルカラムで精製し、ギ酸ｐ−ニ
トロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレス
テロールエーテル（化合物:F）9.8gを得た（収率78
％）。
融点45℃ 元素分析:C234H451NO105 実施例２ 〔新規PEG誘導体によるインスリンの修飾〕 ウシ由来インスリン（6.0mg）を0.025mM Na2B4O7・1
0H2O（pH 9.2）200mlに溶解させた後、実施例１で得た
ギ酸ｐ−ニトロフェニル活性化ポリエチレングリコール
モノコレステロールエーテル（化合物:A）、Ｎ−コハク
酸イミド活性化ポリエチレングリコールモノコレステロ
ールエーテル（化合物:B）、ギ酸ｐ−ニトロフェニル活
性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテ
ル（化合物:C）、シアヌルクロライド活性化ポリエチレ
ングリコールモノコレステロールエーテル（化合物:
D）、２本型シアヌルクロライド活性化ポリエチレング
リコールモノコレステロールエーテル（化合物:E）、ギ
酸ｐ−ニトロフェニル活性化ポリエチレングリコールモ
ノコレステロールエーテル（化合物:F）2.0nmolをそれ
ぞれ加えて室温で５時間攪拌した。セファデックスＧ−
75（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過精製した。目
的とする分画を限外濾過（ファルマシア社製）により脱
塩・濃縮して目的物の水溶液（1.8mg/ml）を得た。ギ酸
ｐ−ニトロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノ
コレステロールエーテル（化合物:A）の場合は目的とす
る修飾が充分でなかった。これは水溶性が低いためであ
ると考えられる。またギ酸ｐ−ニトロフェニル活性化ポ
リエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化
合物:F）での化学修飾の場合も充分ではなかった。これ
は立体障害のためであると考えられる。その他のPEG誘
導体修飾インスリンは、インスリン１分子あたり１〜２
箇所の修飾をうけた場合の分子量に相当する分画に溶出
が観察された。
0H2O（pH 9.2）200mlに溶解させた後、実施例１で得た
ギ酸ｐ−ニトロフェニル活性化ポリエチレングリコール
モノコレステロールエーテル（化合物:A）、Ｎ−コハク
酸イミド活性化ポリエチレングリコールモノコレステロ
ールエーテル（化合物:B）、ギ酸ｐ−ニトロフェニル活
性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテ
ル（化合物:C）、シアヌルクロライド活性化ポリエチレ
ングリコールモノコレステロールエーテル（化合物:
D）、２本型シアヌルクロライド活性化ポリエチレング
リコールモノコレステロールエーテル（化合物:E）、ギ
酸ｐ−ニトロフェニル活性化ポリエチレングリコールモ
ノコレステロールエーテル（化合物:F）2.0nmolをそれ
ぞれ加えて室温で５時間攪拌した。セファデックスＧ−
75（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過精製した。目
的とする分画を限外濾過（ファルマシア社製）により脱
塩・濃縮して目的物の水溶液（1.8mg/ml）を得た。ギ酸
ｐ−ニトロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノ
コレステロールエーテル（化合物:A）の場合は目的とす
る修飾が充分でなかった。これは水溶性が低いためであ
ると考えられる。またギ酸ｐ−ニトロフェニル活性化ポ
リエチレングリコールモノコレステロールエーテル（化
合物:F）での化学修飾の場合も充分ではなかった。これ
は立体障害のためであると考えられる。その他のPEG誘
導体修飾インスリンは、インスリン１分子あたり１〜２
箇所の修飾をうけた場合の分子量に相当する分画に溶出
が観察された。
実施例３ 〔新規PEG誘導体によるSODの修飾〕 ウシ由来Cu,Zn−SOD（30mg）を0.025mM Na2B4O7・10
H2O（pH 9.2）30mlに溶解させた後、実施例１（３）で
得たギ酸ｐ−ニトロフェニル活性化ポリエチレングリコ
ールモノコレステロールエーテル（化合物:C）3.9mgを
加え室温で５時間攪拌した。セファデックスＧ−75（フ
ァルマシア社製）を用いてゲル濾過精製した。目的とす
る分画を限外濾過（ファルマシア社製）により脱塩・濃
縮して目的物の水溶液（20.2mg/ml）を得た。
H2O（pH 9.2）30mlに溶解させた後、実施例１（３）で
得たギ酸ｐ−ニトロフェニル活性化ポリエチレングリコ
ールモノコレステロールエーテル（化合物:C）3.9mgを
加え室温で５時間攪拌した。セファデックスＧ−75（フ
ァルマシア社製）を用いてゲル濾過精製した。目的とす
る分画を限外濾過（ファルマシア社製）により脱塩・濃
縮して目的物の水溶液（20.2mg/ml）を得た。
実施例４ 〔新規PEG誘導体修飾インスリンの血中成分と相互作用i
n vitro実験〕 ウイスター系雄性ラットより採取した血清あるいは４
％ラットアルブミン水溶液450μｌに、実施例２で得ら
れたギ酸ｐ−ニトロフェニル活性化ポリエチレングリコ
