JP3151415B2 - 鳥型結核菌複合種の増幅および検出 - Google Patents
鳥型結核菌複合種の増幅および検出Info
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Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
- C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
- C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
- C12Q2600/16—Primer sets for multiplex assays
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- Chemical & Material Sciences (AREA)
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- Analytical Chemistry (AREA)
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- Immunology (AREA)
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- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
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- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、標的核酸配列の増
幅および検出に関する。特に、本発明は、ミコバクテリ
アの標的核酸配列の増幅および検出に関する。
幅および検出に関する。特に、本発明は、ミコバクテリ
アの標的核酸配列の増幅および検出に関する。
【０００２】
【従来の技術】ミコバクテリアは、抗酸性、非自動性、
グラム陽性の桿状体である細菌の属である。該属は、限
定されるものではないが、ミコバクテリウム・アフリカ
ヌム（Mycobacterium africanum)、鳥型結核菌（M.aviu
m)、ウシ型結核菌（M.bovis)、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、
Ｍ．ケロネエ（chelonae）、Ｍ．フォルツイツム（fort
uitum)、Ｍ．ゴルドネエ（gordonae）、Ｍ．イントラセ
ルレア（intracellulare)、Ｍ．カンサシイ（Kansasi
i）、Ｍ．ミクロティ（Microti)、Ｍ．スクロフラセウ
ム（scrofulaceum）、パラ結核菌（M.paratuberculosi
s）およびヒト型結核菌（M.tuberculosis）を含むいく
つかの種を含む。これらの微生物のいくつかは疾患の原
因物質である。最初の１９５３年以来、ミコバクテリア
感染の症例は米国において増加している。結核が特に問
題であるが、他のミコバクテリア感染もまた、免疫損傷
患者数の増加の結果として増加している。多数のこれら
新規の症例はエイズ流行に関係しており、それは、ミコ
バクテリアによる感染に対して特に感受性である免疫損
傷集団を与えている。鳥型結核菌、ミコバクテリウム・
カンサシイおよび他の非結核ミコバクテリアは、ＨＩＶ
感染および他の免疫損傷患者において日和見病原体とし
て見出される。
グラム陽性の桿状体である細菌の属である。該属は、限
定されるものではないが、ミコバクテリウム・アフリカ
ヌム（Mycobacterium africanum)、鳥型結核菌（M.aviu
m)、ウシ型結核菌（M.bovis)、ウシ型結核菌−ＢＣＧ、
Ｍ．ケロネエ（chelonae）、Ｍ．フォルツイツム（fort
uitum)、Ｍ．ゴルドネエ（gordonae）、Ｍ．イントラセ
ルレア（intracellulare)、Ｍ．カンサシイ（Kansasi
i）、Ｍ．ミクロティ（Microti)、Ｍ．スクロフラセウ
ム（scrofulaceum）、パラ結核菌（M.paratuberculosi
s）およびヒト型結核菌（M.tuberculosis）を含むいく
つかの種を含む。これらの微生物のいくつかは疾患の原
因物質である。最初の１９５３年以来、ミコバクテリア
感染の症例は米国において増加している。結核が特に問
題であるが、他のミコバクテリア感染もまた、免疫損傷
患者数の増加の結果として増加している。多数のこれら
新規の症例はエイズ流行に関係しており、それは、ミコ
バクテリアによる感染に対して特に感受性である免疫損
傷集団を与えている。鳥型結核菌、ミコバクテリウム・
カンサシイおよび他の非結核ミコバクテリアは、ＨＩＶ
感染および他の免疫損傷患者において日和見病原体とし
て見出される。
【０００３】鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア
は、鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）のメンバーである。パ
ラ結核菌は鳥型結核菌の亜種であり、そしてまた、概し
て、ＭＡＣに含まれている。これらの種は、エイズ患者
において広まったＭＡＣ感染の高い罹患率のために、近
年重要になっている。鳥型結核菌複合体は、それらの生
化学的および血清凝集特性に基いて区別しうる２８種類
の血液型亜型から成る（インダーリード（Inderlied）
ら、1993年、Clin Microbiol.Rev.6,266-310 による論
及を参照されたい）。分類の方法に応じて、２８血清亜
型の内１０〜１２種類は鳥型結核菌種に属し、そして１
０〜１２種類はミコバクテリウム・イントラセルレア種
に属すると分類される。ＭＡＣ血清型亜型の６種類はま
だ明確に分類されていない。ＭＡＣ感染は、現在、ミコ
バクテリア学研究室で同定された病原性単離物の約５０
％を占め且つエイズおよび他の免疫損傷患者の中で最も
一般的である。ＭＡＣ感染の初期診断および治療は、感
染した個体の生存状態を改善し且つ延長することができ
る。
は、鳥型結核菌複合体（ＭＡＣ）のメンバーである。パ
ラ結核菌は鳥型結核菌の亜種であり、そしてまた、概し
て、ＭＡＣに含まれている。これらの種は、エイズ患者
において広まったＭＡＣ感染の高い罹患率のために、近
年重要になっている。鳥型結核菌複合体は、それらの生
化学的および血清凝集特性に基いて区別しうる２８種類
の血液型亜型から成る（インダーリード（Inderlied）
ら、1993年、Clin Microbiol.Rev.6,266-310 による論
及を参照されたい）。分類の方法に応じて、２８血清亜
型の内１０〜１２種類は鳥型結核菌種に属し、そして１
０〜１２種類はミコバクテリウム・イントラセルレア種
に属すると分類される。ＭＡＣ血清型亜型の６種類はま
だ明確に分類されていない。ＭＡＣ感染は、現在、ミコ
バクテリア学研究室で同定された病原性単離物の約５０
％を占め且つエイズおよび他の免疫損傷患者の中で最も
一般的である。ＭＡＣ感染の初期診断および治療は、感
染した個体の生存状態を改善し且つ延長することができ
る。
【０００４】ミコバクテリア感染の診断は、伝統的に、
抗酸性染色および微生物の培養に続く生化学的検定にた
よっている。これらの手順は時間を費やし、そして慣用
的な培養法を用いる典型的な診断は６週間程度かかるこ
とがある。BATECTMシステム（ベクトン・ディキンソン
・ミクロバイオロジー・システムズ（Becton Dickinson
Microbiology Systems)，スパークス，ＭＤ）のような
自動培養システムは、診断のための時間を１〜２週間に
減らすことができる。しかしながら、ミコバクテリア感
染を診断するのに必要な時間を１週間未満に、好ましく
は、１日またはそれ未満に短縮する必要がなおある。核
酸増幅は、特異的な標的配列の速やかな検出を可能にす
る有力な技術である。したがって、それは、ミコバクテ
リアの速やかな検出および同定に対して有望な技術であ
る。当該技術分野において知られている核酸増幅技術の
例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：米国特許第4,68
3,195号；第4,683,202号；第4,800,159号；第4,965,188
号明細書）、鎖置換増幅（ＳＤＡ−Ｇ．ウォーカー（Wa
lker）ら、1992年，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89,392-39
6；Ｇ．ウォーカーら、1992年，Nucl.Acids Res.20,169
1-1696；米国特許第5,270,184号明細書；米国特許第5,4
55,166号明細書；欧州特許出願第0684315号明細書）、
核酸配列に基く増幅（ＮＡＳＢＡ：カンジーン（Cangen
e）による米国特許第5,130,238 号明細書）、転写に基
く増幅（ＴＡＳ−Ｄ．クウォー（Kwoh）ら、1989年，Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA 86,1173-1177）、自己持続配列複
製（３ＳＲ：Ｊ．グァテリ（Guatelli）ら、1990年，Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA 87,1874-1878）およびＱβレプリ
カーゼシステム（Ｐ．リザルディ（Lizardi）ら、1988
年，BioTechnology 6,1197-1202）である。
抗酸性染色および微生物の培養に続く生化学的検定にた
よっている。これらの手順は時間を費やし、そして慣用
的な培養法を用いる典型的な診断は６週間程度かかるこ
とがある。BATECTMシステム（ベクトン・ディキンソン
・ミクロバイオロジー・システムズ（Becton Dickinson
Microbiology Systems)，スパークス，ＭＤ）のような
自動培養システムは、診断のための時間を１〜２週間に
減らすことができる。しかしながら、ミコバクテリア感
染を診断するのに必要な時間を１週間未満に、好ましく
は、１日またはそれ未満に短縮する必要がなおある。核
酸増幅は、特異的な標的配列の速やかな検出を可能にす
る有力な技術である。したがって、それは、ミコバクテ
リアの速やかな検出および同定に対して有望な技術であ
る。当該技術分野において知られている核酸増幅技術の
例は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：米国特許第4,68
3,195号；第4,683,202号；第4,800,159号；第4,965,188
号明細書）、鎖置換増幅（ＳＤＡ−Ｇ．ウォーカー（Wa
lker）ら、1992年，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 89,392-39
6；Ｇ．ウォーカーら、1992年，Nucl.Acids Res.20,169
1-1696；米国特許第5,270,184号明細書；米国特許第5,4
55,166号明細書；欧州特許出願第0684315号明細書）、
核酸配列に基く増幅（ＮＡＳＢＡ：カンジーン（Cangen
e）による米国特許第5,130,238 号明細書）、転写に基
く増幅（ＴＡＳ−Ｄ．クウォー（Kwoh）ら、1989年，Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA 86,1173-1177）、自己持続配列複
製（３ＳＲ：Ｊ．グァテリ（Guatelli）ら、1990年，Pr
oc.Nat.Acad.Sci.USA 87,1874-1878）およびＱβレプリ
カーゼシステム（Ｐ．リザルディ（Lizardi）ら、1988
年，BioTechnology 6,1197-1202）である。
【０００５】ＳＤＡおよび３ＳＲのような等温増幅法
は、それらがＰＣＲのような方法に特有の高／低温循環
を必要としないので、診断において特に有益である。し
たがって、それらはより簡単なプロトコルであり且つ実
施のための特別な装置をあまり必要としない。しかしな
がら、ＳＤＡのような等温増幅法は、概して、ＰＣＲに
よって増幅可能なものほど大きい標的を増幅することが
できない。適当な増幅プライマー結合部位の近接が因子
になり且つ増幅生成物中には検定プローブ設計に利用可
能な配列が少ないので、小さい標的配列は、ある与えら
れた標的の検出に望ましい特異性を有するプライマーお
よびプローブを設計する能力を厳しく制限する。
は、それらがＰＣＲのような方法に特有の高／低温循環
を必要としないので、診断において特に有益である。し
たがって、それらはより簡単なプロトコルであり且つ実
施のための特別な装置をあまり必要としない。しかしな
がら、ＳＤＡのような等温増幅法は、概して、ＰＣＲに
よって増幅可能なものほど大きい標的を増幅することが
できない。適当な増幅プライマー結合部位の近接が因子
になり且つ増幅生成物中には検定プローブ設計に利用可
