JP3163090B2

JP3163090B2 - 網膜芽腫診断剤

Info

Publication number: JP3163090B2
Application number: JP50200689A
Authority: JP
Inventors: サデュースピードライジャ; ステファンフレンド; デビットダブリューヤンデル
Original assignee: マサチューセッツアイアンドイヤーインファーマリー; ホワイトヘッドインスティチュート
Priority date: 1988-01-21
Filing date: 1989-01-23
Publication date: 2001-05-08
Anticipated expiration: 2016-05-08
Also published as: JPH04501951A; EP0398955A1; EP0398955B1; DE68928728D1; AU3038189A; ATE168135T1; DE68928728T2; WO1989006703A1; CA1340483C; EP0398955A4

Description

【発明の詳細な説明】［産業上の利用分野］この発明は網膜芽腫の治療診断のための物質及びこれ
ら物質を使用した各種分析方法に関する。

［従来の技術］本出願は1986年８月11日出願（USSN895,163、ドライ
ジャら（DRYJAet al.））の一部係属出願における1988
年１月21日出願（USSN146,525ドライジャら（DRYJA et
al.））の一部係属出願である。両出願は参考文献と
して本明細書中に含まれている。

本発明は網膜芽腫遺伝子に関するものであり、欠損網
膜遺伝子を保持した患者の発見及び治療に関する方法で
ある。

網膜芽腫とは網膜細胞が腫瘍になった状態を指し、０
才から４才迄の子供にのみ見られる病気である。合衆国
では新生児の内、３万４千人に１人から１万５千人に１
人の割合で網膜芽腫に侵されている（L.E.ZIMMERMAN,19
85,網膜芽腫及び網膜細胞,W.H.SPENCER,眼科病理学ア
トラスアンドテキストブック出版，第２巻，フィラ
デルフィア,W.B.SAUNDERS Co.,pp.1292−1351.）。本
病気が治療されない場合、眼球内腫瘍の悪性腫瘍細胞
は、生体内の別の場所に転移し、もはや制御することが
できないほど病巣が発達することとなり、これが致命傷
となる。眼球内の腫瘍が大きい場合の現在行われている
網膜芽腫の治療方法というものは、病気に侵された眼球
を摘出することである。また、腫瘍の大きさが小さい場
合には、放射線療法、レーザ療法あるいは冷凍療法が好
んで用いられる。しかし、現在このような転移した網膜
芽腫に対する効果的な治療方法というものはまだ確立さ
れていない。一般的な癌治療の場合と同じように、病気
進行の初期の段階において診断を行えば、罹病率と死亡
率は療法とも減少することができる。

網膜芽腫の病例の内30−40％においては、病気にかか
った患者は、網膜芽腫の遺伝性素因を保有しており、患
者の子孫に優性的な特徴として伝えられる（A,G,KNUDSO
N,1971,突然変異と腫瘍：網膜芽腫の統計的研究,Proc.N
atl.Acad.Sci.,Vol.68,pp.820−23）。このような網膜
芽腫素因の特性を保有する者は、初期の腫瘍が様々な形
態の腫瘍へと発達するきわめて高い危険性に晒されてい
る。特に、悪名高いものとしては、骨肉腫及び軟皮肉腫
等に発達する可能性がある。血統的な網膜芽腫の原因と
なる遺伝子因子座は、ヒト染色体のq14バンドに割り当
てられている（R.S.SPARKES et al.,1980,Science,Vo
l.208,00.1042−44）。多くの場合、網膜芽腫は網膜芽
腫因子座に正常で優勢の同族対立遺伝子が欠落している
細胞から発生する。しかし、１つの欠損対立遺伝子を保
有する子供（個体）は病気に罹り易い。片目を網膜芽腫
に侵された子供あるいは網膜芽腫に罹った患者と結縁関
係にある子供は、遺伝的にいって病気に罹り易く、従っ
て病気が悪化しやすい危険性を持っている。このような
病気に侵された個体は、通常２〜３月毎に麻酔状態で行
わなくてはならない癌検診法で検査される。

［課題を解決するための手段及び作用］本発明の概要本発明は、Rb遺伝子をコードした単離された核酸（10
0kb以下の大きさ）及びその少なくとも15塩基から構成
されるフラグメントに関する。本発明は、また前記核酸
により形質転換された細胞、前記核酸によりコードされ
た単離ポリペプチド及び前記ポリペプチド若しくは天然
の網膜芽腫ポリペプチドに対する抗体に関する。網膜芽
腫ポリペプチドとは、Rb遺伝子によってコードされたポ
リペプチドをいう。さらに、本発明は、薬学的に許容さ
れたキャリア（賦形剤）中に網膜芽腫ポリペプチド又は
そのフラグメントが含有され、欠損Rb遺伝子を保持した
患者を治療するために適した組成物に関する。

本発明は、さらに、網膜芽腫が発症する危険性がな
く、従来行われていた検査を必要としないことを決定す
るためのヒト患者の選別に関する。この選別方法では、
例えば、患者の核酸と、ヒトRb遺伝子をコードする精製
された核酸、若しくはそのフラグメントとの比較を行
う。

このように、本発明は患者が網膜芽腫素因を持ってい
るか否かの分析に適している。この分析とは、網膜芽腫
遺伝子内における大小サイズの欠損、前記遺伝子内の部
分的突然変異を検出すること含む。または、特定のFRLP
（制限酵素フラグメントポリモルフィズム）における欠
損の共同遺伝を検出することを含む。さらに、網膜芽腫
遺伝子用検査で患者から採取した核酸サンプルをRb遺伝
子に対する特異的なプローブとハイブリッドさせてプロ
ーブが前記核酸とハイブリッドする能力を決定すること
により正常又は欠損網膜芽腫の存否を検出することを含
む。ここで核酸に対するハイブリッドの形成が検出され
ない場合には、遺伝子内に大規模な欠損が存在すること
を示すことになる。また、ここでRb遺伝子に特異的なプ
ローブは、前記患者の核酸サンプルから物理的な特性に
より分離されたフラグメントとハイブリッドを形成させ
てもよい。この場合、プローブとフラグメントとのハイ
ブリッド形成を検出し、このハイブリッドが、正常なRB
遺伝子から単離された核酸フラグメンとプローブとによ
り形成されたハイブリッドと比較される。仮に、この正
常なものと比較して、ハイブリッドが検出されない場合
や、ハイブリッドが形成されたものの、そのサイズがよ
り小さい場合には患者のRb遺伝子に大きな欠損が存在し
ていることを示す。ここで用いられるRb遺伝子に対する
特異的なプローブは、好ましくは、プラスミド4.7R中に
クローニングされたDNA若しくはそのフラグメントであ
る。また、上記特定の物理的特性とは、好ましくは分子
量である。

小規模欠損又は部分突然変異は、次のような方法によ
り検出可能である。

（ａ）患者から取り出した網膜芽腫対立遺伝子の核酸配
列を決定すること（ｂ）前記ヌクレオチド配列と網膜芽腫に罹患していな
い人から取り出した網膜芽腫対立遺伝子若しくはそのサ
ブ領域の核酸配列とを比較すること（ｃ）患者から得られた核酸サンプルと網膜芽腫に罹患
していない人から得られた網膜芽腫遺伝子に特異的なプ
ローブとの間のミスマッチを検出すること、である。ま
た、特定の遺伝多形体と網膜芽腫遺伝子とが共同遺伝
（co−inheritance）した場合には、患者は網膜芽腫の
素因を備えている可能性が高いといえる。本方法によれ
ば、核酸フラグメントは患者から得られたサンプルから
生成され、また、そのフラグメントが持つ特定の物理特
性（例えば、分子量）に基づいて分離される。また、網
膜芽腫遺伝子を特異的に検知可能なプローブは前記フラ
グメントにハイブリッドさせ、このハイブリッド体は、
同じプローブと患者の両親のサンプルから分離された核
酸フラグメントとのハイブリッドにより検出されたハイ
ブリッド体と比較される。

