JP3130338B2 - ポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、Ｃ型肝炎ウイルス（Ｈ
ＣＶ）ゲノムによってコードされた抗原蛋白のうち、塩
基性アミノ酸に富み、高度に保存されたアミノ酸配列を
含む新規な抗原蛋白を組換えＤＮＡ技術を用いて原核細
胞あるいは真核細胞においてインクルージョン・ボディ
ーとして発現させることによって、安定にかつ大量に製
造する技術に関する。

【０００２】

【従来の技術】非Ａ非Ｂ（ＮＡＮＢ）型慢性肝炎のチン
パンジーのプラズマより調製されたＲＮＡからｃＤＮＡ
ライブラリーが作製された。このライブラリーからＮＡ
ＮＢ型肝炎患者の回復期血清と反応する陽性クローン
（５−１−１）が分離され、ジーン・ウオーキングによ
って最終的に約１０ｋｂから成るＨＣＶ遺伝子の大部分
（7310 bp)が解明された（WO 89/04669；特開平2-50088
0)。続いて、このＨＣＶの抗原Ｃ１００−３(363アミノ
酸残基）とヒト・スーパーオキシド・ディスムターゼ
（154アミノ酸残基）とから成る融合蛋白が酵母で生産
され、この抗原を用いる抗ＨＣＶ抗体の測定系が開発さ
れた［Q. L. Chooら、サイエンス(Science)，244, 359
(1989); G. Kuoら、Science, 244, 362（1989)］。この
方法で測定されるＨＣＶ抗体は、従来の基準でＮＡＮＢ
型肝炎と考えられていた症例のなかに多数見出され、米
国では輸血後ＮＡＮＢ型肝炎の７１％、散発性ＮＡＮＢ
型肝炎の５８％に検出された。また、輸血後ＮＡＮＢ型
の慢性肝炎では、イタリアで８４％、日本で７８％に抗
ＨＣＶ抗体が検出された〔G. Kuo ら、Science，244, 3
62(1989)］。スペインでは輸血後ＮＡＮＢ型肝炎の８５
％に抗ＨＣＶ抗体が検出された。また、薬物常用者では
７０％に抗ＨＣＶ抗体が検出され、ＨＣＶが注射器や針
を介して感染する危険性の高いことが示唆された[J. I.
Estebanら、ランセット (Lancet) ii, 294 (1989)］。
Y. Kuboら［ニュークレイック・アシッズ・リサーチ（N
ucl.Acids Res.）, 17, 10367 (1989)］は、輸血後ＮＡ
ＮＢ型肝炎を発症した日本人供血者プラズマからＲＮＡ
を分離し、ＨＣＶ ｃＤＮＡを作製し、ＨＣＶの非構造
蛋白質領域３（ＮＳ３）に特異的なオリゴヌクレオチド
・プライマーを用いるポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション（ＰＣＲ）によりｃＤＮＡを増幅させた。このｃ
ＤＮＡ（Ｊ１と命名、５８３ヌクレオチド）は、上述の
チンパンジー由来のプロトタイプのＨＣＶｃＤＮＡと比
較して、ヌクレオチド・レベルで７９．８％、アミノ酸
レベルで９２．２％の相同性を示した。この結果は、Ｈ
ＣＶにサブタイプの存在することを示唆した。H. Okamo
toら［ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メディシン（Jpn. J. Exp. Med.), 60, 167 (1
990)］は、抗ＨＣＶ抗体陽性のヒト・プラズマおよび抗
ＨＣＶ抗体陰性でＮＡＮＢ型肝炎感染性の証明されたチ
ンパンジー・プラズマからそれぞれＲＮＡを抽出し、こ
れをもとにして作製したｃＤＮＡライブラリーからＨＣ
Ｖゲノムをクローニングし、２種類のサブタイプ（それ
ぞれＨＣ−Ｊ１とＨＣ−Ｊ４と命名）の５’末端側配列
を報告した。この配列の上流域には、高度に保存された
アミノ酸配列が存在し、またアルギニンのような塩基性
アミノ酸の含量が多いことが見出された。これらの結果
から、この配列には、ウイルスのカプシド蛋白がコード
されていると推定された。また、Okamotoらの報告した
配列の１６７４ヌクレオチドの下流にWO89/04669で公開
された塩基配列の続くことが明らかにされた。

【０００３】

【発明が解決すべき課題】上述のようにＨＣＶのゲノム
の全域が解明されたが、ＨＣＶにはサブタイプの存在す
ることも証明された。特に、ＮＡＮＢ型肝炎の感染性を
示すが、従来のＣ１００−３抗原を用いる抗ＨＣＶ抗体
測定系では陰性であった検体からＨＣＶのサブタイプが
検出されたことは、従来のＨＣＶ診断法に新たな問題を
提起した。従って、Ｃ１００−３抗原以外の抗原を用い
る別種の抗ＨＣＶ抗体測定系の作製が望まれている。特
に、サブタイプ間でアミノ酸配列の保存された５’末端
側のコード領域を利用する抗体測定系の開発が注目され
ている。しかしながら、この領域(たとえばＭｅｔ¹〜Ｇ
ｌｙ¹²⁰)では塩基性アミノ酸含量が２３％と異常に高い
ため、遺伝子工学的に生産する場合には産物が宿主のプ
ロテアーゼによって分解を受けやすい傾向が予想され
る。従って、このような産物を安定に、しかも大量に製
造する方法が望まれている。