能な配列が少ないので、小さい標的配列は、ある与えら
れた標的の検出に望ましい特異性を有するプライマーお
よびプローブを設計する能力を厳しく制限する。
【０００６】最初、ＳＤＡは、約３５℃〜４５℃の温度
で使用するために開発された（「従来のＳＤＡ」）。最
近になって、それは、公開欧州特許出願第0684315号明
細書で記載のように、好熱性ポリメラーゼおよび制限エ
ンドヌクレアーゼを用いてより高い温度に適応されてい
る（「好熱性ＳＤＡ」または「ｔＳＤＡ」）。ｔＳＤＡ
システムは、従来のＳＤＡと比較して増大した速度およ
び特異性の利点を与える。従来のＳＤＡにおいて用いる
ために設計された増幅プライマーの標的結合配列は、概
して、ｔＳＤＡにおいて機能するであろうが、通常、そ
れらは不十分であり、したがって、増幅効率はｔＳＤＡ
のより高温で低下することがある。更に、従来のＳＤＡ
でのプライマー設計の場合と同様に、ｔＳＤＡに対する
プライマーの標的結合配列中の見たところ僅かな修飾
（それを延長するなど）が、しばしば、増幅効率に対し
て予想できない影響を与える。対照的に、ｔＳＤＡ用に
設計されたプライマーの標的結合配列を含むプライマー
は、通常、従来のＳＤＡまたは他の増幅反応に対して増
幅プライマーを適応した場合に効率よく機能する。
で使用するために開発された（「従来のＳＤＡ」）。最
近になって、それは、公開欧州特許出願第0684315号明
細書で記載のように、好熱性ポリメラーゼおよび制限エ
ンドヌクレアーゼを用いてより高い温度に適応されてい
る（「好熱性ＳＤＡ」または「ｔＳＤＡ」）。ｔＳＤＡ
システムは、従来のＳＤＡと比較して増大した速度およ
び特異性の利点を与える。従来のＳＤＡにおいて用いる
ために設計された増幅プライマーの標的結合配列は、概
して、ｔＳＤＡにおいて機能するであろうが、通常、そ
れらは不十分であり、したがって、増幅効率はｔＳＤＡ
のより高温で低下することがある。更に、従来のＳＤＡ
でのプライマー設計の場合と同様に、ｔＳＤＡに対する
プライマーの標的結合配列中の見たところ僅かな修飾
（それを延長するなど）が、しばしば、増幅効率に対し
て予想できない影響を与える。対照的に、ｔＳＤＡ用に
設計されたプライマーの標的結合配列を含むプライマー
は、通常、従来のＳＤＡまたは他の増幅反応に対して増
幅プライマーを適応した場合に効率よく機能する。
【０００７】熱ショックタンパク質は、温度の増加によ
って微生物が刺激される場合に高量で発現される一群の
タンパク質である。熱ショックタンパク質は高度に保存
されている（Ｒ．Ｊ．ガルシア（Garcia）ら、1989年，
Infection and Immunity 57,204-212；Ｒ．Ｓ． グプタ
（Gupta）ら、1992年，J.Bacteriology 174,4594-460
5）。ｄｎａＪ遺伝子は、細胞のストレス応答に関与し
ていると考えられる４２ｋｄ熱ショックタンパク質をコ
ードする。ヒト型結核菌は、ｄｎａＪ遺伝子のヌクレオ
チド配列が決定された最初のミコ バクテリアであった
（Ｒ．Ｂ．ラシグラ（Rathigra）ら、1988年，Nucl.Aci
ds Res.16,1636）。らい菌（M.leprae）のｄｎａＪ遺伝
子のセグメントヌクレオチド配列が続いて決定された
（Ｓ．Ｓ．ハービー（Harvey）ら、1993年，J.Gen.Micr
obiol.139,2003-2008）。後に、Ｒ．Ｂ．ラシグラら、
上記によって公表されたヒト型結核菌配列を用いて、
Ｓ．Ｉ．タケワキ（Takewaki）ら（1993年，J.Clin.Mic
robiol.31,446-450）は、鳥型結核菌およびＭ．イント
ラセルレアを含めた広範囲のミコバクテリア種からのｄ
ｎａＪ遺伝子（ｂｐ１３９４〜１６２９）の２３６−ｂ
ｐフラグメントを増幅する一組の属特異的ＰＣＲプライ
マーを開発した。ＰＣＲによってヒト型結核菌、鳥型結
核菌、Ｍ．イントラセルレアおよびＭ．カンサシイの属
特異的増幅を行うことを可能にした種特異的オリゴヌク
レオチドプローブもまた報告された。次に、１９種のミ
コバクテリアのｄｎａＪ遺伝子を配列順序決定し且つ用
いて、系統発生関係を決定し且つ遺伝子中の種特異的制
限部位に基いて種を区別した（Ｓ．Ｉ．タケワキら、19
94年，Int.J.Syst.Bacteriol.44,159-166）。公開特許
第6-133775号公報（タケワキら、1994年５月17日公開
の）は、ＰＣＲのための属特異的増幅プライマー対およ
びミコバクテリアのｄｎａＪ遺伝子に由来するいくつか
の種特異的プローブを開示している。
って微生物が刺激される場合に高量で発現される一群の
タンパク質である。熱ショックタンパク質は高度に保存
されている（Ｒ．Ｊ．ガルシア（Garcia）ら、1989年，
Infection and Immunity 57,204-212；Ｒ．Ｓ． グプタ
（Gupta）ら、1992年，J.Bacteriology 174,4594-460
5）。ｄｎａＪ遺伝子は、細胞のストレス応答に関与し
ていると考えられる４２ｋｄ熱ショックタンパク質をコ
ードする。ヒト型結核菌は、ｄｎａＪ遺伝子のヌクレオ
チド配列が決定された最初のミコ バクテリアであった
（Ｒ．Ｂ．ラシグラ（Rathigra）ら、1988年，Nucl.Aci
ds Res.16,1636）。らい菌（M.leprae）のｄｎａＪ遺伝
子のセグメントヌクレオチド配列が続いて決定された
（Ｓ．Ｓ．ハービー（Harvey）ら、1993年，J.Gen.Micr
obiol.139,2003-2008）。後に、Ｒ．Ｂ．ラシグラら、
上記によって公表されたヒト型結核菌配列を用いて、
Ｓ．Ｉ．タケワキ（Takewaki）ら（1993年，J.Clin.Mic
robiol.31,446-450）は、鳥型結核菌およびＭ．イント
ラセルレアを含めた広範囲のミコバクテリア種からのｄ
ｎａＪ遺伝子（ｂｐ１３９４〜１６２９）の２３６−ｂ
ｐフラグメントを増幅する一組の属特異的ＰＣＲプライ
マーを開発した。ＰＣＲによってヒト型結核菌、鳥型結
核菌、Ｍ．イントラセルレアおよびＭ．カンサシイの属
特異的増幅を行うことを可能にした種特異的オリゴヌク
レオチドプローブもまた報告された。次に、１９種のミ
コバクテリアのｄｎａＪ遺伝子を配列順序決定し且つ用
いて、系統発生関係を決定し且つ遺伝子中の種特異的制
限部位に基いて種を区別した（Ｓ．Ｉ．タケワキら、19
94年，Int.J.Syst.Bacteriol.44,159-166）。公開特許
第6-133775号公報（タケワキら、1994年５月17日公開
の）は、ＰＣＲのための属特異的増幅プライマー対およ
びミコバクテリアのｄｎａＪ遺伝子に由来するいくつか
の種特異的プローブを開示している。
【０００８】本明細書中で用いられる若干の用語を以下
のように定義する。
のように定義する。
【０００９】増幅プライマーは、標的配列に対するハイ
ブリダイゼーション後のプライマーの伸長による標的配
列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡ増幅プライ
マーの３′末端（標的結合配列）は、標的配列の３′末
端にハイブリッド形成する。標的結合配列は、増幅プラ
イマーに対して標的特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライ
マーは、その５′末端付近に制限エンドヌクレアーゼの
認識部位を更に含む。その認識部位は、Ｇ．ウォーカー
ら（1992年，PNAS，上記）によって記載されたように、
認識部位が半修飾された場合にＤＮＡ二重らせんの一方
の鎖にニックを入れるであろう制限エンドヌクレアーゼ
に対する。ＳＤＡ増幅プライマーは、「Ｓ」プライマー
（例えば、二本鎖配列の増幅に対して１対の増幅プライ
マーを用いる場合、Ｓ1およびＳ2）と称することもでき
る。標的の末端に特別な配列を必要としない増幅法に対
して、増幅プライマーは、概して、本質的に標的結合配
列だけから成る。例えば、ＰＣＲを用いる本発明による
標的配列の増幅は、表１の増幅プライマーの標的結合配
列から成る増幅プライマーを用いるであろう。標的に対
して付加された制限エンドヌクレアーゼ認識部位以外の
特別な配列（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは転写に
基く増幅のためのＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を
必要とする増幅法に対して、必要とされる特別な配列
は、オリゴヌクレオチドの製造のための化学合成のよう
な常套法を用いて、表１で示された標的結合配列に対し
て結合することができる。
ブリダイゼーション後のプライマーの伸長による標的配
列の増幅のためのプライマーである。ＳＤＡ増幅プライ
マーの３′末端（標的結合配列）は、標的配列の３′末
端にハイブリッド形成する。標的結合配列は、増幅プラ
イマーに対して標的特異性を与える。ＳＤＡ増幅プライ
マーは、その５′末端付近に制限エンドヌクレアーゼの
認識部位を更に含む。その認識部位は、Ｇ．ウォーカー
ら（1992年，PNAS，上記）によって記載されたように、
認識部位が半修飾された場合にＤＮＡ二重らせんの一方
の鎖にニックを入れるであろう制限エンドヌクレアーゼ
に対する。ＳＤＡ増幅プライマーは、「Ｓ」プライマー
（例えば、二本鎖配列の増幅に対して１対の増幅プライ
マーを用いる場合、Ｓ1およびＳ2）と称することもでき
る。標的の末端に特別な配列を必要としない増幅法に対
して、増幅プライマーは、概して、本質的に標的結合配
列だけから成る。例えば、ＰＣＲを用いる本発明による
標的配列の増幅は、表１の増幅プライマーの標的結合配
列から成る増幅プライマーを用いるであろう。標的に対
して付加された制限エンドヌクレアーゼ認識部位以外の
特別な配列（例えば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡまたは転写に
基く増幅のためのＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を
必要とする増幅法に対して、必要とされる特別な配列
は、オリゴヌクレオチドの製造のための化学合成のよう
な常套法を用いて、表１で示された標的結合配列に対し
て結合することができる。
【００１０】バンパープライマーすなわち外部プライマ
ーは、ＳＤＡによって増幅させることができる標的を生
じるのに用いられるプライマーである。バンパープライ
マーは、バンパープライマーの伸長が下流の増幅プライ
マーおよびその伸長生成物を置換するように、増幅プラ
イマーの上流の標的配列に対してアニーリングする。バ
ンパープライマーは、「Ｂ」プライマー（１対の増幅プ
ライマーの伸長生成物を置換するのに１対のバンパープ
ライマーを用いる場合、Ｂ1およびＢ2）と称することも
できる。バンパープライマーの伸長は、増幅プライマー
の伸長生成物を置換する一つの方法であるが、加熱もま
た、ある種の増幅反応において適当である。
ーは、ＳＤＡによって増幅させることができる標的を生
じるのに用いられるプライマーである。バンパープライ
マーは、バンパープライマーの伸長が下流の増幅プライ
マーおよびその伸長生成物を置換するように、増幅プラ
イマーの上流の標的配列に対してアニーリングする。バ
ンパープライマーは、「Ｂ」プライマー（１対の増幅プ
ライマーの伸長生成物を置換するのに１対のバンパープ
ライマーを用いる場合、Ｂ1およびＢ2）と称することも
できる。バンパープライマーの伸長は、増幅プライマー
の伸長生成物を置換する一つの方法であるが、加熱もま
た、ある種の増幅反応において適当である。
【００１１】標的または標的配列という用語は、増幅さ
れる核酸配列を意味する。これらとしては、増幅される
元の核酸配列、増幅される元の核酸配列の相補的第二
鎖、および増幅反応によって生成される元の配列のコピ
ーのどちらかの鎖がある。これらのコピーは、それら
が、増幅プライマーがハイブリッド形成する元の標的配
列のコピーを含むという事実により、増幅可能な標的配
列としても役立つ。
れる核酸配列を意味する。これらとしては、増幅される
元の核酸配列、増幅される元の核酸配列の相補的第二
鎖、および増幅反応によって生成される元の配列のコピ
ーのどちらかの鎖がある。これらのコピーは、それら
が、増幅プライマーがハイブリッド形成する元の標的配
列のコピーを含むという事実により、増幅可能な標的配
列としても役立つ。
【００１２】増幅反応中に生じる標的配列のコピーは、
増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと称され
る。
増幅生成物、アンプリマーまたはアンプリコンと称され
る。
【００１３】伸長生成物という用語は、増幅プライマー
のハイブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として
用いるポリメラーゼによる増幅プライマーの伸長によっ
て生成された標的配列の一本鎖コピーを意味する。
のハイブリダイゼーションおよび標的配列を鋳型として
用いるポリメラーゼによる増幅プライマーの伸長によっ
て生成された標的配列の一本鎖コピーを意味する。
