JP3168755B2 - 生物固定化担体中の微生物量測定方法 - Google Patents
生物固定化担体中の微生物量測定方法Info
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Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明はＡＴＰ法を利用して生物
固定化担体中の微生物量を測定する方法に関するもので
ある。
固定化担体中の微生物量を測定する方法に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】近年、水事情の悪化に伴い、有機汚染物
含有量の高い湖沼水や河川水等の原水を使用せざるを得
ない浄水処理施設が増加している。これらの浄水処理施
設では、良質の飲料水を確保するため、通常の浄水設備
に生物処理法を加える処理方法が検討されている（吉村
俊治ら，水質汚濁研究，９，４８４−４８９頁，１９８
６年参照）。
含有量の高い湖沼水や河川水等の原水を使用せざるを得
ない浄水処理施設が増加している。これらの浄水処理施
設では、良質の飲料水を確保するため、通常の浄水設備
に生物処理法を加える処理方法が検討されている（吉村
俊治ら，水質汚濁研究，９，４８４−４８９頁，１９８
６年参照）。
【０００３】中でも生物活性炭（Biological active ca
rbon，以下ＢＡＣと略称する）を用いた処理は、生物固
定化担体としての通常の活性炭の持つ優れた吸着特性
と、該活性炭の吸着物質である生物分解による吸着座の
再生作用とにより、高い有機物除去能とこの除去能の長
期持続が可能であることが明らかとなり、今後の高度浄
水処理の有力な方法として期待されている（黒沢義乗
ら，水質汚濁研究，１１，５７７−５８９頁，１９８８
年、同１１，５９０−５８８頁，１９８８年、鈴木順三
ら，水環境学会誌，１５，４５−５１頁，１９９２年参
照）。
rbon，以下ＢＡＣと略称する）を用いた処理は、生物固
定化担体としての通常の活性炭の持つ優れた吸着特性
と、該活性炭の吸着物質である生物分解による吸着座の
再生作用とにより、高い有機物除去能とこの除去能の長
期持続が可能であることが明らかとなり、今後の高度浄
水処理の有力な方法として期待されている（黒沢義乗
ら，水質汚濁研究，１１，５７７−５８９頁，１９８８
年、同１１，５９０−５８８頁，１９８８年、鈴木順三
ら，水環境学会誌，１５，４５−５１頁，１９９２年参
照）。
【０００４】このＢＡＣ処理とは、活性炭等の生物固定
化担体に各種細菌類とか原生動物、微小後生動物等の微
生物を付着生息させた混合培養系により、有機物を処理
する方法である。
化担体に各種細菌類とか原生動物、微小後生動物等の微
生物を付着生息させた混合培養系により、有機物を処理
する方法である。
【０００５】一方、ＢＡＣに付着した微生物量の測定方
法には、超音波処理により微生物を剥離した後、平板培
養法（上水試験法，６０５頁，日本水道協会１９８５
年，厚生省生活衛生局水道環境部監修）とかアクリジン
オレンジを用いる蛍光法（前記上水試験法の６３０頁、
金周永ら，第２６回日本水環境学会年会講演集，１２８
−１２９頁，１９９２年参照）及び熱重量分析法（李建
国ら，第２６回日本水環境学会年会講演集，１３０頁，
１９９２年、胡洪営ら，第２４回日本水質汚濁学会年会
講演集，３７５頁，１９９０年参照）により測定する方
法が知られている。この熱重量分析法とは、微生物が付
着した担体を乾燥後、強熱して重量減少量を測定し、微
生物付着量を求める方法である。
法には、超音波処理により微生物を剥離した後、平板培
養法（上水試験法，６０５頁，日本水道協会１９８５
年，厚生省生活衛生局水道環境部監修）とかアクリジン
オレンジを用いる蛍光法（前記上水試験法の６３０頁、
金周永ら，第２６回日本水環境学会年会講演集，１２８
−１２９頁，１９９２年参照）及び熱重量分析法（李建
国ら，第２６回日本水環境学会年会講演集，１３０頁，
１９９２年、胡洪営ら，第２４回日本水質汚濁学会年会
講演集，３７５頁，１９９０年参照）により測定する方