【０００４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗ＨＣＶ
抗体陽性患者のプラズマからｃＤＮＡライブラリーを作
製し、これからＨＣＶゲノムの５’末端配列を新たにク
ローニングし、従来のものとは一致しない新規なクロー
ンを分離した。このクローンを用いて推定のカプシド蛋
白にある高度保存領域を遺伝子工学的に大量かつ安定に
生産することを目標に研究を進めた結果、該領域はＴ７
ファージの遺伝子１０産物あるいはヒト・インターロイ
キン２との融合蛋白として生産することにより所期の目
的を達成できることが分かり、本発明を完成した。すな
わち、本発明は、（１）抗ＨＣＶ抗体陽性患者のプラズ
マからのＲＮＡの抽出と、これを用いたリバース・トラ
ンスクリプターゼによるｃＤＮＡの合成、（２）既報の
ＨＣＶゲノムの配列［H. Okamotoら、Jpn. J. Exp. Me
d., 60, 167(1990)］をもとにしたプライマーの合成
と、このプライマーを用いたＰＣＲによるカプシド蛋白
コード領域の増幅、（３）増幅されたＤＮＡのベクター
へのサブクローニング、（４）サブクローニングされた
ＤＮＡの中から新規なカプシド蛋白コード領域の同定、
（５）該新規コード配列とＴ７ファージ遺伝子１０ある
いはヒト・インターロイキン２遺伝子との融合遺伝子を
含有する組換えＤＮＡの作製、（６）上記（５）記載の
組換えＤＮＡを保持する形質転換体の分離、（７）上記
（６）記載の形質転換体を培養し、培養物中に新規なカ
プシド蛋白とＴ７ファージ遺伝子１０産物あるいはヒト
・インターロイキン２とから成る融合蛋白を生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする該融合蛋白の製
造法を包含するものである。本発明は、（１）ＨＣＶゲ
ノムの新規なカプシド蛋白における、新規なアミノ酸配
列：Cys-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Thr-Thr-Ar
g-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Cys-Gly-Arg（配
列番号：１）を含有するポリペプチド（I)（当該アミノ
酸配列は、Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (1990）の記載
から、下記２のポリペプチド（II）において親水性に富
み、エピトープを形成する部位であると推定され、該配
列を含有するポリペプチド（I）は化学合成することも
できる。）、（２）上記１のポリペプチド（I）の前駆
体に相当する、新規なアミノ酸配列：Ser-Thr-Ile-Pro-
Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Ar
g-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-
Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Cys-Arg-Gly-Pro-Ar
g-Leu-Gly-Val-Arg-Thr-Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-
Ser-Gln-Pro-Cys-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Al
a-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Ala-Trp-Ala-Gln-Pro-Gly
（配列番号:２）を含有するポリペプチド（II)、（３）
ＨＣＶゲノムの新規なカプシド蛋白における、新規なア
ミノ酸配列：Ser-Thr-Ile-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Th
r-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-
Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Le
u-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-
Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Tr
p-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-
Arg-Ala-Trp-Ala-Gln-Pro-Gly（配列番号：３）を含有
するポリペプチド（III）、（４）ポリペプチド（I）と
Ｔ７ファージ遺伝子１０産物もしくはヒト・インターロ
イキン２とから成る融合蛋白質（IVもしくはV)、（５）
ポリペプチド（II)とＴ７ファージ遺伝子１０産物もし
くはヒト・インターロイキン２とから成る融合蛋白質
（VIもしくはVII)、（６）ポリペプチド（III）とＴ７
ファージ遺伝子１０産物もしくはヒト・インターロイキ
ン２とから成る融合蛋白質（VIIIもしくはIX)、（７）
ポリペプチド（I、IIもしくはIII）をコードする塩基配
列を含有する組換えＤＮＡ（Ａ、ＢもしくはＣ)、
（８）ポリペプチド（IV、V、VI、VII、VIIIもしくはX
I）をコードする塩基配列を含有する組換えＤＮＡ
（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、ＨもしくはＩ)、（９）組換えＤＮ
Ａ（Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、(Ｄ)、（Ｅ)、(Ｆ)、(Ｇ)、
(Ｈ)、もしくは（Ｉ）を含有するベクターで形質転換さ
れた形質転換体、および（１０）上記（９）を培地に培
養し、培養物中にポリペプチド（I)、(II）もしくは（I
II)、または融合蛋白（IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VII
I）もしくは（IX）を生成蓄積せしめ、これを採取する
ことを特徴とする該ポリペプチドあるいは該融合蛋白質
の製造法である。上記ポリペプチド（I）をコードする
塩基配列を含有する組換えＤＮＡとしては、たとえば塩
基配列：5'-TGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCACGACTAGGAAG
ACTTCCGAGCGGTCGCAACCTTGTGGAAGG-3'（配列番号：４）
などが挙げられる。上記ポリペプチド（II）をコードす
る塩基配列を含有する組換えＤＮＡとしては、たとえば
塩基配列：5'-AGCACGATTCCCAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTA
ACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAAGTTCCCGGGCGGTGGTCAGATC
GTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGTGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCG
CACGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTTGTGGAAGGCGACAAC
CTATCCCCAAGGCTCGCCGACCCGAGGGCAGGGCCTGGGCTCAGCCCGGG
-3'（配列番号：５）などが挙げられる。上記ポリペプ
チド（III）をコードする塩基配列を含有する組換えＤ
ＮＡとしては、たとえば塩基配列：5'-AGCACGATTCCCAAA
CCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAA
GTTCCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCA
GGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCG
CAACCTCGTGGATGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGACCCGAGGG
CAGGGCCTGGGCTCAGCCCGGG-3'（配列番号：６）などが挙
げられる。上記Ｔ７ファージ遺伝子１０の塩基配列は、
ファージ本来の配列でもよく、またインクルージョン・
ボディーを形成するＴ７ファージ遺伝子１０産物の性質
を変えないように変化したものであれば何でも良い。Ｉ
Ｌ−２遺伝子としては、その産物がインクルージョン・
ボディーを形成できるものであれば何でもよく、たとえ
ばヒトＩＬ−２遺伝子［特開昭61-78799号公報］やその
変異型遺伝子、たとえば成熟型ヒトＩＬ−２の１２５位
のシステイン残基がセリン残基に置換されたもの［特開
昭59-93093号公報］、該ＩＬ−２のアミノ末端のトラン
ケート型変異体［特開昭60-126088号公報］、該ＩＬ−
２のカルボキシル末端のトランケート型変異体、該ＩＬ
−２のアミノ末端あるいはカルボキシル末端のアミノ酸
の一部が欠損しているか、あるいは他のアミノ酸に置換
された変異体、該ＩＬ−２のアミノ末端あるいはカルボ
キシル末端にアミノ酸残基あるいはペプチドの付加され
た変異体などの遺伝子が挙げられる。

【０００５】本発明で得られた新規なＨＣＶポリペプチ
ドをコードするＲＮＡは、ＮＡＮＢ型肝炎患者のプラズ
マあるいは肝臓から得ることができる。これらの材料か
らＲＮＡを調製する方法としては、グアニジン・チオシ
アネート法［J. M. Chirgwinら、バイオケミストリー
（Biochemistry), 18, 5294 (1979)］などが挙げられ
る。このようにして得られたＲＮＡに既報［WO 89/0466
9］のＨＣＶゲノムの５'末端領域に基づいて合成された
アンチセンス・プライマー（Ａ）を添加した後、リバー
ス・トランスクリプターゼを加えてｃＤＮＡを合成する
ことができる。このｃＤＮＡ標品に既報［H. Okamoto
ら、Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (1990)］のＨＣ−Ｊ
１の５’側末端コード領域に相当するセンス・プライマ
ー（Ｂ）とアンチセンス・プライマー（Ｃ）を添加し、
製造業者（たとえば、Cetus/Perkin-Elmer) のキットの
指示書に従ってＰＣＲを行うことができる。増幅された
ｃＤＮＡを自体公知の方法、たとえばアガロース電気泳
動で分離した後、ゲルから回収することができる。この
ｃＤＮＡの塩基配列はジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止法［T. Messingら、Nucl. Acids Res., 9, 309 (198
1)］によって決定することができる。

