JP3149182B2 - 多領域造血刺激因子類 - Google Patents
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- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
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Description
【発明の詳細な説明】 この発明は、リンカー配列をもつかまたはもたない第
二のリンホカインに融合されたインターロイキン３［IL
3］の存在を特徴とする融合分子に関する。融合分子
は、融合分子を形成する両ペプチドの通常の活性をもつ
ことを特徴とし得るかまたは、さらに、単にIL3または
Ｘの存在という追加的機能をもつよりも大きな生物学的
または生理学的活性をもつことを特徴とし得る。融合分
子はまた、意外にも融合タンパク質のそれぞれの活性に
大きな影響を与えるかまたはIL3またはＸの存在により
期待されるものとは異なる活性を与え得る。
二のリンホカインに融合されたインターロイキン３［IL
3］の存在を特徴とする融合分子に関する。融合分子
は、融合分子を形成する両ペプチドの通常の活性をもつ
ことを特徴とし得るかまたは、さらに、単にIL3または
Ｘの存在という追加的機能をもつよりも大きな生物学的
または生理学的活性をもつことを特徴とし得る。融合分
子はまた、意外にも融合タンパク質のそれぞれの活性に
大きな影響を与えるかまたはIL3またはＸの存在により
期待されるものとは異なる活性を与え得る。
この発明により提供される新規IL3−ＸまたはＸ−IL3
融合タンパク質は、他のほ乳類のタンパク質性の物質を
実質的に随伴しない均質タンパク質である。前記の式中
のＸは、そのDNAコーディング配列が直接またはリンカ
ーを通してIL3のDNAコーディング領域とフレーム内に融
合されたリンホカインを表わす。「フレーム内に融合さ
れる」とは、IL3とＸタンパク質の読み取りフレーム間
に翻訳ターミネーターがないことを意味する。この明細
書に使用されている「直接に」という用語は、ペプチド
リンカーをもたないＸおよびIL3をコードするDNA配列の
融合を定義する。Ｘなる要素は、IL3cDNA分子の５′ま
たは３′末端に融合され得る。
融合タンパク質は、他のほ乳類のタンパク質性の物質を
実質的に随伴しない均質タンパク質である。前記の式中
のＸは、そのDNAコーディング配列が直接またはリンカ
ーを通してIL3のDNAコーディング領域とフレーム内に融
合されたリンホカインを表わす。「フレーム内に融合さ
れる」とは、IL3とＸタンパク質の読み取りフレーム間
に翻訳ターミネーターがないことを意味する。この明細
書に使用されている「直接に」という用語は、ペプチド
リンカーをもたないＸおよびIL3をコードするDNA配列の
融合を定義する。Ｘなる要素は、IL3cDNA分子の５′ま
たは３′末端に融合され得る。
IL3分子のDNAおよびタンパク質配列は公表されてお
り、様々な当技術の現在の標準技術によって構築され得
る。例えば、1988年、１月28日公開されたPCT公開WO88/
00598参照。
り、様々な当技術の現在の標準技術によって構築され得
る。例えば、1988年、１月28日公開されたPCT公開WO88/
00598参照。
Ｘの定義中に含まれるリンホカイン類は、GMCSF、GCS
F、エリスロポエチン、IL1、IL2、IL3、IL4、IL6、IL
7、IL9、IL11、またはＢ細胞刺激因子から成る群から選
択される。現在包含に好ましいＸリンホカイン類は、IL
3、IL6、IL7、IL9、IL11およびGCSFから成る群から選択
される。さらに、この発明は、修飾されたＸ分子の使用
またはこれらのＸ分子をコードする突然変異されたまた
は修飾されたDNA配列を含む。これらのリンホカインの
ポリペプチドおよびDNA配列（天然または修飾された）
は、組み換えまたは化学合成技術によるそれの発現を得
るための方法も同様だが、当技術で開示されている。
F、エリスロポエチン、IL1、IL2、IL3、IL4、IL6、IL
7、IL9、IL11、またはＢ細胞刺激因子から成る群から選
択される。現在包含に好ましいＸリンホカイン類は、IL
3、IL6、IL7、IL9、IL11およびGCSFから成る群から選択
される。さらに、この発明は、修飾されたＸ分子の使用
またはこれらのＸ分子をコードする突然変異されたまた
は修飾されたDNA配列を含む。これらのリンホカインの
ポリペプチドおよびDNA配列（天然または修飾された）
は、組み換えまたは化学合成技術によるそれの発現を得
るための方法も同様だが、当技術で開示されている。
Ｘの配列へのIL3配列の融合を下記の実施例で記載さ
れた中間ベクターの使用によって行い得る。別法とし
て、IL3配列を直接、Ｘタンパク質コーディング領域を
含むベクターに挿入することができまた逆も同様であ
る。ファージまたはプラスミド中のDNAをクローンする
技術は、当技術の熟練者に既知である。従って、例え
ば、融合タンパク質IL3−GCSFの遺伝子は、お互いにフ
レーム内に融合され、直接またはペプチドリンカーを通
して適当な宿主細胞における遺伝子の発現を調節するこ
とのできる調節領域に作動可能に連結された２つの領域
をコードするDNA配列を含むベクターとして構築され
る。融合は常法で行い得る。［例えば、サムブルック
ら、“モルキュラー・クローニング。ア・ラボラトリー
・マニュアル”、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（1989年）参照。］ リンカーおよびアダプターはIL3およびＸ配列を結合
したり、使用される制限位置が関心がある領域に内在す
る場合、失われた配列を置き換えるのに使用され得る。
２つの分子を結合するリンカーは、好ましくは、IL3お
よびＸタンパク質がお互い独立して折りたたまれたり活
動するよう作られる。この発明の実施例において使用さ
れる１つの例示的なリンカーの配列は、HIV−１逆転写
酵素中に見られる配列に基づくもので、そのタンパク質
のＣ−末端領域を端から２番目の領域につなぐと考えら
れる。このペプチドは穏やかなタンパク質加水分解に感
受性があることが知られ、従って、タンパク質の外側表
面にあると考えられている。この配列は高度に荷電さ
れ、それが、この配列を含むタンパク質の溶解性を増
す。IL3およびＸ分子を融合する際に、選ばれたリンカ
ー配列の多重複製を２つの分子の間に挿入することがで
きる。しかし、この発明は使用されるリンカー配列の
形、大きさ、または数によって制限されない。この発明
の融合タンパク質を製造するのに有用な別の模範的なリ
ンカー配列は、Gly Ser Gly Ser Glu Asp Cys Glu Asp
Ser Gly Ser Glyである。実際、リンカー配列に対する
唯一の必要条件は、それが機能的に、融合分子の個々の
成分を折りたたむことに有害な妨害をしないことであ
る。さらに、このようなリンカーは、直接に融合された
IL3−ＸまたはＸ−IL3分子では完全に欠け得る。
れた中間ベクターの使用によって行い得る。別法とし
て、IL3配列を直接、Ｘタンパク質コーディング領域を
含むベクターに挿入することができまた逆も同様であ
る。ファージまたはプラスミド中のDNAをクローンする
技術は、当技術の熟練者に既知である。従って、例え
ば、融合タンパク質IL3−GCSFの遺伝子は、お互いにフ
レーム内に融合され、直接またはペプチドリンカーを通
して適当な宿主細胞における遺伝子の発現を調節するこ
とのできる調節領域に作動可能に連結された２つの領域
をコードするDNA配列を含むベクターとして構築され
る。融合は常法で行い得る。［例えば、サムブルック
ら、“モルキュラー・クローニング。ア・ラボラトリー
・マニュアル”、コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー（1989年）参照。］ リンカーおよびアダプターはIL3およびＸ配列を結合
したり、使用される制限位置が関心がある領域に内在す
る場合、失われた配列を置き換えるのに使用され得る。
２つの分子を結合するリンカーは、好ましくは、IL3お
よびＸタンパク質がお互い独立して折りたたまれたり活
動するよう作られる。この発明の実施例において使用さ
れる１つの例示的なリンカーの配列は、HIV−１逆転写
酵素中に見られる配列に基づくもので、そのタンパク質
のＣ−末端領域を端から２番目の領域につなぐと考えら
れる。このペプチドは穏やかなタンパク質加水分解に感
受性があることが知られ、従って、タンパク質の外側表
面にあると考えられている。この配列は高度に荷電さ
れ、それが、この配列を含むタンパク質の溶解性を増
す。IL3およびＸ分子を融合する際に、選ばれたリンカ
ー配列の多重複製を２つの分子の間に挿入することがで
きる。しかし、この発明は使用されるリンカー配列の
形、大きさ、または数によって制限されない。この発明
の融合タンパク質を製造するのに有用な別の模範的なリ
ンカー配列は、Gly Ser Gly Ser Glu Asp Cys Glu Asp
Ser Gly Ser Glyである。実際、リンカー配列に対する
唯一の必要条件は、それが機能的に、融合分子の個々の
成分を折りたたむことに有害な妨害をしないことであ
る。さらに、このようなリンカーは、直接に融合された
IL3−ＸまたはＸ−IL3分子では完全に欠け得る。
融合分子の構築および新規IL3−ＸまたはIL3融合タン
パク質の発現の方法中での使用のためのベクターもま
た、この発明の一部を形成する。この発明の融合タンパ
ク質をコードするIL3−ＸまたはＸ−IL3DNA配列を含む
ベクターまたはこの明細書に記載されている修飾配列を
組み込むベクターもまた、この発明の具体的であり、IL
3−ＸまたはＸ−IL3タンパク質の製造に有用である。
パク質の発現の方法中での使用のためのベクターもま
た、この発明の一部を形成する。この発明の融合タンパ
ク質をコードするIL3−ＸまたはＸ−IL3DNA配列を含む
ベクターまたはこの明細書に記載されている修飾配列を
組み込むベクターもまた、この発明の具体的であり、IL
3−ＸまたはＸ−IL3タンパク質の製造に有用である。
この方法で使用されるベクターはまた、この発明のDN
Aコード配列と作動可能に関連している選択された調節
配列を含み、選択宿主細胞中でのその複製および発現を
指示することができる。融合遺伝子の転写を調節するた
めの調節領域の使用により、宿主細胞を、融合遺伝子の