本発明の他の特徴は、欠損Rb対立遺伝子を備えていると
判断された患者の治療に用いられるRbポリペプチドを合
成するために、正常な人間の網膜芽腫遺伝子から分離し
て得られた物質を使用することである。

本発明のさらに他の特徴は、網膜芽腫ポリペプチドに
対する抗体を精製し、前記抗体と腫瘍サンプルを接触さ
せ、網膜芽腫ポリペプチドの腫瘍サンプル内での存在を
示す識別として免疫複合体を検知することにより、患者
から得られた腫瘍サンプル内に網膜芽腫ポリペプチドが
あることを検知することにある。ポリペプチドが存在す
るということは、網膜芽腫対立遺伝子内の欠損によって
腫瘍が発生しているということを示している。本方法に
おいては、網膜芽腫ポリペプチドあるいはそのフラグメ
ントと特異的に反応する抗体（すなわちモノクローン抗
体）と患者から得られた腫瘍サンプルとを接触させ、ま
た皮膚標本の細胞と抗体が結び付くか否かを判定する。
突然変異複合体が存在しないということは、欠損網膜芽
腫遺伝子により腫瘍が生じたということを示している。

本発明の特徴及び作用は、以下に続く本明細書の好適
な実施例及び請求の範囲から明らかである。

［実施例］好適な実施例の説明本発明の好適な実施例の説明の前に、図面について簡
単に説明する。

図面第１図はクローンp4.7R.内のインサート（挿入断片）
の制限酵素マップの概略図である。

第２図は、網膜芽腫遺伝子のゲノム上の制限酵素マッ
プの概略図である。

第３図は本願のp2AR3.8及びp2AR0.9ベクターの概略図
である。

第４図は正常網膜芽腫遺伝子のスケールマップであ
る。

第５図（５−１〜５−３）は隣接領域（フランキング
領域）を備えた正常網膜芽腫遺伝子のcDNAの核酸配列を
示す。

第６図（６−１〜６−９）はフランキング領域を備え
た正常網膜芽腫遺伝子のエキソン（exon）の核酸配列を
示す。

第７図はDSPsの配置を示す網膜芽腫遺伝子の制限マッ
プである。

第８図はゲル及び網膜芽腫プローン（prone）ファミ
リー内の多形体RB1.3の遺伝形質を示すダイアグラムで
ある。

第９図は遺伝双網膜芽腫を持つ３ファミリー内のDSP
RB1.3の分離状況を示すダイアグラムである。

網膜芽腫ポリペプチド Rb（網膜芽腫）ポリペプチドは、正常網膜芽腫遺伝子
の核酸配列によってコードされた特定アミノ酸配列であ
る。本発明のRbポリペプチドは次の組成物を含む。

（１）天然に発生した網膜芽腫タンパク質（２）合成された網膜芽腫ポリペプチド（３）生体外形質発現システムを経て精製された核酸
（例えばcDNA又はゲノミックDNA）から製造された網膜
芽腫ポリペプチドさらにまた、自然発生するRbポリペプチドの生物学的
活性は本ポリペプチドのエピトープ（抗原決定基）を含
むRbポリペプチドの生物学的活性フラグメントが含まれ
ており、このためRb特定抗体の生産に適している。

網膜芽腫遺伝子 Rb遺伝子はヒトゲノム内の特定の核酸配列であり、Rb
遺伝子の欠損若しくは突然変異が網膜芽腫の発生要因と
なる。網膜芽腫遺伝子をコードした精製した核酸は、細
胞内において増殖可能なベクターに担持される。

Rb遺伝子をコードする精製された核酸は、ハイブリッ
ド条件下において網膜芽腫遺伝子をハイブリッド（複合
形成）する自然環境（例えば、cDNA又はゲノミックDNA
のフラグメント）から遊離された核酸として定義され
る。網膜芽腫をコードする精製された核酸（この核酸が
ベクターに担われる）の一つの例としてはcDNAクローン
p4.7Rがある。このクローンは次のような方法によって
得られる。

cDNA ヒト染色体13ラムダファジーライブラリィから単離さ
れたヒトDNAプローブpH3−８（M.LALANDEら,1984,CANCE
R GENET.CYTOGENET.,VOL.13,pp.283−95）は、H3−８
配列を取り囲む30kbのゲノムDNAとして分離され、ま
た、その地図を作成するための染色体ウオーキング技術
に使用されている。この技術によって作り出されたp7H3
0,7Rという名前のフラグメントは、ヒト染色体13内にお
けるDNA配列と同様にマウスゲノム内のDNA配列としても
認識し得ることが発見されている（T.P.DRYJAら,1986,P
ROC.NATL.ACAD.SCI.USA,VOL.83,pp.7391−94）。ヒトと
マウスDNAの両方に対するp7H30.7Rの相同性から、p7H3
0.7Rには構造遺伝子のコード配列が含まれていることが
示唆された。

この可能性を確認するために、p7H30.7Rは放射性同位
元素を使って標識され、３検体の網膜芽腫腫瘍及びアデ
ノウイルス12−形質転換ヒト胎児網膜細胞ライン（VAES
SEN et al.,1986,EMBO JOURNAL,VOL.5,pp.335−）か
ら単離されたRNAのノーザンブロットのプローブとして
使用された。前記p7H30,7Rプローブは、網膜細胞ライン
由来のおよそ4.7kbのRNA転写産物とハイブリッド形成し
た。しかし、３検体の腫瘍サンプルからのRNA転写産物
とは、いずれもハイブリッドを形成しなかった。

後に、アデノウィルスで形質転換された網膜芽腫ライ
ンから分離されたRNAは、cDNAライブラリィを構築する
ために使用された。このライブラリは標識されたp7H30.
7Rプローブを用いて選別された。単離されたcDNAクロー
ンの中には、類似した制限酵素マップを持つものが存在
していた。p4.7Rの最も長いものは4.7kbのDNAを含んで
いる。クローンp4.7Rのインサートの制限マップは第１
図に示す通りである。

p4.7Rクローンは４つの網膜芽腫サンプル、１つの骨
肉腫サンプル、上記アデノウィルスで形質転換された網
膜細胞から分離されたRNA転写産物をスクリーニングす
るために使用された。分離されたRNAのノーザンブロッ
ト分析において、形質転換された網膜細胞内には４つの
網膜芽腫及び一つの骨肉腫細胞サンプルの中には存在し
なかった4.7kb転写産物が存在し、またこの転写産物がp
4.7Rプローブと交差反応を起こすことが示された。

ゲノムDNA 網膜芽腫遺伝子を含むゲノムDNAを内在しているクロ
ーンは、以下に説明する方法で分離された。ラムダファ
ージクローニング用ベクターEMBL−３内に挿入されたヒ
トのゲノムDNA断片を含む組換えバクテイリオファージ
ライブラリィは公知の方法に従って構成された（Seed
ら、1982,GENE,Vol.19,pp.201−209）網膜芽腫遺伝子の
フラグメントを含むこれらの組換えバクテリオファージ
は、当初はバクテイオファージプラークのp4.7Rとのハ
イブリッド形成によって検知された。