【０００６】クローン化されたｃＤＮＡを有するプラス
ミドはそのまま、あるいは所望により適当な制限酵素で
切り出して別のベクターに挿入して用いることができ
る。ベクターとしては、宿主に対応して複製できるもの
であれば何でもよい。宿主がエシェリキア属菌（Escher
ichia coli, 大腸菌) の場合には、大腸菌由来のプラス
ミド、例えばｐＢＲ３２２［F．Bolivarら, Gene, 2, 9
5 (1979)］，ｐＢＲ３２５，ｐＵＣｌ２、ｐＵＣｌ３な
どが挙げられる。宿主がバチルス（Bacillus）属菌の場
合には、スタフィロコッカス（Staphylococcus）由来プ
ラスミド、例えばｐＵＢｌ１０ (T. J. Gryczan and D.
Dubnau，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 128 (197
8)］,ｐＴＰ５［N. Noguchi，Gene, 2, 95 (1979)］,
ｐＣｌ９４［D. Dubnau, エキスペリメンタル・マニピ
ュレーション・オブ・ジーン・エクスプレッション（Ex
perimental Manipulation of Gene Expression; ed. M.
Inouye), 83頁、アカデミック・プレス（Academic Pre
ss), (1983)］などが挙げられる。宿主が酵母である場
合には、酵母由来プラスミド、例えばｐＳＨｌ９［S. H
arashimaら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー(Mol. Cell. Biol.)，4, 771（1984)］, ｐＳＨ
ｌ９−１（ヨーロッパ特許出願公開 EP-A-0235430)など
が挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、例えばｐＢ
Ｒ３２２にＳＶ４０のｏｒｉの挿入されたｐＳＶ２−Ｘ
［R. C. Mulligan and P. Berg，Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA, 78，2072（1981)］,ｐｃＤ−Ｘ［H. Okayama a
nd P. Berg，Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)］など
が挙げられる。

【０００７】クローン化されたｃＤＮＡは５’末端に翻
訳開始コドン（ＡＴＧ）を有し、また３’末端に翻訳終
止コドン（ＴＡＧ、ＴＧＡあるいはＴＡＡ）を有してい
てもよい。さらに該ｃＤＮＡを発現させるためにその上
流にプロモーター配列、プロモーター−プレ−プロ配列
あるいはプロモーター−シグナル配列を接続する。本発
明に用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に
用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいか
なるものでもよい。宿主が大腸菌である場合には、ｔｒ
ｐプロモーター、ｌａｃプロモーター、λＰＬ（Ｌは下
付きのＬである）プロモーター、Ｔ７プロモーター、ｔ
ａｃプロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｒｅｃＡプロ
モーターなどが挙げられ、とりわけＴ７プロモーターが
好ましい。宿主がバチルス属菌である場合には、ＳＰＯ
１プロモーター、ＳＰＯ２プロモーター、ｐｅｎＰプロ
モーター、ＭＷＰプロモーターなどが挙げられ、とりわ
けＭＷＰプロモーターが好ましい。宿主が酵母である場
合には、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＰＧＫプロモータ
ー、ＰＨＯ５プロモーター、ＡＤＨプロモーター、ＰＨ
Ｏ８１プロモーターなどが挙げられ、とりわけＧＡＰＤ
Ｈプロモーターが好ましい。宿主が動物細胞である場合
には、ＳＶ４０由来のプロモーター、レトロウイルスの
プロモーターなどが挙げられる。プロモーターは対応す
る遺伝子より調製することができる。また、化学合成す
ることもできる。

【０００８】シグナル配列およびプレ−プロ配列は、宿
主で機能するものであれば何でもよい。大腸菌の場合に
は、β−ラクタマーゼ遺伝子のシグナル配列、エンテロ
トキシン遺伝子のシグナル配列、アルカリ性ホスファタ
ーゼ遺伝子のシグナル配列、ＯｍｐＡ遺伝子のシグナル
配列などが挙げられる。バチルス属菌の場合には、α−
アミラーゼ遺伝子のシグナル配列、中性プロテアーゼ遺
伝子のシグナル配列、ＭＷＰ遺伝子のシグナル配列など
が挙げられる。酵母の場合には、卵白リゾチーム遺伝子
のシグナル配列、ヒト・リゾチーム遺伝子のシグナル配
列、インベルターゼ遺伝子のシグナル配列、α−ファク
ター遺伝子のプレ−プロ配列などが挙げられる。動物細
胞の場合には、インターロイキン２遺伝子のシグナル配
列などが挙げられる。このようにして構築されたＤＮＡ
（Ａ)、(Ｂ)、(Ｃ)、(Ｄ)、(Ｅ)、(Ｆ)、(Ｇ)、(Ｈ）あ
るいは（Ｉ）を含有するベクターを用いて、形質転換体
を製造する。宿主としては、例えばエシェリキア属菌、
バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。エシ
ェリキア属菌としては、エシェリキア・コリＫ１２ＤＨ
１［B. Low，Proc. Natl. Acad. Sci．USA，60, 160 (1
968)］、Ｃ６００［R. K. Appleyard,ジェネティックス
（Genetics), 39, 440 (1954)］、ＭＭ２９４［K. Back
manら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (1976)
］などが挙げられる。バチルス属菌としては、例えば
バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)ＭＩ１１４
［K. Yoshimuraら、Gene. 24, 255 (1983)］、２０７−
２１［K. Ohmuraら、ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー（J. Biochem.), 95, 87 (1984)］、バチルス・
ブレビス４７［S. Udaka. アグリカルチュラル・バイオ
ロジカル・ケミストリー（Agric. Biol. Chem.), 40, 5
23 (1976)］などが挙げられる。酵母としては、例えば
サッカロマイセス・セレビシェ（Saccharomyses cerevi
siae）ＡＨ２２Ｒ~［A．Miyanoharaら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 80，1 (1983)］,ＮＡ８７−１１Ａ、Ｄ
ＫＤ−５Ｄ、ＮＡ７４−３Ａ、ＮＡ７４−３Ａρ~［Y.K
aisho ら、イースト（Yeast) , 5, 91 (1989)］やシゾ
サッカロマイセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pomb
e) ＡＴＣＣ３８３９９（h~ leul-32), ＴＨ１６８（h
⁹⁰ ade6-M210 ural leul)［M. Kishida and C. Shimad
a, カレント・ジェネティクス(Current Genetics), 10,
443 (1986)］などが挙げられる。動物細胞としては、
例えば付着細胞であるサルＣＯＳ−７細胞、サルＶｅｒ
ｏ細胞、チャイニーズ・ハムスター（ＣＨＯ）細胞、マ
ウスＬ細胞、ヒトＦＬ細胞、および浮遊細胞であるマウ
スミエローマ細胞（ＳＰ２／０など）、マウスＹＡＣ−
１細胞、マウスＭｅｔｈＡ細胞、マウスＰ３８８細胞、
マウスＥＬ−４細胞などが挙げられる。

