JP3150158B2 - オリゴヌクレオチドプローブ標識用の予備活性化したタンパク - Google Patents
オリゴヌクレオチドプローブ標識用の予備活性化したタンパクInfo
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Description
たタンパク誘導体、及びタンパク−ポリヌクレオチド及
びタンパク−タンパク結合体の調製におけるその使用に
関する。かかる結合体は分析及び診断方法において有用
であり、タンパク−ポリヌクレオチド結合体は、例えば
診断方法や遺伝子特性化方法において、交雑プローブと
して殊に有用である。
または35Sで予め放射標識された相補的核酸配列の交
雑によりなされた。安全性及び便宜性のために、これら
の標識を、酵素、発蛍光団及び発化学発光団のような非
アイソトープ標識で置き換えようとする努力がなされて
きた。
単一のヌクレオチドのみのような小さな差異でヌクレオ
チド配列同志の間を区別するための交雑プローブとして
有用であるオリゴヌクレオチド−酵素結合体を開示して
いる。かかるアプローチは、最も有用であることが証さ
れてきており、また広く採用されてきている(例えば、
J.C.エドマン等Nucl.Acids Res.,
1988,16,6235及びJ.J.オプランディ等
J.Clin.Microbiol.,1988,26
92)。それ以降、核酸とタンパク標識またはマーカ
ー部分との間の共有結合を達成するための種々の方法が
提案されている。これを達成するのに殊に好都合な方法
は、チオール官能端部を有する結合部分を有するオリゴ
ヌクレオチドを使用することによるものである。チオー
ル官能基は、チオール官能に対して予め活性化された酵
素と反応させ、これによってタンパクとオリゴヌクレオ
チドとの直接的な共有結合が達成される。このアプロー
チは、P.リ等のNucl.Acids Res.,1
987,15,5275や上述の我々の欧州特許出願に
説明されている。
合のための他のすべての方法と同様に、ある種の反応工
程を包含することは了解されよう。このような反応工程
は、再現性のあるベースで合理的な量の結合体を調製す
るためには、関連化学の理解を必要とする。
ていない使用者によっても実施することができ、そして
できるだけ少ない機器及び特殊技能を必要とするにすぎ
ない結合に関する改善された試薬及び方法に対する要求
がある。
れば、チオール化ポリヌクレオチドのチオール基または
チオール含有タンパクのチオール基へ共有結合カップリ
ングするために予め活性化された安定なタンパク試薬が
提供される。
試薬が許容しうる貯蔵寿命を有すること(例えばキット
に含まれたときに少なくとも1月、好適には少なくとも
3月、6月あるいは9月、そして好ましくは12月の貯
蔵寿命を示すこと)を意味するものとする。上記の期間
は周囲温度、例えば室温での貯蔵に関するものである
が、もし希望ならば、それより低い温度例えば10℃以
下(例えば4〜6℃あるいは−15〜−25℃)を使用
できる。試薬の所安定性は、例えば加水分解、重合また
はその他の副反応による分解あるいは劣化が試薬の有用
性を損なう程度まで進行しないような程度のものである
ことは、了解されよう。(例えば中間使用のために)共
有結合カップリングのための活性化タンパクをその場で
調製することは、従来上記の問題を回避するのに必要で
あると考えられてきた。
備活性化)なる表現は、タンパクがチオール化ポリヌク
レオチドのチオール基またはチオール含有タンパクのチ
オール基へ共有結合カップリングするために化学的に変
性されたことを意味するものとする。化学的変性は、架
橋剤、好ましくはタンパク官能性基(例えばタンパクア
ミノ基)と反応しうる基及びチオール基と反応しうる別
の基の両方を有するヘテロ二官能性架橋剤、を用いて都
合よく実施される。後者はハロアセチル、ハロアセトア
ミジル、マレイミド、活性化ジスルフィド、チオール類
(酸化性条件下)及び重金属誘導体(例:水銀誘導体)
から都合よく選択される。チオール基と反応しうる好ま
しい基は、マレイミド基である。そのような基は、好都
合には、例えば12個まで、10個まで、8個まで、6
個まであるいは4個までの炭素原子、そして好適には6
個までの炭素原子を含む飽和もしくは不飽和炭化水素骨
格(これは随意に置換されていてよい)により結合され
ている。随意置換基の例としてはヒドロキシル基があ
る。そのような選定置換基が結合(架橋結合)反応を妨
害してはならないことは了解されよう。
されている。その例としては、ピアース(Pierc
e)ケミカル社によって刊行された「ピアース・カタロ
グ」に記載されているものがある。好適な例としては下
