JP3130338B2 - ポリペプチドおよびその製造法 - Google Patents
ポリペプチドおよびその製造法Info
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Description
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、C型肝炎ウイルス(H
CV)ゲノムによってコードされた抗原蛋白のうち、塩
基性アミノ酸に富み、高度に保存されたアミノ酸配列を
含む新規な抗原蛋白を組換えDNA技術を用いて原核細
胞あるいは真核細胞においてインクルージョン・ボディ
ーとして発現させることによって、安定にかつ大量に製
造する技術に関する。
CV)ゲノムによってコードされた抗原蛋白のうち、塩
基性アミノ酸に富み、高度に保存されたアミノ酸配列を
含む新規な抗原蛋白を組換えDNA技術を用いて原核細
胞あるいは真核細胞においてインクルージョン・ボディ
ーとして発現させることによって、安定にかつ大量に製
造する技術に関する。
【0002】
【従来の技術】非A非B(NANB)型慢性肝炎のチン
パンジーのプラズマより調製されたRNAからcDNA
ライブラリーが作製された。このライブラリーからNA
NB型肝炎患者の回復期血清と反応する陽性クローン
(5−1−1)が分離され、ジーン・ウオーキングによ
って最終的に約10kbから成るHCV遺伝子の大部分
(7310 bp)が解明された(WO 89/04669;特開平2-50088
0)。続いて、このHCVの抗原C100−3(363アミノ
酸残基)とヒト・スーパーオキシド・ディスムターゼ
(154アミノ酸残基)とから成る融合蛋白が酵母で生産
され、この抗原を用いる抗HCV抗体の測定系が開発さ
れた[Q. L. Chooら、サイエンス(Science),244, 359
(1989); G. Kuoら、Science, 244, 362(1989)]。この
方法で測定されるHCV抗体は、従来の基準でNANB
型肝炎と考えられていた症例のなかに多数見出され、米
国では輸血後NANB型肝炎の71%、散発性NANB
型肝炎の58%に検出された。また、輸血後NANB型
の慢性肝炎では、イタリアで84%、日本で78%に抗
HCV抗体が検出された〔G. Kuo ら、Science,244, 3
62(1989)]。スペインでは輸血後NANB型肝炎の85
%に抗HCV抗体が検出された。また、薬物常用者では
70%に抗HCV抗体が検出され、HCVが注射器や針
を介して感染する危険性の高いことが示唆された[J. I.
Estebanら、ランセット (Lancet) ii, 294 (1989)]。
Y. Kuboら[ニュークレイック・アシッズ・リサーチ(N
ucl.Acids Res.), 17, 10367 (1989)]は、輸血後NA
NB型肝炎を発症した日本人供血者プラズマからRNA
を分離し、HCV cDNAを作製し、HCVの非構造
蛋白質領域3(NS3)に特異的なオリゴヌクレオチド
・プライマーを用いるポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション(PCR)によりcDNAを増幅させた。このc
DNA(J1と命名、583ヌクレオチド)は、上述の
チンパンジー由来のプロトタイプのHCVcDNAと比
較して、ヌクレオチド・レベルで79.8%、アミノ酸
レベルで92.2%の相同性を示した。この結果は、H
CVにサブタイプの存在することを示唆した。H. Okamo
toら[ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メディシン(Jpn. J. Exp. Med.), 60, 167 (1
990)]は、抗HCV抗体陽性のヒト・プラズマおよび抗
HCV抗体陰性でNANB型肝炎感染性の証明されたチ
ンパンジー・プラズマからそれぞれRNAを抽出し、こ
れをもとにして作製したcDNAライブラリーからHC
Vゲノムをクローニングし、2種類のサブタイプ(それ
ぞれHC−J1とHC−J4と命名)の5’末端側配列
を報告した。この配列の上流域には、高度に保存された
アミノ酸配列が存在し、またアルギニンのような塩基性
アミノ酸の含量が多いことが見出された。これらの結果
から、この配列には、ウイルスのカプシド蛋白がコード
されていると推定された。また、Okamotoらの報告した
配列の1674ヌクレオチドの下流にWO89/04669で公開
された塩基配列の続くことが明らかにされた。
パンジーのプラズマより調製されたRNAからcDNA
ライブラリーが作製された。このライブラリーからNA
NB型肝炎患者の回復期血清と反応する陽性クローン
(5−1−1)が分離され、ジーン・ウオーキングによ
って最終的に約10kbから成るHCV遺伝子の大部分
(7310 bp)が解明された(WO 89/04669;特開平2-50088
0)。続いて、このHCVの抗原C100−3(363アミノ
酸残基)とヒト・スーパーオキシド・ディスムターゼ
(154アミノ酸残基)とから成る融合蛋白が酵母で生産
され、この抗原を用いる抗HCV抗体の測定系が開発さ
れた[Q. L. Chooら、サイエンス(Science),244, 359
(1989); G. Kuoら、Science, 244, 362(1989)]。この
方法で測定されるHCV抗体は、従来の基準でNANB
型肝炎と考えられていた症例のなかに多数見出され、米
国では輸血後NANB型肝炎の71%、散発性NANB
型肝炎の58%に検出された。また、輸血後NANB型
の慢性肝炎では、イタリアで84%、日本で78%に抗
HCV抗体が検出された〔G. Kuo ら、Science,244, 3
62(1989)]。スペインでは輸血後NANB型肝炎の85
%に抗HCV抗体が検出された。また、薬物常用者では
70%に抗HCV抗体が検出され、HCVが注射器や針
を介して感染する危険性の高いことが示唆された[J. I.