【０００９】エシェリキア属菌を形質転換するには、例
えばT. Maniatisら、Molecular Cloning，Cold Spring
Harbor Laboratory, 249頁 (1982）などに記載の方法に
従って行われる。バチルス属菌を形質転換する方法とし
ては、S. Chang and S. N. Cohen,モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol. Gen. Genet.),
168, 111 (1979) などに記載の方法に従って行われ
る。酵母を形質転換するには、例えば A. Hinnenら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978）に記載の
方法に従って行われる。動物細胞を形質転換するには、
例えば M. Wiglerら、セル（Cell), 14, 725 (1978）に
記載の方法に従って行われる。このようにして得られた
形質転換体をそれ自体公知の方法で培養する。宿主がエ
シェリキア属菌である形質転換体を培養する際、培地と
しては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むＭ９培地
［J. H. Miller, エクスペリメンツ・イン・モレキュラ
ー・ジェネティクス（Experiments in Molecular Genet
ics),431頁, Cold Spring Harbor Laboratory, (197
2)］が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率
よく働かせるために、例えばイソプロピルチオガラクト
シド（ＩＰＴＧ）やインドリル−３−アクリル酸のよう
な薬剤を加えることができる。培養は通常約１５〜４３
℃で約３〜２４時間行い、必要により、通気や撹拌を加
えることもできる。宿主がバチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培地としては、例えばＬ−ブロス培
地、Ｔ２培地［S. Udaka, Agric. Biol. Chem.，40, 52
3（1976)］などが挙げられる。培養は通常約１５〜３７
℃で約６〜９６時間行い、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えばバークホールダー(Burkhold
er)最小培地［K. L. Bostainら、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA,77, 4504 (1980)］などが挙げられる。培地のｐ
Ｈは約５〜８に調整するのが好ましい。培養は通常約２
０〜３５℃で約２４〜７２時間行い、必要に応じて通気
や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培
養する際、培地としては、例えば約５〜２０％の胎児牛
血清を含むＭＥＭ培地［H．Eagle， サイエンス（Scien
ce), 130, 432 (1959)］、ＤＭＥＭ培地［R. Dulbecco
and G. Freeman, ヴィロロジー（Virology), 8, 396 (1
959)］、ＲＰＭＩ−１６４０培地［G. E. Moreら、ジャ
ーナル・オブ・ジ・アメリカン・メディカル・アソシエ
ーション（J．Am. Med. Assoc.), 199, 519 (1967)］、
１９９培地［J. F. Morganら、プロシージング・オブ・
ザ・ソサイエティ・フォー・エクスペリメンタル・バイ
オロジー・アンド・メディスン（Proc. Soc. Exp. Bio
l. Med.), 73，1 (1950)］などが挙げられる。培養は通
常約３０〜４０℃で約１５〜６０時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。本発明によれば、上記培養物か
ら、ＨＣＶ由来の新規なポリペプチドを単離するには、
自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うこと
ができる。これらの公知の分離・精製法としては、塩折
や溶媒沈澱などの溶解度を利用する方法、透析法、限外
ろ過法、ゲルろ過法、およびＳＤＳ−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する
方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を
利用する方法、アフィニティクロマトグラフィーなどの
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられ
る。

【００１０】

【作用および効果】本発明で得られる新規ポリペプチド
は、サブタイプの存在するＨＣＶゲノムのなかではよく
アミノ酸配列の保存された領域であるために、ＨＣＶ抗
体の検出のための抗原として用いることができる。すな
わち、たとえば、本発明のポリペプチドを抗原として固
相に固定したものおよび酵素を標識したまたはラジオア
イソトープでラベルしたヒト由来の抗体であって該ＨＣ
Ｖ抗体と結合能を有するものを試薬として用い、患者の
血清を検体として用い、サンドイッチＥＩＡまたはＲＩ
Ａを行うことにより、該患者の血清中のＨＣＶ抗体を検
出することができる。さらに、該ポリペプチドはＨＣＶ
感染を予防するためのワクチンの免疫原として、またＨ
ＣＶ感染者の治療に用いる免疫療法剤として用いること
ができる。なお、本願明細書や図面において、塩基やア
ミノ酸などを略号で表示する場合、ＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ
Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を次に挙げる。またアミノ酸に関して光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければＬ−体を示すも
のとする。 ＤＮＡ ：デオキシリボ核酸 Ａ ：アデニン Ｔ ：チミン Ｇ ：グアニン Ｃ ：シトシン ＳＤＳ ：ドデシル硫酸ナトリウム Ｇｌｙ ：グリシン（Ｇ） Ａｌａ ：アラニン（Ａ） Ｖａｌ ：バリン（Ｖ） Ｌｅｕ ：ロイシン（Ｌ） Ｉｌｅ ：イソロイシン（Ｉ） Ｓｅｒ ：セリン（Ｓ） Ｔｈｒ ：スレオニン（Ｔ） Ｃｙｓ ：システイン（Ｃ） 1/2 Ｃｙｓ：ハーフシスチン Ｍｅｔ ：メチオニン（Ｍ） Ｇｌｕ ：グルタミン酸（Ｅ） Ａｓｐ ：アスパラギン酸（Ｄ） Ｌｙｓ ：リジン（Ｋ） Ａｒｇ ：アルギニン（Ｒ） Ｈｉｓ ：ヒスチジン（Ｈ） Ｐｈｅ ：フェニールアラニン（Ｆ） Ｔｙｒ ：チロシン（Ｙ） Ｔｒｐ ：トリプトファン（Ｗ） Ｐｒｏ ：プロリン（Ｐ） Ａｓｎ ：アスパラギン（Ｎ） Ｇｌｎ ：グルタミン（Ｑ） Ａｐr ：アンピシリン耐性遺伝子(注：ｒは上付き
のｒを表す） Ｔｃr ：テトラサイクリン耐性遺伝子(注：ｒは上
付きのｒを表す） なお、本発明のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配
列の一部が修飾（付加、除去、その他のアミノ酸への置
換など）されてもよい。