ールモノコレステロールエーテル（化合物:C）修飾イン
スリン水溶液50μｌを加えて37℃で30分間攪拌後、セフ
ァロース4B（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過分離
を行なった。その結果を図１に示す。新規PEG誘導体修
飾インスリンの分子量は、ラット血清と混合した場合に
のみその増加が確認され、アルブミン以外の血清中成分
との間に相互作用が存在することが確認された。
n vitro実験〕 ウイスター系雄性ラットより採取した血清あるいは４
％ラットアルブミン水溶液450μｌに、実施例２で得ら
れたギ酸ｐ−ニトロフェニル活性化ポリエチレングリコ
ールモノコレステロールエーテル（化合物:C）修飾イン
スリン水溶液50μｌを加えて37℃で30分間攪拌後、セフ
ァロース4B（ファルマシア社製）を用いてゲル濾過分離
を行なった。その結果を図１に示す。新規PEG誘導体修
飾インスリンの分子量は、ラット血清と混合した場合に
のみその増加が確認され、アルブミン以外の血清中成分
との間に相互作用が存在することが確認された。
実施例５ 〔新規PEG誘導体修飾SODの血中成分と相互作用in vitro
実験〕 ラットより採取した血清あるいは４％ラットアルブミ
ン水溶液450μｌに、実施例３で得られたギ酸ｐ−ニト
ロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステ
ロールエーテル（化合物:C）修飾SOD水溶液50μｌを加
えて37℃で30分間攪拌後、セファロース4B（ファルマシ
ア社製）を用いてゲル濾過分離を行なった。その結果を
図２に示す。新規PEG誘導体修飾SODの分子量は、ラット
血清と混合した場合にのみその増加が確認され、アルブ
ミン以外の血清中成分との間に相互作用が存在すること
が確認された。
実験〕 ラットより採取した血清あるいは４％ラットアルブミ
ン水溶液450μｌに、実施例３で得られたギ酸ｐ−ニト
ロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステ
ロールエーテル（化合物:C）修飾SOD水溶液50μｌを加
えて37℃で30分間攪拌後、セファロース4B（ファルマシ
ア社製）を用いてゲル濾過分離を行なった。その結果を
図２に示す。新規PEG誘導体修飾SODの分子量は、ラット
血清と混合した場合にのみその増加が確認され、アルブ
ミン以外の血清中成分との間に相互作用が存在すること
が確認された。
実施例６ 〔新規PEG誘導体修飾インスリンの生体内挙動in vivo実
験〕 ウレタン麻酔したラットもしくはウレタン麻酔後に腎
動脈のみを結紮したラットに、約0.5Uのギ酸ｐ−ニトロ
フェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステロ
ールエーテル（化合物:C）修飾インスリンまたは未修飾
インスリンを静脈投与後、所定時間に静脈血を採取し、
各時間における血中インスリン濃度および血糖値を測定
した。その結果を図３に示す。正常ラットにおける修飾
インスリンおよび未修飾インスリンの生体内挙動は、腎
動脈を結紮したラットにおける未修飾インスリンの生体
内挙動と同様であった。この結果から、修飾インスリン
では、生体内からの消失に関与するクリアランスレセプ
ターとの間の相互作用は修飾により阻害されていないこ
とが示された。また、正常ラットにおける修飾インスリ
ンおよび未修飾インスリンの薬理効果は同等であったこ
とから、新規PEG誘導体修飾インスリンでは、生体内か
らの消失に関与する薬理作用に関連するインスリンレセ
プターとの間の相互作用も修飾により阻害されていない
ことが確認された。
験〕 ウレタン麻酔したラットもしくはウレタン麻酔後に腎
動脈のみを結紮したラットに、約0.5Uのギ酸ｐ−ニトロ
フェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステロ
ールエーテル（化合物:C）修飾インスリンまたは未修飾
インスリンを静脈投与後、所定時間に静脈血を採取し、
各時間における血中インスリン濃度および血糖値を測定
した。その結果を図３に示す。正常ラットにおける修飾
インスリンおよび未修飾インスリンの生体内挙動は、腎
動脈を結紮したラットにおける未修飾インスリンの生体
内挙動と同様であった。この結果から、修飾インスリン
では、生体内からの消失に関与するクリアランスレセプ
ターとの間の相互作用は修飾により阻害されていないこ
とが示された。また、正常ラットにおける修飾インスリ
ンおよび未修飾インスリンの薬理効果は同等であったこ
とから、新規PEG誘導体修飾インスリンでは、生体内か
らの消失に関与する薬理作用に関連するインスリンレセ
プターとの間の相互作用も修飾により阻害されていない
ことが確認された。
実施例７ 〔新規PEG誘導体修飾SODの生体内挙動in vivo実験〕 ウレタン麻酔したラットもしくはウレタン麻酔後に腎
動脈のみを結紮したラットに、約5000Uのギ酸ｐ−ニト
ロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステ
ロールエーテル（化合物:C）修飾SODまたは未修飾SODを
静脈投与後、所定時間に静脈血を採取し、各時間におけ
る血中SOD濃度を測定した。その結果を図４に示す。正