部分的に重なり合っているヒトのゲノムDNAフラグメ
ントを含む36種のことなった組換えバクテオファージが
分離された。そのうち選択されたバクテリオファージは
プラク形成法で精製増幅されて、各ファージ挿入断片の
制限マップは、Rackwithら,gene,Vol.30,pp.195−200の
方法によって決定された。

これらのバクテリオファージを用いて約200kbにわた
る領域の制限マップが構成され、第２図及び第４図に示
されている。網膜芽腫遺伝子からのmRNA内に存在する既
知の配列は、すべてこのクローン化された領域内に存在
する。全体としては、これら一連のバクテオファージ内
に存在するヒトのDNA配列は、Rb遺伝子の染色体の切片
を表わしている。第２図において、このマップ上方の垂
直のマークはHind IIIサイトの場所を示しており、また
マップの下方にある垂直マークはEcoR Iサイトの場所を
現している。箱で囲まれた領域はcDNA（エキソン）内で
発見された配列を含むHind IIIフラグメントを表わして
いる。マップ下方の両端に矢印を持つ記号はそれぞれ異
なった組換えバクテリオファージクローンを表わしてい
る。第４図には６種の制限酵素Hind III,EcoR I,Xba I,
Sac I,Sac II及びBamH Iの認識サイトがすべて示されて
いる（New England Biolabs,Inc.）。エキソンを含む制
限エンドヌクレアーゼフラグメントは、cDNAクローン若
しくはcDNA配列に基づいて合成されたオリゴヌクレオチ
ド配列とのハイブリッド形成によって同定された。これ
らの制限フラグメントはプラスミド・ベクター・ブルー
スクライブ（BLUESCRIBE）内にサブクローンされた（ST
RATAGENE,San DIEGO,CA）。24の異なるプラスミドの全
部がこのような方法によってサブクローンされた。

各エキソンの数及びその大きさは以下の方法の反復に
よって決定された。まず、cDNA配列の最初の20個のヌク
レオチドに対応するオリゴヌクレオチドが合成された。
このオリゴヌクレオチドをプライマとして用い、大部分
の５′側エキソンを含むゲノムの挿入片を持つプラスミ
ドの配列化が決定された。その結果得られた配列は、cD
NA配列と整列させることにより第１エキソンの長さが決
定された。このプラスミドとcDNAの配列が分岐する点が
第１イントロンの起点としてマークされた。

合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いて、このエ
キソン及びフランキング（隣接）領域の配列をさらに決
定し、５′側プロモータ配列、エキソン１及びイントロ
ン１の始点から構成される連続したヌクレオチド配列を
生成した。第２及びそれに続くエキソンは、エキソンに
以前には割当てられていなかったcDNA配列の次の20個の
ヌクレオチドに対応する配列決定用のプライマーを合成
することによって規定された。すべてのエキソンと直接
フランキング（隣接）しているイントロンの配列は、セ
ンス及びアンチセンスの両方向から配列決定させた。

配列決定のジデオキシヌクレオチド鎖ターミネーショ
ン法は、シーケナーゼ酵素（UNITED STATES BIOCHEMI
CAL CORPORATION,クリーブランド，オハイオ）を利用
し製造元の提供する添付量に従って行われた。エキソン
20の下流にあるイントロン領域は、この方法によって配
列を決定することは出来なかった。これは、この領域に
おいては異常なほどに問題の多い繰り返し配列が存在
し、一連の45ストップが生じたからである（配列決定ゲ
ルの４レーンすべてにバンドが現れた）。この領域を解
明するため、Tagポリメラーゼ（Perkin−Elmer/Cetus）
を用いて配列決定反応が行われた。この酵素は68℃にお
ける重合を可能にしてこの領域における塩基を解明し
た。

すべての配列決定データはシーケンス分析プログラム
Microgenie Sequence Software（Beckman,Palo Alt
o,CA）を用いて、分析され重複領域に関してスクリーン
された。

遺伝子の制限マップ内の各エキソンの位置は、様々な
制限エンドヌクレアーゼによって消化された組換えバク
テリオファージDNAをcDNAフラグメント若しくは合成オ
リゴマ配列とハイブリッド形成させることにより決定さ
れた。大抵のエキソンの正確な位置は、次いでエンドヌ
クレアーゼの認識配列がイントロン−エキソン配列内で
判別され、マップと相関されて推定された。残りのエキ
ソンの各々の位置は、それに対してハイブリッドを形成
する最小フラグメントの中心部に任意配置された。

第４図に示すように、網膜芽腫遺伝子のゲノムマップ
に沿って27個のエキソンが組織されている。この図にお
いては６種の制限エンドヌクレアーゼに対する認知サイ
トとこれらのサイトに相関するエキソンの位置が詳述さ
れている。エキソン1,2,3,6,9,10,13,21,22,23,24,25及
び26,27は地図（マップ）の上に正確に配置されてい
る。他のエキソンは小さな制限フラグメントの中にマッ
プされており、これらのフラグメントの真ん中に描かれ
ている。この技術によってエキソン11,17及びエキソン1
4〜16のクラスターは2.0kb以下の不正確さをもって地図
（マップ）上に位置付けられた。残りのエキソン（エキ
ソン4,5,7,8,12,18,19及び20）は真の位置に対し0.8kb
以下の誤差を持ってすべて地図（マップ）上に位置付け
られている。参考までにこのマップは、また（天然の発
生する）制限フラグメント長の多型性の位置も示してい
る。

第６図（６−１から６−９まで）は各エキソンにフラ
ンキング（隣接）しまたこれを含む配列を表わしてい
る。これらエクソンの大きさは31ヌクレオチド（エキソ
ン24）から1973ヌクレオチド（エキソン27）までの範囲
に亘っている。最も短いイントロン配列は80ヌクレオチ
ド長であることが分かっており、エキソン15及び16の間
に位置している。一方、最長のイントロン配列は約70.5
kbにわたり、エキソン17と18の間に存在している。すべ
てのイントロン供与部位（DONOR）及び受容部位（ACCEP
TOR）のスプライス（境界）部位は、すべてGT−AGスプ
ライス部位法則に従っている。我々の配列決定方法は、
従来報告された方法に比べ網膜芽腫遺伝子を含むエキソ
ンの正確な数を定義するという点においてより正確であ
る事が証明された。

第１エキソン及びこのエキソンのすぐ５′側の領域は
Ｇ−Ｃが大変豊富であり、これがプロモータ領域の特徴
である。この領域にはHpa II制限サイトを９つ含む可能
性があり、Ｃ＋Ｇヌクレオチドを66％含み、CpG抑制を
示すことはない。これらの基準はHTFアイランド（ISLAN
D）の存在を示している。このプロモータ領域は、シー
ケナーゼあるいはTagポリメラーゼのどちらかを用いて
も、センス若しくはアンチセンス方向のどちらにも解明
することのできないヌクレオチドを含んでいた。この事
はおそらくこのプロモータ領域において形成されている
２次構造によるものであろう。

Leeら（1987b）によって定義された転写開始サイトの
上流およそ30ヌクレオチドの配列の分析では、他のプロ
モータ領域内において発見されているTATAボックスの存
在は明らかにされていない。この事は以前に発表された
（転写）開始部位が実際は正確に規定されていないか、
あるいはまた網膜芽腫遺伝子にはプロモータ領域の基本
的なTATA及びCAATボックスが欠けていることを示唆して
いる。