【００１１】

【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
後述の実施例５で得られた形質転換体エシェリキア コ
リ(Escherichia coli）ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣ
ａ１０１ＣＦおよびＥ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＨＣｂ１０１ＣＦ、は平成２年１１月９日から
財団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １５
１０７およびＩＦＯ １５１０８としてそれぞれ寄託さ
れており、又これらの形質転換体は平成２年１１月２２
日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(Ｆ
ＲＩ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３１７１及びＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−３１７２としてそれぞれ寄託されている。

【００１２】後述の実施例１０で得られた形質転換体エ
シェリキア コリ(Escherichia coli）ＭＭ２９４（Ｄ
Ｅ３）／ｐＨＣａ２０１ＣＦは平成３年９月５日から財
団法人発酵研究所（ＩＦＯ）に受託番号ＩＦＯ １５２
２１として、又この形質転換体は平成３年９月１１日か
ら通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(ＦＲ
Ｉ）に寄託番号ＦＥＲＭ ＢＰ−３５６２として寄託さ
れている。

【００１３】実施例１ Ｃ１００−３抗体陽性血漿由来
ｃＤＮＡからのＨＣＶ遺伝子の増幅 ベックマン(Beckman）製の超遠心ローターＳＷ２８用チ
ューブに１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を
含む１２ｍｌの２０％（ｗ／ｖ）庶糖を注入した後、Ｃ
１００−３抗体陽性の血漿２３ｍｌを重層して室温、２
８，０００回転／分(rpm）で４時間、超遠心分離を行っ
た。７０ｍｌ分の該血漿から得られた沈澱を５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．０)，２００ｍＭ ＮａＣ
ｌ、１０ｍＭＥＤＴＡ、２％（ｗ／ｖ）ＳＤＳ、１ｍｇ
／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ（メルク社製）を含む
溶液３ｍｌで溶解し、６５℃、１時間静置した。この溶
液に等容量のフェノールとクロロホルムを加えて水層を
抽出した後、該水相に５μｇのグリコーゲン、１０分の
１倍容量の３Ｍ酢酸ナトリウム溶液(ｐＨ４．８)、２倍
容量のエタノールを加えて−２０℃で一昼夜静置した。
この液をエッペンドルフ微量遠心機で室温、１０,００
０rpmで１０分間遠心分離にかけ、得られた沈澱（核酸
画分）を３０μｌの蒸留水で溶解した。一方、既報のＨ
ＣＶ塩基配列［H. Okamotoら、Jpn. J. Exp. Med., 60,
167 (1990); WO 89/04669; 特開平２−５００８８０］
の５’末端を塩基番号１とした時、２０２３〜２０４２
に相当するアンチセンス・プライマーNo.２：5' C C
T C C G A T G A C A C A A G G A G G 3'(配列番号：
７）、塩基番号３２５〜３４７［H. Okamotoら、Jpn.
J. Exp. Med., 60, 167 (1990)］に対応するセンス・プ
ライマーNo.２１７：5' C A A G A T C T C G G A T
G A G C A C G A T T C C C A A A C C T CA 3'（配列
番号：８）、塩基番号６７９〜７０１［H. Okamotoら、
Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (1990)］ に対応するアン
チセンス・プライマーNo.２１９：5' C T A G A T C
T T C A G A G G G T A T C G A T G A C C T T A C C
CA A 3'（配列番号：９）、をそれぞれ合成し、ｃＤＮ
Ａ作製用プライマーとして用いた。上記核酸画分の１０
分の１量（３μｌ）にプライマーNo.２を６０ｐｍｏｌ
加えて７５℃、１０分間保温した後、氷中で急冷した。
次に５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ(ｐＨ８．３)、７５ｍ
Ｍ ＫＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．４ｍＭ 各ｄＮＴ
Ｐ、１０ｍＭ ＤＴＴ、２００ｕｎｉｔｓリバース・ト
ランスクリプターゼ［SuperScript(Trade Mark) RT(Lif
e Technologies, Inc.)］を含有する溶液中で４２℃、
１時間のｃＤＮＡ合成反応を行い、７０℃、１０分間加
熱して反応を停止させた。得られたｃＤＮＡ画分の５分
の１量に２種類のプライマー（No.２１７と２１９；各
１００ｐｍｏｌ）を加え、シータス／パーキン−エルマ
ー（Cetus/Perkin-Elmer) により供給されたキット指示
書に従って、９４℃、１分間、５５℃、２分間、７２
℃、３分間の反応を４０回繰り返すＰＣＲを行った。

【００１４】実施例２ ＨＣＶｃＤＮＡのクローニング
とその塩基配列の決定 上記ＰＣＲ産物を１．２％アガロース電気泳動で分離し
た後、ＨＣＶ塩基配列から予想される大きさ（約４００
ｂｐ；塩基番号３２５〜７０１に相当）に相当する位置
のアガロースゲルからＤＮＡ断片を回収した。得られた
ＤＮＡ断片をＴ４ポリヌクレオチド・キナーゼ［宝酒造
（株）製］と［γ−³²Ｐ］−ＡＴＰにより５’末端をリ
ン酸化した後、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ［宝酒造（株）製］
とＡＴＰによりプラスミドｐＵＣ１１８［宝酒造（株）
製］のＨｉｎｃII部位に挿入し、ｃＤＮＡ部分の塩基配
列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法［J. Messing
ら、Nucl．Acids Res., 9, 309, (1981)］によって決定
した。その結果、該ＤＮＡ断片は既報の配列とは明らか
に異なる１種類のＨＣＶ ｃＤＮＡ（ａ型）を含んでい
ることが分かった。ａ型のｃＤＮＡ断片を含むプラスミ
ドをｐＨＣａ１０１と命名し、ｃＤＮＡ部分の塩基配列
および塩基配列より予測されるアミノ酸配列を各々図１
と図２に示した。同様に他のＣ１００−３抗体陽性血漿
由来ｃＤＮＡについてもＰＣＲを行った結果、ａ型と同
じ大きさの産物が回収された。塩基配列を解析したとこ
ろ H. Okamotoら［Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (199
0)］の報告したＨＣ−Ｊ４株と全く同じＨＣＶ ｃＤＮ
Ａ以外に、新規なＨＣＶ ｃＤＮＡ（ｂ型）がクローニ
ングされていることが判明した。そこで、上記ｂ型ｃＤ
ＮＡを有するプラスミドをｐＨＣｂ１０１と命名した。
その塩基配列および塩基配列より予測されるアミノ酸配
列を各々図１と図２に示した。これらのａ型とｂ型のｃ
ＤＮＡより予測されるアミノ酸配列は、従来知られてい
たＨＣＶのアミノ酸配列と高い相同性を示したが、既知
のＨＣＶポリペプチドと一致するものはなく、新規なＨ
ＣＶポリペプチドであることが分かった。