【００１４】検定プローブという用語は、検定の検出ま
たは同定部分で用いられる任意のオリゴヌクレオチドを
意味する。本発明において、検定プローブは、ミコバク
テリアの複合体−、群−または種特異的検出または同定
に用いられるプローブである。検出用プローブおよび捕
捉プローブは検定プローブの例である。
たは同定部分で用いられる任意のオリゴヌクレオチドを
意味する。本発明において、検定プローブは、ミコバク
テリアの複合体−、群−または種特異的検出または同定
に用いられるプローブである。検出用プローブおよび捕
捉プローブは検定プローブの例である。
【００１５】検定範囲または検定範囲配列は、検定プロ
ーブがハイブリッド形成する標的配列の部分または他の
核酸である。
ーブがハイブリッド形成する標的配列の部分または他の
核酸である。
【００１６】種特異的という用語は、同属の他の種また
は異なる属の種の実質的な検出または増幅を伴わない微
生物の種の検出または増幅を意味する。属特異的とは、
異なる属の種の実質的な検出または増幅を伴わない、あ
る属の種の大多数の検出または増幅を意味する。群−ま
たは複合体特異的とは、同属の他の種または異なる属の
種の実質的な検出または増幅を伴わない、ある選択され
た群（例えば、ＭＡＣ）の同類種の大多数の検出または
増幅を意味する。
は異なる属の種の実質的な検出または増幅を伴わない微
生物の種の検出または増幅を意味する。属特異的とは、
異なる属の種の実質的な検出または増幅を伴わない、あ
る属の種の大多数の検出または増幅を意味する。群−ま
たは複合体特異的とは、同属の他の種または異なる属の
種の実質的な検出または増幅を伴わない、ある選択され
た群（例えば、ＭＡＣ）の同類種の大多数の検出または
増幅を意味する。
【００１７】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ＭＡＣを含
む全２８種類の血液型亜型で見出された標的配列の複合
体特異的増幅に用いることかできるオリゴヌクレオチド
プライマーを提供する。該標的配列はｄｎａＪ遺伝子の
セグメントである。したがって、一つの対の増幅プライ
マーは、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方の
ｄｎａＪ遺伝子からの標的配列の増幅を可能にする。こ
れらの増幅プライマーは、ｔＳＤＡおよびＰＣＲの場合
のような増加した温度での高効率、高特異性増幅に対し
て設計されているが、しかしながら、それらは、従来の
ＳＤＡ、３ＳＲまたはＮＡＳＢＡのようなより低温の増
幅反応においても有用である。増幅された標的の検定範
囲に対してハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド検
定プローブを用いて、増幅生成物を検出し、場合によ
り、ＭＡＣ種間を区別する。本発明の方法はまた、ヒト
のクローン病および家畜のヨーネ病に関係した鳥型結核
菌の亜種であるパラ結核菌のｄｎａＪ標的配列の検出を
可能にする。
む全２８種類の血液型亜型で見出された標的配列の複合
体特異的増幅に用いることかできるオリゴヌクレオチド
プライマーを提供する。該標的配列はｄｎａＪ遺伝子の
セグメントである。したがって、一つの対の増幅プライ
マーは、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方の
ｄｎａＪ遺伝子からの標的配列の増幅を可能にする。こ
れらの増幅プライマーは、ｔＳＤＡおよびＰＣＲの場合
のような増加した温度での高効率、高特異性増幅に対し
て設計されているが、しかしながら、それらは、従来の
ＳＤＡ、３ＳＲまたはＮＡＳＢＡのようなより低温の増
幅反応においても有用である。増幅された標的の検定範
囲に対してハイブリッド形成するオリゴヌクレオチド検
定プローブを用いて、増幅生成物を検出し、場合によ
り、ＭＡＣ種間を区別する。本発明の方法はまた、ヒト
のクローン病および家畜のヨーネ病に関係した鳥型結核
菌の亜種であるパラ結核菌のｄｎａＪ標的配列の検出を
可能にする。
【００１８】
【課題を解決するための手段】ＭＡＣ種のｄｎａＪ遺伝
子の標的フラグメントの複合体特異的増幅を可能にする
増幅プライマーを提供する。鳥型結核菌およびＭ．イン
トラセルレアの配列は、増幅プライマーがハイブリッド
形成する範囲において１〜２個のヌクレオチドだけ異な
るので、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方の
標的の有効な増幅は、Ｓ．Ｉ．タケワキら（1994年、上
記）の配列データに基いて予測されなかった。プライマ
ーの標的結合配列とそれらが標的においてハイブリッド
形成する配列との誤対合は、概して、標的増幅を阻止す
るかまたはさもなければ妨げる。本発明は、更に、好熱
性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）によるｄｎａＪ遺伝子中のＭ
ＡＣ特異的標的の増幅に特に有用であるオリゴヌクレオ
チドプローブおよびプライマーを提供する。増幅された
標的は、ＭＡＣ種の存在を示すものとしてまたは存在す
る具体的なＭＡＣ種を同定するために検出されうる。本
発明のプライマーは、鳥型結核菌およびＭ．イントラセ
ルレア標的を、それらの標的の増幅プライマーハイブリ
ダイゼーション部位のヌクレオチド配列がこれらの種間
で異なるにもかかわらず、効率よく増幅する。鳥型結核
菌における標的は、本発明のプライマーを用いて少なく
とも約１０6倍に増幅される。更に、増幅後、増幅され
た鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア標的配列は、
本発明の検定プローブに対するハイブリダイゼーシ ョ
ンによって互いに区別することができる。
子の標的フラグメントの複合体特異的増幅を可能にする
増幅プライマーを提供する。鳥型結核菌およびＭ．イン
トラセルレアの配列は、増幅プライマーがハイブリッド
形成する範囲において１〜２個のヌクレオチドだけ異な
るので、鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア両方の
標的の有効な増幅は、Ｓ．Ｉ．タケワキら（1994年、上
記）の配列データに基いて予測されなかった。プライマ
ーの標的結合配列とそれらが標的においてハイブリッド
形成する配列との誤対合は、概して、標的増幅を阻止す
るかまたはさもなければ妨げる。本発明は、更に、好熱
性鎖置換増幅（ｔＳＤＡ）によるｄｎａＪ遺伝子中のＭ
ＡＣ特異的標的の増幅に特に有用であるオリゴヌクレオ
チドプローブおよびプライマーを提供する。増幅された
標的は、ＭＡＣ種の存在を示すものとしてまたは存在す
る具体的なＭＡＣ種を同定するために検出されうる。本
発明のプライマーは、鳥型結核菌およびＭ．イントラセ
ルレア標的を、それらの標的の増幅プライマーハイブリ
ダイゼーション部位のヌクレオチド配列がこれらの種間
で異なるにもかかわらず、効率よく増幅する。鳥型結核
菌における標的は、本発明のプライマーを用いて少なく
とも約１０6倍に増幅される。更に、増幅後、増幅され
た鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレア標的配列は、
本発明の検定プローブに対するハイブリダイゼーシ ョ
ンによって互いに区別することができる。
【００１９】最初に、鳥型結核菌およびＭ．イントラセ
ルレアのｄｎａＪ遺伝子を、タケワキら、1993年、上記
のプライマー＃３およびラシグラら、上記によって記載
されたヒト型結核菌ｄｎａＪ配列のヌクレオチド１７３
０〜１７５１に基く第二プライマーを用いてＰＣＲによ
って増幅させた。次に、増幅生成物を、タケワキら、19
94年、上記によって公表された配列を越えた範囲を含む
ように配列順序決定し、そしてそのようにして得られた
配列をプライマー設計用に整列させた。ｔＳＤＡによっ
て用いるために開発されたプライマーを表１で示す。更
に示されているのはＭＡＣ標的の検出用プローブであ
る。増幅プライマー中の典型的な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位（ＢｓｏＢＩ）を太字で示し且つ標的結合配
列をイタリック体で示している。増幅プライマーの標的
結合配列はその標的特異性を決定している。鳥型結核菌
およびＭ．イントラセルレアにおいて増幅プライマーが
ハイブリッド形成するｄｎａＪ配列は、標的の両末端の
１〜２個のヌクレオチドだけ異なる。増幅プライマーの
一つ（配列番号：７）を除く全部を、標的結合配列が完
全なワトソン・クリック相補性によって二つの標的の一
方（鳥型結核菌かまたはＭ．イントラセルレア）に対し
てハイブリッド形成するが、もう一方の種の標的に対し
てハイブリッド形成させた場合に１〜２個のヌクレオチ
ド誤対合を示すように設計した。例えば、配列番号：１
の標的結合配列は、完全な相補性によってＭ．イントラ
セルレア標的に対してハイブリッド形成するが、一つの
ヌクレオチド誤対合を含んで鳥型結核菌標的に対してハ
イブリッド形成する。配列番号：２〜４の標的結合配列
は、鳥型結核菌に対して２個のヌクレオチド誤対合を有
する。同様に、配列番号：５〜６の標的結合配列は、完
全な相補性によってＭ．イントラセルレア標的に対して
ハイブリッド形成するが、一つのヌクレオチド誤対合を
含んで鳥型結核菌標的に対してハイブリッド形成する。
配列番号：７は、それぞれの種の標的に対して一つのヌ
クレオチド誤対合を有する。
ルレアのｄｎａＪ遺伝子を、タケワキら、1993年、上記
のプライマー＃３およびラシグラら、上記によって記載
されたヒト型結核菌ｄｎａＪ配列のヌクレオチド１７３
０〜１７５１に基く第二プライマーを用いてＰＣＲによ
って増幅させた。次に、増幅生成物を、タケワキら、19
94年、上記によって公表された配列を越えた範囲を含む
ように配列順序決定し、そしてそのようにして得られた
配列をプライマー設計用に整列させた。ｔＳＤＡによっ
て用いるために開発されたプライマーを表１で示す。更
に示されているのはＭＡＣ標的の検出用プローブであ
る。増幅プライマー中の典型的な制限エンドヌクレアー
ゼ認識部位（ＢｓｏＢＩ）を太字で示し且つ標的結合配
列をイタリック体で示している。増幅プライマーの標的
結合配列はその標的特異性を決定している。鳥型結核菌
およびＭ．イントラセルレアにおいて増幅プライマーが
ハイブリッド形成するｄｎａＪ配列は、標的の両末端の
１〜２個のヌクレオチドだけ異なる。増幅プライマーの
一つ（配列番号：７）を除く全部を、標的結合配列が完
全なワトソン・クリック相補性によって二つの標的の一
方（鳥型結核菌かまたはＭ．イントラセルレア）に対し
てハイブリッド形成するが、もう一方の種の標的に対し
てハイブリッド形成させた場合に１〜２個のヌクレオチ
ド誤対合を示すように設計した。例えば、配列番号：１
の標的結合配列は、完全な相補性によってＭ．イントラ
セルレア標的に対してハイブリッド形成するが、一つの
ヌクレオチド誤対合を含んで鳥型結核菌標的に対してハ
イブリッド形成する。配列番号：２〜４の標的結合配列
は、鳥型結核菌に対して２個のヌクレオチド誤対合を有
する。同様に、配列番号：５〜６の標的結合配列は、完
全な相補性によってＭ．イントラセルレア標的に対して
ハイブリッド形成するが、一つのヌクレオチド誤対合を
含んで鳥型結核菌標的に対してハイブリッド形成する。
配列番号：７は、それぞれの種の標的に対して一つのヌ
クレオチド誤対合を有する。
【００２０】
【表１】
【００２１】ヌクレオチド誤対合の存在は、完全に相補
的な複合体と比較して、プライマー−標的複合体を不安
定にさせると考えられたが、意外にも、増幅効率を有意
に減少させるようには見えなかった。増幅反応および増
幅プライマーの伸長における標的配列に対する増幅プラ
イマーの初期ハイブリダイゼーションは、増幅プライマ
ーによって与えられた完全に相補的な配列と隣接した所
望の標的配列のコピーを生成する。したがって、誤対合
は訂正され、そしてこれらの末端に修飾された標的が増
幅される。したがって、鳥型結核菌およびＭ．イントラ
セルレア両方の修飾された標的の末端配列は同一になる
であろうが、増幅プライマーを結合する配列間の検定範
囲は未変化のままであり、鳥型結核菌およびＭ．イント
ラセルレアの増幅生成物を区別することは可能であろ
う。出願人は、核酸増幅のこの独特の特徴は、増幅に適
当な修飾された標的を生じるために、標的に対する誤対
合のあるプライマーの十分なハイブリダイゼーションが
存在する限りにおいて、増幅反応がプライマー／標的誤
対合の有害な影響を克服することを可能にすると仮定し
た。これは、このシステムにおいて誤対合にもかかわら
ず観察された増幅の高効率を説明しうる。表１で挙げた
増幅プライマーおよびバンパープライマーを用いると、
鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアのｄｎａＪ標的
を、ｔＳＤＡによって少なくとも約１０6倍に増幅させ
ることができ、鳥型結核菌の標的の１００初期コピーお
よびＭ．イントラセルレアの標的の１０００初期コピー