記のものがある:
1979、Eur.J.Biochem.,101,3
95−399 R1 =SO3 Na 文献:Hashida等,198
4,J.AppliedBiochem.,6,56−
63
Aikawa T,1976,J.Biochem.,
79,233−236 R2 =SO3 Na 文献:ピアース社のカタログ
hadjopolous D.,1982,J.Bio
l.Chem,257,286−288 R3 =SO3 Na 文献:Bangs J.D.等,1
986,J.Cell.Biol.,103,255−
263
an J.K,1983,Bio SO3 Na Tac
hniques,1,148−152
8,Biochem.J.,173,723−737
等によりEuropean Jounal of Bi
ochemstiry,(1979),101,395
−399において記載され、製造された如き、スクシン
イミジル4−(マレイミドメチル)クロロヘキサン−1
−カルボキシレート(SMCC)架橋剤である。
結合性物質(例えば、アビディン、ストレスタビディン
もしくは抗体)であるのが好適である。タンパク試薬は
酵素であるのが好適である。酵素の例としては、アルカ
リ性ホスファターゼ;ワサビ・ペルオキシダーゼ(HR
P)のようなペルオキシダーゼ;ベータガラクトシダー
ゼ;キサンチンオキシダーゼ;ホタルまたは細菌ルシフ
ェラーゼ等がある。好ましい酵素は、適切である場合に
は、熱安定性形態にあるのが好ましい。合成タンパクも
包含される。
は、1個またはそれ以上のペンダント状チオール基を与
えるように予め誘導されたオリゴヌクレオチドのような
ポリヌクレオチドを意味するものとする。ポリヌクレオ
チドは、DNA、RNAまたはその他の類似体(アナロ
ーグ)のような任意の核酸であってよく、それは単一ま
たは二本鎖の形態であってよく、そしてそれは天然物で
あっても、合成物であってもよい。殊に、ポリヌクレオ
チドは合成単一鎖オリゴヌクレオチドであってよい。チ
オール基はポリヌクレオチド中へ化学的な経路または酵
素的な経路により導入できる。オリゴヌクレオチドにつ
いては、化学的方法が好適である。チオール基導入のた
めのいくつかの方法が、例えばP.リー等,Nucl.
Acids.Res.,1987,15,5275及び
我々の欧州特許出願207758号明細書において公知
である。チオール基は、一般に1つまたはそれ以上の中
間(スペーサー)アームを介してオリゴヌクレオチドに
結合されている。そのような中間アームは、一般に、オ
リゴヌクレオチドに架橋剤を結合するのに用いられた方
法の結果として生じる部分(例えばカルボニルまたはホ
スホリール)を介して通常オリゴヌクレオチドに結合さ
れた2〜6個の炭素原子の直鎖炭化水素からなる。我々
は、
を最初に合成し(ここに「oligo」はオリゴヌクレ
オチドを意味する。)、次いでチオール化試薬と反応さ
せることにより、好適かつ有利な架橋剤が構成されるこ
とを発見した。
ミノチオラン及びホモシステインチオラクトンがある。
2−イミノチオラン(典型的には塩酸塩、すなわちトラ
ウト試薬の形で用いられる): ホモシステインチオラクトン: 〔あるいはそのN−アセチル化誘導体〕
ゴヌクレオチドが得られる。 (ここにnは例えば6または2であり、そして「oli
go」はオリゴヌクレオチドを意味する)。
個またはそれ以上の元々存在するチオール基;あるい
は、例えば元々存在したジスルファイド基の還元によ
り、または上記の「一段階」試薬のようなチオール化剤
あるいは「二段階」試薬のようなチオール化剤との反応
により、導入されたチオール基;を含む任意のタンパク
質物質を意味するものとする。
で与えられるのが好ましい。我々は予想外にも、マレイ
ミドまたはヨードアセトアミジル官能基のようなチオー
ル反応性部分をもつように変性されたタンパクが凍結乾
燥されうること、そして得られる予備活性化試薬が安定
でありかつ可成りの時間後に核酸結合体の共有結合合成
のために使用できることを発見した。
ル化ポリヌクレオチドのチオール基またはチオール含有
タンパクのチオール基に共有結合カップリングするため
に予め活性化された安定な凍結乾燥タンパク試薬が提供
される。
活性、ならびにチオール反応性官能基の反応性を維持し
うる溶液から実施される。そのような溶液は、炭水化
物、殊にマンニトール、ラクトースまたはトレハロース
のような糖類、あるいは重炭酸アンモニウム、もしくは
有機酸あるいは塩基の塩のような揮発性塩、を含んでい
てもよい。我々は、凍結乾燥用溶液においてラクトース
を(特に約1%の濃度で)用いて殊に良好な結果を得て
いる。その溶液は望ましくは6〜8、殊に7.2〜7.