法が知られている。この熱重量分析法とは、微生物が付
着した担体を乾燥後、強熱して重量減少量を測定し、微
生物付着量を求める方法である。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】しかしながらこのよう
な従来のＢＡＣに付着した微生物量の測定方法は、各種
の観点から必ずしも最適な方法であるとは言えない面が
あり、測定方法に関する再検討が要求されている現況に
ある。
な従来のＢＡＣに付着した微生物量の測定方法は、各種
の観点から必ずしも最適な方法であるとは言えない面が
あり、測定方法に関する再検討が要求されている現況に
ある。
【０００７】例えば前記平板培養法とかアクリジンオレ
ンジを用いた蛍光法の前処理として実施されている超音
波処理による微生物の剥離方法の場合には、超音波処理
法が通常の磨砕法とかHughesプレス法、Frenchプレス法
等の方法と比較してもきわめて強力であるが、同時に超
音波はキャビテーションで多くの細胞構造体を破砕する
能力があるため、微生物の生存率の面から問題点が残存
している。
ンジを用いた蛍光法の前処理として実施されている超音
波処理による微生物の剥離方法の場合には、超音波処理
法が通常の磨砕法とかHughesプレス法、Frenchプレス法
等の方法と比較してもきわめて強力であるが、同時に超
音波はキャビテーションで多くの細胞構造体を破砕する
能力があるため、微生物の生存率の面から問題点が残存
している。
【０００８】又、平板培養法自体も操作が繁雑で且つ無
菌操作を必要とする上、培養時間に２４時間を要するの
で、能率上での難点があり、更に蛍光法に比較して１〜
２桁程度少なく計数される（前記上水試験法，６０５
頁，日本水道協会１９８５年参照）という問題点があ
る。
菌操作を必要とする上、培養時間に２４時間を要するの
で、能率上での難点があり、更に蛍光法に比較して１〜
２桁程度少なく計数される（前記上水試験法，６０５
頁，日本水道協会１９８５年参照）という問題点があ
る。
【０００９】他方のアクリジンオレンジを用いた蛍光法
は、超音波処理後に試料をメンブランフィルタで濾過
し、アクリジンオレンジで染色する必要があり、前処理
に関しては平板培養法よりも更に繁雑である。更に実施
に際して高価な設備である落射蛍光顕微鏡を必要とする
ため、コストの面での難点を有している。
は、超音波処理後に試料をメンブランフィルタで濾過
し、アクリジンオレンジで染色する必要があり、前処理
に関しては平板培養法よりも更に繁雑である。更に実施
に際して高価な設備である落射蛍光顕微鏡を必要とする
ため、コストの面での難点を有している。
【００１０】熱重量分析法は、微生物が付着した担体を
乾燥後、強熱して重量減少量を測定し、微生物付着量を
求める方法であるため、乾燥炉の温度設定はきわめて正
確であることが要求される上、精度の高い秤量計と熟練
した測定技術が必要であり、コスト並びに操作性の面で
の問題点が存在する。
乾燥後、強熱して重量減少量を測定し、微生物付着量を
求める方法であるため、乾燥炉の温度設定はきわめて正
確であることが要求される上、精度の高い秤量計と熟練
した測定技術が必要であり、コスト並びに操作性の面で
の問題点が存在する。
【００１１】微生物量の測定は、例えば生物活性炭塔に
おける立ち上げの際に、生物分解除去機能を持つ新たな
生物活性炭を補充すべきか否かを判断する場合に特に必
要である。
おける立ち上げの際に、生物分解除去機能を持つ新たな
生物活性炭を補充すべきか否かを判断する場合に特に必
要である。
【００１２】そこで本発明はこのような従来の生物固定
化担体中の微生物量測定方法が有している各種の問題点
を解消して、迅速且つ簡便な操作で短時間に微生物量の
測定を行うことができる方法を提供することを目的とす
るものである。
化担体中の微生物量測定方法が有している各種の問題点
を解消して、迅速且つ簡便な操作で短時間に微生物量の
測定を行うことができる方法を提供することを目的とす
るものである。
【００１３】
【課題を解決するための手段】本発明は、上記の目的を