発現がないかまたは低水準の状態で高密度にまで育成さ
せ、その後栄養、温度その他のような環境条件を変化さ
せることにより発現を誘導することができる。組み換え
IL3−ＸまたはＸ−IL3を製造するのに使用するこのよう
なベクターにより形質転換された宿主細胞もまた、この
発明によって提供される。
Aコード配列と作動可能に関連している選択された調節
配列を含み、選択宿主細胞中でのその複製および発現を
指示することができる。融合遺伝子の転写を調節するた
めの調節領域の使用により、宿主細胞を、融合遺伝子の
発現がないかまたは低水準の状態で高密度にまで育成さ
せ、その後栄養、温度その他のような環境条件を変化さ
せることにより発現を誘導することができる。組み換え
IL3−ＸまたはＸ−IL3を製造するのに使用するこのよう
なベクターにより形質転換された宿主細胞もまた、この
発明によって提供される。
この発明はまた、他の霊長類のタンパク質をコードす
るDNA配列を随伴せず、IL3−ＸまたはＸ−IL3融合タン
パク質をコードする、新規融合DNA配列を含む。DNA配列
は、お互いに好ましい近距離内に配列を置くように直接
またはリンカーを通してフレーム内に融合され得る。IL
3およびＸペプチド配列をコードするDNA配列の変形物も
またこの発明の融合分子およびその類似体または誘導体
に含まれる。IL3およびＸポリペプチド類をコードする
が、遺伝子コードの同義性のためまたは対立遺伝子の変
形（アミノ酸変化を起し得るかまたは起し得ない種の集
団における天然発生の塩基の変化）のために、コドン配
列において天然のIL3またはＸと異なるDNA配列もまた、
この発明に含まれる。点突然変異によるかまたはその際
コードされた融合タンパク質の活性、半減期または製造
を増強するために誘導された修飾によって起るIL3また
はＸのDNA配列における変形もまたこの発明に含まれ
る。
るDNA配列を随伴せず、IL3−ＸまたはＸ−IL3融合タン
パク質をコードする、新規融合DNA配列を含む。DNA配列
は、お互いに好ましい近距離内に配列を置くように直接
またはリンカーを通してフレーム内に融合され得る。IL
3およびＸペプチド配列をコードするDNA配列の変形物も
またこの発明の融合分子およびその類似体または誘導体
に含まれる。IL3およびＸポリペプチド類をコードする
が、遺伝子コードの同義性のためまたは対立遺伝子の変
形（アミノ酸変化を起し得るかまたは起し得ない種の集
団における天然発生の塩基の変化）のために、コドン配
列において天然のIL3またはＸと異なるDNA配列もまた、
この発明に含まれる。点突然変異によるかまたはその際
コードされた融合タンパク質の活性、半減期または製造
を増強するために誘導された修飾によって起るIL3また
はＸのDNA配列における変形もまたこの発明に含まれ
る。
この発明の融合分子を形成するペプチドまたはDNA配
列における修飾は、既知の技術を使う当技術の熟練者に
よって作られ得る。IL3またはＸ配列におけるこの修飾
は、それのコーディング配列における選択アミノ酸残基
の置換、挿入または欠失、グリコシル化位置または他の
既知のペプチド修飾の挿入または分解を含み得る。この
ような修飾はそれの生物学的特性を増大するために融合
分子の成分中でなされ得る。このような置換、挿入また
は欠失のための突然変異誘発技術は、当技術の熟練者に
既知である。［例えば、米国特許4518584号参照。］ その分子の全体的または部分的な生物学的または生理
学的活性を保持することが期待されるであろうIL3また
はＸの配列の他の類似体および誘導体もまた、この明細
書で開示されたこの発明の融合分子における使用のため
に当技術の熟練者の１人によって容易に作られ得る。１
つのこのような修飾は、既存の塩基の置換または1990年
11月１日に公開されたPCT公開WO90/12874号に記載され
た挿入によってIL3に、またはＸにまたはリンカーペプ
チド領域において加えられたシステイン残基へのポリエ
チレングリコールの添加であり得る。このような修飾は
この発明に含まれると思われる。
列における修飾は、既知の技術を使う当技術の熟練者に
よって作られ得る。IL3またはＸ配列におけるこの修飾
は、それのコーディング配列における選択アミノ酸残基
の置換、挿入または欠失、グリコシル化位置または他の
既知のペプチド修飾の挿入または分解を含み得る。この
ような修飾はそれの生物学的特性を増大するために融合
分子の成分中でなされ得る。このような置換、挿入また
は欠失のための突然変異誘発技術は、当技術の熟練者に
既知である。［例えば、米国特許4518584号参照。］ その分子の全体的または部分的な生物学的または生理
学的活性を保持することが期待されるであろうIL3また
はＸの配列の他の類似体および誘導体もまた、この明細
書で開示されたこの発明の融合分子における使用のため
に当技術の熟練者の１人によって容易に作られ得る。１
つのこのような修飾は、既存の塩基の置換または1990年
11月１日に公開されたPCT公開WO90/12874号に記載され
た挿入によってIL3に、またはＸにまたはリンカーペプ
チド領域において加えられたシステイン残基へのポリエ
チレングリコールの添加であり得る。このような修飾は
この発明に含まれると思われる。
この発明はまた、IL3−ＸまたはＸ−IL3融合分子の製
造方法を提供する。この方法は、（１）融合タンパク質
の発現をさせる条件下で、発現調節配列と作動可能に連
携したIL3−ＸまたはＸ−IL3融合分子の発現をコードす
るDNA配列により形質転換された、適当な細胞または細
胞系を培養培地中に培養し、（２）培養培地からそのよ
うに製造された融合タンパク質を収穫することを含む。
適当な好ましい細胞は細菌細胞である。例えば、大腸菌
の様々な菌株（例えば、HB101、MC1061および後記の実
施例中で使用された菌株）はバイオテクノロジーの分野
における宿主細胞として既知である。枯草菌、プソイド
モナス、他のかん菌その他もまた、この方法中で使用さ
れ得る。他の適当な細胞は、例えばCOSおよびCHOなどの
ほ乳類の細胞である。
造方法を提供する。この方法は、（１）融合タンパク質
の発現をさせる条件下で、発現調節配列と作動可能に連
携したIL3−ＸまたはＸ−IL3融合分子の発現をコードす
るDNA配列により形質転換された、適当な細胞または細
胞系を培養培地中に培養し、（２）培養培地からそのよ
うに製造された融合タンパク質を収穫することを含む。
適当な好ましい細胞は細菌細胞である。例えば、大腸菌
の様々な菌株（例えば、HB101、MC1061および後記の実
施例中で使用された菌株）はバイオテクノロジーの分野
における宿主細胞として既知である。枯草菌、プソイド
モナス、他のかん菌その他もまた、この方法中で使用さ
れ得る。他の適当な細胞は、例えばCOSおよびCHOなどの
ほ乳類の細胞である。
適当な細胞の選択および形質転換、培養、増幅、スク
リーニングおよび製品製造および精製の方法は当技術で
既知である。例えば、ゲシングおよびサムブルック、ネ
ーチャー、293巻、620−625頁、（1981年）、マウフマ
ンら、モルキュラー・セルラー・バイオロジー．、５巻
（７）、1750−1759頁（1985年）またはハウリーら、米
国特許4419446号参照。
リーニングおよび製品製造および精製の方法は当技術で
既知である。例えば、ゲシングおよびサムブルック、ネ
ーチャー、293巻、620−625頁、（1981年）、マウフマ
ンら、モルキュラー・セルラー・バイオロジー．、５巻
（７）、1750−1759頁（1985年）またはハウリーら、米
国特許4419446号参照。
当技術の熟練者らに既知のイースト菌細胞、真菌細
胞、または昆虫細胞もまた、この発明の融合分子の発現
のための宿主として有用であり得る。例えば、ミラー
ら、ジュネティック・エンジニアリング、８巻、277−2
98頁、（プレナム・プレス 1986年）およびその中の資
料参照。
胞、または昆虫細胞もまた、この発明の融合分子の発現
のための宿主として有用であり得る。例えば、ミラー
ら、ジュネティック・エンジニアリング、８巻、277−2
98頁、（プレナム・プレス 1986年）およびその中の資
料参照。
細胞溶菌液または前記の宿主細胞のいずれかの培養培
地の抽出液からのこの発明の融合タンパク質の収穫を常
法のタンパク質分離法により行なうことができる。
地の抽出液からのこの発明の融合タンパク質の収穫を常
法のタンパク質分離法により行なうことができる。
医薬的に許容され得る媒体との混合物としての、治療
上有効な量の融合タンパク質IL3−ＸまたはXIL−３を含
む医薬組成物がこの発明に含まれる。これらの医薬組成
物は、多くの病理学的または疾病状態、特に、低水準の
骨髄、赤芽球、リンパ球または造血組織の巨核球または
それの組合せを特徴とするものの処置に適している。さ
らに、融合タンパク質は、成熟骨髄および／またはリン
パ球細胞活性化に適した医薬組成物の製造に使用され得
る。例えばIL3−IL11融合分子を含む医薬組成物は、巨
核球および血小板の生成および／または成長を刺激する
のに有用であり得る。この発明の医薬組成物による処置
に感受性がある状態の中には白血球減少症、末梢血中の
循環白血球（白血球）の数の減少がある。白血球減少症
は、特定のウイルスまたは放射線にさらされることによ
って誘導され得る。それは化学療法剤にさらされること
の副作用であることも多い。この発明の医薬組成物は、
現在入手可能な薬品によって起る望ましくない副作用を
避け得る。さらに、この発明のタンパク質の多領域特性
は、個別にIL3またはＸリンパ液のみを含む医薬組成物
の使用と比較して、より低い用量の医薬組成物の使用を
可能にし得る。
上有効な量の融合タンパク質IL3−ＸまたはXIL−３を含
む医薬組成物がこの発明に含まれる。これらの医薬組成
物は、多くの病理学的または疾病状態、特に、低水準の
骨髄、赤芽球、リンパ球または造血組織の巨核球または
それの組合せを特徴とするものの処置に適している。さ
らに、融合タンパク質は、成熟骨髄および／またはリン
パ球細胞活性化に適した医薬組成物の製造に使用され得
る。例えばIL3−IL11融合分子を含む医薬組成物は、巨
核球および血小板の生成および／または成長を刺激する
のに有用であり得る。この発明の医薬組成物による処置
に感受性がある状態の中には白血球減少症、末梢血中の
循環白血球（白血球）の数の減少がある。白血球減少症
は、特定のウイルスまたは放射線にさらされることによ
って誘導され得る。それは化学療法剤にさらされること
の副作用であることも多い。この発明の医薬組成物は、