8の範囲、特に約7.4のpH値に緩衝される。SMC
C誘導(変性)アルカリ性ホスファターゼに関して、ラ
クトースは好ましい糖であり、そして好ましい凍結乾燥
緩衝剤は1%のラクトース、5mMのNaH2 PO4 /
Na2 HPO4 (pH7.4)である。求核性緩衝成分
は、これらが、予備活性化タンパク試薬、特にチオール
反応性基に対して反応性である場合には、避けるのが好
ましい。不揮発性塩は許容されることもあるが、それら
は、例えば10mM以下のような低濃度であるべきであ
る。チオール反応性官能基が加水分解を受け易い予備活
性化タンパクの場合には、凍結乾燥その誘導体の調製直
後に実施されるべきである。タンパクを安定化すること
が公知であるか判明しているその他の成分も包含されう
る。
る架橋剤は、低度かつ制御された程度の置換をなすよう
に制御された量で存在するのが好ましい。好ましくは、
置換の程度は、タンパクの1モル当り3モル以下、さら
に好ましくは1〜2モル、例えば1.4/1.6モルで
ある。このように低度かつ制御された程度の置換は、安
定な活性化タンパク試薬を与え、そして1:1結合体が
高含量である結合体混合物を与える。
化手段によって最も良好に制御されるが、温度、pH及
び反応時間のようなその他の因子によっても制御されう
る。置換の程度の測定のための適当な検定法は当業者で
あれば容易に案出できる。例えば、変性処理済タンパク
の試料を過剰の既知濃度チオール化合物と反応させ、そ
の反応後に残留するチオール化合物の量を測定する検定
(分析)法を考案することができよう。
SMCC(前述)架橋剤によって誘導(変性)されたア
ルカリ性ホスファターゼからなる。このものは、好まし
くは1%のラクトース及び5mMのNaH2 PO4 /N
a2 HPO4 を含む溶液(pH7.4)から凍結乾燥さ
れたものである。
レオチド信号発生結合体が使用されるべき目的によって
左右され決定される。これが交雑プローブとして使用さ
れる場合、好適なオリゴヌクレオチドの長さは、1〜5
0個のように50個以下、20〜40個のように40個
以下、そして10〜20個のように20個以下のヌクレ
オチド単位である。核酸はDNAもしくはRNAあるい
はそれらの同族体ないし類似体であるのが好適であり、
例えばDNAは一本鎖または二本鎖の形で存在していて
よい。好適には、交雑のために意図されている核酸配列
の少なくとも一部分は一本鎖の形であろう。好ましく
は、核酸はすべて一本(単一)鎖の形で存在する。好適
には、ポリヌクレオチド配列、例えばDNA配列は、合
成反応により調製して、チオール含有基を結合可能にす
る。そのような合成のための方法及び装置は、例えば
M.J.Gait編 IRLプレス社(1984年オッ
クスフォード)の「Oligonucleotide
Synthesis,a practical app
roach」及びその他の上記引用文献に記載されてい
るような公知方法を用いている分子生物学者や通常の熟
練度の化学者にとっては明らかであろう。
合体の調製に用いる場合、殊に有用な別のタンパクは、
好適には免疫学的検定、殊に酵素免疫学的検定、ウエス