程度の僅かな検出が可能であ る。鳥型結核菌の検出の
ためのより大きい感度は、プライマー中の誤対合を考え
ると意外であった。更に、増幅および検出反応条件の常
套の最適化は、検定感度をなお一層増加させると予想さ
れる。
的な複合体と比較して、プライマー−標的複合体を不安
定にさせると考えられたが、意外にも、増幅効率を有意
に減少させるようには見えなかった。増幅反応および増
幅プライマーの伸長における標的配列に対する増幅プラ
イマーの初期ハイブリダイゼーションは、増幅プライマ
ーによって与えられた完全に相補的な配列と隣接した所
望の標的配列のコピーを生成する。したがって、誤対合
は訂正され、そしてこれらの末端に修飾された標的が増
幅される。したがって、鳥型結核菌およびＭ．イントラ
セルレア両方の修飾された標的の末端配列は同一になる
であろうが、増幅プライマーを結合する配列間の検定範
囲は未変化のままであり、鳥型結核菌およびＭ．イント
ラセルレアの増幅生成物を区別することは可能であろ
う。出願人は、核酸増幅のこの独特の特徴は、増幅に適
当な修飾された標的を生じるために、標的に対する誤対
合のあるプライマーの十分なハイブリダイゼーションが
存在する限りにおいて、増幅反応がプライマー／標的誤
対合の有害な影響を克服することを可能にすると仮定し
た。これは、このシステムにおいて誤対合にもかかわら
ず観察された増幅の高効率を説明しうる。表１で挙げた
増幅プライマーおよびバンパープライマーを用いると、
鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアのｄｎａＪ標的
を、ｔＳＤＡによって少なくとも約１０6倍に増幅させ
ることができ、鳥型結核菌の標的の１００初期コピーお
よびＭ．イントラセルレアの標的の１０００初期コピー
程度の僅かな検出が可能であ る。鳥型結核菌の検出の
ためのより大きい感度は、プライマー中の誤対合を考え
ると意外であった。更に、増幅および検出反応条件の常
套の最適化は、検定感度をなお一層増加させると予想さ
れる。
【００２２】本発明の増幅プライマーは、ＰＣＲ、従来
のＳＤＡ（ｔＳＤＡの場合と本質的に同じであるがより
低温で行われる反応スキーム）、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡお
よびＴＡＳのような他の核酸増幅プロトコルにおいても
有用である。具体的に、標的配列に対するプライマーの
循環的特異的ハイブリダイゼーション、標的配列を鋳型
として用いるプライマーの伸長およびその伸長生成物の
標的配列からの分離または置換を用いるいずれの増幅プ
ロトコルも、本発明の増幅プライマーを用いることがで
きる。特別な非標的結合配列を必要としない増幅法（例
えば、ＰＣＲ）に対して、増幅プライマーは、表１で挙
げた増幅プライマーの標的結合配列だけから成ることが
できる。表１で図示されたプライマー配列は、ＳＤＡの
ために必要とされ且つＳＤＡによる増幅に先立つ標的生
成反応において標的に対して付加される特別な非標的結
合配列（制限エンドヌクレアーゼ認識部位）を含む。標
的に対して結合された他の特別な非標的結合配列（例え
ば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＡＳによって必要とさ
れるＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を必要とする増
幅法は、選択された増幅法によって必要とされる配列に
対して付加された本明細書中で開示された標的結合配列
を含む増幅プライマーを用いることができる。同様に、
従来のＳＤＡに適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位
は、当該技術分野において知られている例示されたＢｓ
ｏＢＩに代用することができるし、または標的が好熱性
ＳＤＡによって増幅される場合、ｔＳＤＡに適当な別の
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を代用することができ
る。ＳＤＡ以外の増幅法に対する本発明の標的結合配列
の適応は、化学合成のような増幅プライマーの製造のた
めの常套法、および選択された増幅反応のプライマーに
対する周知の構造的必要条件を用いる。本発明の標的結
合配列は、したがって、生成、スクリーニングおよび最
適化のための常套法だけを用いる種々の増幅反応でのＭ
ＡＣ特異的標的増幅および検出に対して容易に適応する
ことができる。
のＳＤＡ（ｔＳＤＡの場合と本質的に同じであるがより
低温で行われる反応スキーム）、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡお
よびＴＡＳのような他の核酸増幅プロトコルにおいても
有用である。具体的に、標的配列に対するプライマーの
循環的特異的ハイブリダイゼーション、標的配列を鋳型
として用いるプライマーの伸長およびその伸長生成物の
標的配列からの分離または置換を用いるいずれの増幅プ
ロトコルも、本発明の増幅プライマーを用いることがで
きる。特別な非標的結合配列を必要としない増幅法（例
えば、ＰＣＲ）に対して、増幅プライマーは、表１で挙
げた増幅プライマーの標的結合配列だけから成ることが
できる。表１で図示されたプライマー配列は、ＳＤＡの
ために必要とされ且つＳＤＡによる増幅に先立つ標的生
成反応において標的に対して付加される特別な非標的結
合配列（制限エンドヌクレアーゼ認識部位）を含む。標
的に対して結合された他の特別な非標的結合配列（例え
ば、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡおよびＴＡＳによって必要とさ
れるＲＮＡポリメラーゼプロモーター）を必要とする増
幅法は、選択された増幅法によって必要とされる配列に
対して付加された本明細書中で開示された標的結合配列
を含む増幅プライマーを用いることができる。同様に、
従来のＳＤＡに適当な制限エンドヌクレアーゼ認識部位
は、当該技術分野において知られている例示されたＢｓ
ｏＢＩに代用することができるし、または標的が好熱性
ＳＤＡによって増幅される場合、ｔＳＤＡに適当な別の
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を代用することができ
る。ＳＤＡ以外の増幅法に対する本発明の標的結合配列
の適応は、化学合成のような増幅プライマーの製造のた
めの常套法、および選択された増幅反応のプライマーに
対する周知の構造的必要条件を用いる。本発明の標的結
合配列は、したがって、生成、スクリーニングおよび最
適化のための常套法だけを用いる種々の増幅反応でのＭ
ＡＣ特異的標的増幅および検出に対して容易に適応する
ことができる。
【００２３】本発明のプライマーは、多数の異なる標的
が同時に増幅される増幅反応（多種増幅または多種化）
においても有用である。例えば、ＳＤＡを用いる多種増
幅は、米国特許第5,470,723号明細書および米国特許第
5,422,252号明細書で記載され、それらの開示は本明細
書に援用される。そこで開示されたように、アダプター
プライマーを用いると、ｄｎａＪ標的の末端配列を第二
標的の一端に付加することができるし、そして第二標的
の末端配列をｄｎａＪ標的の一端に付加することができ
る。例えば、アダプタープライマーを生成するために、
本明細書中で開示されたｄｎａＪ増幅プライマーの標的
結合配列の５′末端を、第二標的に対する増幅プライマ
ーの標的結合配列と実質的に同一であるアダプター配列
に対して結合することができる。第二標的に対して、ア
ダプタープライマーは、第二標的に対してハイブリッド
形成する３′標的結合配列およびｄｎａＪの増幅プライ
マーの標的結合配列と実質的に同一である５′配列を含
む。それぞれの標的の末端セグメントを他方の一端に対
して付加した後、ｄｎａＪ増幅プライマーおよび第二標
的の増幅プライマーを含んで成る一つの対の増幅プライ
マーを用いて、それらを両方とも増幅させることができ
る。例えば、本発明のプライマーを、ＩＳ６１１０増幅
プライマーおよび適当なアダプタープライマーと一緒に
用いて、検定の検出部分での群または種の同定と共に、
ヒト型結核菌特異的およびＭＡＣ特異的標的を同時に増
幅することができる。或いは、本発明のプライマーを、
１６Ｓプライマーおよび適当なアダプタープライマーと
一緒に用いて、検定の検出部分でのＭＡＣの群特異的同
定またはミコバクテリアの属特異的同定と共に、ミコバ
クテリウム属特異的およびＭＡＣ種特異的標的を同時に
増幅することができる。
が同時に増幅される増幅反応（多種増幅または多種化）
においても有用である。例えば、ＳＤＡを用いる多種増
幅は、米国特許第5,470,723号明細書および米国特許第
5,422,252号明細書で記載され、それらの開示は本明細
書に援用される。そこで開示されたように、アダプター
プライマーを用いると、ｄｎａＪ標的の末端配列を第二
標的の一端に付加することができるし、そして第二標的
の末端配列をｄｎａＪ標的の一端に付加することができ
る。例えば、アダプタープライマーを生成するために、
本明細書中で開示されたｄｎａＪ増幅プライマーの標的
結合配列の５′末端を、第二標的に対する増幅プライマ
ーの標的結合配列と実質的に同一であるアダプター配列
に対して結合することができる。第二標的に対して、ア
ダプタープライマーは、第二標的に対してハイブリッド
形成する３′標的結合配列およびｄｎａＪの増幅プライ
マーの標的結合配列と実質的に同一である５′配列を含
む。それぞれの標的の末端セグメントを他方の一端に対
して付加した後、ｄｎａＪ増幅プライマーおよび第二標
的の増幅プライマーを含んで成る一つの対の増幅プライ
マーを用いて、それらを両方とも増幅させることができ
る。例えば、本発明のプライマーを、ＩＳ６１１０増幅
プライマーおよび適当なアダプタープライマーと一緒に
用いて、検定の検出部分での群または種の同定と共に、
ヒト型結核菌特異的およびＭＡＣ特異的標的を同時に増
幅することができる。或いは、本発明のプライマーを、
１６Ｓプライマーおよび適当なアダプタープライマーと
一緒に用いて、検定の検出部分でのＭＡＣの群特異的同
定またはミコバクテリアの属特異的同定と共に、ミコバ
クテリウム属特異的およびＭＡＣ種特異的標的を同時に
増幅することができる。
【００２４】アダプターに媒介された多種化において用
いられるプライマーの構造および機能は、米国特許第5,
470,723号明細書および米国特許第5,422,252号明細書で
記載されている。これらの技法を用いると、本発明のｄ
ｎａＪ増幅プイラマーの標的結合配列を、プライマー構
築のための常套法を用いてアダプター配列に対して付加
し且つｄｎａＪ標的および任意の選択された第二標的の
多種増幅に用いることができる。例えば、本発明のプラ
イマーおよび上記特許のプライマーは、表２で示される
ＭＡＣ特異的標的（ｄｎａＪ）およびヒト型結核菌種特
異的標的（ＩＳ６１１０）のｔＳＤＡ多種増幅に適応す
ることができる。標的結合配列をイタリック体で示し、
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を太字で示し、そして
アダプター配列に下線を施している。
いられるプライマーの構造および機能は、米国特許第5,
470,723号明細書および米国特許第5,422,252号明細書で
記載されている。これらの技法を用いると、本発明のｄ
ｎａＪ増幅プイラマーの標的結合配列を、プライマー構
築のための常套法を用いてアダプター配列に対して付加
し且つｄｎａＪ標的および任意の選択された第二標的の
多種増幅に用いることができる。例えば、本発明のプラ
イマーおよび上記特許のプライマーは、表２で示される
ＭＡＣ特異的標的（ｄｎａＪ）およびヒト型結核菌種特
異的標的（ＩＳ６１１０）のｔＳＤＡ多種増幅に適応す
ることができる。標的結合配列をイタリック体で示し、
制限エンドヌクレアーゼ認識部位を太字で示し、そして
アダプター配列に下線を施している。
【００２５】
【表２】
【００２６】多種プライマーセット３は、ヒト型結核菌
および鳥型結核菌両方において標的の最もよい検出を提
供した。本発明のプライマーは、更に、当該技術分野に
おいて知られている多種ＰＣＲに対して、典型的に、本
発明のＭＡＣ特異的プライマー対および別の標的特異性
を有するＰＣＲプライマー対の標的結合配列を用いてＰ
ＣＲを行うことによって適応することができる。
および鳥型結核菌両方において標的の最もよい検出を提
供した。本発明のプライマーは、更に、当該技術分野に
おいて知られている多種ＰＣＲに対して、典型的に、本
発明のＭＡＣ特異的プライマー対および別の標的特異性
を有するＰＣＲプライマー対の標的結合配列を用いてＰ
ＣＲを行うことによって適応することができる。
【００２７】増幅生成物が生成されるＭＡＣ種は、ハイ
ブリダイゼーションによって同定されまたは区別され
て、検定の検出部分でプローブを検定することができ
る。ハイブリダイゼーションによる検出に対して、検出
用プローブは、典型的に、検出可能な標識を付けられ
る。検出可能な標識は、標的核酸に対するプローブのハ