現在入手可能な薬品によって起る望ましくない副作用を
避け得る。さらに、この発明のタンパク質の多領域特性
は、個別にIL3またはＸリンパ液のみを含む医薬組成物
の使用と比較して、より低い用量の医薬組成物の使用を
可能にし得る。
様々な免疫不全または免疫障害もまた、この発明の医
薬組成物による処置に対して感受性がある。これらの医
薬組成物は、単独でまたは他の療法との組合せで、例え
ば、HIV、HTLV IまたはHTLV IIなどのウイルス感染の結
果、放射線多量被曝、癌治療または他の医療の結果であ
る免疫不全の処置または矯正に有用であり得る。Ｘが何
であるかによって異なるが、医薬組成物を、血小板減少
症（血小板不全）、または貧血（赤血球不全）を含む、
他の血液細胞不全を処置するのに使用し得る。他の用途
は骨髄移植から回復した患者の処置における使用であ
る。
薬組成物による処置に対して感受性がある。これらの医
薬組成物は、単独でまたは他の療法との組合せで、例え
ば、HIV、HTLV IまたはHTLV IIなどのウイルス感染の結
果、放射線多量被曝、癌治療または他の医療の結果であ
る免疫不全の処置または矯正に有用であり得る。Ｘが何
であるかによって異なるが、医薬組成物を、血小板減少
症（血小板不全）、または貧血（赤血球不全）を含む、
他の血液細胞不全を処置するのに使用し得る。他の用途
は骨髄移植から回復した患者の処置における使用であ
る。
このような医薬組成物は、医薬的に許容され得る担体
との混合物として治療上有効な量のこの発明の融合タン
パク質IL3−ＸまたはＸ−IL3を含む。この組成物は、非
経口で組織的に投与され得る。別法として、この組成物
は静脈注射により投与され得る。所望により、この組成
物は皮下投与し得る。組織的に投与される場合、この発
明における使用のための治療組成物は、発熱物質を含ま
ない、非経口的に許容され得る水溶液の形態にある。p
H、等張性、安定性その他に必要な考慮を払った、この
ような医薬的に許容され得るタンパク質溶液は、当技術
の範囲内にある。
との混合物として治療上有効な量のこの発明の融合タン
パク質IL3−ＸまたはＸ−IL3を含む。この組成物は、非
経口で組織的に投与され得る。別法として、この組成物
は静脈注射により投与され得る。所望により、この組成
物は皮下投与し得る。組織的に投与される場合、この発
明における使用のための治療組成物は、発熱物質を含ま
ない、非経口的に許容され得る水溶液の形態にある。p
H、等張性、安定性その他に必要な考慮を払った、この
ような医薬的に許容され得るタンパク質溶液は、当技術
の範囲内にある。
下記の実施例は、この発明の実例となる融合タンパク
質の構築および製造を記載している。
質の構築および製造を記載している。
実施例１−多領域IL3分子の構築 IL3−Ｘ融合タンパク質を得るために、２つのIL3 cD
NA配列を、1988年１月28日に公開されたPCT公開WO88/00
598号中に記載された方法に従って得た。２つのcDNA配
列をDNAの短片と共に融合した。このDNAは、２つのIL3
タンパク質が互いに独立して折りたたまれ作用するよう
設計されたリンカーペプチドをコードしていた。
NA配列を、1988年１月28日に公開されたPCT公開WO88/00
598号中に記載された方法に従って得た。２つのcDNA配
列をDNAの短片と共に融合した。このDNAは、２つのIL3
タンパク質が互いに独立して折りたたまれ作用するよう
設計されたリンカーペプチドをコードしていた。
このリンカーペプチドの配列は、前記のHIV−１逆転
写酵素中に見られた配列に基づいたものである。この融
合物中で使用されたリンカーの配列は、下記のとおりで
ある。
写酵素中に見られた配列に基づいたものである。この融
合物中で使用されたリンカーの配列は、下記のとおりで
ある。
IL3 cDNAとリンカー領域を融合するのに使用される
方式は、マニアチスら、“モルキュラー・クローニン
グ、ア・ラボラトリー・マニュアル”、コールド・スプ
リング・ハーバー研究所、コールド・スプリング・ハー
バー、ニューヨーク（1982年）中に記載された常法の組
み換え工法を使っている。融合物の構築を図１に示し
た。簡単に記すと、「IL3 cDNA配列、マイナスその分
泌リーダーをコードする配列」は、下記の表Ａの上部に
見られる５′末端および３′末端をもっていた。Xba I
およびマング・ビーンヌクレアーゼ、またはNde Iによ
る消化後のこれらのIL3配列は、表Ａの下部に見られる
５′末端および３′末端をもっていた。
方式は、マニアチスら、“モルキュラー・クローニン
グ、ア・ラボラトリー・マニュアル”、コールド・スプ
リング・ハーバー研究所、コールド・スプリング・ハー
バー、ニューヨーク（1982年）中に記載された常法の組
み換え工法を使っている。融合物の構築を図１に示し
た。簡単に記すと、「IL3 cDNA配列、マイナスその分
泌リーダーをコードする配列」は、下記の表Ａの上部に
見られる５′末端および３′末端をもっていた。Xba I
およびマング・ビーンヌクレアーゼ、またはNde Iによ
る消化後のこれらのIL3配列は、表Ａの下部に見られる
５′末端および３′末端をもっていた。
消化されたIL3配列を、大腸菌中の細胞内での異型タ
ンパク質の発現のために設計されたプラスミド、pALhIL
3−781中に挿入した。このプラスミドを説明のためにだ
け記載する。記載された融合分子を製造するために記載
された方法は、同一のまたは異なる成分配列、制限部位
などを含む他のプラスミドを用い得る。他の例示的なプ
ラスミドは、別の転写ターミネーター配列を含むpAL181
［ATCC 寄託物 ＃40134］の修飾された型である。図
Ｉに記されている、プラスミドpALhIL3−781は、イニシ
エーターメチオニンおよび適当に隔てられたリボソーム
結合位置をフレーム中に融合した成熟IL3の完全なcDNA
配列、IL3cDNAの転写を制御し、推進するファージλか
らのおもに左方向のプロモーター、転写を終結させるIL
3配列の３′末端を越える配列、プラスミド中の３つの
独特の制限部位、を特徴とする。IL3遺伝子およびイニ
シエーターメチオニンのコーディング配列を含むものに
対する１つの部位は５′はNde Iである。別の位置が、I
L3遺伝子、Xba Iの３′末端における翻訳終結配列中に
組み込まれている。残りの部位は転写終結配列、Hind I
IIに対して５′である。
ンパク質の発現のために設計されたプラスミド、pALhIL
3−781中に挿入した。このプラスミドを説明のためにだ
け記載する。記載された融合分子を製造するために記載
された方法は、同一のまたは異なる成分配列、制限部位
などを含む他のプラスミドを用い得る。他の例示的なプ
ラスミドは、別の転写ターミネーター配列を含むpAL181
［ATCC 寄託物 ＃40134］の修飾された型である。図
Ｉに記されている、プラスミドpALhIL3−781は、イニシ
エーターメチオニンおよび適当に隔てられたリボソーム
結合位置をフレーム中に融合した成熟IL3の完全なcDNA
配列、IL3cDNAの転写を制御し、推進するファージλか
らのおもに左方向のプロモーター、転写を終結させるIL
3配列の３′末端を越える配列、プラスミド中の３つの
独特の制限部位、を特徴とする。IL3遺伝子およびイニ
シエーターメチオニンのコーディング配列を含むものに
対する１つの部位は５′はNde Iである。別の位置が、I
L3遺伝子、Xba Iの３′末端における翻訳終結配列中に
組み込まれている。残りの部位は転写終結配列、Hind I
IIに対して５′である。
プラスミドの２つの試料を製造した。１つはNde Iお
よびHind IIIおよびIL3cDNAを含む小断片により切断
し、精製した（図Ｉの右側参照）。第二番目はXba Iで
切断し、マングビーンエキソヌクレアーゼで処理し、一
本鎖DNA尾部を除去し、Hind IIIで消化した。より大き
な断片を分離した（図Ｉの左側を参照）。２つの分離さ
れた断片を、前記の配列の合成リンカーオリゴヌクレオ
チドと混合し、T4−ポリヌクレオチドリガーゼで処置し
た。リゲーション後の２つのIL3配列間の結合領域の配
列は、下記のとおりである。
よびHind IIIおよびIL3cDNAを含む小断片により切断
し、精製した（図Ｉの右側参照）。第二番目はXba Iで
切断し、マングビーンエキソヌクレアーゼで処理し、一
本鎖DNA尾部を除去し、Hind IIIで消化した。より大き
な断片を分離した（図Ｉの左側を参照）。２つの分離さ
れた断片を、前記の配列の合成リンカーオリゴヌクレオ
チドと混合し、T4−ポリヌクレオチドリガーゼで処置し
た。リゲーション後の２つのIL3配列間の結合領域の配
列は、下記のとおりである。
２つのIL3コーディング配列および１つ以上のリンカ
ー配列が共に融合されたプラスミドを、リンカー配列お
よび立証された融合結合の配列にハイブリダイズするコ
ロニーによって選択した。IL3配列間に挿入された１つ
以上のリンカーをもつプラスミドの存在は予期されなか
った。これらの多重リンカープラスミドは多分、近接の
リンカー二重らせんの鈍い末端に結合されるようにリン
カー二重らせんのTA−本鎖尾部を除去する少量のヌクレ
アーゼまたはマングビーンヌクレアーゼの残り物のDNA
リガーゼ中への混入から生じた。
ー配列が共に融合されたプラスミドを、リンカー配列お
よび立証された融合結合の配列にハイブリダイズするコ
ロニーによって選択した。IL3配列間に挿入された１つ
以上のリンカーをもつプラスミドの存在は予期されなか
った。これらの多重リンカープラスミドは多分、近接の
リンカー二重らせんの鈍い末端に結合されるようにリン
カー二重らせんのTA−本鎖尾部を除去する少量のヌクレ
アーゼまたはマングビーンヌクレアーゼの残り物のDNA
リガーゼ中への混入から生じた。
一度プラスミドが構築されると、それらは、多領域IL
3発現のための、W3110（ラムダPamc I857）［M.ローゼ
ンバーグら、メソズ・オブ・エンザイモロジー、101
巻、123−137頁（1983年）および前記、サムブルック
ら、］などの適当な大腸菌菌株へ形質転換された。この
実験のために選択された２つのプラスミドは、各々１つ
および３つのリンカー配列によって分離される２つのIL
3 cDNA配列を含んでいる。リンカーの１つの複製を含
むpALIL31−781が図１の下部に示されている。これらの
融合分子は、それぞれ31と34キロダルトンのタンパク質
を生成した。
3発現のための、W3110（ラムダPamc I857）［M.ローゼ
ンバーグら、メソズ・オブ・エンザイモロジー、101