達成するために、微生物が付着した生物固定化担体を採
取して試料を作成し、この試料のＡＴＰを抽出してか
ら、該抽出液に発光試薬を加えて発光量を測定し、この
発光強度から担体に付着している微生物量を決定するよ
うした生物固定化担体中の微生物量測定方法において、
前記生物固定化担体は、生物活性炭であること、を特徴
とする、生物固定化担体中の微生物量測定方法を提供す
る。
達成するために、微生物が付着した生物固定化担体を採
取して試料を作成し、この試料のＡＴＰを抽出してか
ら、該抽出液に発光試薬を加えて発光量を測定し、この
発光強度から担体に付着している微生物量を決定するよ
うした生物固定化担体中の微生物量測定方法において、
前記生物固定化担体は、生物活性炭であること、を特徴
とする、生物固定化担体中の微生物量測定方法を提供す
る。
【００１４】 ここで、前記ＡＴＰ抽出用試薬として
は、トリクロロ酢酸を用いるとよい。又、前記発光試薬
としては、ルシフェリン，ルシフェラーゼを用いるとよ
い。
は、トリクロロ酢酸を用いるとよい。又、前記発光試薬
としては、ルシフェリン，ルシフェラーゼを用いるとよ
い。
【００１５】
【作用】かかる生物固定化担体中の微生物量測定方法、
即ち、微生物が付着した生物固定化担体を採取して試料
を作成し、この試料のＡＴＰを抽出してから該抽出液に
発光試薬を加えて発光量を測定して、発光強度から担体
に付着している微生物量を決定する方法を用いることに
より、従来の平板培養法である生物活性炭から超音波処
理によって微生物を剥離し、処理液を希釈してから標準
寒天培地を無菌的に加えて培養することにより、生物活
性炭から剥離した一般細菌数を決定する方法ときわめて
良好な相関関係が得られる。従って簡易な手段であるＡ
ＴＰ法を用いて、生物活性炭中の微生物量を精度良く測
定することが可能となる。
即ち、微生物が付着した生物固定化担体を採取して試料
を作成し、この試料のＡＴＰを抽出してから該抽出液に
発光試薬を加えて発光量を測定して、発光強度から担体
に付着している微生物量を決定する方法を用いることに
より、従来の平板培養法である生物活性炭から超音波処
理によって微生物を剥離し、処理液を希釈してから標準
寒天培地を無菌的に加えて培養することにより、生物活
性炭から剥離した一般細菌数を決定する方法ときわめて
良好な相関関係が得られる。従って簡易な手段であるＡ
ＴＰ法を用いて、生物活性炭中の微生物量を精度良く測
定することが可能となる。
【００１６】
【実施例】以下本発明にかかる生物固定化担体中の微生
物量測定方法の具体的な実施例を説明する。尚、本実施
例では、ＡＴＰ法によるＢＡＣ中の微生物量の測定が有
効に行われたか否かを、比較例として行った平板培養法
との相関に基づいて検証した。
物量測定方法の具体的な実施例を説明する。尚、本実施
例では、ＡＴＰ法によるＢＡＣ中の微生物量の測定が有
効に行われたか否かを、比較例として行った平板培養法
との相関に基づいて検証した。
【００１７】尚、本実施例の測定原理であるＡＴＰ（ア
デノシン三リン酸）法について簡単に説明すると、一般
にＡＴＰは微生物活性を表わす指標として用いられてお
り、ＡＴＰがルシフェリン，ルシフェラーゼと反応して
発光する原理を利用している。このＡＴＰの抽出法はい
くつか知られているが、一般には試料を試験管に取り、
トリス緩衝液を加えて沸騰水浴中で撹拌しながら抽出を
行い、得られた検水を蛍光光度計のキュベットに入れて
蛍光光度を測定する方法を用いる。
デノシン三リン酸）法について簡単に説明すると、一般
にＡＴＰは微生物活性を表わす指標として用いられてお
り、ＡＴＰがルシフェリン，ルシフェラーゼと反応して
発光する原理を利用している。このＡＴＰの抽出法はい
くつか知られているが、一般には試料を試験管に取り、
トリス緩衝液を加えて沸騰水浴中で撹拌しながら抽出を
行い、得られた検水を蛍光光度計のキュベットに入れて
蛍光光度を測定する方法を用いる。
【００１８】〔実施例〕本実施例では生物固定化担体と
して生物活性炭を採用し、１ｍｌの蒸留水を含む小型シ
ャーレに、スパーテルで洗浄済みの生物活性炭を０．５