イブリダイゼーションを示すものとして直接的にかまた
は間接的に検出することができる残基である。標識の直
接的検出に対して、プローブは、放射性同位体を付けら
れ且つオートラジオグラフィーによって検出されうるし
または蛍光残基を付けられ且つ当該技術分野において知
られているように蛍光によって検出されうる。或いは、
プローブは、それを検出可能にさせるのに更に別の試薬
を必要とする標識を付けることによって間接的に検出さ
れうる。間接的に検出可能な標識としては、例えば、化
学発光物質、目に見える反応生成物を生じる酵素、およ
び標識された特異的結合パートナー（例えば、抗体また
は抗原／ハプテン）に対して結合することによって検出
することができるリガンド（例えば、ビオチン、アビジ
ン、ストレプトアビジン、ハプテン、抗体または抗原）
がある。特に有用な標識としては、（標識されたアビジ
ンまたはストレプトアビジンに対して結合することによ
って検出可能な）ビオチンおよび（着色反応生成物を生
じる酵素基質の添加によって検出可能な）西洋ワサビペ
ルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼのよう
な酵素がある。ビオチンおよび他のリガンドはまた、捕
捉プローブおよびそれが適当な特異的結合パートナーに
対して結合することによって固相上でハイブリッド形成
する複合体を固定させるように、捕捉プローブに付ける
のに有用である。このような標識をオリゴヌクレオチド
に対して加えるまたはこのような標識をオリゴヌクレオ
チド中に包含させる方法は当該技術分野において周知で
あり、そしてこれらの方法はいずれも、本発明において
用いるのに適している。
ブリダイゼーションによって同定されまたは区別され
て、検定の検出部分でプローブを検定することができ
る。ハイブリダイゼーションによる検出に対して、検出
用プローブは、典型的に、検出可能な標識を付けられ
る。検出可能な標識は、標的核酸に対するプローブのハ
イブリダイゼーションを示すものとして直接的にかまた
は間接的に検出することができる残基である。標識の直
接的検出に対して、プローブは、放射性同位体を付けら
れ且つオートラジオグラフィーによって検出されうるし
または蛍光残基を付けられ且つ当該技術分野において知
られているように蛍光によって検出されうる。或いは、
プローブは、それを検出可能にさせるのに更に別の試薬
を必要とする標識を付けることによって間接的に検出さ
れうる。間接的に検出可能な標識としては、例えば、化
学発光物質、目に見える反応生成物を生じる酵素、およ
び標識された特異的結合パートナー（例えば、抗体また
は抗原／ハプテン）に対して結合することによって検出
することができるリガンド（例えば、ビオチン、アビジ
ン、ストレプトアビジン、ハプテン、抗体または抗原）
がある。特に有用な標識としては、（標識されたアビジ
ンまたはストレプトアビジンに対して結合することによ
って検出可能な）ビオチンおよび（着色反応生成物を生
じる酵素基質の添加によって検出可能な）西洋ワサビペ
ルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼのよう
な酵素がある。ビオチンおよび他のリガンドはまた、捕
捉プローブおよびそれが適当な特異的結合パートナーに
対して結合することによって固相上でハイブリッド形成
する複合体を固定させるように、捕捉プローブに付ける
のに有用である。このような標識をオリゴヌクレオチド
に対して加えるまたはこのような標識をオリゴヌクレオ
チド中に包含させる方法は当該技術分野において周知で
あり、そしてこれらの方法はいずれも、本発明において
用いるのに適している。
【００２８】増幅生成物を検出する一つの方法は、検定
範囲に対して特異的にハイブリッド形成したプライマー
のポリメラーゼ伸長を用いる。そのプライマーを上記の
ように、例えば、放射性同位体によって標識し、その結
果、標識はアンプリコン特異的伸長生成物中にプライマ
ーと一緒に包含される。プライマー伸長による検出は、
Ｇ．ウォーカーら（1992年，Nucl.Acids Res.およびPNA
S、上記）によって記載されている。配列番号：１４
は、鳥型結核菌の検出用の本発明の増幅プライマーと連
結したプライマー伸長検出用プロ ーブとして特に有用
である。配列番号：１５は、Ｍ．イントラセルレアの検
出用の本発明の増幅プライマーと連結したプライマー伸
長検出用プローブとして特に有用である。増幅生成物を
検出する第二の方法は、ビオチニル化オリゴヌクレオチ
ド捕捉プローブおよび、Ｃ．Ａ．スパーゴ（Spargo）ら
（1993年，Molec.Cell.Probes 7,395-404）によって記
載の酵素結合オリゴヌクレオチド検出用プローブを用い
て増幅生成物を検出する化学発光検定である。検定範囲
中の異なる部位に対するこれら二つのプローブのハイブ
リダイゼーション後、複合体をストレプトアビジン被
覆マイクロウェルプレート上で捕捉し、そして化学発光
シグナルを生じさせ且つルミノメーターで読み取る。化
学発光検定は２時間未満で行うことができ、しかも１個
程度の少ない前増幅標的配列を検出するのに十分に感度
がよい。配列番号：１４および配列番号：１５は、検定
において捕捉または検出用プローブとしても有用であ
る。
範囲に対して特異的にハイブリッド形成したプライマー
のポリメラーゼ伸長を用いる。そのプライマーを上記の
ように、例えば、放射性同位体によって標識し、その結
果、標識はアンプリコン特異的伸長生成物中にプライマ
ーと一緒に包含される。プライマー伸長による検出は、
Ｇ．ウォーカーら（1992年，Nucl.Acids Res.およびPNA
S、上記）によって記載されている。配列番号：１４
は、鳥型結核菌の検出用の本発明の増幅プライマーと連
結したプライマー伸長検出用プロ ーブとして特に有用
である。配列番号：１５は、Ｍ．イントラセルレアの検
出用の本発明の増幅プライマーと連結したプライマー伸
長検出用プローブとして特に有用である。増幅生成物を
検出する第二の方法は、ビオチニル化オリゴヌクレオチ
ド捕捉プローブおよび、Ｃ．Ａ．スパーゴ（Spargo）ら
（1993年，Molec.Cell.Probes 7,395-404）によって記
載の酵素結合オリゴヌクレオチド検出用プローブを用い
て増幅生成物を検出する化学発光検定である。検定範囲
中の異なる部位に対するこれら二つのプローブのハイブ
リダイゼーション後、複合体をストレプトアビジン被
覆マイクロウェルプレート上で捕捉し、そして化学発光
シグナルを生じさせ且つルミノメーターで読み取る。化
学発光検定は２時間未満で行うことができ、しかも１個
程度の少ない前増幅標的配列を検出するのに十分に感度
がよい。配列番号：１４および配列番号：１５は、検定
において捕捉または検出用プローブとしても有用であ
る。
【００２９】本発明の一つの実施態様において、表１で
示された捕捉および検出用プローブは、鳥型結核菌およ
び／またはＭ．イントラセルレア増幅生成物の存在を検
出するのに用いることができる。鳥型結核菌およびＭ．
イントラセルレアの増幅生成物の検定範囲はいくつかの
ヌクレオチド位置で互いに異なるので、所望の標的の検
定範囲に特異的な捕捉および／または検出用プローブだ
けを用いて種を区別することができる。これらの同様の
検定プローブはまた、パラ結核菌を検出する。或いは、
多数の種特異的検定プローブは、全ＭＡＣ種の増幅生成
物を検出するために、それらの間で区別することなく単
一混合物中に混合することができる。
示された捕捉および検出用プローブは、鳥型結核菌およ
び／またはＭ．イントラセルレア増幅生成物の存在を検
出するのに用いることができる。鳥型結核菌およびＭ．
イントラセルレアの増幅生成物の検定範囲はいくつかの
ヌクレオチド位置で互いに異なるので、所望の標的の検
定範囲に特異的な捕捉および／または検出用プローブだ
けを用いて種を区別することができる。これらの同様の
検定プローブはまた、パラ結核菌を検出する。或いは、
多数の種特異的検定プローブは、全ＭＡＣ種の増幅生成
物を検出するために、それらの間で区別することなく単
一混合物中に混合することができる。
【００３０】
実施例１ 表１で示された上流および下流増幅プライマーの対の
（pairwise）組み合わせ全部を、鳥型結核菌の標的（１
０6ゲノム）の増幅についてｔＳＤＡによって試験し
た。増幅反応は、本質的に、公開欧州特許出願第068431
5号明細書で記載のように行われた。これは、４種類の
上流プライマー（配列番号：１〜４）それぞれが３種類
の下流プライマー（配列番号：５〜７）それぞれと対に
なった全部で１２種類の増幅反応を引き起こした。各プ
ライマー対は有力で明確な検定結果を生じ、ｄｎａＪ標
的配列の増幅を示した。
（pairwise）組み合わせ全部を、鳥型結核菌の標的（１
０6ゲノム）の増幅についてｔＳＤＡによって試験し
た。増幅反応は、本質的に、公開欧州特許出願第068431
5号明細書で記載のように行われた。これは、４種類の
上流プライマー（配列番号：１〜４）それぞれが３種類
の下流プライマー（配列番号：５〜７）それぞれと対に
なった全部で１２種類の増幅反応を引き起こした。各プ
ライマー対は有力で明確な検定結果を生じ、ｄｎａＪ標
的配列の増幅を示した。
【００３１】実施例２ 鳥型結核菌およびＭ．イントラセルレアｄｎａＪ標的配
列の増幅および検出の感度を、鳥型結核菌株ＡＴＣＣ２
５２９１およびＭ．イントラセルレア菌株ＡＴＣＣ１３
９５０を用いて決定した。ミコバクテリアゲノムＤＮＡ
を単離し且つヒト胎盤ＤＮＡ ５０ｎｇ中で希釈して、
最終濃度をｔＳＤＡ反応５０μＬ中１０4、１０3、１０
2、１０および０ゲノムとした。増幅プライマーは配列
番号：１および配列番号：６であり且つバンパープライ
マーは配列番号：８および配列番号：９であった。好熱
性ＳＤＡは、本質 的に、公開欧州特許出願第0684315号
明細書で記載のように、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ
７．６、アセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０
０μｇ／ｍＬ、０．５ｍＭ ｄＵＴＰ、各０．２ｍＭの
ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ、並びに１．４ｍＭ ２′デオ
キシシチジン５′−Ｏ−（１−チオ三リン酸）（α−チ
オｄＣＴＰ）、１２％グリセロール、６．５ｍＭ酢酸マ
グネシウム、０．５μＭ増幅プライマー、０．０５μＭ
バンパープライマー、ヒト胎盤ＤＮＡ ５０ｎｇ、Ｂｓ
ｔポリメラーゼ１２．５単位、ＢｓｏＢＩ １６０単
位、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）１単位お
よびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）２
単位を含む反応混合物中で行った。
列の増幅および検出の感度を、鳥型結核菌株ＡＴＣＣ２
５２９１およびＭ．イントラセルレア菌株ＡＴＣＣ１３
９５０を用いて決定した。ミコバクテリアゲノムＤＮＡ
を単離し且つヒト胎盤ＤＮＡ ５０ｎｇ中で希釈して、
最終濃度をｔＳＤＡ反応５０μＬ中１０4、１０3、１０
2、１０および０ゲノムとした。増幅プライマーは配列
番号：１および配列番号：６であり且つバンパープライ
マーは配列番号：８および配列番号：９であった。好熱
性ＳＤＡは、本質 的に、公開欧州特許出願第0684315号
明細書で記載のように、２５ｍＭリン酸カリウムｐＨ
７．６、アセチル化ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）１０
０μｇ／ｍＬ、０．５ｍＭ ｄＵＴＰ、各０．２ｍＭの
ｄＡＴＰおよびｄＧＴＰ、並びに１．４ｍＭ ２′デオ
キシシチジン５′−Ｏ−（１−チオ三リン酸）（α−チ
オｄＣＴＰ）、１２％グリセロール、６．５ｍＭ酢酸マ
グネシウム、０．５μＭ増幅プライマー、０．０５μＭ
バンパープライマー、ヒト胎盤ＤＮＡ ５０ｎｇ、Ｂｓ
ｔポリメラーゼ１２．５単位、ＢｓｏＢＩ １６０単
位、ウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）１単位お
よびウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ阻害剤（Ｕｇｉ）２
単位を含む反応混合物中で行った。
【００３２】酵素の添加および増幅反応の開始の前に、
試料を２分間煮沸した。次に、試料を４１℃で２分間イ
ンキュベートし、そしてＵＮＧを加えて混入したアンプ
リコンを全て分解した。ＵＮＧと一緒に３０分間インキ
ュベーションした後、試料を５分間５２℃にした。酵素
配合物（Ｂｓｔポリメラーゼ、ＢｓｏＢＩ、Ｕｇｉおよ
びグリセロール）を加え、そして増幅を５２℃で３０分
間進行させた。反応を５分間煮沸することによって停止
した。
試料を２分間煮沸した。次に、試料を４１℃で２分間イ
ンキュベートし、そしてＵＮＧを加えて混入したアンプ
リコンを全て分解した。ＵＮＧと一緒に３０分間インキ
ュベーションした後、試料を５分間５２℃にした。酵素