巻、123−137頁（1983年）および前記、サムブルック
ら、］などの適当な大腸菌菌株へ形質転換された。この
実験のために選択された２つのプラスミドは、各々１つ
および３つのリンカー配列によって分離される２つのIL
3 cDNA配列を含んでいる。リンカーの１つの複製を含
むpALIL31−781が図１の下部に示されている。これらの
融合分子は、それぞれ31と34キロダルトンのタンパク質
を生成した。
タンパク質は、細胞内に不溶性の細胞封入体として蓄
積し、標準方法によって可溶化され、折りたたまれた
［例えば、米国特許第4512922号、参照］。下記実施例
９中のCML検定において試験されたとき、タンパク質
は、天然または組み換えIL3の活性と等しいかまたはそ
れより大きいIL3活性を示した。
積し、標準方法によって可溶化され、折りたたまれた
［例えば、米国特許第4512922号、参照］。下記実施例
９中のCML検定において試験されたとき、タンパク質
は、天然または組み換えIL3の活性と等しいかまたはそ
れより大きいIL3活性を示した。
実施例２−IL3/GMCSF融合タンパク質 別の融合タンパク質を、顆粒細胞マクロファージコロ
ニー刺激因子、GMCSFをコードするDNA配列とIL3 cDNA
配列をフレーム中に融合することによって形成した。GM
CSF cDNA配列は、1986年１月30日に発行された欧州特
許第188479号に記載されている。２つのcDNA配列を、同
じ方法によって実施例１中に記載されたリンカーDNAの
短片と一緒に融合した。
ニー刺激因子、GMCSFをコードするDNA配列とIL3 cDNA
配列をフレーム中に融合することによって形成した。GM
CSF cDNA配列は、1986年１月30日に発行された欧州特
許第188479号に記載されている。２つのcDNA配列を、同
じ方法によって実施例１中に記載されたリンカーDNAの
短片と一緒に融合した。
IL3−GMCSF融合タンパク質をコードするDNA配列を構
築するために使用された仕組みを図２に図式的に示して
いる。IL3 cDNAを、実施例１中に記載されたように修
飾された、発現プラスミド、pAL181中に挿入した。「GM
CSF cDNA、マイナスその分泌リーダー」をコードする
配列を、pAL181の非修飾型に挿入してプラスミドpALC−
181にした。IL3プラスミド、pALhIL3−781をXba Iで消
化してからマングビーンエキソヌクレアーゼで処理して
一本鎖DNA尾部を除去した。次にプラスミドをAva Iで消
化し、IL3コーデング配列をもつ生成した小断片を分離
した。GMCSF発現プラスミド、pALC−186をNde IおよびA
va Iで消化し、GMCSF遺伝子をもつ大きな断片を分離す
る。２つの断片を、実施例１に記載されたリンカーペプ
チドをコードする合成オリゴヌクレオチド類と混合し、
T4−ポリヌクレオチド リガーゼで処理した。Ｎ−末端
領域としてIL3を、Ｃ末端領域としてGMCSFをもつタンパ
ク質をコードする遺伝子を形成するように、IL3 cDN
A、リンカーオリゴヌクレオチド、GMCSF cDNA配列が隣
接して融合されたプラスミドを、選択した。
築するために使用された仕組みを図２に図式的に示して
いる。IL3 cDNAを、実施例１中に記載されたように修
飾された、発現プラスミド、pAL181中に挿入した。「GM
CSF cDNA、マイナスその分泌リーダー」をコードする
配列を、pAL181の非修飾型に挿入してプラスミドpALC−
181にした。IL3プラスミド、pALhIL3−781をXba Iで消
化してからマングビーンエキソヌクレアーゼで処理して
一本鎖DNA尾部を除去した。次にプラスミドをAva Iで消
化し、IL3コーデング配列をもつ生成した小断片を分離
した。GMCSF発現プラスミド、pALC−186をNde IおよびA
va Iで消化し、GMCSF遺伝子をもつ大きな断片を分離す
る。２つの断片を、実施例１に記載されたリンカーペプ
チドをコードする合成オリゴヌクレオチド類と混合し、
T4−ポリヌクレオチド リガーゼで処理した。Ｎ−末端
領域としてIL3を、Ｃ末端領域としてGMCSFをもつタンパ
ク質をコードする遺伝子を形成するように、IL3 cDN
A、リンカーオリゴヌクレオチド、GMCSF cDNA配列が隣
接して融合されたプラスミドを、選択した。
IL3−GMCSF融合タンパク質、pALIL3−GM181の遺伝子
をもつプラスミドを、融合タンパク質発現のための実施
例１中に記載されたような適当な大腸菌宿主菌株に形質
転換した。発現されると、融合タンパク質は、前記の標
準方法によって可溶化され折りたたまれる不溶性の細胞
封入体として細胞内に蓄積する。この融合タンパク質の
活性を、実施例９中に記載された［CML］検定において
試験する。
をもつプラスミドを、融合タンパク質発現のための実施
例１中に記載されたような適当な大腸菌宿主菌株に形質
転換した。発現されると、融合タンパク質は、前記の標
準方法によって可溶化され折りたたまれる不溶性の細胞
封入体として細胞内に蓄積する。この融合タンパク質の
活性を、実施例９中に記載された［CML］検定において
試験する。
実施例３−IL3/GCSF 融合タンパク質 別の式IL3−Ｘの模範融合タンパク質を顆粒球コロニ
ー刺激因子、GCSFをコードするDNA配列とともにIL3cDNA
配列をフレーム中に融合することによって形成した。こ
の融合のためのGCSF cDNAはジェネティクス・インステ
ィチュート社から得られ、1987年２月26日に公開された
PCT公開WO87/01132号中の配列をもつ。この融合分子をI
L3/IL3について記載したのと同様の方法で構築した。具
体的には、この融合を実施例１中に記載されたリンカー
DNA配列によって仲介した。
ー刺激因子、GCSFをコードするDNA配列とともにIL3cDNA
配列をフレーム中に融合することによって形成した。こ
の融合のためのGCSF cDNAはジェネティクス・インステ
ィチュート社から得られ、1987年２月26日に公開された
PCT公開WO87/01132号中の配列をもつ。この融合分子をI
L3/IL3について記載したのと同様の方法で構築した。具
体的には、この融合を実施例１中に記載されたリンカー
DNA配列によって仲介した。
IL3−GCSF融合タンパク質をコードするDNA配列を構築
するのに使用される仕組みを図式的に図３に示した。IL
3およびGCSF cDNA、マイナスこれらのリーダー配列
を、実施例１中に記載されたように修飾された発現プラ
スミド、pAL181に挿入した。IL3発現プラスミドpALhIL3
−781をXba Iで切断し、一本鎖DNA尾部を除去するため
にマング・ビーンエキソヌクレアーゼで処理し、Hind I
IIで消化した。やや大きな断片を分離した。GCSF発現プ
ラスミドpALGa−781をNde IおよびHind IIIで切断し、G
CSF遺伝子を含む小断片を精製した。２つの分離された
断片を実施例１で使用されたのと同じリンカーペプチド
をコードする合成オリゴヌクレオチドと混合し、T4−ポ
リヌクレオチドリガーゼで処理した。Ｎ−末端領域とし
てIL3を、Ｃ末端領域としてGCSFをもつタンパク質をコ
ードする遺伝子を形成するようにIL3 cDNA、リンカー
オリゴヌクレオチドおよびGCSF cDNA配列が隣接して融
合されたプラスミドを、選択した。
するのに使用される仕組みを図式的に図３に示した。IL
3およびGCSF cDNA、マイナスこれらのリーダー配列
を、実施例１中に記載されたように修飾された発現プラ
スミド、pAL181に挿入した。IL3発現プラスミドpALhIL3
−781をXba Iで切断し、一本鎖DNA尾部を除去するため
にマング・ビーンエキソヌクレアーゼで処理し、Hind I
IIで消化した。やや大きな断片を分離した。GCSF発現プ
ラスミドpALGa−781をNde IおよびHind IIIで切断し、G
CSF遺伝子を含む小断片を精製した。２つの分離された
断片を実施例１で使用されたのと同じリンカーペプチド
をコードする合成オリゴヌクレオチドと混合し、T4−ポ
リヌクレオチドリガーゼで処理した。Ｎ−末端領域とし
てIL3を、Ｃ末端領域としてGCSFをもつタンパク質をコ
ードする遺伝子を形成するようにIL3 cDNA、リンカー
オリゴヌクレオチドおよびGCSF cDNA配列が隣接して融
合されたプラスミドを、選択した。
IL3−GCSF融合タンパク質、pALIL3G−781の遺伝子を
もつプラスミドを、融合タンパク質の発現のための実施
例１に記載された適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換し
た。
もつプラスミドを、融合タンパク質の発現のための実施
例１に記載された適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換し
た。
発現されると、融合タンパク質は不溶性の細胞封入体
として細胞内に蓄積し、前記の標準方法によって可溶化
され折りたたまれた。生成タンパク質は下記実施例のMO
7E、32DおよびDA2増殖検定においてIL3活性およびGCSF
活性をもっていた。
として細胞内に蓄積し、前記の標準方法によって可溶化
され折りたたまれた。生成タンパク質は下記実施例のMO
7E、32DおよびDA2増殖検定においてIL3活性およびGCSF
活性をもっていた。
実施例４−GCSF/IL3融合タンパク質 式Ｘ−IL3の代表的融合タンパク質を、IL3 cDNA配列
を顆粒細胞コロニー刺激因子、GCSFをコードするDNA配
列とフレーム内かつ３′で融合することによって形成し
た。この融合分子を、IL3/GCSFについて記載されたのと
同様の方法で構築した。具体的には、融合は、実施例１
中に記載されたリンカーDNA配列によって仲介された。
を顆粒細胞コロニー刺激因子、GCSFをコードするDNA配
列とフレーム内かつ３′で融合することによって形成し
た。この融合分子を、IL3/GCSFについて記載されたのと
同様の方法で構築した。具体的には、融合は、実施例１
中に記載されたリンカーDNA配列によって仲介された。
GCSF−IL3融合タンパク質をコードするDNA配列を構築
するのに使用される機構を図４に図式的に示している。
IL3およびGCSF cDNAを実施例１中に記載された修飾発
現プラスミドpAL181に挿入した。GCSF cDNAは、３′末
端に１つのSty I位置を、遺伝子のコーディング配列の
内部に別の１つをもつ。内部部位は位置指定突然変異導
入法によって変化し、タンパク質配列は変わらないまま