ターン法、組織化学及びその他の免疫化学技法におい
て、使用するための抗体またはその断片である。
を調製するために安定予備活性タンパク試薬を使用でき
るようにするキットが提供される。そのようなキット
は、安定予備活性化タンパク試薬と使用指針(説明書)
そして場合により長期保存のための乾燥剤からなろう。
つまたはそれ以上をも含むことがある: 1.ある量の固体チオール化剤、例えば2−イミノチオ
ラン、 2.チオール化剤の生成物から過剰のチオール化剤を除
去するための予備充填されたカラム(好ましくは、この
ものは例えばPhamacia社製、Sephadex
TM G25Mを含むゲル濾過カラムであるべきであ
る。)、 3.2のカラムを平衡化及び/または機能させるための
緩衝剤、 4.チオール化剤を再構成するための緩衝剤、 5.結合体の精製のためのさらに別のカラム(好適に
は、このものは、例えばBiprad社製Biogel
TM P100を含む予備充填されたゲル濾過カラムであ
る。) 6.5のカラムを平衡化及び/または機能させるための
緩衝剤、 7.これらのカラムを装着するための架台、 8.生成物及び中間体を捕集するためのビン、 9.結合後に過剰のチオール反応性基を鎮静化するため
の試薬、 10.長期貯蔵のために結合体を安定化させる添加剤、 11.操作を実施するための指針ないし説明書。
レオチドやその他のタンパク意外のチオール含有または
チオール化成分、例えばその他の核酸種(物質)、オリ
ゴ糖類または多糖類、ペプチド、ハプテン及び薬剤類と
の結合体を形成するように使用できること、ならびに、
本発明の安定な活性化タンパク試薬及びキットは本発明
の試薬に結合される成分によって限定されるものでない
こと、は了解されよう。
する。略記号 下記の略記号は実施例に適用される。 SMCC:スクシンイミジル−4−(N−マレイミドメ
チル)シクロヘキサン−1−カルボキシレート SIAB:N−スクシンイミジル(4−ヨードアセチ
ル)アミノベンゾエートTris:トリス(ヒドロキシ
メチル)アミノメタン BSA:ウシ血清アルブミン(Boehringer分
子生物学品級) PBS:0.13M NaCl,5.4mM Na2 H
PO4 ,1.6mM KH2 PO4 緩衝液 pH7.3 SSC:20×SSCは3M NaCl,0.3Mクエ
ン酸三ナトリウム PVP:ポリビニルピロリドン SDS:ナトリウムドデシルサルフェート DMF:ジメチルホルムアミド HRP:ワサビペルオキシダーゼ TBS:1×TBSは25mM Tris,pH8.
1,NaCl 150mM
r,10mg/ml,0.2ml)に対して、0.1M
のトリエタノールアミンHCl、1mMのMgCl2 、
1mMのZnSO4 、pH7.4(0.6ml)を加
え、次いで乾燥DMF中のSMCC(Pierce製)
(6.7mg/l)の作りたての溶液12μlを加え、
反応混合物を25℃で30分間インキュベートした。次
いで生成物をNAP25脱塩カラム(Pharmaci
a製)に通して精製した。このカラムはBSAで前処理
し、そして10g/lのD−マンニトールを含むリン酸
塩緩衝剤PBS中で平衡化させてあった。生成物を1.