ｇずつ秤量して入れ、サンプルとする。本例ではサンプ
ル７個を用意した。
して生物活性炭を採用し、１ｍｌの蒸留水を含む小型シ
ャーレに、スパーテルで洗浄済みの生物活性炭を０．５
ｇずつ秤量して入れ、サンプルとする。本例ではサンプ
ル７個を用意した。
【００１９】（１）パスツールピペットで蒸留水を除
き、１ｍｌの蒸留水を含む試験管にスパーテルとパスツ
ールピペットを用いて生物活性炭をもれなく加える。
き、１ｍｌの蒸留水を含む試験管にスパーテルとパスツ
ールピペットを用いて生物活性炭をもれなく加える。
【００２０】（２）次に生物活性炭を含む試験管にトリ
クロロ酢酸を１ｍｌ加え、３０秒間ボルテックスでＡＴ
Ｐを抽出する。そしてトリス緩衝液を１０ｍｌ加えて希
釈する。この時点で生物活性炭中のＡＴＰは１２倍に希
釈されたことになる。
クロロ酢酸を１ｍｌ加え、３０秒間ボルテックスでＡＴ
Ｐを抽出する。そしてトリス緩衝液を１０ｍｌ加えて希
釈する。この時点で生物活性炭中のＡＴＰは１２倍に希
釈されたことになる。
【００２１】（３）０、１０-11、１０-10、１０-9、１
０-8、１０-7、１０-6MのＡＴＰを調製し、標準曲線を
作成する。
０-8、１０-7、１０-6MのＡＴＰを調製し、標準曲線を
作成する。
【００２２】（４）汚泥活性度測定装置（キッコーマン
製ＵＰＤ−２０００ＥＸ）用の試薬キット「ルシフェー
ル−ＡＳ」の発光試薬０．２５ｍｌと上記ＡＴＰ抽出液
をポリエチレンチューブに加え、発光量をルミノメータ
（明電舍製ＵＰＤ−８０００）で測定する。
製ＵＰＤ−２０００ＥＸ）用の試薬キット「ルシフェー
ル−ＡＳ」の発光試薬０．２５ｍｌと上記ＡＴＰ抽出液
をポリエチレンチューブに加え、発光量をルミノメータ
（明電舍製ＵＰＤ−８０００）で測定する。
【００２３】（５）ＡＴＰの標準曲線に基づいて、生物
活性炭から抽出されたＡＴＰ量を求め、坦体に付着して
いる微生物量を決定する。
活性炭から抽出されたＡＴＰ量を求め、坦体に付着して
いる微生物量を決定する。
【００２４】〔比較例〕実施例と同様１ｍｌの蒸留水を
含む小型シャーレに、スパーテルで洗浄済みの生物活性
炭を０．５ｇずつ秤量して入れ、７個のサンプルを用意
する。
含む小型シャーレに、スパーテルで洗浄済みの生物活性
炭を０．５ｇずつ秤量して入れ、７個のサンプルを用意
する。
【００２５】（１）パスツールピペットで蒸留水を除
き、減菌生理食塩水３．０ｍｌを含む試験管にスパーテ
ルとパスツールピペットを用いて生物活性炭をもれなく
加える。 （２）DUTY CYCLE調整機能を持つ超音波発生装置を用い
て、生物活性炭をDUTY CYCLE５０％、OUTPUT CONTROL：
２、処理時間：１分の条件で超音波処理し、微生物を剥
離する。超音波発生装置として島津製作所製超音波発生
装置ＵＳＰ−３００を採用した。又、上記のOUTPUT CON
TROL２とは、超音波出力が４０〜５０Ｗの範囲にあるこ
とを指している。
き、減菌生理食塩水３．０ｍｌを含む試験管にスパーテ
ルとパスツールピペットを用いて生物活性炭をもれなく
加える。 （２）DUTY CYCLE調整機能を持つ超音波発生装置を用い
て、生物活性炭をDUTY CYCLE５０％、OUTPUT CONTROL：
２、処理時間：１分の条件で超音波処理し、微生物を剥
離する。超音波発生装置として島津製作所製超音波発生
装置ＵＳＰ−３００を採用した。又、上記のOUTPUT CON
TROL２とは、超音波出力が４０〜５０Ｗの範囲にあるこ
とを指している。
【００２６】（３）処理液を１０-6、１０-5、１０-4、
１０-3、１０-2倍に希釈する。この希釈液１ｍｌをシャ
ーレに入れ、これに４５℃〜５０℃に保温した標準寒天
培地を約１５ｍｌずつ無菌的に加え（ｎ＝２）、３６℃
±１℃で４８時間±２時間培養し、生物活性炭から剥離
した一般細菌数を決定する（厚生省生活衛生局水道環境
部監修、上水試験法、日本水道協会、１９８５年によ
る）。
１０-3、１０-2倍に希釈する。この希釈液１ｍｌをシャ
ーレに入れ、これに４５℃〜５０℃に保温した標準寒天
培地を約１５ｍｌずつ無菌的に加え（ｎ＝２）、３６℃