エキソン１までの５′側配列をさらに分析すると、図
面６−１における標識された＃122の塩基対、塩基対−
＃274においてTATAボックスの可能性が示されている。
７つの塩基からなる領域の相同性は57％に過ぎないにも
拘わらず、最も頻繁に保存されている塩基である最初の
４つの塩基Ｔ−Ａ−Ｔ−Ａは100％相同である。予測さ
れるキャピング（CAPPING）サイト,CAC,は14塩基程離れ
た所及び、また49塩基離れた所に位置してている。この
領域は一般的にＧ−Ｃが豊富であるにもかかわらず、CA
ATボックスは見出だされていない。

エキソン20の３′端側に隣接して配置されているイン
トロン配列は、互いに87ヌクレオチド離れているTTT
（Ｔ）Ｃ配列の21連続繰返し配列から構成される。繰返
し単位の数は、個体間の相違と、遺伝可能なDNA多型の
ように振舞う繰返し配列の数によって決定される対立遺
伝子との間で変更される。

配列データのコンピュータサーチによれば、Alu反復
配列と相同ないくつかのイントロン領域があることが判
明している。Alu反復配列は以下に示す領域に存在して
いる。

１）第６図に示したエキソン２の下流、第492塩基と第7
04塩基との間；２）エキソン９の上流、第19塩基と第117塩基との間；３）エキソン11の下流、第504塩基と第608塩基との間；４）エキソン14の両側に隣接するイントロン配列、第13
2塩基と第270塩基との間及び第420塩基と第741塩基；５）エキソン17の上流、第36塩基から第210塩基。

エキソン２の下流に位置するAlu配列には、Alu反復配
列内に高度に保存された２つの内部配列が含まれる。そ
の一つは、SV40転写開始転のＴ抗体結合配列に対応する
配列（GAGGCNGAGC）である。他の一つは機能が不明な対
称配列（CCAGCCTGG）である。この短い対称シーケンス
はまた、エキソン14の両サイドに位置する各Alu配列の
両方に存在する。エキソン14及び15は、ほぼ完全にAlu
配列から構成されたショートイントロンによって分離さ
れている。このことは、エキソン14及び15が、おそら
く、以前は単一のエキソンであり、進化の過程でAluエ
レメントの挿入によって分割されたことを予測させる。
レトロポゾンは互いに近接してインテグレートする傾向
を持つことから、このAluシーケンスはエキソン14の
５′端に位置した他のAluシーケンスから、この位置に
挿入された可能性がある。

網膜芽腫遺伝子の３′端部には、通常のポリアデニレ
ーションシグナル配列、AATAAAが含まれている。このヘ
キサマーの32塩基下流に位置した一の配列（TGTGTTCT）
は、McLauchlan等（1985）により記述された、保存され
た下流コンセンサス配列（YGTGTYY）に該当する。この
シーケンス及び周辺の塩基は、一般にポリアデニレーシ
ョンシグナル配列（Birnstiel等,1985）の30塩基下流の
領域内に見出ださせる"G/Tクラスター”を構成してい
る。

p4.7Rプローブは、互いに関係の無い50個体（網膜芽
腫40個体、骨肉腫（オステオサルコーマ）８個、及び遺
伝性の網膜芽腫を持つ患者で発症する未知細胞由来の未
分化腫瘍２個体）の各腫瘍から分離されたゲノムDNAを
スクリーニングするために用いられた。これらについて
は、以下に詳細にのべる。これらのDNAサンプルはHind
IIIによって消化され、放射線標識されたp4.7Rをプロー
ブとして用いたサザンブロットハイブリダイゼーション
により分析された。この分析により、３種類のゲノムDN
Aの制限フラグメントの分離パターンが明らかにされ
た。これらは、明らかなホモ接合体欠損を表す全体が欠
損したフラグメント、ヘテロ接合体欠損を表しその欠損
が明瞭に示されないフラグメント、及び部分的欠損また
は制限サイトの変化のいずれかを反映する大きさの変化
したフラグメントである。腫瘍DNAの少なくとも30％は
これら３種類の異常のいずれかを示していた。

これに対し、18の正常な個体から得た白血球DNAのサ
ザンブロット分析では、制限フラグメントは１つの均一
なパターンを示した。

使用 cDNA及びゲノムシーケンス、例えば、p4.7R内に担持
されたものなどは、個体におけるRb遺伝子の変異対立遺
伝子の存在を確認するためのスクリーンにも用いられ
る。このスクリーニング方法によれば、一方の目に網膜
芽腫の家系的あるいは先天的要因を持つために網膜芽腫
が進行する危険を持つ個体が通常の眼球検査を定期的に
受信する必要があるかどうかが判定することが可能とな
る。すなわち、このスクリーン処理によって個体が変異
Rb対立遺伝子を持つことが判明した場合にのみ、前記眼
球検査を定期的に行う必要が生じる。一方、２個の正常
なRb対立遺伝子を個体が持つ場合には、このような個体
内で網膜芽腫が成長するケースは約1/20000または0.005
％であることから、もはや検査を継続的に行う必要がな
い。なお、対立遺伝子を不活性化するのに十分な変異を
持つRb対立遺伝子を持つ個体の場合には、網膜芽腫が成
長する危険性は80−90％にのぼる。

このように、現在定期的に検査を受けている個体のか
なりの割合は、実際には一般的な人に比べ危険が大きい
訳ではない。網膜芽腫の家系的素因も先天的素因も一の
個体が遺伝的にこの病気にかかることの結論的証拠では
ない。

従って、現に２個の正常なRb遺伝子のコピーを持つ上
述した個体が、これまで不必要にもかかわらず高価でま
た眼球を傷つけるおそれのある眼球検査を繰返し受け続
けてきたということがいえる。

本発明に係るスクリーン方法は、以下の各ステップを
含む。すなわち、（１）Rb遺伝子因子座における大きな
欠損の判定のために患者の核酸サンプルを検査するステ
ップ；（２）Rb遺伝子因子座の小さな欠損またはポイン
ト変更の判定のために患者の核酸サンプルを検査するス
テップ；及び（３）Rb遺伝子因子座にリンクしたRFLPを
判定するために患者の核酸サンプルを検査するステップ
である。

Rb遺伝子における大規模欠損の検出 Rb遺伝子由来のDNAプローブが使用可能であること
は、網膜芽腫素因対立遺伝子を生み出し得る遺伝子の損
傷を直接検出する手段を提供することが可能となる。す
なわち、このような好適なプローブには、完全長の正常
網膜芽腫遺伝子配列あるいは網膜芽腫遺伝子の特定フラ
グメントをコードした15またはそれ以上の塩基からなる
フラグメントを含む。そして、これらプローブを用いて
ブサザンブロット及びドットブロット解析を実施する場
合には、これら分析は多数の塩基対の欠損等、Rb遺伝子
内の大きな構造的変化を起こすような欠損の検査に通常
は限定される。

サザンプロットまたはドットプロット分析に用いられ
るDNA検体は、通常、末梢の白血球から分離されるが、
仮に、患者が一の眼球に腫瘍を持つ場合にはこの腫瘍か
ら採取される。白血球DNAの検査に際しては、まず個体
から10ミリリットルの血液サンプルを採取し、この血液
サンプルの白血球から周知の技術を用いてゲノムDNAを
分離する。このDNAはHind IIIなどの制限エンドヌクレ
アーゼによって消化され、これによって生じるフラグメ
ントは、分子形状または分子量等の物理的特性に基づい
てアガロース電気泳動ゲル上で分画される。本発明の目
的においては、分子形状は線状、環状、二本鎖または一
本鎖などの構造形態として特定される。