6ml捕集し、その一部を分析のために採取した。タン
パク濃度を280nmにおけるODにより検定した(1
mg/mlの溶液について0.89の消光定数を使
用)、またマレイミド濃度は下記のように検定した。:
0.15mlの試料を1mMメルカプトエタノール10
μlと30分間37℃で反応させ、対照として緩衝液の
み0.15mlも同様に反応させた。次いで反応混合物
を1.2mlのPBSで稀釈し、分光分析器において4
12nmで零ポイト合せをし、1mMの5,5′−ジチ
オビス(2−ニトロ安息香酸)25μlを添加した。こ
のようにして、14150の消光定数を用いて残留チオ
ール濃度を測定し、試料と対照との間の差異によって、
マレイミド濃度、従って置換度の計算ができた。この値
は、タンパク1モル当り1.4〜1.6モルのマレイミ
ノであることが判明した。このように誘導された酵素を
次いで3ナノモルの部分に分割(少量つづに別けて)、
凍結乾燥した。
動化DNA合成器で公称1.0μモルの規模で以下に示
されるアミノアルキルオリゴヌクレオチドを合成した。
上記のAlは下記の結合基を表わす。 この結合基は下記のホスホルアミジトから誘導され、製
造業者によって説明されているように合成中に導入され
る。 脱保護及び蒸発処理の後、試料を1.0mlの水に再溶
解させた。
調製 実施例1は本発明の可能なキットの一つ主要な成分を説
明するものである。本実施例は、その成分を所望の結合
体の製造するのに使用することを説明するものである。
その他の成分も必要とされ、それらのうちのいくつかま
たはすべてはキットの部分として提供されうる。0.0
1mlの上記アミノアルキルオリゴヌクレオチドを水で
0.2mlに稀釈した。2−イミノチオラン(5mg)
を含むびんに、1.0mlの0.2M重炭酸ナトリウム
緩衝液pH9.2を加え、この溶液の0.3mlをただ
ちにオリゴヌクレオチド溶液に添加した。この混合物を
37℃で30分間インキュベートし、次いでPBSで平
衡化されたNAP25脱塩カラムに装入した。試料がカ
ラムに吸着された後に、2.2mlの(カラム機能化
用)ランニング緩衝液を加え、溶離液をすてた。この部
分を適用した後に誘導(変性)酵素(実施例1)を含む
びんを、カラムの下に置き、そして1.6mlの緩衝液
をカラムに適用してチオール化オリゴヌクレオチドを溶
離させた。溶離試料を穏かに振とうして酵素を溶解し、
反応を4℃で16時間進行させた。次いで試料を2分割
した。
TM製)を用いて約0.3mlまで濃縮し、そして、50
mM Tris緩衝液pH7.5で平衡化され機能化さ
れた「BiogelTM P−100F」(Biorad
製)のカラム(約35ml)に、0.14ml/分の流
量で適用した。溶離されたピークはUV吸収(260n
m)により検出し(図1a参照)、そして第1のピーク
をなす画分(結合体を含む)のUVスペクトルを測定し
た。この第1のピーク内の画分をプールした。試料を3
0倍モル過剰のメルカプトエタノールで周囲温度におい
て15分間処理した。この結合体の長期貯蔵のために、
NaN3 及びBSA(分子生物学用品級)をそれぞれ
0.2%及び0.1%添加した。前記2分割した試料の
他の半分は精製しなかったが、上記のようにメルカプト
エタノールで処理し、またBSA及びNaN3 を添加し
た。
定性 乾燥剤と共に4℃で3月間貯蔵されていた凍結乾燥マレ
イミドアルカリ性ホスファターゼの試料を前記のように
(ただし約79ml容のカラムを使用)結合体としそし
て精製した。図1bは得られた溶離分布を示す。OD2
60/280(nm)比は>1.0であった。この比の
値とその溶離分布の形状とは、貯蔵されていた材料がそ
の能力を結合体に対して維持したことを証明した。予め
活性化された酵素の安定性は、試料を4℃で8月間また
37℃で8月間それぞれ貯蔵することにより確認され
た。これらの両貯蔵試料は、結合されて試験スロットブ
ロット検定で使用されたときになおも良い結果を与え
た。我々は4℃で3月間貯蔵されたものと比較して、こ
れら8月間貯蔵(4℃または37℃)後の試験検定にお