±１℃で４８時間±２時間培養し、生物活性炭から剥離
した一般細菌数を決定する（厚生省生活衛生局水道環境
部監修、上水試験法、日本水道協会、１９８５年によ
る）。
【００２７】〔結果〕図１は、室外，室内実験における
７個の生物活性炭サンプルの微生物量を、本実施例に基
づくＡＴＰ法と比較例に基づく平板培養法とを用いて測
定した細菌数（cells/ml）の相関を示すグラフである。
図１によれば、相関係数ｒ＝０．９３１ときわめて良好
な結果が得られた。
７個の生物活性炭サンプルの微生物量を、本実施例に基
づくＡＴＰ法と比較例に基づく平板培養法とを用いて測
定した細菌数（cells/ml）の相関を示すグラフである。
図１によれば、相関係数ｒ＝０．９３１ときわめて良好
な結果が得られた。
【００２８】上記のように本実施例にかかる方法、即
ち、微生物が付着した生物固定化担体を採取して試料を
作成し、この試料のＡＴＰを抽出して該抽出液に発光試
薬を加えて発光量を測定し、この発光強度から担体に付
着している微生物量を決定する方法と、生物活性炭から
超音波処理によって微生物を剥離し、処理液を希釈して
から標準寒天培地を無菌的に加えて培養することによ
り、生物活性炭から剥離した一般細菌数を決定するとい
う平板培養法とが良好な相関関係を保っており、従って
簡易な手段であるＡＴＰ法によって生物活性炭中の微生
物量をかなり精度良く測定できることが判明した。
ち、微生物が付着した生物固定化担体を採取して試料を
作成し、この試料のＡＴＰを抽出して該抽出液に発光試
薬を加えて発光量を測定し、この発光強度から担体に付
着している微生物量を決定する方法と、生物活性炭から
超音波処理によって微生物を剥離し、処理液を希釈して
から標準寒天培地を無菌的に加えて培養することによ
り、生物活性炭から剥離した一般細菌数を決定するとい
う平板培養法とが良好な相関関係を保っており、従って
簡易な手段であるＡＴＰ法によって生物活性炭中の微生
物量をかなり精度良く測定できることが判明した。
【００２９】
【発明の効果】以上詳細に説明したように、本発明にか
かる生物固定化担体中の微生物量測定方法を用いること
により、従来の平板培養法ときわめて良好な相関関係が
得られ、従って簡易な手段であるＡＴＰ法を用いて生物
活性炭中の微生物量を精度良く測定することが可能とな
る。この方法は超音波を用いた場合のようにキャビテー
ションで多くの細胞構造体を破砕する惧れがなく、微生
物の生存率の面からも有効であり、且つ無菌操作等を省
略して操作自体を簡易化することが出来る。
かる生物固定化担体中の微生物量測定方法を用いること
により、従来の平板培養法ときわめて良好な相関関係が
得られ、従って簡易な手段であるＡＴＰ法を用いて生物
活性炭中の微生物量を精度良く測定することが可能とな
る。この方法は超音波を用いた場合のようにキャビテー
ションで多くの細胞構造体を破砕する惧れがなく、微生
物の生存率の面からも有効であり、且つ無菌操作等を省
略して操作自体を簡易化することが出来る。
【００３０】更に実施に際し、迅速且つ簡便な操作で短
時間に微生物量の測定を行うことができるとともに、高
価な設備を不要としてコストの面からも有利であり、格
別の精度とか熟練した測定技術を必要としないという効
果が得られ、例えば生物活性炭塔における立ち上げの際
に新たな生物活性炭を補充すべきか否かを判断するデー
タを容易に得ることができる。
時間に微生物量の測定を行うことができるとともに、高
価な設備を不要としてコストの面からも有利であり、格
別の精度とか熟練した測定技術を必要としないという効
果が得られ、例えば生物活性炭塔における立ち上げの際
に新たな生物活性炭を補充すべきか否かを判断するデー
タを容易に得ることができる。
【図１】生物活性炭のサンプルの微生物量を、本実施例
に基づくＡＴＰ法と比較例に基づく平板培養法とを用い
て測定した細菌数（cells/ml）の相関を示すグラフ。
に基づくＡＴＰ法と比較例に基づく平板培養法とを用い