ゲル中のDNAは、ブロティングによりニトロセルロー
スフィルタへ転移される。このフィルタは、その後放射
線標識されたp2AR3.8、及びこれとは別に、EcoR1消化に
より得られたp4.7Rのサブフラグメントを含むp2AR0.9を
用いて検査される。（p2AR3.8及びp2AR0.9のベクターの
ダイアグラムを第３図に示す）。検出された種々の異常
の存在位置をより正確に特定するためには、p4.7Rのイ
ンサートの全体をプローブとして用いるよりも２個また
はそれ以上のサブフラグメントプローブに分けて使用し
たほうが好ましい。試験されたフィルタの放射線写真の
結果から、被検体の体細胞または腫瘍DNA内におけるRb
因子座の制限酵素マップを構築するために必要なデータ
を得ることが可能となる。

この制限マップは、同一の制限酵素及び同一のプロー
ブを用いて特定されたコントロールの制限マップと比較
される。このコントロールDNAは、アデノウイルス形質
転換網膜細胞ラインまたは正常な複数の個体の一組に由
来する白血球DNAから得られる。もし、被検体がかなり
大きな欠損を含むRb対立遺伝子を持つ場合、そのDNAの
制限マップは、コントロールの制限マップと比較する
と、一または複数の付加的バンド及び／またはその強度
が50％低下した一または複数のバンドが含まれることに
なる。この強度の低下は、Rb因子座における一方の対立
遺伝子内における消失により生じた一または複数の制限
フラグメントの大きさの変化または完全消失により引き
起こされるものである。このようなサザン分析によるス
クリーニングによって、大きな欠損部分を持ち、これに
よって機能を失ったRb対立遺伝子の存在を検出すること
ができる。仮に、この分析によって個体由来の被検DNA
がコントロールマップと異なる制限マップを有すること
が判明した場合には、当該個体は機能欠損型の変異Rb対
立遺伝子を保持している可能性が高い。このような個体
は、その後網膜芽腫の進行について頻繁にモニタをうけ
る必要がある。

もし、検査した制限マップがコントロールのマップと
一致した場合には、当該個体が小さな欠損部またはポイ
ント変異を持つRb対立遺伝子を有しているか否かを判定
するための他の異なるスクリーン処理を行うことが可能
である。小欠損及びポイント変異は対立遺伝子を不活性
化するには十分であるが、プローブとの（ハイブリッ
ド）を防ぐことは出来ない。このようなスクリーニング
処理の一例につき以下に概要を述べる。

その他の突然変異の検出 Rb遺伝子座における小規模欠損若しくは部分的突然変
異に関し患者のDNAサンプルを調べるためには、Rb遺伝
子の相同物が両方とも患者からクローンされなくてはな
らない。クローンされた対立遺伝子は、その後、以下に
示す二つの内のどれか一つの方法によって、正常対立遺
伝子、例えば、p4.7Rと異なる核酸配列の存在を調べる
ことが可能である。前記方法は、（１）クローンされた
対立遺伝子及びp4.7Rの核酸配列を検出しそれらを比較
する（２）p4.7Rから転写されたRNAを検査される患者か
ら取り出された一本鎖にされた完全長のゲノミックDNA
とハイブリッドさせ、この結果物であるヘテロ２重鎖は
リボヌクレアーゼＡ（RNase Ａ）によって処理され、
何らかのミスマッチ位置を検出するための変性ゲル上で
泳動させる。つまり、これらの方法は以下の手順に従っ
て実行される。

検査される患者のRd遺伝子の対立遺伝子は従来の周知
の技術を使用してクローンされる。例えば、一般的な方
法としてはバクテリオファージベクターEMBL3（Frisoha
uf et al.,1983,J.Mol.Biol.,Vol.170,pp.827−）が
採用される。10ミリリットルの血液サンプルを患者から
取り出す。このサンプル内の細胞から分離されたゲノミ
ックDNAは、Mbo Iによって部分的に消化され、約20kb程
度の平均的フラグメントサイズとされる。18−21kbの範
囲にあるフラグメントが単離される。この結果、得られ
るMbo I認識部位を末端に有するフラグメントは、EMBL3
ベクターとライゲーションされる。なお、このEMBL3ベ
クターは、ライゲーション前にBamH Iで完全に消化さ
れ、アルカリホスターゼ処理され、さらに10分間68℃に
熱せられ、その粘着末端が破壊されたものが用いられ
る。このライゲーション後の反応液は、次に、インビト
ロのラムダパッケージング反応に用いられ、パッケージ
ングされたファージはプレートストックを生育させるこ
とによって増幅される（このクローン技術は、Maniatis
et al,1982、Molecular Cloning,A Laboratory M
anual,Cold Spring Harbor Publications,pp.256−2
93.に記載されている。）このプレートストックからの約５×10³プラーク形成
ユニット（pfu）は、ハイブリッド及び放射性同位元素
を使って標識されたp4.7Rによって選抜される。p4.7Rプ
ロープにハイブリッドされるプラークは、プラーク精製
され上記の手続きに従って再度、選抜される。再スクリ
ーニングから得られた陽性（ポジティブ）プラークは分
離されRb対立遺伝子を含んでいると思われるDNAを患者
から得るために分離され使用される。

これら分離されたEMBL3ベクターDNAサンプル内のMbo
Iゲノミックインサートはサザン解析を用い、p4.7Rと相
同な配列位置の検索に関しての試験が行われる。完全な
Rb遺伝子を含む領域がDNAサンプルとして選択される。
これらサンプルの中のRb遺伝子を含む適切な制限フラグ
メントは適当なベクター（例えばpUC9）にサブクローニ
ングされる。これらのサブクローンは、検査されるべき
上記個体から得たDNAの一方又は双方のRb対立遺伝子の
コピーを含んでいる。両対立遺伝子が存在しているかど
うかを判断するためには、初期のファージ分離物に対
し、制限断片の多型が存在するか否かに関する試験を行
う。これらサブクローンされた対立遺伝子は、以下の技
術のどれか一つを用いてp4.7Rとの相違しているかに関
し検査される。

まず第１に、p4.7R内に存在する正常Rb遺伝子の核酸
配列が決定される。p4.7Rからおよそ500塩基対（bp）の
制限フラグメントはM13mp8ファージベクターにサブロー
ンされ、ジデオキシ技術によって配列決定される（Sang
er et al.,1977.,,PROC.Natl.ACAD.SCI.USA,Vol.74,p
p.5463−）。次に、Rd遺伝子を構成する配列は、これら
個体から得た個々のサブクローン配列を組み合わせるこ
とにより作られる。正常網膜芽腫遺伝子の完全配列とフ
ランキング配置の配列は、第５図及び６図に示されてい
る。

分離されたRb遺伝子対遺伝子は、以下の方法に従って
配列決定される。対立遺伝子の制限フラグメント（〜2k
b）はM13mp8ベクターにサブクローンされ、p4.7Rから分
離された小さな制限フラグメントをプライマーとして用
いて、、ジデオキキシークエンス反応によりショートス
トレッチ（〜500bp）毎の配列が決定される。分離され
た対立遺伝子の完全な核酸配列は、個々にプライミング
されて決定された核酸配列に基づいて構築される。この
配列は、正常Rb遺伝子の配列と直接比較され、p4.7Rに
基づき分離された対立遺伝子内に欠損若しくはポイント
変異が存在するかが決定される。