ける顕著な性能差異は認められなかった。
サザン法ブロットをA.J.Jeffrey等によって
Nature,1985,314,67に記載されてい
るようにして調製した。次いでフィルターをSSCで予
め湿潤し、次いでロール圧搾し、プラスチック箱に入れ
た。これらの容器を、軌道インキュベータ内で5×SS
C、1%SDS、0.1%BSA、0.1%Ficol
TM 400(PharmaciaTM)、0.1%PVP
4400(BDH)中50℃で2時間インキュベート
した。次いで結合体を1.0nMの濃度で容器に入れ、
50℃で20分間回転下にインキュベートした。フィル
ターを次いで1×SSC中の0.5%のSDSを入れた
箱に移し、インキュベータ中で50℃において5分間洗
浄した。この洗浄工程を2回繰返し、次いで0.25×
SSC、0.5%SDSでさらに2回洗浄した。次いで
フィルターを1×SSCのみで最終洗浄した。この最後
の洗浄は室温で実施した。次いでフィルターに、かがつ
発光性アルカリ性ホスファターゼ基質である「Lumi
−phosTM」(Lumigen社製)を噴霧し、カセ
ット内の透明フィルムの間に置き、1.7時間にわたり
「Agfa CurixTM」フィルムに露出した。
ゼの調製 アルカリ性ホスファターゼの溶液(Boehringe
r製;10mg/ml,0.1ml)に対して、0.1
MのトリエタノールアミンHCl、1mMのMgC
l2 、1mMのZnSO4 、pH7.4(0.3ml)
を加え、次いで乾燥DMF中のSIAB(Pierce
製)の新鮮溶液(8.3mg/ml濃度)7μlを加え
た。次いで、この反応混合物を25℃で30分間インキ
ュベートし、生成物を「NAP25」脱塩カラムに通し
て精製した。このカラムは1%ラクトース、5mM N
a2 SO4 (pH7.4)で前処理(プライム)し、P
BS中で平衡化させてあった。生成物1.6mlを捕集
し、これを二つの等量試料(0.8ml);約3nモル
の変性酵素含有)に分割した。これらの試料を−70℃
で凍結し、次いで一晩凍結乾燥させた。この凍結乾燥
後、試料を含むびんに栓をして4℃で1週間貯蔵した
後、以下の実施例7のようにして結合体を作った。
性)オリゴヌクレオチドのチオール化及びそれに引き続
く、SIAB誘導(変性)凍結乾燥アルカリ性ホスファ
ターゼとの結合 アミノ変性オリゴヌクレオチドの水性溶液(名目0.2
μモル合成の10分の1)を、凍結乾燥2−イミノチオ
ラン(0.6mg)及び反応用緩衝剤1M重炭酸ナトリ
ウム(緩衝液pH9.2)の20μlを含むびんに加え
た。びんの内容物を、すべての2−イミノチオラン試薬
が溶解されるように混合し、次いで37℃で30分間イ
ンキュベートした。次いで生成物を「NAP5」脱塩カ
ラムに通して精製した(PBS中で平衡化)。そして生
成物を0.6ml捕集した。これを、実施例6で調製し
たSIAB変性凍結乾燥アルカリ性ホスファターゼのび
んに加えた。少しの間混合の後、結合反応を4℃で一晩
進行させた。次いで反応混合物を、50mMのTris
緩衝剤pH7.5、0.1%BSA及び0.2%ナトリ
ウムアジド中で平衡化され機能化された「Biogel
TMP−100C」(Biorad製)のカラム(約10
ml)に適用した。精製された結合体を1.1mlの量
で回収し、そして以下の実施例10でスロットブロット
をプローブするのに用いた。
し、0.1MのトリエタノールアミンHCl、1mMの
MgCl2 、1mMのZnSO4 、pH7.4(0.8
ml)中に溶解させた。これに対して、乾燥DMF中の
SMCC(15mg/ml)の新鮮溶液100μlを加
え、この反応混合物を25℃で40分間インキュベート
した。次いで生成物を、BSAでプライム処理され5m
Mリン酸塩、1%ラクトース緩衝液(pH7.4)で平
衡化された「NAP25」脱塩カラムに通して精製し
た。生成物を1.6mlの量で捕集し、試料を分析のた
めに採取した。変性℃はタンパク1モル当り1.80モ
ルのマレイミドであった。残部の試料を2.32mlに
稀釈し、200μlの画分に分散した(びん1個当り6
nモル)。これらを−70℃に凍結し、1晩凍結乾燥さ