【００１５】実施例３ 発現ベクターの構築−１ 実施例２で得られたプラスミドｐＨＣａ１０１とｐＨＣ
ｂ１０１を制限酵素ＢｇｌIIで消化した後、それぞれか
ら０．３８ｋｂのＤＮＡ断片を分離した。これらの断片
をプラスミドｐＥＴ−３ｘａ［メソッズ・イン・エンザ
イモロジー(Methods in Enzymology. ed. D. V. Goedde
l), 185巻、68頁、アカデミック・プレス (Academic Pr
ess),(1990)］のＢａｍＨI部位に挿入し、プラスミドｐ
ＨＣａ１０１ＣＦとｐＨＣｂ１０１ＣＦを作製した。

【００１６】実施例４ 発現ベクターの構築−２ 実施例２で得られたプラスミドｐＨＣａ１０１とｐＨＣ
ｂ１０１を制限酵素ＫｐｎIで消化してそれぞれ開環し
た後、Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ処理により末端を平滑に
した。これらにＢａｍＨIリンカー（ｐＣＧＧＧＡＴＣ
ＣＣＧ）（ＮＥＢ製）をＴ４ ＤＮＡリガーゼ［宝酒造
（株）製］を用いて付加した。該リンカーの付加したｐ
ＨＣａ１０１を更に制限酵素ＨｉｎｄIIIとＢａｍＨIで
処理した後、プラスミドｐＵＣ８のＨｉｎｄIII部位と
ＢａｍＨI部位との間に挿入してプラスミドｐＵＣａ−
ＫＦを作製した。また、該リンカーの付加したｐＨＣｂ
１０１を制限酵素ＸｂａIとＢａｍＨIで消化した後、プ
ラスミドｐＵＣ１８のＸｂａI部位とＢａｍＨI部位との
間に挿入してプラスミドｐＵＣｂ−ＫＦを作製した。こ
れらのプラスミドを制限酵素ＢｇｌIIとＢａｍＨIで消
化し、それぞれから０．２６ｋｂのＢｇｌII−ＢａｍＨ
I断片を得た。これらの断片をプラスミドｐＥＴ−３Ｘ
ａのＢａｍＨI部位に挿入し、発現プラスミドｐＨＣａ
１０１ＫＦとｐＨＣｂ１０１ＫＦを作製した。

【００１７】実施例５ 形質転換体の作製および発現 エシェリキア・コリ（Escherichia coli）ＭＭ２９４
に、Ｔ７ファージのＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を組み込
んだλファージＤＥ３［F．W．Studierら、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー（J. Mol. Biol.),
189, 113 (1986)］を溶原化させて作製したエシェリキ
ア・コリ（Escherichia coli）ＭＭ２９４（ＤＥ３）
を、実施例３および４で得られた発現ベクターｐＨＣａ
１０１ＣＦ、ｐＨＣｂ１０１ＣＦ、ｐＨＣａ１０１ＫＦ
およびｐＨＣｂ１０１ＫＦを用いて形質転換し、形質転
換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１
０１ＣＦ（ＩＦＯ １５１０７）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２
９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１ＣＦ（ＩＦＯ １５１
０８）、Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣ
ａ１０１ＫＦおよびＥ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ
３）／ｐＨＣｂ１０１ＫＦをそれぞれ得た。各形質転換
体を、４０μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１．５ｍｌ
のＬＢ培地で３７℃、１６時間培養した。得られた培養
液の０．５ｍｌを１０ｍｌの同じ培地を含む２００ｍｌ
容フラスコに移し、３７℃で培養し、Ｋｌｅｔｔ値が１
７０〜２００になった時ＩＰＴＧを終濃度０．１ｍＭに
なるように加え、さらに３７℃、３時間培養した。得ら
れた培養液の１ｍｌから集めた菌体に５０μｌの蒸留水
と５０μｌの２倍濃度のサンプル緩衝液［５０ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）−２ｍＭ ＥＤＴＡ−１
％ＳＤＳ−１％メルカプトエタノール−８％グリセロー
ル−０．０２５％ブロムフェノールブルー］を加えて懸
濁し、１００℃、１０分間加熱した後、０．１％ＳＤＳ
を含むポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけた。
泳動後、ゲルをクマジー・ブリリアント・ブルーあるい
は銀染色液で染めたところ、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１ＣＦとＥ．ｃｏ
ｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１ＣＦは約
４６キロダルトンの位置に、またＥ．ｃｏｌｉ ＭＭ２
９４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１ＫＦとＥ．ｃｏｌｉ
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１ＫＦは約４４キ
ロダルトンの位置にそれぞれ泳動する特異的な産物を発
現していることが分かった。

【００１８】実施例６ T7ファージ遺伝子10産物とHCV
ポリペプチドとから成る融合蛋白遺伝子の大腸菌におけ
る発現 実施例５において得られた形質転換体 Ｅ． ｃｏｌｉ
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１ＣＦ 及び Ｅ．
ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１ＣＦ
を50μg/mlのアンピシリンを含む20mlの培養液(１リッ
トルあたり、バクトトリプトン10ｇ,イーストエキスト
ラクト5ｇ，塩化ナトリウム5ｇを含む)中で37℃，一晩
振とう培養した後、その15mlを上記同培地300ml（１リ
ットル容フラスコ中）に移し、更に37℃で振とう培養を
行った。Klett 値が170〜200になった時点で最終濃度が
0.1mMになるように40mMのイソプロピル-β-D-チオガラ
クトピラノシド(IPTG)を750μl加えて、更に37℃で2時
間振とう培養し、菌体を遠心分離によって集めた。