Estebanら、ランセット (Lancet) ii, 294 (1989)]。
Y. Kuboら[ニュークレイック・アシッズ・リサーチ(N
ucl.Acids Res.), 17, 10367 (1989)]は、輸血後NA
NB型肝炎を発症した日本人供血者プラズマからRNA
を分離し、HCV cDNAを作製し、HCVの非構造
蛋白質領域3(NS3)に特異的なオリゴヌクレオチド
・プライマーを用いるポリメラーゼ・チェイン・リアク
ション(PCR)によりcDNAを増幅させた。このc
DNA(J1と命名、583ヌクレオチド)は、上述の
チンパンジー由来のプロトタイプのHCVcDNAと比
較して、ヌクレオチド・レベルで79.8%、アミノ酸
レベルで92.2%の相同性を示した。この結果は、H
CVにサブタイプの存在することを示唆した。H. Okamo
toら[ジャパニーズ・ジャーナル・オブ・エクスペリメ
ンタル・メディシン(Jpn. J. Exp. Med.), 60, 167 (1
990)]は、抗HCV抗体陽性のヒト・プラズマおよび抗
HCV抗体陰性でNANB型肝炎感染性の証明されたチ
ンパンジー・プラズマからそれぞれRNAを抽出し、こ
れをもとにして作製したcDNAライブラリーからHC
Vゲノムをクローニングし、2種類のサブタイプ(それ
ぞれHC−J1とHC−J4と命名)の5’末端側配列
を報告した。この配列の上流域には、高度に保存された
アミノ酸配列が存在し、またアルギニンのような塩基性
アミノ酸の含量が多いことが見出された。これらの結果
から、この配列には、ウイルスのカプシド蛋白がコード
されていると推定された。また、Okamotoらの報告した
配列の1674ヌクレオチドの下流にWO89/04669で公開
された塩基配列の続くことが明らかにされた。
【0003】
【発明が解決すべき課題】上述のようにHCVのゲノム
の全域が解明されたが、HCVにはサブタイプの存在す
ることも証明された。特に、NANB型肝炎の感染性を
示すが、従来のC100−3抗原を用いる抗HCV抗体
測定系では陰性であった検体からHCVのサブタイプが
検出されたことは、従来のHCV診断法に新たな問題を
提起した。従って、C100−3抗原以外の抗原を用い
る別種の抗HCV抗体測定系の作製が望まれている。特
に、サブタイプ間でアミノ酸配列の保存された5’末端
側のコード領域を利用する抗体測定系の開発が注目され
ている。しかしながら、この領域(たとえばMet1〜G
ly120)では塩基性アミノ酸含量が23%と異常に高い
ため、遺伝子工学的に生産する場合には産物が宿主のプ
ロテアーゼによって分解を受けやすい傾向が予想され
る。従って、このような産物を安定に、しかも大量に製
造する方法が望まれている。
の全域が解明されたが、HCVにはサブタイプの存在す
ることも証明された。特に、NANB型肝炎の感染性を
示すが、従来のC100−3抗原を用いる抗HCV抗体
測定系では陰性であった検体からHCVのサブタイプが
検出されたことは、従来のHCV診断法に新たな問題を
提起した。従って、C100−3抗原以外の抗原を用い
る別種の抗HCV抗体測定系の作製が望まれている。特
に、サブタイプ間でアミノ酸配列の保存された5’末端
側のコード領域を利用する抗体測定系の開発が注目され
ている。しかしながら、この領域(たとえばMet1〜G
ly120)では塩基性アミノ酸含量が23%と異常に高い
ため、遺伝子工学的に生産する場合には産物が宿主のプ
ロテアーゼによって分解を受けやすい傾向が予想され
る。従って、このような産物を安定に、しかも大量に製
造する方法が望まれている。
【0004】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、抗HCV
抗体陽性患者のプラズマからcDNAライブラリーを作
製し、これからHCVゲノムの5’末端配列を新たにク
ローニングし、従来のものとは一致しない新規なクロー
ンを分離した。このクローンを用いて推定のカプシド蛋
白にある高度保存領域を遺伝子工学的に大量かつ安定に
生産することを目標に研究を進めた結果、該領域はT7
ファージの遺伝子10産物あるいはヒト・インターロイ
キン2との融合蛋白として生産することにより所期の目
的を達成できることが分かり、本発明を完成した。すな
わち、本発明は、(1)抗HCV抗体陽性患者のプラズ
マからのRNAの抽出と、これを用いたリバース・トラ
ンスクリプターゼによるcDNAの合成、(2)既報の
HCVゲノムの配列[H. Okamotoら、Jpn. J. Exp. Me
d., 60, 167(1990)]をもとにしたプライマーの合成
と、このプライマーを用いたPCRによるカプシド蛋白
コード領域の増幅、(3)増幅されたDNAのベクター
へのサブクローニング、(4)サブクローニングされた
DNAの中から新規なカプシド蛋白コード領域の同定、
(5)該新規コード配列とT7ファージ遺伝子10ある
いはヒト・インターロイキン2遺伝子との融合遺伝子を
含有する組換えDNAの作製、(6)上記(5)記載の
組換えDNAを保持する形質転換体の分離、(7)上記
(6)記載の形質転換体を培養し、培養物中に新規なカ