せた。凍結乾燥の後に、各びんに蓋をして、37℃で1
月間貯蔵してから実施例9のようにして結合体を調製し
た。
1gG抗体(スコテッシュ・アンチボディ・プロダクシ
ョン・ユニット)の0.8ml(1mg/ml)を、ミ
クロ試験管中の26μlの2−イミノチオランPBS中
2mg/ml)、100μlの1.0M炭酸ナトリウム
緩衝剤pH9.0及び74μlのPBSに加えた。この
ミクロ試験管を37℃で30分間インキュベートし、そ
して下記の操作により「NAP −25」カラムで脱塩
処理することにより未反応のイミノチオランを除去し
た。カラムは100μlのPBS 1%BSAの添加に
より予めブロックしておいた。その処理剤は次に15m
lのPBSで完全に洗浄除去された。ミクロ試験管の内
容物をカラムに入れ、溶離液を流出させこれを廃棄し
た。次いでカラムに1.6mlのPBSを加え、溶離液
を、予め37℃で1月間貯蔵してあった凍結乾燥マレイ
ミドHRPの6nモルを含むびんに捕集した。このびん
を4℃で16時間インキュベートした。結合体はかくし
てすぐに使用できる状態にあった。
製 「Hybond−N」膜に接合されたMS1DNAでス
ロットブロットを作った。MS1を稀釈して下記の濃度
(pg/μl)とした。30,15,6,3,0.6,
0.2デナチュレーション(変性)緩衝液を次のように
して作った。14.8mlの水に、1.7mlの1M
Tris−HCl,pH7.5、3mlの2M NaO
H、及び10mlの20×SSCを加えた。5μlのD
NA溶液を295μlの変性緩衝液に加え(試料)、こ
れを沸とう水浴中で10分間インキュベートし、氷浴に
移し、100μlの1M Tris−HCl,pH7.
5で中和した。「Hybond−NTM」ナイロン膜(1
×SSC中に予備浸漬)を用いてスロットブロットを作
り、これらのスロットをまず40mlの1×SSCで洗
浄し、変性試料(0.4ml)を適用し、そしてスロッ
トをさらに0.4mlの1×SSCで洗浄した。膜を濾
紙上で20分間風乾させ、「サランラップ」で包み、4
分間UV照射し、次いで完全に風乾させた。
BSリン酸塩pH7.5中で1/18に稀釈して、50
ng/μlの濃度とした。PBS中での一連の稀釈を行
なって、10,5,1,0.5,0.1,0.05,
0.01ng/μlの種々の濃度とした。これら各溶液
の1μlの部分を「Hybond CTMextra」
(Amersham製)の細長片上へスポットし、これ
を30分間乾燥させた。下記のフォーマットを用いた。
浴内で50℃において2時間交雑溶液中でインキュベー
トした。その交雑溶液に代えて、新鮮交雑溶液を入れ、
そして50μlのDNAプローブ(実施例7)を添加し
た。フィルターをその溶液中におき、振とう水浴内で5
0℃において20分間インキュベートした。交雑後、フ
ィルターを洗浄溶液(1×SSC、0.5%SDS)中
50℃で5分間(2回)、次いで洗浄溶液(0.25×
SSC、0.5%SDS)中50℃で5分間(3回)、
そして最後に1×SSC中室温で5分間(1回)洗浄し
た。次いでフィルターをプラスチック皿の上に置き、
「Lumi−phos」を噴霧し、次いでフィルムカセ
ット中のアセテートシートの間に密封した。X線フィル
ム片(富士)をそのアセテートサンドイッチ構造体の上
に置き、そしてフィルムカセットを37℃で1時間イン
キュベートした。次いでフィルムを現像し、信号発現を
測定した(図3参照)。
出 ヒツジIgGドットブロットをブロッキング緩衝液
(0.5%カゼイン、1×TBS、0.1%Tween
20)中で室温において予めブロック処理した。ブロッ
トを実施例12で調製したロバ抗ヒツジHRP検出体の
1/500稀釈物を含むブロッキング溶液に移した。ブ
ロットをこの溶液中で室温において2時間インキュベー
トした。次いでブロットを1×TBS、0.05%Tw
ween20中室温で15分間(2回)そして1×TB
S中室温で5分間(1回)洗浄した。このブロットを基
質緩衝液(1.5μl30%過酸化水素、4mg3,
3′−ジアミノベンジジンテトラハイドロクロライドを