【００１９】実施例７ Ｔ７ファージ遺伝子10産物とＨ
ＣＶポリペプチドから成る融合蛋白の精製 実施例６において集めた菌体を10mlの懸濁バッファー
［50mM Tris-HCl(pH8.5)-100mM NaCl-１mM EDTA- 0.1mM
APMSF-0.5％ Triton X-100］に懸濁し、超音波処理を
行った後、８℃，250×ｇ,20分間遠心分離にかけて、上
澄液を得た。更にこの上澄液を８℃，5000×ｇ,20分間
遠心分離にかけ沈殿物を得、これを4mlの１M尿素バッフ
ァー［１M尿素-50mM Tris-HCl(pH8.5)-100mM NaCl-１mM
EDTA-0.1mMAPMSF-0.5％ Triton X-100］によく懸濁し
室温で1時間放置した。これを８℃,5000×ｇ,20分間遠
心分離にかけ沈殿物を得、この沈殿物を４mlの４M尿素
バッファー［４M尿素-50mM Tris-HCl(pH8.5)-100mM NaC
l-１mM EDTA-0.1mM APMSF-0.5％ Triton X-100］によく
懸濁し室温で１時間放置した。これを８℃，5000×ｇ,2
0分間遠心分離にかけ沈殿物を得、この沈殿物を４mlの
８M尿素バッファー［８M尿素-50mM Tris-HCl(pH8.5)-10
0mM NaCl-１mM EDTA-0.1mM APMSF-0.5％ TritonX-100］
によく懸濁し、４℃で一晩放置した。これを８℃,5000
×ｇ,20分間遠心分離にかけ上澄液を得た。これに半量
の2倍の濃度の Laemmli buffer を加え、100℃,10分間
加熱した。冷却後13000rpm,５分間遠心分離にかけ、上
澄液を得た。これをSDS-ポリアクリルアミドゲルでの電
気泳動にかけた後、銀染色を行ったところ、約46キロダ
ルトンの位置に単一バンドが得られた。

【００２０】実施例８ 大腸菌で作製したＴ７ファージ
遺伝子１０産物とＨＣＶポリペプチドから成る融合蛋白
とＨＣＶ−ＲＮＡ陽性ヒト血清との反応 実施例７において、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９
４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１ＣＦおよびＥ．ｃｏｌｉ
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣｂ１０１ＣＦから精製
された約４６キロダルトンのＴ７ファージ遺伝子１０産
物−ＨＣＶポリペプチド融合蛋白を以下それぞれ融合蛋
白ＡおよびＢと称する。１％ＳＤＳを含む１２．５％ポ
リアクリルアミドゲルの１レーンあたり、融合蛋白Ａあ
るいはＢの１０μｇを負荷した後、電気泳動を行った。
泳動後、ゲルにニトロセルロースフィルター（Schleich
er & Schuell，BA85)を密着させ、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ
−１９２ｍＭ Ｇｌｙｃｉｎｅ−２０％ メタノールを
含む溶液中においてアクリルアミドゲル中の該融合蛋白
を電気的に転写した。転写後、フィルターをレーン毎に
切断し２５％ ブロックエース（雪印乳業製、大日本製
薬販売）に浸して室温で１時間振盪した。次に、ＴＢＳ
−Ｔ溶液［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）
−１５０ｍＭ ＮａＣｌ−０．０５％ Ｔｗｅｅｎ２
０］でフィルターを１０分間洗浄した後、ＴＢＳ−Ｔ溶
液で１００倍に希釈したヒト血清を各フィルター毎に添
加して室温で３０分間振盪した。ＴＢＳ−Ｔ溶液で各フ
ィルターを１０分間洗浄した後、同溶液で３０００倍に
希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒト免疫グロ
ブリン（多価）抗体（TAGO社)を各フィルター毎に添加
して室温で３０分間振盪した。各フィルターをＴＢＳ−
Ｔ溶液で１０分間洗浄した後、基質溶液［３３０μｇ／
ｍｌ ＮＢＴ（nitro blue tetrazolium)−１６５μｇ
／ｍｌ ＢＣＩＰ（5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosp
hate)−１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９．５）
−１００ｍＭ ＮａＣｌ−５ｍＭ ＭｇＣｌ₂］に浸し
て室温で１５分間静置した。その結果、ＨＣＶ抗体測定
用キット（オーソ ＨＣＶ Ａｂ ＥＬＩＳＡテスト、
オーソ社販売）陽性でＨＣＶ・ＲＮＡ陽性の血清（＃
２、３）および上記キット陰性でＨＣＶ・ＲＮＡ陽性血
清（＃１、４、５）は、融合蛋白ＡおよびＢと反応する
ことが示された（図３）。なお、同時に陽性対照として
ＨＣＶに感染したチンパンジー血清（＃１６）を、陰性
対照として健常人血清（＃０）をそれぞれ使用した。

【００２１】実施例９ 発現ベクターの構築−３ 実施例２で得られたプラスミドｐＨＣａ１０１を制限酵
素ＢｇｌIIで消化した後、０．３８ｋｂのＤＮＡ断片を
分離した。この断片をプラスミドｐＢＴ−３ａ［メソッ
ズ イン エンザイモロジー（Methods in Enzymolog
y），185，68 (1990)］のＢａｍＨＩ部位に挿入し、Ｈ
ＣＶポリペプチドを直接発現するための発現プラスミド
ｐＨＣａ２０１ＣＦを作製した。

【００２２】実施例１０ 形質転換体の作製および発現 実施例５のＥ．ｃｏｌｉ ＭＭ２９４（ＤＥ３）を実施
例９で得られた発現プラスミドｐＨＣａ２０１ＣＦを用
いて形質転換し、形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉＭＭ２９４
（ＤＥ３）／ｐＨＣａ２０１ＣＦを得た。本形質転換体
を実施例５と同一条件下で培養し、同一条件下でポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動後、ゲルを銀
染色液で染めたところ、本形質転換体は約１４キロダル
トン（ｋＤａ）の位置に泳動する特異的な産物を発現し
ていることが分かった。なお、本形質転換体による１４
ｋＤａのＨＣＶポリペプチド（コア蛋白）の生産量（図
４のレーン２）は、実施例５の形質転換体Ｅ．ｃｏｌｉ
ＭＭ２９４（ＤＥ３）／ｐＨＣａ１０１ＣＦによる約
４６ｋＤａのＨＣＶポリペプチド（Ｔ７ファージの遺伝
子１０産物とＨＣＶコア蛋白から成る融合蛋白）の生産
量（図４のレーン３）の約１／３であった。