対立遺伝子DNAと正常Rb遺伝子を比較するもう一つの
方法は、p4.7R配列と対立遺伝子配列の間における差異
（ミスマッチ）を検知するためにRNasaを使用する。こ
の比較はp4.7R配列の小制限フラグメント（〜500bp）を
プローブとして用いることにより実施することができ
る。先ず、p4.7Rは、制限酵素によって消化される。こ
の制限酵素はRb遺伝子配列を約500bp強のフラグメント
に切断する。これらフラグメントは電気泳動ゲル上で分
離され、ゲルから精製され両方のオリエンテーションで
それぞれクローン化され、SP6ベクターにクローンされ
る（例えば、pSP64又はpSP65;Melton etal.,1984,Nule
ic Acids Res.,Vol.12,pp,7035−）。p4.7Rフラグメ
ントのインサートを含むSP6を骨格とするプラスミド
は、従来技術として良く知られているSP6転写システム
を用いてインビトロで転写させる。

RB遺伝子に接合したRFLPsの検出網膜芽腫素因欠陥の遺伝性は、１の系統分析における
DNA多形体に係る共通遺伝性を追跡することにより明ら
かにできる。

第２図で示した遺伝子マップは、網膜芽腫診断に対し
有用に用いられる核酸をさがすために用いられる。この
ため、人間の遺伝子の挿入に対応できるバクテリオファ
ージDNAのプラスミドベクタ“Bluescribe"内にサブクロ
ーンされる（Stratagene）。そして、500bp〜2000bpの
大きさを持ち、上記遺伝子から得られた15種の単一コピ
ーのDNAフラグメントがサブクローンされる。これらの
配列はマップされた200kb領域にわたって分散する。サ
ブクローンされたDNAフラグメントは、１又はそれ以上
の制限酵素を用いてプラスミドDNAを切断することによ
り、0.6％の低融点アガロースゲル上での電気泳動、及
びElutip−ｄカラム（Schleicher and Schuell）を用
いたクロマトグラフィーによる精製によってベクター配
列から分離された。精製されたDNAフラグメントは、DNA
ポリメラーゼＩのKlenowフラグメントを用いたランダム
プライマー技術によって³²P−dCTPで放射線標識され
る。

制限酵素断片の長における多型（RFLP's）は、33個の
制限酵素で正常な６個の個体から分離されたゲノミック
DNAを切断することにより見い出された。DNAフラグメン
トから生じた198の切断片は、その分子形状又は分子質
量に従って0.8％アガロース電気泳動用ゲル上で分離さ
れる。

そして、DNAはニトロセルロースフィルタに移され、
その後、公知の方法（T.P.Dryjaら.,1986,Proc.Natl.Ac
ad.Sci.USA,Vol.83,pp.7391−94）に従って網膜芽腫遺
伝子から精製された単一コピーDNAプローブでハイブリ
ッド形成を行わせた。

15の単一コピープローブフラグメントのうち僅かに５
個のみがRFLP'sを示した。そして、この４つの多型を示
したフラグメントは、制限酵素（Kpn I,Xba I,Mbo II又
はTth III）の認識配列において、わずかに変異（おそ
らく一塩基変異）しているという結果が明かになった。
第５の多型は、50塩基対の長さの同方向に反復配列が複
数繰り返されているという変異を示した。DNAの多型を
示す位置は、第２図のマップ内に示されている（マップ
上方の垂直方向矢印）。Mbo IIサイトの多型を示す位置
は、正確に特定されていないが、マップ上の約175kbの
範囲に位置している。特定のDNA多型に対応する対立遺
伝子の頻度をテーブル１に示した。

ヒトにおける網膜芽腫素因対立遺伝子の存在を検出す
るためのこれらプローブの利用性を示すために、遺伝性
網膜芽腫を持つ20の系統（家系）が分析された。「Kunk
el et al.,1977,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.74,pp.
1245−49」に示された方法に従い、DNAサンプルは、対
象となる家族の各構成員から採取した静脈血液の白血球
核から抽出された。与えられたRFLPを有する家族（kind
red）の分析において、この家族構成員に由来するDNAは
適切な制限酵素により消化された。この消化作用により
切断片は、アガロースゲル電気泳動により分離され、そ
の後、ニトロセルロースフィルタに移され、さらに標識
されたプローブとのハイブリッド形成が行われた。

これらの家族において、網膜芽腫遺伝子内のDNA多型
により決定された対立遺伝子の遺伝性が追跡され、網膜
芽腫素因特性の遺伝性と比較された。例えば、プローブ
p68RS2.0（表１参照）により検出されたポリモルフィズ
ムを通して見てみる。ゲノムDNを制限酵素Rsa Iで消化
した場合、上記プローブは互いに異なる長さの対立遺伝
子DNAフラグメントとハイブリッドを形成する。これら
各フラグメントのサイズは、互いに50bpの間隔を持って
1.5kbから2.0kbの範囲内に広がっている。p68RS2.0にク
ローニングされた2.0kbゲノムフラグメントのDNA配列
は、50〜53bpのセグメントを持ち、該セグメントが約30
回繰り返されている（テーブル２参照）。この53bpセグ
メントは、各分析におけるプローブとして用いることが
できる。前記繰返し配列の一部は、種々の文献（Y.Naka
mura et al.,1987,Science,Vol.235,pp.1616−22）な
どにより報告されているVNTR（Variable Number of Tan
dem Repeat）のコアシーケンスと相同性を有している。
（テーブル２の繰返し配列のユニットの上部に示した11
bpシーケンスは、Nakamuraらにより観察された幾つかの
VNTRとして報告されたコアシーケンスを表わしてい
る。）このようなタンデムに繰り返された配列は遺伝的に不
安定な傾向を示すので、繰り返し回数は大きく変化し得
る。このようなサイトにおいて、異なる８つの対立遺伝
子が検出されたが、更に、多数存在する可能性がある。
このような複数の一般的な対立遺伝子の存在のため、互
いに関係のない各個体の75％がこの多型に対しヘテロ接
合的である。そして、ヘテロ接合性の高い頻度により、
この多型は極めて有用なものとなる。（表２に於て、括
弧（）内は、繰返し配列ユニット内における塩基が変
化し得る領域を示しており、また、括弧内の塩基で上方
及び下方にアンダーラインが付されたものは、これ変化
領域の可能性のある塩基を示す。

網膜芽腫を持つ14の家族が、このDNA多型における対
立遺伝子の配列を持っていた。このような変異によっ
て、網膜芽腫素因特性を持つ部分の共遺伝性の頻度を検
出することが可能となる。例えば、これら各家系内の各
個体のゲノムDNAはRsa Iによって消化され、欠陥Rb対立
遺伝子を持つ任意の一のRsa Iフラグメントの共遺伝性
が決定されることになる。