常ラットにおける未修飾SODの生体内挙動は明らかに改
善されており、未修飾SODの生体からの消失において糸
球体濾過の関与が大きいことが示された。一方、修飾SO
Dの生体内挙動は大きく改善されて血中半減期が延長さ
れており、修飾によって生じる血中成分との相互作用に
より修飾SODは糸球体濾過を免れていることが確認され
た。
動脈のみを結紮したラットに、約5000Uのギ酸ｐ−ニト
ロフェニル活性化ポリエチレングリコールモノコレステ
ロールエーテル（化合物:C）修飾SODまたは未修飾SODを
静脈投与後、所定時間に静脈血を採取し、各時間におけ
る血中SOD濃度を測定した。その結果を図４に示す。正
常ラットにおける未修飾SODの生体内挙動は明らかに改
善されており、未修飾SODの生体からの消失において糸
球体濾過の関与が大きいことが示された。一方、修飾SO
Dの生体内挙動は大きく改善されて血中半減期が延長さ
れており、修飾によって生じる血中成分との相互作用に
より修飾SODは糸球体濾過を免れていることが確認され
た。
実施例８ 〔新規PEG誘導体修飾SODの薬理効果in vivo実験〕 ラットに対して、10000Uのギ酸ｐ−ニトロフェニル活
性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテ
ル（化合物:C）修飾SODもしくは未修飾SODを投与後、水
浸ストレス潰瘍モデルの作製方法にしたがって急性胃潰
瘍を発生させ、その際の潰瘍発生阻害効果について検討
を行なった。その結果を図５に示す。修飾SODを投与し
た場合は、未修飾SODを投与した場合に比較して潰瘍の
発生が抑制されており、修飾によるin vivo薬理効果の
増強が確認された。
性化ポリエチレングリコールモノコレステロールエーテ
ル（化合物:C）修飾SODもしくは未修飾SODを投与後、水
浸ストレス潰瘍モデルの作製方法にしたがって急性胃潰
瘍を発生させ、その際の潰瘍発生阻害効果について検討
を行なった。その結果を図５に示す。修飾SODを投与し
た場合は、未修飾SODを投与した場合に比較して潰瘍の
発生が抑制されており、修飾によるin vivo薬理効果の
増強が確認された。
産業上の利用可能性 この発明によるPEG誘導体を用いることにより、生理
活性物質、特にタンパク質、ポリアミノ酸およびポリペ
プチド類の生体内挙動が改善され、高い薬理効果を示す
製剤の開発が可能となると同時に、上記薬物の水溶性の
改善、貯蔵安定性の増大、免疫原性の減少、酵素分解耐
性の向上が可能となる。
活性物質、特にタンパク質、ポリアミノ酸およびポリペ
プチド類の生体内挙動が改善され、高い薬理効果を示す
製剤の開発が可能となると同時に、上記薬物の水溶性の
改善、貯蔵安定性の増大、免疫原性の減少、酵素分解耐
性の向上が可能となる。
そして、この発明のPEG誘導体修飾タンパク質または
ポリペプチド類は、公知の担体、稀釈剤等を用いること
により、錠剤、カプセル剤、注射剤等の医薬品組成物と
して経口または非経口による投与形態において哺乳動物
（たとえば、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒト）に投与す
ることができる。
ポリペプチド類は、公知の担体、稀釈剤等を用いること
により、錠剤、カプセル剤、注射剤等の医薬品組成物と
して経口または非経口による投与形態において哺乳動物
（たとえば、イヌ、ブタ、ウシ、ウマ、ヒト）に投与す
ることができる。
または、たとえば、この発明のPEG誘導体修飾インス
リンは血糖降下作用を有し、糖尿病に対する治療薬また
は予防薬として、１日当たりの投与量４〜100単位を注
射剤として投与することができる。
リンは血糖降下作用を有し、糖尿病に対する治療薬また
は予防薬として、１日当たりの投与量４〜100単位を注
射剤として投与することができる。
PEG誘導体修飾SODは抗潰瘍作用を有するため胃または
十二腸に対する抗潰瘍剤、あるいは抗炎症作用を有する
ため抗炎症剤としての適用ができ、１日当たりの投与量
１〜5mg/kgを錠剤、注射剤などの形態において投与する
ことができる。
十二腸に対する抗潰瘍剤、あるいは抗炎症作用を有する
ため抗炎症剤としての適用ができ、１日当たりの投与量
１〜5mg/kgを錠剤、注射剤などの形態において投与する
ことができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 14/62 Ａ６１Ｋ 37/26 Ｃ０８Ｇ 65/321 37/48 Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ０８Ｇ 65/32 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 14/00 C07K 14/62 C12N 9/02 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (8)
- 【請求項１】分子中の少なくとも１個のアミノ基に次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ− 〔式中、R1は置換基を有してもよいコレステリル基、ｎ
は任意に変わりうる10〜100の整数をそれぞれ示す〕で
表されるポリエチレングリコールオキシ基を結合してな