【００２３】

【００２４】

【配列表】配列番号:1 配列の長さ:23 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Thr Thr Arg Lys Thr Ser Glu 1 5 10 15 Arg Ser Gln Pro Cys Gly Arg 20。

【００２５】配列番号:2 配列の長さ:79 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ser Thr Ile Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg 1 5 10 15 Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly 20 25 30 Val Tyr Leu Leu Pro Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Thr Thr 35 40 45 Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Cys Gly Arg Arg Gln Pro Ile 50 55 60 Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75。

【００２６】配列番号:3 配列の長さ:79 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ser Thr Ile Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg 1 5 10 15 Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly 20 25 30 Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 35 40 45 Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Trp Arg Gln Pro Ile 50 55 60 Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75。

【００２７】配列番号:4 配列の長さ:69 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 TGCAGGGGCC CCAGGTTGGG TGTGCGCACG ACTAGGAAGA CTTCCGAGCG GTCGCAACCT 60 TGTGGAAGG 69。

【００２８】配列番号:5 配列の長さ：２３７ 配列の型：核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 AGCACGATTC CCAAACCTCA AAGAAAAACC AAACGTAACA CCAACCGCCG CCCACAGGAC 60 GTCAAGTTCC CGGGCGGTGG TCAGATCGTT GGTGGAGTTT ACCTGTTGCC GTGCAGGGGC 120 CCCAGGTTGG GTGTGCGCAC GACTAGGAAG ACTTCCGAGC GGTCGCAACC TTGTGGAAGG 180 CGACAACCTA TCCCCAAGGC TCGCCGACCC GAGGGCAGGG CCTGGGCTCA GCCCGGG 237。

【００２９】配列番号:6 配列の長さ:237 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 AGCACGATTC CCAAACCTCA AAGAAAAACC AAACGTAACA CCAACCGCCG CCCACAGGAC 60 GTCAAGTTCC CGGGCGGTGG TCAGATCGTT GGTGGAGTTT ACCTGTTGCC GCGCAGGGGC 120 CCCAGGTTGG GTGTGCGCGC GACTAGGAAG ACTTCCGAGC GGTCGCAACC TCGTGGATGG 180 CGACAACCTA TCCCCAAGGC TCGCCGACCC GAGGGCAGGG CCTGGGCTCA GCCCGGG 237。

【００３０】配列番号:7 配列の長さ:20 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 CCTCCGATGA CACAAGGAGG 20。

【００３１】配列番号：８ 配列の長さ：３４ 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 CAAGATCTCG GATGAGCACG ATTCCCAAAC CTCA 34。

【００３２】配列番号:9 配列の長さ:35 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 CTAGATCTTC AGAGGGTATC GATGACCTTA CCCAA 35。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明で得られたＨＣＶ ｃＤＮＡのａ型の塩
基配列およびｂ型の塩基配列をａ型と比較して示した図
である。ｂ型における「−」はａ型のものと同じ塩基で
あることを示す。

【図２】図１の塩基配列から予測されるアミノ酸配列を
示した図であり、ｂ型における「−」はａ型のものと同
じアミノ酸であることを示す。

【図３】実施例８に記載の融合蛋白ＡおよびＢとＨＣＶ
・ＲＮＡ陽性ヒト血清との反応を示す。

【図４】プラスミドｐＥＴ−３ａ，ｐＨＣａ２０１ＣＦ
およびｐＨＣａ１０１ＣＦを用いて、それぞれエシェリ
キア コリ ＭＭ２９４（ＤＥ３）を形質転換して得ら
れる形質転換体の生産物を、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動後、銀染色した結果を示す（実施例１０参照）。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 39/29 // Ａ６１Ｋ 39/29 Ａ６１Ｐ 31/12 Ａ６１Ｐ 31/12 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 33/569 Ｌ 33/569 33/576 Ｚ 33/576 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C07K 14/00 - 19/00 C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/08 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims (15)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】アミノ酸配列： Cys-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Thr-Thr-Arg-Ly
   s-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Cys-Gly-Argからなる
   ポリペプチド。
2. 【請求項２】アミノ酸配列： Ser-Thr-Ile-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-As
   n-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-
   Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Cy
   s-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Thr-Thr-Arg-Lys-
   Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Cys-Gly-Arg-Arg-Gln-Pr
   o-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Ala-Trp-
   Ala-Gln-Pro-Glyからなるポリペプチド。
3. 【請求項３】アミノ酸配列： Ser-Thr-Ile-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-As
   n-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-
   Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Ar
   g-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg-Lys-
   Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Arg-Gln-Pr
   o-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Ala-Trp-
   Ala-Gln-Pro-Glyからなるポリペプチド。
4. 【請求項４】請求項１記載のアミノ酸配列をコードする
   塩基配列からなる組換えＤＮＡ。
5. 【請求項５】請求項２記載のアミノ酸配列をコードする
   塩基配列からなる組換えＤＮＡ。
6. 【請求項６】請求項３記載のアミノ酸配列をコードする
   塩基配列からなる組換えＤＮＡ。
7. 【請求項７】塩基配列がTGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCA
   CGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTTGTGGAAGGである請
   求項４記載の組換えＤＮＡ。
8. 【請求項８】塩基配列が AGCACGATTCCCAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAAGTTCCCG GGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGTGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCACGACT AGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTTGTGGAAGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGACCCGAGGGC AGGGCCTGGGCTCAGCCCGGGである請求項５記載の組換えＤ
   ＮＡ。
9. 【請求項９】塩基配列が AGCACGATTCCCAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAAGTTCCCG GGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACT AGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGTGGATGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGACCCGAGGGC AGGGCCTGGGCTCAGCCCGGGである請求項６記載の組換えＤ
   ＮＡ。
10. 【請求項１０】Ｔ７ファージの遺伝子１０産物と請求項
    １、２あるいは３記載のポリペプチドとから成る融合蛋
    白質。
11. 【請求項１１】ヒト・インターロイキン２と請求項１、
    ２あるいは３記載のポリペプチドとから成る融合蛋白
    質。
12. 【請求項１２】請求項１０記載の融合蛋白質をコードす
    る塩基配列からなる組換えＤＮＡ。
13. 【請求項１３】請求項１１記載の融合蛋白質をコードす
    る塩基配列からなる組換えＤＮＡ。
14. 【請求項１４】請求項４、５、６、１２または１３記載
    の組換えＤＮＡを保持する形質転換体。
15. 【請求項１５】請求項１４記載の形質転換体を培養し、
    培養物中に請求項１、２、３、１０あるいは１１記載の
    蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
    する該蛋白質の製造法。