配合物（Ｂｓｔポリメラーゼ、ＢｓｏＢＩ、Ｕｇｉおよ
びグリセロール）を加え、そして増幅を５２℃で３０分
間進行させた。反応を５分間煮沸することによって停止
した。
【００３３】増幅生成物を、本質的にはスパーゴら、上
記によって記載のように、化学発光検定で検出した。ア
ルカリ性ホスファターゼで標識された検出用プローブ配
列番号：１２および配列番号：１３、ビオチニル化捕捉
プローブ配列番号：１０および配列番号：１１、並びに
試料を、ストレプトアビジンによって被覆された微量滴
定プレートのウェルに対して加え且つ３７℃で５０分間
インキュベートした。このシステムでのＭ．ヘモフィル
ム（hemophilum）では低レベルの標的増幅が予想され
た。しかしながら、検定の検出部分での両方の捕捉プロ
ーブの使用は、Ｍ．ヘモフィルムの検定範囲に対する両
方のハイブリッド形成を引き起こし、それによって検出
プローブの接近を阻止した。したがって、Ｍ．ヘモフィ
ルム標的は検出されなかった。捕捉プローブはまた、特
に、Ｍ．ヘモフィルム標的の検出が問題ではない場合
に、個々の種を検出するための対応する検出用プローブ
と一緒に別個に用いることができる。次に、ウェルを緊
縮緩衝液によって３回洗浄した。ＬＵＭＩＰＨＯＳ（ル
ミジェン・インコーポレーテッド（Lumigen,Inc.）を加
え、そして反応を３７℃で３０分間インキュベートし
た。ルミネセンスをルミノメーターで検出し、そして相
対光単位（ＲＬＵ）を記録した。バックグラウンドの少
なくとも約２〜３倍のＲＬＵ読みを正とみなした。結果
は下記の通りであった。
記によって記載のように、化学発光検定で検出した。ア
ルカリ性ホスファターゼで標識された検出用プローブ配
列番号：１２および配列番号：１３、ビオチニル化捕捉
プローブ配列番号：１０および配列番号：１１、並びに
試料を、ストレプトアビジンによって被覆された微量滴
定プレートのウェルに対して加え且つ３７℃で５０分間
インキュベートした。このシステムでのＭ．ヘモフィル
ム（hemophilum）では低レベルの標的増幅が予想され
た。しかしながら、検定の検出部分での両方の捕捉プロ
ーブの使用は、Ｍ．ヘモフィルムの検定範囲に対する両
方のハイブリッド形成を引き起こし、それによって検出
プローブの接近を阻止した。したがって、Ｍ．ヘモフィ
ルム標的は検出されなかった。捕捉プローブはまた、特
に、Ｍ．ヘモフィルム標的の検出が問題ではない場合
に、個々の種を検出するための対応する検出用プローブ
と一緒に別個に用いることができる。次に、ウェルを緊
縮緩衝液によって３回洗浄した。ＬＵＭＩＰＨＯＳ（ル
ミジェン・インコーポレーテッド（Lumigen,Inc.）を加
え、そして反応を３７℃で３０分間インキュベートし
た。ルミネセンスをルミノメーターで検出し、そして相
対光単位（ＲＬＵ）を記録した。バックグラウンドの少
なくとも約２〜３倍のＲＬＵ読みを正とみなした。結果
は下記の通りであった。
【００３４】
【表３】
【００３５】このプライマーセットを用いた検定感度
は、鳥型結核菌に対して１０〜１００ゲノムであり且つ
Ｍ．イントラセルレアに対して１００〜１０００ゲノム
であった。配列番号：２／配列番号：５増幅プライマー
対に対する増幅および検出感度を同様の実験で調べ、そ
して鳥型結核菌の１００〜１０００初期ゲノムの検出感
度をもたらした。
は、鳥型結核菌に対して１０〜１００ゲノムであり且つ
Ｍ．イントラセルレアに対して１００〜１０００ゲノム
であった。配列番号：２／配列番号：５増幅プライマー
対に対する増幅および検出感度を同様の実験で調べ、そ
して鳥型結核菌の１００〜１０００初期ゲノムの検出感
度をもたらした。
【００３６】実施例３ プライマー特異性を、インダーリードら、上記によって
記載された２８種類のＭＡＣ血清型亜型（各血清型亜型
の菌株を含む）のｄｎａＪ標的配列を増幅することによ
って、反応当り１０5ゲノムを用いて評価した。試験さ
れた鳥型結核菌株は、鳥型結核菌型菌株（ＡＴＣＣ２５
２９１）、１１９０７−３００、Ｂ−９２、１４１４１
−１３９５（ＡＴＣＣ３５７１６）、６１９５、Sparro
w １８５（ＡＴＣＣ２５７６７）、３４５４０−Wale
s、１４１８６−１４２４（ＡＴＣＣ３５７６８）、１
３５２８−１０７９ 、２５５５４６−７５９、ＳＢＪ
＃２、ＴＭＣ１４６１（ＡＴＣＣ１４６１）、１６０２
−１９６５、２９９３、６１９４、１７５４８−２８６
（ＡＴＣＣ１４７９）およびＷ−５５２であった。試験
されたＭ．イントラセルレア菌株は、ＡＴＣＣ１３９５
０、１５７ Manten、Ｐ−４２（ＡＴＣＣ３５７６
２）、５５０９−Borstel（ＡＴＣＣ２５１２２）、Edg
ar Boone（ＡＴＣＣ３５７６１）、Dent（ＡＴＣＣ３５
８４０）、Yandle-Yandle、Ｐ−５４（ＡＴＣＣ３５７
６３）、Ｐ−４０（ＡＴＣＣ３５７６４）、７２−８０
８、１２４４ Hillberry、６８４５、１２６４５および
２３３９３であった。International Working Group on
Mycobacterial Taxonomy による分子判定基準および培
養特性によって未解決であった素性の２種類の菌株：Me
lnick（ＡＴＣＣ３５７７０）および５１５４ O'Connor
を更に試験した。Ｐ−４９（ＡＴＣＣ３５８４７）お
よび Lane ３０８１も試験したが、以前に、Internatio
nal Working Group on Mycobacterial Taxonomy によっ
てＭ．スクロフラセウムと同定されおり、それはＭＡＣ
のメンバーではない。ｔＳＤＡおよび検出反応は実施例
２の場合と同様に行われた。負の対照のＲＬＵ読み（ヒ
ト胎盤ＤＮＡ ５０ｎｇだけを含有する増幅反応−ＲＬ
Ｕ０．９３）と比較すると、Ｍ．スクロフラセウム菌株
の一つおよび両方の未同定菌株は検定において負であっ
た（ＲＬＵ２〜６）。試験されたＭＡＣ種全部において
標的を増幅させ且つ検出し、そして強い正のシグナルを
生じた（ＲＬＵ７６〜１８７４）。次のＭ．スクロフラ
セウムはかすかに正（ＲＬＵ２７）であったが、ＭＡＣ
種の強い正の結果と容易に区別された。標的結合配列は
配列番号：１および配列番号：６と同様の標的範囲に対
してハイブリッド形成するので、他の増幅プライマー対
について同様の特異性が予想される。標的結合配列の
５′末端の１〜３個のヌクレオチドの付加または欠失
は、プライマーの特異性を変化させるはずはないが、検
定感度を変更するかもしれない。
記載された２８種類のＭＡＣ血清型亜型（各血清型亜型
の菌株を含む）のｄｎａＪ標的配列を増幅することによ
って、反応当り１０5ゲノムを用いて評価した。試験さ
れた鳥型結核菌株は、鳥型結核菌型菌株（ＡＴＣＣ２５
２９１）、１１９０７−３００、Ｂ−９２、１４１４１
−１３９５（ＡＴＣＣ３５７１６）、６１９５、Sparro
w １８５（ＡＴＣＣ２５７６７）、３４５４０−Wale
s、１４１８６−１４２４（ＡＴＣＣ３５７６８）、１
３５２８−１０７９ 、２５５５４６−７５９、ＳＢＪ
＃２、ＴＭＣ１４６１（ＡＴＣＣ１４６１）、１６０２
−１９６５、２９９３、６１９４、１７５４８−２８６
（ＡＴＣＣ１４７９）およびＷ−５５２であった。試験
されたＭ．イントラセルレア菌株は、ＡＴＣＣ１３９５
０、１５７ Manten、Ｐ−４２（ＡＴＣＣ３５７６
２）、５５０９−Borstel（ＡＴＣＣ２５１２２）、Edg
ar Boone（ＡＴＣＣ３５７６１）、Dent（ＡＴＣＣ３５
８４０）、Yandle-Yandle、Ｐ−５４（ＡＴＣＣ３５７
６３）、Ｐ−４０（ＡＴＣＣ３５７６４）、７２−８０
８、１２４４ Hillberry、６８４５、１２６４５および
２３３９３であった。International Working Group on
Mycobacterial Taxonomy による分子判定基準および培
養特性によって未解決であった素性の２種類の菌株：Me
lnick（ＡＴＣＣ３５７７０）および５１５４ O'Connor
を更に試験した。Ｐ−４９（ＡＴＣＣ３５８４７）お
よび Lane ３０８１も試験したが、以前に、Internatio
nal Working Group on Mycobacterial Taxonomy によっ
てＭ．スクロフラセウムと同定されおり、それはＭＡＣ
のメンバーではない。ｔＳＤＡおよび検出反応は実施例
２の場合と同様に行われた。負の対照のＲＬＵ読み（ヒ
ト胎盤ＤＮＡ ５０ｎｇだけを含有する増幅反応−ＲＬ
Ｕ０．９３）と比較すると、Ｍ．スクロフラセウム菌株
の一つおよび両方の未同定菌株は検定において負であっ
た（ＲＬＵ２〜６）。試験されたＭＡＣ種全部において
標的を増幅させ且つ検出し、そして強い正のシグナルを
生じた（ＲＬＵ７６〜１８７４）。次のＭ．スクロフラ
セウムはかすかに正（ＲＬＵ２７）であったが、ＭＡＣ
種の強い正の結果と容易に区別された。標的結合配列は
配列番号：１および配列番号：６と同様の標的範囲に対
してハイブリッド形成するので、他の増幅プライマー対
について同様の特異性が予想される。標的結合配列の
５′末端の１〜３個のヌクレオチドの付加または欠失
は、プライマーの特異性を変化させるはずはないが、検
定感度を変更するかもしれない。
【００３７】実施例４ 本発明のプライマーの種および属交差反応性について、
実施例２の場合と同様に反応当り１０7ゲノムの各非Ｍ
ＡＣ種を増幅することによって試験した。鳥型結核菌
（ＡＴＣＣ２５２９１）およびＭ．イントラセルレア
（ＡＴＣＣ１３９５０）（反応当り１０4ゲノム）は正
の対照として役立った。試験されたミコバクテリアの非
ＭＡＣ種は、パラ結核菌（Linda）、Ｍ．ケロネエ（Ｔ
ＭＣ１５４３）、Ｍ．フォルツイツム（ＴＭＣ２８０
８）、Ｍ．ガストリ（gastri）（ＬＣＤＣ１３０１）、
Ｍ．ゴルドネエ（ＴＭＣ１３１８）、Ｍ．カンサシイ
（ＴＭＣ１２０１）、Ｍ．マリヌム（marinum）（ＬＣ
ＤＣ８０１）、Ｍ．ミクロティ（ＬＣＤＣ２０３）、
Ｍ．スクロフラセウム（ＴＭＣ１３０２）、ヒト型結核
菌（ＶＡ４４）、Ｍ．キセノピ（xenopi）（ＬＣＤＣ１
９０１）、ウシ型結核菌（ＣＤＣ５２）、ウシ型結核菌
−ＢＣＧ（ＣＤＣ４）、Ｍ．アフリカヌム（ＡＴＣＣ３
５７１１）、Ｍ．マルモエンス（malmoense）（ＢＤＤ
ＩＳ３４７２）、Ｍ．フラベセンス（flavescens）（Ｌ
ＣＤＣ２６０１）、Ｍ．テレエ（terrae）（ＢＤＤＩＳ
３０１０）、Ｍ．ヘモフィルム（ＡＴＣＣ２７５４
８）、Ｍ．ゲネベンス（genevense）（ＰＩＲ２１）、
スメグマ菌（M.smegmatis）（ＴＭＣ１５３３）、Ｍ．
スズルガイ（szulgai）（ＴＭＣ１３２８）、Ｍ．スズ
ルガイ（ＶＡＨ）、Ｍ．シミエー（simiae）（ＢＤＤＩ
Ｓ２３０８）、Ｍ．シミエー（ＢＤＤＩＳ２３００）お
よびＭ．シミエー（ＢＤＤＩＳ２３０１）であった。負
の対照増幅反応（ヒト胎盤ＤＮＡ ５０ｎｇ−ＲＬＵ
０．９）と比較すると、Ｍ．マルモエンス菌株の弱い正
シグナル（ＲＬＵ４．６）、Ｍ．スズルガイの一つの菌
株での強い正シグナル（ＴＭＣ１３２８，ＲＬＵ２１６
１）およびＭ．シミエーの一つの菌株での強い正シグナ
ル（ＢＤＤＩＳ２３０８，ＲＬＵ２４０４）を例外とし
て、非ＭＡＣ種全部が負であった（ＲＬＵ０．３〜０．
６）。Ｍ．スズルガイおよびＭ．シミエーの他の菌株は
明らかに負であった。鳥型結核菌の亜種であるパラ結核
菌もまた、強い正シグナルを与えた。
実施例２の場合と同様に反応当り１０7ゲノムの各非Ｍ
ＡＣ種を増幅することによって試験した。鳥型結核菌
（ＡＴＣＣ２５２９１）およびＭ．イントラセルレア
（ＡＴＣＣ１３９５０）（反応当り１０4ゲノム）は正
の対照として役立った。試験されたミコバクテリアの非
ＭＡＣ種は、パラ結核菌（Linda）、Ｍ．ケロネエ（Ｔ
ＭＣ１５４３）、Ｍ．フォルツイツム（ＴＭＣ２８０
８）、Ｍ．ガストリ（gastri）（ＬＣＤＣ１３０１）、
Ｍ．ゴルドネエ（ＴＭＣ１３１８）、Ｍ．カンサシイ
（ＴＭＣ１２０１）、Ｍ．マリヌム（marinum）（ＬＣ
ＤＣ８０１）、Ｍ．ミクロティ（ＬＣＤＣ２０３）、
Ｍ．スクロフラセウム（ＴＭＣ１３０２）、ヒト型結核
菌（ＶＡ４４）、Ｍ．キセノピ（xenopi）（ＬＣＤＣ１
９０１）、ウシ型結核菌（ＣＤＣ５２）、ウシ型結核菌
−ＢＣＧ（ＣＤＣ４）、Ｍ．アフリカヌム（ＡＴＣＣ３
５７１１）、Ｍ．マルモエンス（malmoense）（ＢＤＤ
ＩＳ３４７２）、Ｍ．フラベセンス（flavescens）（Ｌ
ＣＤＣ２６０１）、Ｍ．テレエ（terrae）（ＢＤＤＩＳ
３０１０）、Ｍ．ヘモフィルム（ＡＴＣＣ２７５４
８）、Ｍ．ゲネベンス（genevense）（ＰＩＲ２１）、
スメグマ菌（M.smegmatis）（ＴＭＣ１５３３）、Ｍ．
スズルガイ（szulgai）（ＴＭＣ１３２８）、Ｍ．スズ
ルガイ（ＶＡＨ）、Ｍ．シミエー（simiae）（ＢＤＤＩ
Ｓ２３０８）、Ｍ．シミエー（ＢＤＤＩＳ２３００）お
よびＭ．シミエー（ＢＤＤＩＳ２３０１）であった。負
の対照増幅反応（ヒト胎盤ＤＮＡ ５０ｎｇ−ＲＬＵ
０．９）と比較すると、Ｍ．マルモエンス菌株の弱い正
シグナル（ＲＬＵ４．６）、Ｍ．スズルガイの一つの菌
株での強い正シグナル（ＴＭＣ１３２８，ＲＬＵ２１６