シーケンス分析 RFLP分析によって明らかにすることができる配列の変
化は、サザンブロット解析において、正常な核酸を特徴
付ける制限フラグメントと比較して検知可能な相違を有
する制限フラグメントを生じさせる場合に限られる。こ
のような検知可能な多型の大部分は、制限酵素の認識部
位内のDNA配列の変化から生じる。このような部分は希
である。そのため、それらを発見するには、複数の互い
に関連性のない個体から得られたゲノムDNAを50程度の
多くの異なる制限酵素をもちいて切断するというような
多大な作業かつ高価なスクリーニング処理が必要とな
る。特定因子座におけるすべてのゲノムDNA配列の多型
（DSPs）の画分のうち、RFLPとして検出可能なものは少
なく、また、スクリーニングには、多数の酵素に依存す
ることになる。通常、ヒトのゲノムに存在するDNAシー
ケンス多型の90％またはそれ以上が、RFLPに基づく分析
の対象外にある。数10または数100もの潜在的に有用なD
SPのほとんどは、疾患の原因遺伝子の内部またはその近
傍に存在しているが、これらDSPの内のほとんど又は、
時に全くRFLPとして検出することができない。第４図
は、ヒト網膜芽腫遺伝子の27エキソンを含む200kbゲノ
ム領域のスケールマップを示す。27のエキソンによって
4.7kbの転写産物が生成される。

第７図は、この遺伝子内で確認されたDNA配列の多型
（DSPs）の位置を示す。制限酵素という名前で確認され
た多型はRFLPSであり、RB1.2,RB1.3,RB1.20,RB1.26の各
多型はRFLPとして検出不可能であり、これらはPCR増幅
作用及び直接シーケンス作用により、見出されたもので
あり、これを以下に述べる。200kbのゲノム領域は、35
の異なる再接合バクテリオファージラムダクローンから
重複しているインサートのシリーズとして分離されたも
のである。エキソンを含むセグメントはブルースクライ
ブプイラスミドクローニングベクター内にサブクローン
された。クローンされたプラスミドインサートの最初の
配列決定は、プラスミドを用いた配列決定に関する通常
の方法を用いて遂行される。このゲノム配列に基づき、
複数の20塩基のオリゴヌクレオチドプライマ対が合成さ
れ、これらは、サイズとして320〜1200bp毎の領域が、M
ullis等のポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によりゲノムDN
Aから増幅されるようにデザインされた。

このようなそれぞれの増幅反応において、200ngから
1.0μｇのゲノムDNAが準備され、以下の反応バッファに
懸濁された。反応バッファには、20mM Tris（pH 8.4
または8.6）、30ugml牛の血清アルブミン、30mM〜7.5m
M、10〜50pMの各オリゴンクレオチドパライマ、及び１
単位のTaqポリメラーゼ（Perkin−Elmer Centus）が含
まれる。最適なMgCl₂濃度及びPCR反応のpHは、使用する
プライマ対によって異なる。PCR増幅（30〜35ラウン
ド）は、プログラマブルサーマルサイクラーを用いて行
われ、その条件として、（変性）94℃で10秒間、（アニ
ーリング）42〜55℃において10秒間、そして、（伸長）
70℃において30秒間において遂行される。すべての時間
はサンプル温度に基づくもので、ヒートブロック温度で
はなく、またヒートブロックの立ち上がり時間も包含し
ていない。最良アニーリングは各プライマー毎に異な
る。このプロトコルによって、各領域を2500bpにまでPC
R増幅可能となる。９〜20の個体から得たゲノムDNAは各
領域が増幅され、DSPに関しスクリーニングされる。

網膜芽腫遺伝子内に存在するDNA多型のより大きな断
片を検出及び使用するため、本発明者らは一般にK.b.Mu
llis等（1987）に開示されているポリメラーゼ連鎖反応
（PCR）、及びC.Wong等（1987）に開示された直接塩基
配列決定技術を用い、当該位置における正常対立遺伝子
の変異を分析した。オリゴヌクレオチドプライマは、32
0〜1200bpのサイズの異なる遺伝子から複数の領域を増
幅し得るように合成された。前記増幅及びシークエンス
反応は、少なくとも９の互いに関連の無い個体から採取
したDNAにおいてスクリーニングが行われた全領域に対
して関し実施され、また、15以上の個体については多く
の領域が分析がされた。

ほとんどのケースにおいて、各プライマ対は遺伝子の
27エキソンの一方に隣接したイントロン配列に由来して
おり、これによってPCR増幅された領域はイントロン配
列及びエキソン配列の双方を含有することとなる。

このスクリーニングの結果をテーブル３及び４に示
す。増幅されたDNA配列は、互いに比較され、同じ領域
に由来するプラスミドに予めクローニングされたインサ
ートの塩基配列データの確認が行われる。技術的な人為
的産物により観察された塩基や他のあいまいな塩基は表
から省いた。この遺伝子座のうちスクリーニングされた
3712bpのゲノムDNA配列の内、４つの配列バリエーショ
ンが確認された（表3;マップ位置は図７において示され
ている）。これら４つ全ての変異は、イントロン内に発
見され、このうち、一つはまれな変異（配列決定された
１又は15の個体内でのみ）のように見られ、３個は真性
のDNA配列多型として示された。代表的な例（RB13）を
第７図に示す、この多型は網膜芽腫遺伝子のエキソン３
の近傍で生じる。多型シーケンスのどれも周知の制限酵
素の認識部位を構成しておらず、そのため、DSPはRFLP
として検出することができない。

第８図は、網膜芽腫プローン家系におけるRB1.3多形
体の遺伝について示したものである。オリゴヌクレオチ
ドプライマー（表４参照）は、エキソン３を含むヒト網
膜芽腫遺伝子の530bp領域をPCR増幅するために用いられ
た。多型を包囲する配列が、図８の左側に下から上に向
かって５′から３′となるように記載されている。多型
塩基は、近接したマーカーによって認識される。

第９図は、遺伝性網膜芽腫を持つ３つの家系における
DSP RB1.3の分離を模式的に示している。対立遺伝子は
各人のシンボルの下側に記載してある。家族RB−32にお
いて、（−）対立遺伝子は遺伝子内部の欠損の結果であ
る。後のサザンブロッティング分析によれば、欠損はエ
キソン２〜17において発見された。この結果に基づい
て、家系RB32の遺伝子型（G,−）を有し発病されていな
い人は、変異を有していることが推測される。

本発明による検査方法により、変異の推定を好適に行
うことができるが確かめられている。

ここに行われたDSPs検出についてのアプローチは、通
常のRFLPを基にした選別（スクリーニング）ににおいて
幾つかの利点を提供する。上述したように、増幅及び直
接シーケンシングによるDSP選別は、クローンされた遺
伝子座における利用可能な多形体マーカーの数を増大さ
せることができる。この技術は、制限酵素を基礎とする
選別を超え、さらには、これに取って替わる。何故な
ら、RFLPs及びVNTRsをも同時に検出することが可能とな
るからである。このようなマーカーを利用可能にするた
めには、特有の増幅用のプライマー配列のセット及び多
形体そのものについての知識が必要となる。多形体に関
する公表された記述は、全ての読者において直ちにそれ
を利用可能となる。このため、研究室間におけるプラス
ミドDNAsの物理的な移動に伴う問題及び遅延を避けるこ
とが可能となっている。また、プラスミドの保存維持の
コストは最終的に減少された。さらに、これらの多形体
マーカーの迅速な解析は、増幅DNAに対する直接ハイブ
リッド形成し得る対立遺伝子に特異的なオリゴヌクレオ
チドプローブを用いて大規模なスケールで実行され得
る。最後に、同一の染色性因子座における両戦略による
我々の経験に基づいて、我々は比較可能なそれぞれの方
法によってDSPsの位置の検索に必要となる費用と努力を
見積もることができた。