であった。生成したプラスミド、pALGb−781をSty Iで
切断し、一本鎖DNA尾部を除去するためにマング・ビー
ンエキソヌクレアーゼで処理し、Hind IIIで消化した。
より大きな断片を分離した。IL3発現プラスミド、pALhI
L3−781をNde IおよびHind IIIで切断し、IL3遺伝子を
含む小断片を精製した。２つの分離した断片を、実施例
１で使用されたのと同じリンカーペプチドをコードする
合成オリゴヌクレオチドと混合し、T4−ポリヌクレオチ
ドリガーゼで処理した。Ｎ−末端領域としてGCSFを、Ｃ
末端領域としてIL3をもつタンパク質をコードする遺伝
子を形成するように、GCSF、リンカーオリゴヌクレオチ
ド、およびIL3 cDNA配列が隣接して融合されたプラス
ミドを、を選択した。
するのに使用される機構を図４に図式的に示している。
IL3およびGCSF cDNAを実施例１中に記載された修飾発
現プラスミドpAL181に挿入した。GCSF cDNAは、３′末
端に１つのSty I位置を、遺伝子のコーディング配列の
内部に別の１つをもつ。内部部位は位置指定突然変異導
入法によって変化し、タンパク質配列は変わらないまま
であった。生成したプラスミド、pALGb−781をSty Iで
切断し、一本鎖DNA尾部を除去するためにマング・ビー
ンエキソヌクレアーゼで処理し、Hind IIIで消化した。
より大きな断片を分離した。IL3発現プラスミド、pALhI
L3−781をNde IおよびHind IIIで切断し、IL3遺伝子を
含む小断片を精製した。２つの分離した断片を、実施例
１で使用されたのと同じリンカーペプチドをコードする
合成オリゴヌクレオチドと混合し、T4−ポリヌクレオチ
ドリガーゼで処理した。Ｎ−末端領域としてGCSFを、Ｃ
末端領域としてIL3をもつタンパク質をコードする遺伝
子を形成するように、GCSF、リンカーオリゴヌクレオチ
ド、およびIL3 cDNA配列が隣接して融合されたプラス
ミドを、を選択した。
GCSF−IL3融合タンパク質、pALGIL3−781の遺伝子を
もつプラスミドを、融合タンパク質の発現のための実施
例１中に記載された適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換
した。
もつプラスミドを、融合タンパク質の発現のための実施
例１中に記載された適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換
した。
発現されると、融合タンパク質は細胞内で不溶性の細
胞封入体として蓄積し、前記の標準方法によって可溶化
し、折りたたまれた。融合タンパク質は実施例９で記載
されたインビトロ細胞刺激検定MO7E、32D、およびDA2増
殖検定においてGCSFおよびIL3活性の両方をもってい
た。
胞封入体として蓄積し、前記の標準方法によって可溶化
し、折りたたまれた。融合タンパク質は実施例９で記載
されたインビトロ細胞刺激検定MO7E、32D、およびDA2増
殖検定においてGCSFおよびIL3活性の両方をもってい
た。
実施例５−IL3/IL11融合タンパク質 式IL3−Ｘの別の模範融合タンパク質を、IL3 cDNA配
列をインターロイキン11［IL11］の成熟型をコードする
DNA配列でフレーム中に融合することによって形成し
た。IL11の配列およびそれを得る方法が1991年５月30日
に公開されたPCT公開WO91/07495号中に詳しく記載され
ている。IL11 cDNAを、ヒトIL11中に見られるのと同じ
第一アミノ酸配列をもつが、天然のcDNAより細菌の発現
に適合するコドンを使ったタンパク質をコードするため
に、合成オリゴヌクレオチドから構築した。この修飾IL
11遺伝子の配列を下記の表Ｂに示している。遺伝子融合
物を実施例３中に記載されたのと同様の方法で構築し
た。特異的に、融合は実施例１に記載されたリンカーDN
A配列によって仲介された。
列をインターロイキン11［IL11］の成熟型をコードする
DNA配列でフレーム中に融合することによって形成し
た。IL11の配列およびそれを得る方法が1991年５月30日
に公開されたPCT公開WO91/07495号中に詳しく記載され
ている。IL11 cDNAを、ヒトIL11中に見られるのと同じ
第一アミノ酸配列をもつが、天然のcDNAより細菌の発現
に適合するコドンを使ったタンパク質をコードするため
に、合成オリゴヌクレオチドから構築した。この修飾IL
11遺伝子の配列を下記の表Ｂに示している。遺伝子融合
物を実施例３中に記載されたのと同様の方法で構築し
た。特異的に、融合は実施例１に記載されたリンカーDN
A配列によって仲介された。
（なお、成熟IL11タンパク質のアミノ酸配列は、（Ａ）
の記号を付したProから（Ｂ）の記号を付したLeuまでで
ある。） IL3−IL11融合タンパク質をコードするDNA配列を構築
するために使用された機構を図５に図式で示した。IL3
発現プラスミド、pALhIL3−781を実施例３に記載された
ように処理した。IL11配列を、約150塩基対の断片中へ7
0−90塩基対のオリゴヌクレオチドをライゲートし、そ
れらを逐次発現プラスミド、pAL181中に挿入することに
よって合成し、全遺伝子を作り上げた。全IL11コーディ
ング配列が構築されると、pALIL11−781と呼ばれるプラ
スミドはIL11タンパク質の合成を指定することができ
る。発現プラスミドをNde IおよびHind IIIで消化し、I
L11遺伝子を含む小断片を精製した。IL11 cDNA断片お
よび切断された実施例１中に記載されたように製造され
たIL3発現ベクターを実施例１中に記載されたリンカー
ペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドと混合
し、T4−ポリヌクレオチドリガーゼで処理した。Ｎ−末
端領域としてIL3、Ｃ−末端領域としてIL11をもつタン
パク質をコードする新しい遺伝子を形成するように、IL
3 cDNA、リンカーオリゴヌクレオチド、およびIL11遺伝
子配列が隣接して融合されたプラスミドを、選択した。
の記号を付したProから（Ｂ）の記号を付したLeuまでで
ある。） IL3−IL11融合タンパク質をコードするDNA配列を構築
するために使用された機構を図５に図式で示した。IL3
発現プラスミド、pALhIL3−781を実施例３に記載された
ように処理した。IL11配列を、約150塩基対の断片中へ7
0−90塩基対のオリゴヌクレオチドをライゲートし、そ
れらを逐次発現プラスミド、pAL181中に挿入することに
よって合成し、全遺伝子を作り上げた。全IL11コーディ
ング配列が構築されると、pALIL11−781と呼ばれるプラ
スミドはIL11タンパク質の合成を指定することができ
る。発現プラスミドをNde IおよびHind IIIで消化し、I
L11遺伝子を含む小断片を精製した。IL11 cDNA断片お
よび切断された実施例１中に記載されたように製造され
たIL3発現ベクターを実施例１中に記載されたリンカー
ペプチドをコードする合成オリゴヌクレオチドと混合
し、T4−ポリヌクレオチドリガーゼで処理した。Ｎ−末
端領域としてIL3、Ｃ−末端領域としてIL11をもつタン
パク質をコードする新しい遺伝子を形成するように、IL
3 cDNA、リンカーオリゴヌクレオチド、およびIL11遺伝
子配列が隣接して融合されたプラスミドを、選択した。
IL3/IL11融合タンパク質、pALIL311−781の遺伝子を
もつプラスミドを適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換
し、融合タンパク質を実施例１に記載されているように
発現し収穫した。収穫された融合タンパク質は、実施例
９中に記載されているT10検定およびM07E検定において
活性をもっていた。
もつプラスミドを適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換
し、融合タンパク質を実施例１に記載されているように
発現し収穫した。収穫された融合タンパク質は、実施例
９中に記載されているT10検定およびM07E検定において
活性をもっていた。
実施例６−IL3/IL9 融合タンパク質 式IL3−Ｘの別の代表的融合タンパク質を、インター
ロイキン９［IL9］の成熟型をコードするDNA配列のフレ
ーム中にIL3 cDNA配列を融合することによって形成す
る。IL9の配列およびそれを得る方法は1990年、11月29
日に公開された、PCT公開WO90/14432中に詳細に記載さ
れている。
ロイキン９［IL9］の成熟型をコードするDNA配列のフレ
ーム中にIL3 cDNA配列を融合することによって形成す
る。IL9の配列およびそれを得る方法は1990年、11月29
日に公開された、PCT公開WO90/14432中に詳細に記載さ
れている。
前記の公開公報中に記載されたIL9 cDNAは、ヌクレ
オチド94でBamH Iによる切断部位をもち、ヌクレオチド
490でHind IIIによる切断部位をもつ。この396塩基対断
片をもとのcDNAクローンから分離する。このIL9 cDNA
断片および実施例１中に記載したように製造した切断IL
3発現ベクターを、リンカー配列をコードするオリゴヌ
クレオチドおよび成熟IL9タンパク質の最初の７コドン
と混合する。このリンカーの配列は下記の通りである。
オチド94でBamH Iによる切断部位をもち、ヌクレオチド
490でHind IIIによる切断部位をもつ。この396塩基対断
片をもとのcDNAクローンから分離する。このIL9 cDNA
断片および実施例１中に記載したように製造した切断IL
3発現ベクターを、リンカー配列をコードするオリゴヌ
クレオチドおよび成熟IL9タンパク質の最初の７コドン
と混合する。このリンカーの配列は下記の通りである。
この混合物をT4−ポリヌクレオチドリガーゼで処理す
る。Ｎ−末端領域としてIL3を、Ｃ−末端領域としてIL9
をもつタンパク質をコードする新しい遺伝子を形成する
ように、IL3 cDNA、リンカーオリゴヌクレオチド、IL9
cDNA配列が隣接して融合されたプラスミドを、選択す
る。
る。Ｎ−末端領域としてIL3を、Ｃ−末端領域としてIL9
をもつタンパク質をコードする新しい遺伝子を形成する
ように、IL3 cDNA、リンカーオリゴヌクレオチド、IL9
cDNA配列が隣接して融合されたプラスミドを、選択す
る。
IL3/IL9融合タンパク質の遺伝子をもつプラスミド
を、融合タンパク質の発現のための実施例１中に記載さ