るタンパク質またはポリペプチド類。 - 【請求項２】インスリンである請求項１のタンパク質ま
たはポリペプチド類。 - 【請求項３】スーパーオキシドジスムターゼである請求
項１のタンパク質またはポリペプチド類。 - 【請求項４】タンパク質またはポリペプチド類と次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−R2 〔式中、R1は置換基を有してもよいコレステリル基、R2
は次式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）〕 （式中、R3はOH、アルコキシ基、アシルオキシ基、ハロ
ゲン原子またはR1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−を示す）のい
ずれかを示し、ｎは任意に変わりうる10〜100の整数を
示す）〕で表される反応性ポリエチレングリコールとを
反応させることからなる分子中の少なくとも１個のアミ
ノ基に次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ− 〔式中、R1は置換基を有してもよいコレステリル基、ｎ
は任意に変わりうる10〜100の整数をそれぞれ示す〕で
表されるポリエチレングリコールオキシ基を結合してな
るタンパク質またはポリペプチド類の製造法。 - 【請求項５】タンパク質またはポリペプチド類が、イン
スリンまたはスーパーオキシドジスムターゼである請求
項３の製造法。 - 【請求項６】次式 R1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−R2 〔式中、R1は置換基を有してもよいコレステリル基、R2
は次式（ａ）、（ｂ）および（ｃ）〕 （式中、R3はOH、アルコキシ基、アシルオキシ基、ハロ
ゲン原子またはR1−（OCH2CH2）ｎ−Ｏ−を示す）のい
ずれかを示し、ｎは任意に変わりうる10〜100の整数を
示す）〕で表される反応性ポリエチレングリコール誘導
体。 - 【請求項７】請求項２記載のタンパク質またはポリペプ
チド類からなる糖尿病治療剤または糖尿病予防剤。 - 【請求項８】請求項３記載のタンパク質またはポリペプ
チド類からなう抗潰瘍剤または抗潰瘍予防剤。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP10730194 | 1994-05-20 | ||
| JP6-107301 | 1994-05-20 | ||
| PCT/JP1995/000968 WO1995032219A1 (fr) | 1994-05-20 | 1995-05-19 | Proteine ou polypeptide, procede et intermediaires permettant leur preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP3173794B2 true JP3173794B2 (ja) | 2001-06-04 |
Family
ID=14455630
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP52992795A Expired - Fee Related JP3173794B2 (ja) | 1994-05-20 | 1995-05-19 | タンパク質またはポリペプチド類とその製造法および中間化合物 |
Country Status (6)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5889153A (ja) |
| EP (1) | EP0761683B1 (ja) |
| JP (1) | JP3173794B2 (ja) |
| AU (1) | AU2455295A (ja) |
| DE (1) | DE69533987T2 (ja) |
| WO (1) | WO1995032219A1 (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| US5681811A (en) * | 1993-05-10 | 1997-10-28 | Protein Delivery, Inc. | Conjugation-stabilized therapeutic agent compositions, delivery and diagnostic formulations comprising same, and method of making and using the same |
| GB9811059D0 (en) * | 1998-05-23 | 1998-07-22 | Univ Strathclyde | Polyamino acid vesicles |
| US7060675B2 (en) * | 2001-02-15 | 2006-06-13 | Nobex Corporation | Methods of treating diabetes mellitus |
| US6867183B2 (en) * | 2001-02-15 | 2005-03-15 | Nobex Corporation | Pharmaceutical compositions of insulin drug-oligomer conjugates and methods of treating diseases therewith |