5mlの0.1M Trisに加えたものpH7.5)
中で10分間インキュベートし、水で洗浄し、乾燥させ
た。結果を図4に示す。
記載の結合体(b)の精製についての「BiogelTM
P−100F」溶離分布図である。
(b)でプローブしたHinflヒトDNA断片のサザ
ン法ブロットである。3つの列は、左から右へ、3,2
及び1μgのDNA負荷を含む。
実施例3で調製のオリゴヌクレオチド結合体MSIミニ
サテライトプローブでプローブすることにより得られた
バンドを示す。カラム1,2,3,4,5及び6のそれ
ぞれにおけるターゲットDNA負荷は150,75,3
0,15,3及び1.5pgであった。
実施例Fで調製したヒツジIgGドットブロットと共に
インキュベートすることにより得られたデータを示す。
ターゲットIgG負荷は図示のように50,10,5,
0,1,0.5,0.1,0.05,0.01及び0n
gであった。
Claims (11)
- 【請求項1】 チオール化ポリヌクレオチドのチオール
基またはチオール含有タンパクのチオール基へ共有結合
カップリングするために予め活性化された安定なタンパ
ク試薬であって、6〜8のpH値を有しかつ10mM以
下の不揮発性塩の濃度を有する緩衝処理溶液から凍結乾
燥される前記タンパク試薬。 - 【請求項2】 タンパクを、タンパク官能基と反応しう
る第1の反応性基及びチオール基と反応しうる第2の反
応性基を有するヘテロ二官能性架橋剤の第1の反応性基
に対して反応させることにより予め活性化された請求項
1の試薬。 - 【請求項3】 第1の反応性基がタンパクアミノ基に対
して反応性である請求項2の試薬。 - 【請求項4】 第1の反応性基がスクシンイミド基であ
る請求項3の試薬。 - 【請求項5】 第2の反応性基がマレイミド、アロアセ
チルもしくはハロアセトアミジル、または活性化ジスル
フィド、チオール基、あるいは重金属誘導体である請求
項1〜4のいずれかの試薬。 - 【請求項6】 タンパク試薬のタンパクが抗体、酸素ま
たは特異結合性物質である請求項1〜5のいずれかの試
薬。 - 【請求項7】 タンパクがアルカリ性ホスファターゼま
たはワサビペルオシターゼである請求項6の試薬。 - 【請求項8】 タンパク試薬が炭水化物、殊にラクトー
スの溶液から凍結乾燥される請求項7の試薬。 - 【請求項9】 チオール化ポリヌクレオチドのチオール
基またはチオール含有タンパクのチオール基へ共有結合
カップリングするために予め活性化された安定なタンパ
ク試薬と、使用のための説明書と、からなる調製結合体
の指南キットであって、該タンパク質が6〜8のpH値
を有しかつ10mM以下の不揮発性塩の濃度を有する緩
衝処理溶液から凍結乾燥される前記キット。 - 【請求項10】1.ある量の固体チオール化剤、例えば
2−イミノチオラン、 2.チオール化済生成物から過剰のチオール化剤を除去
するための予備充填カラム、 3.2のカラムを平衡化及び/または作用させるための
緩衝剤、 4.チオール化剤を再構成するための緩衝剤、 5.結合体の精製のためのさらに別のカラム、 6.5のカラムを平衡化及び/または作用させるための
緩衝剤、 7.カラムを装着するための架台、 8.生成物及び中間体を捕集するためのバイアル、 9.結合後に過剰のチオール反応性基を鎮静化するため
の試薬、 10.長期保存のために結合体を安定化するための添加
剤、 11.操作を実施するための説明書、 のうちの一つまたはそれ以上をも含む請求項9のキッ
ト。 - 【請求項11】 チオール化ポリヌクレオチドのチオー
ル基またはチオール含有タンパクのチオール基へ共有結
合カップリングするために予め活性化された安定なタン
パク試薬を、それぞれチオール化ポリヌクレオチドまた
はチオール含有タンパクのチオール基と、反応させるこ
とからなる結合体の製法であって、該タンパク質が6〜
8のpH値を有しかつ10mM以下の不揮発性塩の濃度
を有する緩衝処理溶液から凍結乾燥される前記製法。
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