れた適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換する。この融合
タンパク質の活性を実施例９中に記載されたMO7E検定中
で試験する。
を、融合タンパク質の発現のための実施例１中に記載さ
れた適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換する。この融合
タンパク質の活性を実施例９中に記載されたMO7E検定中
で試験する。
実施例７−IL3/IL6 融合タンパク質 式IL3−Ｘの別の代表的融合タンパク質を、IL3 cDNA
配列をインターロイキン６［IL6］の成熟型をコードす
るDNA配列のフレーム中に融合することによって形成す
る。IL6の配列およびそれを得るための方法は、1988年
１月14日に公開されたPCT公開 WO88/00206号に詳細に
記載されている。
配列をインターロイキン６［IL6］の成熟型をコードす
るDNA配列のフレーム中に融合することによって形成す
る。IL6の配列およびそれを得るための方法は、1988年
１月14日に公開されたPCT公開 WO88/00206号に詳細に
記載されている。
前記の開示中に記載されたプラスミドpAL309C−781中
に含まれたIL6 cDNAを制限エンドヌクレアーゼNde Iお
よびHind IIIで切断する。断片をコードする小IL6を精
製する。このIL6 cDNA断片および実施例１中に記載し
た通りに製造した切断されたIL3発現ベクターを実施例
１に記載したリンカーペプチドをコードする合成オリゴ
ヌクレオチドと混合し、T4−ポリヌクレオチドリガーゼ
で処理する。Ｎ−末端領域としてIL3を、Ｃ−末端領域
としてIL6をもつタンパク質をコードする新しい遺伝子
を形成するようにIL3 cDNA配列が隣接して融合されて
いるプラスミドを、選択する。
に含まれたIL6 cDNAを制限エンドヌクレアーゼNde Iお
よびHind IIIで切断する。断片をコードする小IL6を精
製する。このIL6 cDNA断片および実施例１中に記載し
た通りに製造した切断されたIL3発現ベクターを実施例
１に記載したリンカーペプチドをコードする合成オリゴ
ヌクレオチドと混合し、T4−ポリヌクレオチドリガーゼ
で処理する。Ｎ−末端領域としてIL3を、Ｃ−末端領域
としてIL6をもつタンパク質をコードする新しい遺伝子
を形成するようにIL3 cDNA配列が隣接して融合されて
いるプラスミドを、選択する。
IL3/IL6融合タンパク質の遺伝子をもつプラスミド
を、融合タンパク質の発現のための実施例１中に記載さ
れた適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換する。この融合
タンパク質の活性を実施例９中に記載されたMO7Eおよび
T10検定中で試験する。
を、融合タンパク質の発現のための実施例１中に記載さ
れた適当な大腸菌宿主菌株へと形質転換する。この融合
タンパク質の活性を実施例９中に記載されたMO7Eおよび
T10検定中で試験する。
実施例８−組み換えIL3−Ｘ融合タンパク質の発現 実施例の融合タンパク質を発現するために、融合タン
パク質をコードする前記のプラスミド中のDNAを、その
うちのほ乳類、昆虫、イースト菌、菌類および細菌の発
現の多くの型が当技術で既知である適当な発現ベクター
に、標準分子生物学技術によって形質転換する。
パク質をコードする前記のプラスミド中のDNAを、その
うちのほ乳類、昆虫、イースト菌、菌類および細菌の発
現の多くの型が当技術で既知である適当な発現ベクター
に、標準分子生物学技術によって形質転換する。
a.細菌発現系 当技術の熟練者は、コーディング配列に隣接するほ乳
類の調節配列を削除し、細菌細胞によるこの発明の融合
タンパク質の細胞内または細胞外の発現のための細菌ベ
クターをつくる細菌調節配列を挿入することによって、
IL3−ＸおよびＸ−IL3タンパク質をコードする配列を操
作することができる。融合タンパク質をコードするDNA
を、当技術で既知である細菌の発現を最適化する様々な
コドンを含むように、さらに修飾することができる。融
合タンパク質をコードする配列を、当技術で既知の方法
によって融合タンパク質の細菌発現、分泌およびプロセ
シングをさせる分泌リーダーポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列に作動的にフレーム内で結合させるこ
とができる。別法として、IL3−ＸまたはＸ−IL3融合物
を、細胞内発現および当技術で既知の方法によって分
離、混合、折りたたまれたタンパク質のために構築する
ことができる。次に、細菌宿主細胞内のルートを通って
発現された融合タンパク質を、全て既知の方法によっ
て、採取し、精製するおよび／または物理化学的、生化
学的および／または臨床的パラメーターについて確認す
ることができる。
類の調節配列を削除し、細菌細胞によるこの発明の融合
タンパク質の細胞内または細胞外の発現のための細菌ベ
クターをつくる細菌調節配列を挿入することによって、
IL3−ＸおよびＸ−IL3タンパク質をコードする配列を操
作することができる。融合タンパク質をコードするDNA
を、当技術で既知である細菌の発現を最適化する様々な
コドンを含むように、さらに修飾することができる。融
合タンパク質をコードする配列を、当技術で既知の方法
によって融合タンパク質の細菌発現、分泌およびプロセ
シングをさせる分泌リーダーポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列に作動的にフレーム内で結合させるこ
とができる。別法として、IL3−ＸまたはＸ−IL3融合物
を、細胞内発現および当技術で既知の方法によって分
離、混合、折りたたまれたタンパク質のために構築する
ことができる。次に、細菌宿主細胞内のルートを通って
発現された融合タンパク質を、全て既知の方法によっ
て、採取し、精製するおよび／または物理化学的、生化
学的および／または臨床的パラメーターについて確認す
ることができる。
b.ほ乳類細胞発現 融合タンパク質の発現を得るために、ほ乳類の細胞、
pXM、およびY.C.ヤンら、セル、47巻、３−10頁（1986
年）に記載されている一般的方法を使用し得る。また、
この発明の実施に有用なベクター構築技術およびベクタ
ー成分の記述については、カウフマン、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・オブ・USA、82巻、689−693頁（1985年）、カウフマ
ンら、ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジ
ー、159巻、511−521頁（1982年）、およびカウフマ
ン、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス、USA、82巻、689−693頁（1985
年）参照。
pXM、およびY.C.ヤンら、セル、47巻、３−10頁（1986
年）に記載されている一般的方法を使用し得る。また、
この発明の実施に有用なベクター構築技術およびベクタ
ー成分の記述については、カウフマン、プロシーディン
グ・オブ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス
・オブ・USA、82巻、689−693頁（1985年）、カウフマ
ンら、ジャーナル・オブ・モルキュラー・バイオロジ
ー、159巻、511−521頁（1982年）、およびカウフマ
ン、プロシーディング・オブ・ナショナル・アカデミー
・オブ・サイエンス、USA、82巻、689−693頁（1985
年）参照。
当技術の熟練者はまた、例えば、各プラスミドの融合
タンパク質のDNA配列に適当な酵素を挿入したり、既知
の組み換え遺伝子工学技術や他の既知のベクターを用い
ることによって、pXMベクターに匹敵する他のほ乳類の
発現ベクターを構築することもできる。
タンパク質のDNA配列に適当な酵素を挿入したり、既知
の組み換え遺伝子工学技術や他の既知のベクターを用い
ることによって、pXMベクターに匹敵する他のほ乳類の
発現ベクターを構築することもできる。
ベクターDNAの安定な一体化、および一体化されたベ
クターDNAのそれに続く増幅のために、常法を使ってCHO
細胞を用いることができる。IL3−ＸまたはＸ−IL3をも
つこれらのベクターの適当な宿主細胞への形質転換は融
合タンパク質の発現をもたらし得る。生成細胞系は適当
な薬剤選択によって増殖され得、生成細胞系は再クロー
ンされ、発現の水準をIL3−Ｘ融合タンパク質の成分の
適当な検定法を使って評価し得る。この方法は、Ｘが望
ましくグリコシル化された、例えばエリスロポエチンの
とき、特に有用である。
クターDNAのそれに続く増幅のために、常法を使ってCHO
細胞を用いることができる。IL3−ＸまたはＸ−IL3をも
つこれらのベクターの適当な宿主細胞への形質転換は融
合タンパク質の発現をもたらし得る。生成細胞系は適当
な薬剤選択によって増殖され得、生成細胞系は再クロー
ンされ、発現の水準をIL3−Ｘ融合タンパク質の成分の
適当な検定法を使って評価し得る。この方法は、Ｘが望
ましくグリコシル化された、例えばエリスロポエチンの
とき、特に有用である。
c.昆虫またはイースト菌細胞発現 同様の操作を、昆虫細胞中のこれらの融合タンパク質
の発現のための昆虫ベクターの構築のために行い得る
［例えば、1985年９月25日公開の欧州特許第155476号記
載の方法を参照。］ 同様に、イースト菌ベクターを、イースト細胞内で融
合タンパク質を発現して細胞内で発現されたまたは分泌
された細胞外の活性融合タンパク質を生み出すイースト
菌調節配列を使用して構築する。［例えば、1986年１月
30日公開のPCT公開WO86/00639号、1984年10月31日公開
の欧州特許EP123289号などを参照。］菌類のベクターも
また、これらの融合分子の発現に使用し得る。
の発現のための昆虫ベクターの構築のために行い得る
［例えば、1985年９月25日公開の欧州特許第155476号記
載の方法を参照。］ 同様に、イースト菌ベクターを、イースト細胞内で融
合タンパク質を発現して細胞内で発現されたまたは分泌
された細胞外の活性融合タンパク質を生み出すイースト
菌調節配列を使用して構築する。［例えば、1986年１月
30日公開のPCT公開WO86/00639号、1984年10月31日公開
の欧州特許EP123289号などを参照。］菌類のベクターも
また、これらの融合分子の発現に使用し得る。