１）およびＭ．シミエーの一つの菌株での強い正シグナ
ル（ＢＤＤＩＳ２３０８，ＲＬＵ２４０４）を例外とし
て、非ＭＡＣ種全部が負であった（ＲＬＵ０．３〜０．
６）。Ｍ．スズルガイおよびＭ．シミエーの他の菌株は
明らかに負であった。鳥型結核菌の亜種であるパラ結核
菌もまた、強い正シグナルを与えた。
【００３８】試験された非ミコバクテリア種は、ジフテ
リア菌（Corynebacterium diphtheriae）（ＡＴＣＣ１
１９１３）、コリネバクテリウム・キセローシス（Cory
nebacterium xerosis）（ＡＴＣＣ３７３）、コリネバ
クテリウム・シュードジフテリティクム（Corynebacter
ium pseudodiphthericum）（ＡＴＣＣ１０７００）、ノ
カルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）
（ＡＴＣＣ３３０８）、ノカルジア・ブラジリエンシス
（Nocardia brasiliensis）（ＡＴＣＣ１９２９６）、
ノカルジア・オリエンタリス（Nocardia orientalis）
（ＡＴＣＣ１９７９５）、ストレプトミセス・ソマリエ
ンシス （Streptomyces somaliensis）（ＡＴＣＣ１３
２０１）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyc
es griseus）（ＡＴＣＣ１０１３７）、ストレプトミセ
ス・アルブス（Streptomyces albus）（ＡＴＣＣ３００
４）、ストレプトミセス・ゲダネンシス（Streptomyces
gedanensis）（ＡＴＣＣ４８８０）、イスラエル放線
菌（Actinomyces israelii）（ＡＴＣＣ１００４９）、
ユーバクテリウム・レンツム（Eubacterium lentum）
（ＡＴＣＣ４３０５５）、ロドコッカス・エクイ（Rhod
ococcus equi）（ＡＴＣＣ６９ ３９）、ロドコッカス
・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）（ＡＴＣ
Ｃ１３８０８）、ざ瘡プロピオンバクテリウム（Propio
nibacterium acnes）（ＡＴＣＣ６９１９）、アクチノ
プランス・アウランティコラー（Actinoplanesaurantic
olor）（ＡＴＣ Ｃ１５３３０）、ストレプトスポラン
ジウム・ビリジアルブム（Streptosporangium viridial
bum）（ＡＴＣＣ３３３２８）およびストレプトベルテ
ィシリウム・アルボベルティシラツム（Streptovertici
llium alboverticillatum）（ＡＴＣＣ２９８１８）で
あった。負の対照と比較すると、試験された非ミコバク
テリア属全部が、ｄｎａＪ標的配列の増幅に対して負で
あった（ＲＬＵ０．３〜１．０）。これらの実験結果
は、本発明のプライマーが、ミコバクテリアの非ＭＡＣ
種かまたは非ミコバクテリア属において標的配列を実質
的に増幅させることなく、鳥型結核菌複合体の種の標的
を特異的に増幅することを実証している。標的結合配列
は配列番号：１および配列番号：６と同様の標的範囲に
対してハイブリッド形成するので、他の増幅プライマー
対について同様の特異性が予想される。標的結合配列の
５′末端の１〜３個のヌクレオチドの付加または欠失
は、プライマーの特異性を変化させるはずはないが、検
定感度を変更するかもしれない。
リア菌（Corynebacterium diphtheriae）（ＡＴＣＣ１
１９１３）、コリネバクテリウム・キセローシス（Cory
nebacterium xerosis）（ＡＴＣＣ３７３）、コリネバ
クテリウム・シュードジフテリティクム（Corynebacter
ium pseudodiphthericum）（ＡＴＣＣ１０７００）、ノ
カルジア・アステロイデス（Nocardia asteroides）
（ＡＴＣＣ３３０８）、ノカルジア・ブラジリエンシス
（Nocardia brasiliensis）（ＡＴＣＣ１９２９６）、
ノカルジア・オリエンタリス（Nocardia orientalis）
（ＡＴＣＣ１９７９５）、ストレプトミセス・ソマリエ
ンシス （Streptomyces somaliensis）（ＡＴＣＣ１３
２０１）、ストレプトミセス・グリセウス（Streptomyc
es griseus）（ＡＴＣＣ１０１３７）、ストレプトミセ
ス・アルブス（Streptomyces albus）（ＡＴＣＣ３００
４）、ストレプトミセス・ゲダネンシス（Streptomyces
gedanensis）（ＡＴＣＣ４８８０）、イスラエル放線
菌（Actinomyces israelii）（ＡＴＣＣ１００４９）、
ユーバクテリウム・レンツム（Eubacterium lentum）
（ＡＴＣＣ４３０５５）、ロドコッカス・エクイ（Rhod
ococcus equi）（ＡＴＣＣ６９ ３９）、ロドコッカス
・ロドクロウス（Rhodococcus rhodochrous）（ＡＴＣ
Ｃ１３８０８）、ざ瘡プロピオンバクテリウム（Propio
nibacterium acnes）（ＡＴＣＣ６９１９）、アクチノ
プランス・アウランティコラー（Actinoplanesaurantic
olor）（ＡＴＣ Ｃ１５３３０）、ストレプトスポラン
ジウム・ビリジアルブム（Streptosporangium viridial
bum）（ＡＴＣＣ３３３２８）およびストレプトベルテ
ィシリウム・アルボベルティシラツム（Streptovertici
llium alboverticillatum）（ＡＴＣＣ２９８１８）で
あった。負の対照と比較すると、試験された非ミコバク
テリア属全部が、ｄｎａＪ標的配列の増幅に対して負で
あった（ＲＬＵ０．３〜１．０）。これらの実験結果
は、本発明のプライマーが、ミコバクテリアの非ＭＡＣ
種かまたは非ミコバクテリア属において標的配列を実質
的に増幅させることなく、鳥型結核菌複合体の種の標的
を特異的に増幅することを実証している。標的結合配列
は配列番号：１および配列番号：６と同様の標的範囲に
対してハイブリッド形成するので、他の増幅プライマー
対について同様の特異性が予想される。標的結合配列の
５′末端の１〜３個のヌクレオチドの付加または欠失
は、プライマーの特異性を変化させるはずはないが、検
定感度を変更するかもしれない。
【００３９】
【００４０】配列番号（SEQ ID NO）:1: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 36 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:1: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGGCCGGT GAACGA 36
【００４１】配列番号（SEQ ID NO）:2: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 37 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:2: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGCGCCGG TGAACGA 37
【００４２】配列番号（SEQ ID NO）:3: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:3: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGCCGCCG GTGAACGA 38
【００４３】配列番号（ SEQ ID NO）:4: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 39 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:4: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGGCCGCC GGTGAACGA 39
【００４４】配列番号（SEQ ID NO）:5: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 38 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:5: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGCGGACA ACACGTTG 38
【００４５】配列番号（SEQ ID NO）:6: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 39 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:6: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTCGGAC AACACGTTG 39
【００４６】配列番号（SEQ ID NO）:7: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:7: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGGTCGGA CAACACGTTG 40
【００４７】配列番号（SEQ ID NO）:8: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:8: TTCCTTGCGC TTGG 14
【００４８】配列番号（SEQ ID NO）:9: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 14 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:9: GCCAACCCGG ACAA 14
【００４９】配列番号（SEQ ID NO）:10: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:10: GTGCGCCTCC GAC 13
【００５０】配列番号（SEQ ID NO）:11: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:11: ACCGCCTTGA ATC 13
【００５１】配列番号（SEQ ID NO）:12: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:12: ACGGCTTTGA ATC 13
【００５２】配列番号（SEQ ID NO）:13: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 13 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:13: GTGCGCCTCG GAG 13
【００５３】配列番号（SEQ ID NO）:14: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:14: TTCAAGGCGG TCTCC 15
【００５４】配列番号（SEQ ID NO）:15: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 15 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:15: TTCAAAGCCG TGTCG 15
【００５５】配列番号（SEQ ID NO）:16: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:16: AAGGCGTACT CGACCGCCGG TGAACGA 27
【００５６】配列番号（SEQ ID NO）:17: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 39 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:17: CGATTCCGCT CCAGACTTCT CGGGTCGGAC AACACGTTG 39
【００５７】配列番号（SEQ ID NO）:18: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:18: TCGGACAACA CGTTGGTACT GAGATCCCCT 30
【００５８】配列番号（SEQ ID NO）:19: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:19: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTAAGGC GTACTCGACC 40