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| US6858580B2 (en) * | 2001-06-04 | 2005-02-22 | Nobex Corporation | Mixtures of drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US6828305B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of growth hormone drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
| US6828297B2 (en) * | 2001-06-04 | 2004-12-07 | Nobex Corporation | Mixtures of insulin drug-oligomer conjugates comprising polyalkylene glycol, uses thereof, and methods of making same |
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| EA013535B1 (ru) * | 2002-12-26 | 2010-06-30 | Маунтин Вью Фамэсьютикэлс, Инк. | Полимерный конъюгат биоактивного компонента (варианты), способ его получения и использования, фармацевтические продукты на его основе |
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| US8388951B2 (en) | 2003-07-14 | 2013-03-05 | Cls Therapeutics Limited | Method for treating systemic DNA mutation disease |
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| PL2095825T3 (pl) * | 2006-11-28 | 2011-12-30 | Cls Therapeutics Ltd | Sposób leczenia ludzkich chorób związanych ze zwiększoną zawartością kwasu deoksyrybonukleinowego w przestrzeniach pozakomórkowych i tkankach i preparat leczniczy do przeprowadzenia tego sposobu |
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| US10617743B2 (en) | 2014-06-19 | 2020-04-14 | Cls Therapeutics Limited | Method to improve safety and efficacy of anti-cancer therapy |
| US11701410B2 (en) | 2015-05-22 | 2023-07-18 | Cls Therapeutics Limited | Extracellular DNA as a therapeutic target in neurodegeneration |
| JP2021510539A (ja) | 2018-01-16 | 2021-04-30 | シーエルエス セラピューティクス リミテッドＣＬＳ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄ | デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮａｓｅ）活性を有する酵素の肝臓発現による疾患の処置 |
| CN115397846A (zh) * | 2020-03-06 | 2022-11-25 | 昆山新蕴达生物科技有限公司 | 疏水性修饰的白蛋白及其制备方法和用途 |
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| CA1244347A (en) * | 1984-05-29 | 1988-11-08 | Eddie H. Massey | Stabilized insulin formulations |
| US5080891A (en) * | 1987-08-03 | 1992-01-14 | Ddi Pharmaceuticals, Inc. | Conjugates of superoxide dismutase coupled to high molecular weight polyalkylene glycols |
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