実施例９−IL3−Ｘの生物学的活性 記載された全ての増殖検定において、基本的な構成は
下記の通りである。
下記の通りである。
検体および標準溶液を、Ｕ字底微量滴定皿中の検定培
地中に、100μl/ウエルの最終容量で希釈する。ほとん
どの場合５倍の連続希釈が適当である。標的細胞を活発
に成長している培養物から収穫し、遠心分離し、洗浄
し、各検定用に最適化された濃度で検定培地中に再懸濁
する。即ち、100μｌの細胞懸濁液を、最終容量200μl/
ウエルになるよう各ウエルに添加する。プレートを37℃
で完全に湿ったインキュベーター中にインキュベート
し、下記の各検定中に記載されている0.5uCi［3H］−チ
ミジン／ウエルでパルスする。増殖を、［3H］−チミジ
ンの細胞への挿入によって測定する。生物活性を、IL3/
X融合1mlにつき１単位の最終濃度が、検定中の［3H］−
チミジンの50％の組み込みになる半最大希釈単位で測定
する。
地中に、100μl/ウエルの最終容量で希釈する。ほとん
どの場合５倍の連続希釈が適当である。標的細胞を活発
に成長している培養物から収穫し、遠心分離し、洗浄
し、各検定用に最適化された濃度で検定培地中に再懸濁
する。即ち、100μｌの細胞懸濁液を、最終容量200μl/
ウエルになるよう各ウエルに添加する。プレートを37℃
で完全に湿ったインキュベーター中にインキュベート
し、下記の各検定中に記載されている0.5uCi［3H］−チ
ミジン／ウエルでパルスする。増殖を、［3H］−チミジ
ンの細胞への挿入によって測定する。生物活性を、IL3/
X融合1mlにつき１単位の最終濃度が、検定中の［3H］−
チミジンの50％の組み込みになる半最大希釈単位で測定
する。
a.CML検定 白血病芽細胞の増殖を刺激するCML検定を、ブラッ
ド、63巻（４）、904−111頁（1984年）記載の方法に本
質的に従って行なった。細胞のストックを安定期のCML
患者の末梢血の凍結バッグから得た。バッグを溶かし、
500アリコートの1.7×107細胞／バイアルとして再凍結
した。検定を始める１日前に、１バイアルの細胞を溶か
し、細胞を10mlのRPMI＋５％加熱不活性ヒトAB血清（Hi
HAB）で洗浄する。細胞を10mlの同培地に再懸濁し、一
晩にわたって37℃で５％のCO2中でインキュベートす
る。次の日、細胞を培養物から除去し、フィコル処理
し、洗浄し、検定培地中に再懸濁する。
ド、63巻（４）、904−111頁（1984年）記載の方法に本
質的に従って行なった。細胞のストックを安定期のCML
患者の末梢血の凍結バッグから得た。バッグを溶かし、
500アリコートの1.7×107細胞／バイアルとして再凍結
した。検定を始める１日前に、１バイアルの細胞を溶か
し、細胞を10mlのRPMI＋５％加熱不活性ヒトAB血清（Hi
HAB）で洗浄する。細胞を10mlの同培地に再懸濁し、一
晩にわたって37℃で５％のCO2中でインキュベートす
る。次の日、細胞を培養物から除去し、フィコル処理
し、洗浄し、検定培地中に再懸濁する。
検定を、RPMI＋10％加熱不活性胎児ウシ血清（HiFC
S）、2mMグルタミン（GLM）およびP/S（100U/mlペニシ
リン、100ug/mlストレプトマイシン）中で行なう。細胞
の播種密度は、２×104細胞／ウエルである。プレート
を48時間５％のCO2の中でインキュベートし、検定の最
後の６時間［3H］−チミジンでパルスする。CML細胞はh
GMCSFとhIL3の両方に反応する。従って、実施例２の融
合タンパク質中の各サイトカインの活性を別々に定量す
るためには、hGMCSFまたはhIL3に対する抗体を中和する
ことを含むことが必要である。
S）、2mMグルタミン（GLM）およびP/S（100U/mlペニシ
リン、100ug/mlストレプトマイシン）中で行なう。細胞
の播種密度は、２×104細胞／ウエルである。プレート
を48時間５％のCO2の中でインキュベートし、検定の最
後の６時間［3H］−チミジンでパルスする。CML細胞はh
GMCSFとhIL3の両方に反応する。従って、実施例２の融
合タンパク質中の各サイトカインの活性を別々に定量す
るためには、hGMCSFまたはhIL3に対する抗体を中和する
ことを含むことが必要である。
b.MO7E 検定 M07E細胞系を、急性血小板再生白血病の幼児の末梢血
から誘導した。M07E細胞の成長は、ヒトGMCSF、ヒトIL3
またはヒトIL4の存在による。
から誘導した。M07E細胞の成長は、ヒトGMCSF、ヒトIL3
またはヒトIL4の存在による。
M07E細胞を、１ミリリットル当り８単位の組み換えヒ
トIL−３を補われた、DMEプラス10％加熱不活性FCS、グ
ルタミンおよびP/S中に置く。検定を、ヒトIL−３を添
加しない同じ培地中で行なう。細胞の播種密度は、１ウ
エル当り104細胞である。プレートを３日間10％CO2中で
インキュベートし、最後の４時間を［3H］−チミジンで
パルスする。
トIL−３を補われた、DMEプラス10％加熱不活性FCS、グ
ルタミンおよびP/S中に置く。検定を、ヒトIL−３を添
加しない同じ培地中で行なう。細胞の播種密度は、１ウ
エル当り104細胞である。プレートを３日間10％CO2中で
インキュベートし、最後の４時間を［3H］−チミジンで
パルスする。
CML検定に記載されているように、M07E細胞は、中和
抗体の使用を必要とするhGMCSFおよびhIL3の両方に対応
する。
抗体の使用を必要とするhGMCSFおよびhIL3の両方に対応
する。
［3H］−チミジンの挿入に基づいて、全てのIL−3/X
融合例のIL3−含有融合タンパク質は、このCML検定中の
白血病幼若細胞の増殖を刺激することにおいて活性であ
る。
融合例のIL3−含有融合タンパク質は、このCML検定中の
白血病幼若細胞の増殖を刺激することにおいて活性であ
る。
c.TF−１検定 TF−１細胞系を赤白血病の患者の骨髄から誘導した
［T.キタムラ、東京大学］。細胞を、1mlにつき100単位
の組換えヒトGMCSFを補ったPRMIプラス10％加熱−不活
性FCS、グルタミンおよびP/S中で成育する。検定を、hG
MCSFを添加しない同じ培地中で行なう。細胞の播種密度
は、１ウエルにつき7.5×103細胞である。プレートを５
％CO2中で３日間インキュベートし、最後の４時間を3H
−チミジンでパルスする。CML検定中に記載されている
ように、TF−１細胞は、中和抗体の使用を要するhGMCSF
およびhIL3の両方に対応する。
［T.キタムラ、東京大学］。細胞を、1mlにつき100単位
の組換えヒトGMCSFを補ったPRMIプラス10％加熱−不活
性FCS、グルタミンおよびP/S中で成育する。検定を、hG
MCSFを添加しない同じ培地中で行なう。細胞の播種密度
は、１ウエルにつき7.5×103細胞である。プレートを５
％CO2中で３日間インキュベートし、最後の４時間を3H
−チミジンでパルスする。CML検定中に記載されている
ように、TF−１細胞は、中和抗体の使用を要するhGMCSF
およびhIL3の両方に対応する。
チミジン捕集法に基づいて、IL3/X融合タンパク質
は、これらの赤白血病細胞の増殖を刺激することにおい
てこの検定中で活性である。
は、これらの赤白血病細胞の増殖を刺激することにおい
てこの検定中で活性である。
d.32D 増殖検定 32Dは、10％加熱不活性FCS、グルタミン、および20％
WeHi3B条件培血をネズミIL3の源としてもつP/Sを含むRP
MI中で生育したネズミIL3−依存細胞系である。これら
の細胞はGCSFの存在下で増殖する。
WeHi3B条件培血をネズミIL3の源としてもつP/Sを含むRP
MI中で生育したネズミIL3−依存細胞系である。これら
の細胞はGCSFの存在下で増殖する。
検定を、５％加熱不活性FCS、グルタミンおよびP/Sを
含むRPMI中で行なう。播種密度は、１ウエル当り２×10
4細胞である。プレートを５％CO2中で24時間インキュベ
ートし、最後の４時間を［3H］−チミジンでパルスす
る。
含むRPMI中で行なう。播種密度は、１ウエル当り２×10
4細胞である。プレートを５％CO2中で24時間インキュベ
ートし、最後の４時間を［3H］−チミジンでパルスす
る。
e.DA2 増殖検定 DA2は、ネズミIL−３中で同じようによく生育するLIF
依存ネズミ細胞系である。細胞を、５％加熱−不活性FC
S、グルタミン、P/Sおよび500単位/ml組み換えヒトLIF
を含むRPMI中で維持する。
依存ネズミ細胞系である。細胞を、５％加熱−不活性FC
S、グルタミン、P/Sおよび500単位/ml組み換えヒトLIF
を含むRPMI中で維持する。
DA−２検定を、32D検定と同じ培地中で行なう。細胞
の播種密度は１ウエルにつき7.5×103細胞である。プレ
ートを３日間インキュベートし、最後の４時間［3H］−
チミジンでパルスする。
の播種密度は１ウエルにつき7.5×103細胞である。プレ
ートを３日間インキュベートし、最後の４時間［3H］−
チミジンでパルスする。
f.T10増殖検定 この検定は、1991年５月30日に公開されたPCT公開WO9
1/07495中に詳細に記載されている。
1/07495中に詳細に記載されている。
T10細胞は、IL−11中での生育のために選択されたIL
−６依存ネズミ形質細胞細胞系T1165の副集団である
［R.P.ノーダンら、サイエンス、233巻、566頁（1986
年）、およびナショナル・インスティチュート・オブ・
ヘルス、ノーダン博士から入手。］。T10細胞系は、IL6
またはIL11によく反応するが、IL11に対する反応は、も
とのT1165細胞系のそれよりずっと大きい。細胞を10％
加熱不活性FCS、グルタミン、P/S、５×10-5Mベータメ
ルカプトエタノール（シグマ・ケミカル・カンパニー、
セントルイス、ミズーリ）を含むRPMI中で維持し、20U/
mlのrhuIL11で補う。検定をIL11なしの同じ培地中で行
なう。播種密度は１ウエル当り7.5×103細胞である。プ
レートを３日間インキュベートし、最後の３時間［3H］
−チミジンでパルスする。
−６依存ネズミ形質細胞細胞系T1165の副集団である
［R.P.ノーダンら、サイエンス、233巻、566頁（1986
年）、およびナショナル・インスティチュート・オブ・
ヘルス、ノーダン博士から入手。］。T10細胞系は、IL6
またはIL11によく反応するが、IL11に対する反応は、も
とのT1165細胞系のそれよりずっと大きい。細胞を10％
加熱不活性FCS、グルタミン、P/S、５×10-5Mベータメ
ルカプトエタノール（シグマ・ケミカル・カンパニー、