【００５９】配列番号（SEQ ID NO）:20: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:20: AAGGCGTACT CGACCTCGGA CAACACGTTG 30
【００６０】配列番号（SEQ ID NO）:21: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:21: GCCGGTGAAC GAGTACTGAG ATCCCCT 27
【００６１】配列番号（SEQ ID NO）:22: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:22: GTACTGAGAT CCCCTGCCGG TGAACGA 27
【００６２】配列番号（SEQ ID NO）:23: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:23: TCGGACAACA CGTTGAAGGC GTACTCGACC 30
【００６３】配列番号（SEQ ID NO）:24: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 40 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:24: ACCGCATCGA ATGCATGTCT CGGGTGTACT GAGATCCCCT 40
【００６４】配列（SEQ ID NO）:25: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 30 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:25: GTACTGAGAT CCCCTTCGGA CAACACGTTG 30
【００６５】配列（SEQ ID NO）:26: (i) 配列の特性: (A) 長さ: 27 塩基対 (B) 型: 核酸 (C) 鎖の数: 一本鎖 (D) トポロジー: 直線状 (xi) 配列: SEQ ID NO:26: GCCGGTGAAC GAAAGGCGTA CTCGACC 27
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (73)特許権者 595117091 １ ＢＥＣＴＯＮ ＤＲＩＶＥ， ＦＲ ＡＮＫＬＩＮ ＬＡＫＥＳ， ＮＥＷ ＪＥＲＳＥＹ 07417−1880， ＵＮＩ ＴＥＤ ＳＴＡＴＥＳ ＯＦ ＡＭＥＲ ＩＣＡ (72)発明者 シルビア・ア・ブストス アメリカ合衆国メリーランド州21228, キャントンズビル，ハンター・ウエイ 710 (72)発明者 クリスティーン・アン・ロストコウスキ ー アメリカ合衆国メリーランド州21224, ボルチモア，イースト・プラット・スト リート 3000 (72)発明者 ドロレス・エム・バーガー アメリカ合衆国メリーランド州21239, ボルチモア，ロッチ・ヒル・コート 6505 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/31 - 15/51 C12Q 1/68 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＧｅｎＢａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (10)
- 【請求項１】 （ａ）配列番号：１、配列番号：２、配
列番号：３、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：
６もしくは配列番号：７の標的結合配列；または（ｂ）
配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番
号：４、配列番号：５、配列番号：６もしくは配列番
号：７の標的結合配列および増幅反応に必要な配列から
成るオリゴヌクレオチド。 - 【請求項２】 増幅反応に必要な配列が、鎖置換増幅の
際に制限エンドヌクレアーゼによってニックを入れられ
る制限エンドヌクレアーゼ認識部位である請求項１に記
載のオリゴヌクレオチド。 - 【請求項３】 鳥型結核菌複合体の標的核酸配列を増幅
する方法であって、 （ａ）該標的核酸に対して （ｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、も
しくは配列番号：４の標的結合配列；または配列番号
１、配列番号：２、配列番号：３、もしくは配列番号：
４の標的結合配列および増幅反応に必要な配列から成る
第一増幅プライマー、および （ｉｉ）配列番号：５、配列番号：６もしくは配列番
号：７の標的結合配列；または配列番号：５、配列番
号：６もしくは配列番号：７の標的結合配列および増幅
反応に必要な配列から成る第二増幅プライマーをハイブ
リッド形成させ；そして （ｂ）ハイブリッド形成した第一および第二増幅プライ
マーを標的核酸配列上で伸長し、それによって標的核酸
配列を増幅することを含む上記方法。 - 【請求項４】 増幅反応に必要な配列が、鎖置換増幅の
際に制限エンドヌクレアーゼによってニックを入れられ
る制限エンドヌクレアーゼの認識部位である請求項３に
記載の方法。 - 【請求項５】 鳥型結核菌複合体の標的核酸配列を増幅
する方法であって、 （ａ）該標的核酸に対して （ｉ）配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３また
は配列番号：４から成る第一増幅プライマー、および
（ii）配列番号：５、配列番号：６または配列番号：７
から成る第二増幅プライマーをハイブリッド形成させ；
そして （ｂ）鎖置換増幅反応で標的核酸を増幅することを含む
上記方法。 - 【請求項６】 増幅した標的核酸を、検出用プローブに
対するハイブリダイゼーションによって検出することを
更に含む請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 配列番号：１６、配列番号：１７、配列
番号：１８、配列番号：１９、配列番号：２０、配列番
号：１、配列番号：２１、配列番号：２２、配列番号：
２３、配列番号：２４、配列番号：２５および配列番
号：２６から成る群より選択されるオリゴヌクレオチ
ド。 - 【請求項８】 第一および第二標的を同時に増幅する方
法であって、 （ａ）第一増幅プライマーを該第一標的に対してハイブ
リッド形成させ、該第一増幅プライマーは、配列番号：
１または配列番号：６の標的結合配列および、制限エン
ドヌクレアーゼの二本鎖半修飾認識部位の一方の鎖にニ
ックを入れることができる制限エンドヌクレアーゼの認
識部位を含み、該第一増幅プライマーを伸長して第一伸
長生成物を生じ、そして該第一伸長生成物を置換し； （ｂ）該第一伸長生成物に対して、配列番号：６の標的
結合配列または配列番号：１の標的結合配列および、該
第二標的に対してハイブリッド形成する第二増幅プライ
マーの標的結合配列と実質的に同一の第一アダプター配
列から成る第一アダプタープライマーをハイブリッド形
成させ、該第二増幅プライマーは、制限エンドヌクレア
ーゼの認識部位を更に含み、該第一アダプタープライマ
ーを伸長して第二伸長生成物を生じ、そして該第二伸長
生成物を置換し； （ｃ）該第二増幅プライマーを該第二標的に対してハイ
ブリッド形成させ、該第二増幅プライマーを伸長して第
三伸長生成物を生じ、そして該第三伸長を置換し； （ｄ）該第三伸長生成物に対して、該第三伸長生成物に
対してハイブリッド形成する標的結合配列および、配列
番号：１の標的結合配列または配列番号：６の標的結合
配列から成る第二アダプター配列から成る第二アダプタ
ープライマーをハイブリッド形成させ、該第二アダプタ
ープライマーを伸長して第四伸長生成物を生じ、該第四
伸長生成物を置換し；そして （ｅ）該第一および第二増幅プライマーを用いて該第二
および第四伸長生成物を同時に増幅することを含む上記
方法。 - 【請求項９】 （ａ）第一アダプタープライマーが配列
番号：１６から成り、第一増幅プライマーが配列番号：
１７から成り、第二アダプタープライマーが配列番号：
１８から成り、そして第二増幅プライマーが配列番号：
１９から成る； （ｂ）第一アダプタープライマーが配列番号：２０から
成り、第一増幅プライマーが配列番号：１から成り、第
二アダプタープライマーが配列番号：２１から成り、そ
して第二増幅プライマーが配列番号：１９から成る； （ｃ）第一アダプタープライマーが配列番号：２２から
成り、第一増幅プライマーが配列番号：１７から成り、
第二アダプタープライマーが配列番号：２３から成り、
そして第二増幅プライマーが配列番号：２４から成る；
または （ｄ）第一アダプタープライマーが配列番号：２５から
成り、第一増幅プライマーが配列番号：１から成り、第
二アダプタープライマーが配列番号：２６から成り、そ
して第二増幅プライマーが配列番号：２４から成る請求
項８に記載の方法。 - 【請求項１０】 第一および第二標的を同時に増幅する
方法であって、 （ａ）該第一標的に対して、配列番号：６の標的結合配
列または配列番号：１の標的結合配列および、該第二標
的に対してハイブリッド形成する第一増幅プライマーの
標的結合配列と実質的に同一の第一アダプター配列から
成る第一アダプタープライマーをハイブリッド形成さ
せ、該第一増幅プライマーは、制限エンドヌクレアーゼ
の認識部位を更に含み、該第一アダプタープライマーを
伸長して第一伸長生成物を生じ、そして該第一伸長生成
物を置換し； （ｂ）第二増幅プライマーを該第一伸長生成物に対して
ハイブリッド形成させ、該第二増幅プライマーは、配列
番号：１または配列番号：６の標的結合配列および、制
限エンドヌクレアーゼの二本鎖半修飾認識部位の一方の
鎖にニックを入れることができる制限エンドヌクレアー
ゼの認識部位を含み、該第一増幅プライマーを伸長して
第二伸長生成物を生じ、そして該第二伸長生成物を置換
し； （ｃ）該第二標的に対して、該第二標的に対してハイブ
リッド形成する標的結合配列および、配列番号：１の標
的結合配列または配列番号：６の標的結合配列から成る
第二アダプター配列から成る第二アダプタープライマー
をハイブリッド形成させ、該第二アダプタープライマー
を伸長して第三伸長生成物を生じ、そして該第三伸長生
成物を置換し； （ｄ）該第一増幅プライマーを該第三伸長生成物に対し
てハイブリッド形成させ、該第一増幅プライマーを伸長
して第四伸長生成物を生じ、該第四伸長生成物を置換
し；そして （ｅ）該第一および第二増幅プライマーを用いて該第二
および第四伸長生成物を同時に増幅することを含む上記
方法。
Applications Claiming Priority (2)
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|---|---|---|---|
| US608584 | 1996-02-28 | ||
| US08/608,584 US5667994A (en) | 1996-02-28 | 1996-02-28 | Amplification and detection of mycobacterium avium complex species |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04350797A Expired - Fee Related JP3151415B2 (ja) | 1996-02-28 | 1997-02-27 | 鳥型結核菌複合種の増幅および検出 |
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|---|---|
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| US5985569A (en) * | 1997-09-26 | 1999-11-16 | Becton, Dickinson And Company | Primers for amplification of a genus specific sequence of the mycobacterium 16S rRNA gene |
| US5837469A (en) * | 1997-11-04 | 1998-11-17 | Becton Dickinson And Company | Assay for chlamydia trachomatis by amplification and detection of chlamydia trachomatis nucleic acid |
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| DE60024679T2 (de) | 1999-12-15 | 2006-08-24 | Gen-Probe Inc., San Diego | Methoden und zusammensetzungen zur detektion von spezies des mycobacterium avium-komplexes |
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