て測定した細菌数（cells/ml）の相関を示すグラフ。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 藤生 昌男 東京都品川区大崎２丁目１番17号 株式 会社明電舎内 (72)発明者 島崎 弘志 東京都品川区大崎２丁目１番17号 株式 会社明電舎内 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12Q 1/02 - 1/66 C12N 11/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (3)
- 【請求項１】 微生物が付着した生物固定化担体を採取
して試料を作成し、この試料のＡＴＰを抽出してから、
該抽出液に発光試薬を加えて発光量を測定し、この発光
強度から担体に付着している微生物量を決定する生物固
定化担体中の微生物量測定方法において、 前記生物固定化担体は生物活性炭であることを特徴とす
る生物固定化担体中の微生物量測定方法。 - 【請求項２】 前記ＡＴＰ抽出用試薬としてトリクロロ
酢酸を用いたことを特徴する請求項１記載の生物固定化
担体中の微生物量測定方法。 - 【請求項３】 前記ＡＴＰの発光試薬としてルシフェリ
ン，ルシフェラーゼを用いたことを特徴とする請求項１
記載の生物固定化担体中の微生物量測定方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03103693A JP3168755B2 (ja) | 1993-02-22 | 1993-02-22 | 生物固定化担体中の微生物量測定方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP03103693A JP3168755B2 (ja) | 1993-02-22 | 1993-02-22 | 生物固定化担体中の微生物量測定方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06245795A JPH06245795A (ja) | 1994-09-06 |
| JP3168755B2 true JP3168755B2 (ja) | 2001-05-21 |
Family
ID=12320274
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP03103693A Expired - Fee Related JP3168755B2 (ja) | 1993-02-22 | 1993-02-22 | 生物固定化担体中の微生物量測定方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3168755B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2002191395A (ja) * | 2000-12-27 | 2002-07-09 | Zeon Joho System Kk | 製品の真偽判別方法 |
| EP2379226B1 (en) * | 2008-12-31 | 2016-04-20 | 3M Innovative Properties Company | Live bioload detection using microparticles |
| US9284593B2 (en) | 2009-12-30 | 2016-03-15 | 3M Innovative Properties Company | Live bioload detection using microparticles |
-
1993
- 1993-02-22 JP JP03103693A patent/JP3168755B2/ja not_active Expired - Fee Related
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06245795A (ja) | 1994-09-06 |
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