セントルイス、ミズーリ）を含むRPMI中で維持し、20U/
mlのrhuIL11で補う。検定をIL11なしの同じ培地中で行
なう。播種密度は１ウエル当り7.5×103細胞である。プ
レートを３日間インキュベートし、最後の３時間［3H］
−チミジンでパルスする。
実施例５に記載されたpALIL311−781の形質転換から
の大腸菌細胞上澄みを前記に従って活性を検定した。IL
3−IL11融合タンパク質はこの検定でIL11活性を顕し
た。
の大腸菌細胞上澄みを前記に従って活性を検定した。IL
3−IL11融合タンパク質はこの検定でIL11活性を顕し
た。
g.ヒト血漿凝塊meg−CSF検定 この発明の融合分子IL3−IL11はまた、修飾に関する
E.マズールら、ブラッド、57巻、277−286頁（1981年）
中に記載されている血漿凝塊meg−CSF検定中でヒト血小
板生成細胞コロニー形成活性を試験された。非付着末梢
血細胞をロイコパクスから分離し、分けて凍結した。試
験検体を、血小板欠乏ヒトAB血漿および24ウエルのプレ
ート中の1.25×105細胞と混合し、カルシウムの添加に
よって凝結させた。12日間のインキュベーションの後、
血小板生成細胞を、血小板糖タンパク質II b/III aに対
して指示されたモノクローナル抗体および西洋わさびペ
ルオキシダーゼ／抗ペルオキシダーゼ色素原検索システ
ムを使って同定した。組み換えヒトIL−３［ジェネティ
クス・インスティチュート社］を、陽性対照として使用
し、これは約60％が純粋で40％が混合の血小板生成コロ
ニーで１凝塊につき12−30血小板形成コロニーを製造し
た。形成不全イヌ血清もまた、陽性対照として使用し、
それは１凝塊につき５−10の血小板生成細胞コロニーを
生成し、そのうち約50％は10以下の細胞を含む純粋な血
小板生成細胞コロニーであり、50％は40以上の血小板生
成細胞を含む混合血小板生成細胞コロニーであった。陰
性対照はアルファ培地であり、１凝塊につき０−１の血
小板生成細胞コロニーを生成した。
E.マズールら、ブラッド、57巻、277−286頁（1981年）
中に記載されている血漿凝塊meg−CSF検定中でヒト血小
板生成細胞コロニー形成活性を試験された。非付着末梢
血細胞をロイコパクスから分離し、分けて凍結した。試
験検体を、血小板欠乏ヒトAB血漿および24ウエルのプレ
ート中の1.25×105細胞と混合し、カルシウムの添加に
よって凝結させた。12日間のインキュベーションの後、
血小板生成細胞を、血小板糖タンパク質II b/III aに対
して指示されたモノクローナル抗体および西洋わさびペ
ルオキシダーゼ／抗ペルオキシダーゼ色素原検索システ
ムを使って同定した。組み換えヒトIL−３［ジェネティ
クス・インスティチュート社］を、陽性対照として使用
し、これは約60％が純粋で40％が混合の血小板生成コロ
ニーで１凝塊につき12−30血小板形成コロニーを製造し
た。形成不全イヌ血清もまた、陽性対照として使用し、
それは１凝塊につき５−10の血小板生成細胞コロニーを
生成し、そのうち約50％は10以下の細胞を含む純粋な血
小板生成細胞コロニーであり、50％は40以上の血小板生
成細胞を含む混合血小板生成細胞コロニーであった。陰
性対照はアルファ培地であり、１凝塊につき０−１の血
小板生成細胞コロニーを生成した。
IL3−IL11融合タンパク質をIL3タンパク質およびIL11
タンパク質の最適濃度と比較した。２シリーズの実験を
行なった。第一のシリーズにおいては、IL11の濃度を10
U/mlのそれの最適濃度で一定に保ち、IL3濃度を0.2から
200U/mlまで変化させた。第二のシリーズにおいては、I
L3の濃度を1U/mlのそれの最適濃度で一定に保ち、IL11
濃度を0.2から200U/mlまで変化させた。最適濃度を、0.
2から200U/mlの濃度でIL3のみおよびIL11のみの検定を
実行することによって測定した。つぎに、生成されるme
gコロニー／凝塊の数が最も多くなる濃度を比較実験の
最適濃度として選択した。
タンパク質の最適濃度と比較した。２シリーズの実験を
行なった。第一のシリーズにおいては、IL11の濃度を10
U/mlのそれの最適濃度で一定に保ち、IL3濃度を0.2から
200U/mlまで変化させた。第二のシリーズにおいては、I
L3の濃度を1U/mlのそれの最適濃度で一定に保ち、IL11
濃度を0.2から200U/mlまで変化させた。最適濃度を、0.
2から200U/mlの濃度でIL3のみおよびIL11のみの検定を
実行することによって測定した。つぎに、生成されるme
gコロニー／凝塊の数が最も多くなる濃度を比較実験の
最適濃度として選択した。
結果は下記の通りである。
前記の結果を、IL3−IL11融合タンパク質の濃度を５
単位のIL11から１単位のIL3の割合で変化させて得た下
記の結果と比較した。この率を、T10およびM07E細胞増
殖検定で測定されたような、２つの融合パートナーの相
対的特異的活性をまねて測定した。
単位のIL11から１単位のIL3の割合で変化させて得た下
記の結果と比較した。この率を、T10およびM07E細胞増
殖検定で測定されたような、２つの融合パートナーの相
対的特異的活性をまねて測定した。
[IL3−IL11融合タンパク質]U/ml Megコロニー／凝塊 0.2/1.0 14 1.0/5.0 26 5.0/25 20 25.0/125 15 125/625 26 これからわかるように、IL3−IL11融合タンパク質は
少なくとも、血小板生成細胞コロニー形成を刺激するこ
とにおいて一緒に加えられたIL3およびIL11の最適濃度
と同じぐらい活性である。
少なくとも、血小板生成細胞コロニー形成を刺激するこ
とにおいて一緒に加えられたIL3およびIL11の最適濃度
と同じぐらい活性である。
この発明の実施における多くの修正および変形が、当
技術の熟練者に起ることは予期される。
技術の熟練者に起ることは予期される。
この発明によって下記の各事項が可能となる。
（１）式IL3−ＸまたはＸ−IL3〔式中、Ｘは、IL3に融
合され、IL3、IL6、IL7、IL9、IL11、エリスロポエチン
およびGCSFから成る群から選択されたリンフォカインで
ある〕で示される、他のタンパク質性の物質を実質的に
随伴しない融合タンパク質。
合され、IL3、IL6、IL7、IL9、IL11、エリスロポエチン
およびGCSFから成る群から選択されたリンフォカインで
ある〕で示される、他のタンパク質性の物質を実質的に
随伴しない融合タンパク質。
（２）前記リンフォカインがIL11である１記載のタンパ
ク質。
ク質。
（３）前記リンフォカインがIL3である１記載のタンパ
ク質。
ク質。
（４）前記リンフォカインがエリスロポエチンである１
記載のタンパク質。
記載のタンパク質。
（５）前記リンフォカインがGCSFである１記載のタンパ
ク質。
ク質。
（６）前記リンフォカインがIL9である１記載のタンパ
ク質。
ク質。
（７）前記リンフォカインがIL6である１記載のタンパ
ク質。
ク質。
（８）Ｘがペプチドリンカー配列を通してIL3に融合さ
れている１−６記載のタンパク質。
れている１−６記載のタンパク質。
（９）１記載の融合タンパク質をコードするDNA配列。
（10）宿主細胞中で９のDNA配列の発現を指示すること
ができる発現調節配列と作動可能に結合した、９記載の
DNA配列を含むプラスミドベクター。
ができる発現調節配列と作動可能に結合した、９記載の
DNA配列を含むプラスミドベクター。
（11）10記載のプラスミドベクターにより形質転換され
た適当な宿主細胞。
た適当な宿主細胞。
（12）（１）タンパク質の発現をさせる条件下で培養培
地中の11記載の適当な宿主細胞を培養し、（２）培養培
地から融合タンパク質を採取することを含む、融合タン
パク質IL3−ＸまたはＸ−IL3の製造方法。
地中の11記載の適当な宿主細胞を培養し、（２）培養培
地から融合タンパク質を採取することを含む、融合タン
パク質IL3−ＸまたはＸ−IL3の製造方法。
（13）12の方法により製造されたタンパク質。
（14）医薬的に許容され得る媒体中に治療上有効な量の
１−８記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
１−８記載の融合タンパク質を含む医薬組成物。
（15）白血病の処置のための医薬組成物の製造における
14記載の組成物の使用。
14記載の組成物の使用。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 (56)参考文献 特開 昭62−282593（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−241890（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−267278（ＪＰ，Ａ) 国際公開90／1039（ＷＯ，Ａ１) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 A C07K 14/54 C12N 1/21 C12P 21/02 ZNA A61K 37/02 ADV
Claims (6)
- 【請求項１】他のタンパク質性物質を実質的に随伴しな
い、IL−３とIL−11から成る融合タンパク質；ただし、
IL−11は次ぎのいずれかのタンパク質を意味する： （ａ）次ぎの塩基配列を有するDNAでコードされている
アミノ酸配列を有するタンパク質： （ｂ）上記（ａ）に記載のDNAとストリンジェントな条
件下にハイブリダイズすることができるDNAでコードさ
れているアミノ酸配列を有するタンパク質であって、実
質的に（ａ）に記載のタンパク質と同様の生理活性を有
するタンパク質。 - 【請求項２】請求項１記載の融合タンパク質をコードす
るDNA。 - 【請求項３】宿主細胞中で請求項２記載のDNAの発現を
指示することができる発現調節配列と作動可能に結合し
た、請求項２記載のDNAを含むプラスミドベクター。 - 【請求項４】請求項３記載のプラスミドベクターにより
形質転換された宿主細胞。 - 【請求項５】タンパク質を発現させる条件下、培養培地
中で請求項４記載の宿主を培養し、培養物から融合タン
パク質を採取することを特徴とする、IL−３とIL−11か
ら成る融合タンパク質の製造方法。 - 【請求項６】請求項５の方法により製造された、IL−３
とIL−11から成る融合タンパク質。
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