Rb遺伝子の欠損を持つ患者の治療選別に追加して、この発明は、欠陥Rb対立遺伝子を保
有することが確認された個体及び網膜芽腫の発達の危険
を持つ個体に対するポリペプチド治療を含む。

個体に対する網膜芽腫の形成を抑制するために、Rbポ
リペプチドが治療として投与される。この投与量は網膜
芽腫腫瘍の形成および成長を抑制するのに十分な量（ア
ンチ網膜芽腫形成量）とされる。網膜芽腫形成を抑制す
るためのRbポリペプチドの投与量は、一日当たり１〜50
0μg/体重kgである。Rbタンパクは薬学的に受け入れら
れる賦形剤（キャリア）と共に注射により投与される。
この投与は単独でも他の薬との組み合わせでもよい。前
記キャリアはRbポリペプチドを溶解する物でも浮游して
保持するものでもよい。ただし、患者に有毒なものであ
ってはならない。塩化ナトリウムのような食塩の水溶液
や非イオン性化合物（グルコース）等が考えられ、これ
らは生理的な等張な濃度であることが好ましい。他の薬
剤は、Rbポリペプチドの反応を阻害しないものであれば
よい。当業者であれば、通常の実験によって、この組成
のための特別な薬学的な賦形剤を確かめることができ
る。

治療に適したRbポリペプチドは、以下の３つの通常の
手法のいずれかによって製造することができる。第１
に、Rbポリペプチドは、p4.7Rに挿入されたRbcDNAを適
切な哺乳類の発現ベクター内へ挿入クローニングして生
成させることもできる。すなわち、インビトロ発現シス
テムにおいて、このベクターからRb遺伝子産物を発現さ
せ、発現システムに使用された培地又は細胞からRbポリ
ペプチドを単離することにより行うことができる。一般
的な発現ベクター及びシステムは、この技術においてよ
く知られている。

第２に、Rbポリペプチドは、タンパク化学技術を用い
て製造することができる。ここにおいて、特異的なアミ
ノ酸残基は、適切な配列に従って合成されて連結され
る。

第３は、天然に生じるRbタンパクは親和性クロマトグ
ラフィーによって全タンパク試料中から分離することが
できる。Rbタンパクに対する特異的な抗体は、標準的な
手順（下記参照）によって調整され、そして、この抗体
は不活性マトリックスに固定されて、選択的にRbタンパ
クを結合させるために用いられる。

網膜芽腫の免疫診断法この発明は、また特別の腫瘍がRb遺伝子異常の結果で
あるかいなかを判定する為の方法をも包含する。骨肉腫
及びある区別できない腫瘍がRb遺伝子内の検出可能な損
傷により生じることがあることから、免疫診断法はこの
ような腫瘍の診断の道具として用いることができる。

抗Rb抗体の製造の為に、上述のようにして製造された
Rbポリペプチド又は天然発生したRbタンパクによりラビ
ットが免疫される。製造された抗Rb抗体はその後ラベル
される。標識は、例えば、放射線、螢光又はアルカリフ
ォスファターゼのような酵素によって行われる。この標
識された抗体は、ヒト腫瘍が、検出可能なRb遺伝子に由
来しているかどうかを判定するために用いることができ
る。これは、従来のいかなる技術を用いて実施してもよ
い。例えば、腫瘍サンプルは溶液とされ、従来のELISA
（酵素免疫分析法）によりラベルされた抗体を用いてテ
ストが行われる。また、ヒト組織サンプル（例えば、生
検サンプル）は他の免疫診断技術（例えば、I.ROITT,IN
TERACTIN OF ANTIGEN AND ANTIBODY,IN ESSENTIAL
IMMUNOLOGY,5版，ボストン:BLACKWELL SCIENTIGFIC
PUBULICATIONS,1984,pp.145−75）によって、網膜芽
腫タンパクの発現をテストしてもよい。

免疫複合体は、抗Rb抗体に対して反応性のある抗原
（例えば、網膜芽腫ポリペプチド）を保持する腫瘍サン
プル内において検出される。このような抗原を持たない
腫瘍は網膜芽腫遺伝子に欠陥を持つと推定される。

デポジットプラスミドp2AR3.8及びp2AR0.9は1987年７月17日にAm
erican Type Cultur Collection（ATCC）,Rockvill
e,Marylandに預けられた。ATCCの登録番号は、それぞれ
40,241、40242である。

DNA シーケンスの多形性は、ヒト網膜芽腫部位の13
個の分離されたPCR増幅された増幅領域を直接シーケン
スすることにより検出された。最少の互いに関連性のな
い９つの個体から得たDNAサンプルは、選抜された全塩
基が検査に供される。あいまいな塩基は表記から外し
た。

［発明の効果］以上説明したように、本発明によれば、網膜芽腫に関
連する診断治療を効果的に行うことができ、患者が網膜
芽腫に掛かりやすいか否かも精度よく判定することがで
きる。

図面の簡単な説明第１図はクローンp4.7R.内のインサートの制限酵素マ
ップの概略図である。

第２図は網膜芽腫遺伝子のゲノム制限マップの概略図
である。

第３図はp2AR3.8及びp2AR0.9ベクターの概略図であ
る。

第４図は正常網膜芽腫遺伝子のスケールマップ図であ
る。

第５図（５−１〜５−３）はフランキング領域を備え
た正常網膜芽腫遺伝子のcDNAの核酸配列を示す説明図で
ある。

第６図（６−１〜６−９）はフランキング領域を備え
る正常網膜芽腫遺伝子のエキソンの核酸配列を示す説明
図である。

第７図はDSPsの配置を示す網膜芽腫遺伝子の制限酵素
マップを示す図である。

第８図はゲル及び網膜芽腫プローンファミリー内の多
形体RB1.3の遺伝形質を示すダイアグラムである。

第９図は遺伝性網膜芽腫を持つ３ファミリー内のDSP
RB1.3の分離状況を示すダイアグラムを示す図であ
る。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 999999999 ホワイトヘッドインスティチュートアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02130 ケンブリッジナインケンブリッジセンター (72)発明者ドライジャサデュースピーアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02143 ミルトンフォーブズロード 85 (72)発明者フレンドステファンアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02143 サマービルスペンサーアベニュー 14 (72)発明者ヤンデルデビットダブリューアメリカ合衆国マサチューセッツ州 02154 ウォルサムアプトンロード 53 (56)参考文献ＮｅｗＥｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｏｌ．314（1986）ｐ．1201−1207 「眼科」，第29巻 1225−1232頁（1987) ＳｃｉｅｎｃｅＶｏｌ．236（1987 −７−26）ｐ．1657−1661 Ｎａｔｕｒｅ，329［6140］（1987− 10−15）ｐ．642−645

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】ヒト患者からのサンプルの核酸を用いて網
膜芽腫の罹りやすさを検査する方法であって、前記患者の網膜芽腫遺伝子における、以下の（ａ）及び
（ｂ）からなる群から選択されたいずれかの遺伝子多型
を検出することを含み、（ａ）以下の化学式１に示された核酸配列を含む配列の
タンデムな繰り返し数における変化、ここで、N₁はTG,A又はＧであり、N₂はＡ又はＣであり、
N₃はAG又はAGAAGである、（ｂ）核酸配列GGGNNGTGGGGをコアシーケンスとして実
質的に含むVNTR配列のタンデム繰返し数における変化で
あって、ここで、ＮはA,T,C又はＧのいずれかであるこ
とを特徴とする検査方法。