プシド蛋白とT7ファージ遺伝子10産物あるいはヒト
・インターロイキン2とから成る融合蛋白を生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする該融合蛋白の製
造法を包含するものである。本発明は、(1)HCVゲ
ノムの新規なカプシド蛋白における、新規なアミノ酸配
列:Cys-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Thr-Thr-Ar
g-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Cys-Gly-Arg(配
列番号:1)を含有するポリペプチド(I)(当該アミノ
酸配列は、Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (1990)の記載
から、下記2のポリペプチド(II)において親水性に富
み、エピトープを形成する部位であると推定され、該配
列を含有するポリペプチド(I)は化学合成することも
できる。)、(2)上記1のポリペプチド(I)の前駆
体に相当する、新規なアミノ酸配列:Ser-Thr-Ile-Pro-
Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Ar
g-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-
Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Cys-Arg-Gly-Pro-Ar
g-Leu-Gly-Val-Arg-Thr-Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-
Ser-Gln-Pro-Cys-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Al
a-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Ala-Trp-Ala-Gln-Pro-Gly
(配列番号:2)を含有するポリペプチド(II)、(3)
HCVゲノムの新規なカプシド蛋白における、新規なア
ミノ酸配列:Ser-Thr-Ile-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Th
r-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-
Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Le
u-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-
Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Tr
p-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-
Arg-Ala-Trp-Ala-Gln-Pro-Gly(配列番号:3)を含有
するポリペプチド(III)、(4)ポリペプチド(I)と
T7ファージ遺伝子10産物もしくはヒト・インターロ
イキン2とから成る融合蛋白質(IVもしくはV)、(5)
ポリペプチド(II)とT7ファージ遺伝子10産物もし
くはヒト・インターロイキン2とから成る融合蛋白質
(VIもしくはVII)、(6)ポリペプチド(III)とT7
ファージ遺伝子10産物もしくはヒト・インターロイキ
ン2とから成る融合蛋白質(VIIIもしくはIX)、(7)
ポリペプチド(I、IIもしくはIII)をコードする塩基配
列を含有する組換えDNA(A、BもしくはC)、
(8)ポリペプチド(IV、V、VI、VII、VIIIもしくはX
I)をコードする塩基配列を含有する組換えDNA
(D、E、F、G、HもしくはI)、(9)組換えDN
A(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、
(H)、もしくは(I)を含有するベクターで形質転換さ
れた形質転換体、および(10)上記(9)を培地に培
養し、培養物中にポリペプチド(I)、(II)もしくは(I
II)、または融合蛋白(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VII
I)もしくは(IX)を生成蓄積せしめ、これを採取する
ことを特徴とする該ポリペプチドあるいは該融合蛋白質
の製造法である。上記ポリペプチド(I)をコードする
塩基配列を含有する組換えDNAとしては、たとえば塩
基配列:5'-TGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCACGACTAGGAAG
ACTTCCGAGCGGTCGCAACCTTGTGGAAGG-3'(配列番号:4)
などが挙げられる。上記ポリペプチド(II)をコードす
る塩基配列を含有する組換えDNAとしては、たとえば
塩基配列:5'-AGCACGATTCCCAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTA
ACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAAGTTCCCGGGCGGTGGTCAGATC
GTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGTGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCG
CACGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTTGTGGAAGGCGACAAC
CTATCCCCAAGGCTCGCCGACCCGAGGGCAGGGCCTGGGCTCAGCCCGGG
-3'(配列番号:5)などが挙げられる。上記ポリペプ
チド(III)をコードする塩基配列を含有する組換えD
NAとしては、たとえば塩基配列:5'-AGCACGATTCCCAAA
CCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAA
GTTCCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCA
GGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCG
CAACCTCGTGGATGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGACCCGAGGG
CAGGGCCTGGGCTCAGCCCGGG-3'(配列番号:6)などが挙
げられる。上記T7ファージ遺伝子10の塩基配列は、
ファージ本来の配列でもよく、またインクルージョン・
ボディーを形成するT7ファージ遺伝子10産物の性質
を変えないように変化したものであれば何でも良い。I
L−2遺伝子としては、その産物がインクルージョン・
ボディーを形成できるものであれば何でもよく、たとえ
ばヒトIL−2遺伝子[特開昭61-78799号公報]やその
変異型遺伝子、たとえば成熟型ヒトIL−2の125位
のシステイン残基がセリン残基に置換されたもの[特開
昭59-93093号公報]、該IL−2のアミノ末端のトラン
ケート型変異体[特開昭60-126088号公報]、該IL−
2のカルボキシル末端のトランケート型変異体、該IL
−2のアミノ末端あるいはカルボキシル末端のアミノ酸
の一部が欠損しているか、あるいは他のアミノ酸に置換
された変異体、該IL−2のアミノ末端あるいはカルボ
キシル末端にアミノ酸残基あるいはペプチドの付加され
た変異体などの遺伝子が挙げられる。
抗体陽性患者のプラズマからcDNAライブラリーを作
製し、これからHCVゲノムの5’末端配列を新たにク
ローニングし、従来のものとは一致しない新規なクロー
ンを分離した。このクローンを用いて推定のカプシド蛋
白にある高度保存領域を遺伝子工学的に大量かつ安定に
生産することを目標に研究を進めた結果、該領域はT7
ファージの遺伝子10産物あるいはヒト・インターロイ
キン2との融合蛋白として生産することにより所期の目
的を達成できることが分かり、本発明を完成した。すな
わち、本発明は、(1)抗HCV抗体陽性患者のプラズ
マからのRNAの抽出と、これを用いたリバース・トラ
ンスクリプターゼによるcDNAの合成、(2)既報の
HCVゲノムの配列[H. Okamotoら、Jpn. J. Exp. Me
d., 60, 167(1990)]をもとにしたプライマーの合成
と、このプライマーを用いたPCRによるカプシド蛋白
コード領域の増幅、(3)増幅されたDNAのベクター
へのサブクローニング、(4)サブクローニングされた
DNAの中から新規なカプシド蛋白コード領域の同定、
(5)該新規コード配列とT7ファージ遺伝子10ある
いはヒト・インターロイキン2遺伝子との融合遺伝子を
含有する組換えDNAの作製、(6)上記(5)記載の
組換えDNAを保持する形質転換体の分離、(7)上記
(6)記載の形質転換体を培養し、培養物中に新規なカ
プシド蛋白とT7ファージ遺伝子10産物あるいはヒト
・インターロイキン2とから成る融合蛋白を生成蓄積せ
しめ、これを採取することを特徴とする該融合蛋白の製
造法を包含するものである。本発明は、(1)HCVゲ
ノムの新規なカプシド蛋白における、新規なアミノ酸配
列:Cys-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Thr-Thr-Ar
g-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Cys-Gly-Arg(配
列番号:1)を含有するポリペプチド(I)(当該アミノ
酸配列は、Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (1990)の記載
から、下記2のポリペプチド(II)において親水性に富
み、エピトープを形成する部位であると推定され、該配
列を含有するポリペプチド(I)は化学合成することも
できる。)、(2)上記1のポリペプチド(I)の前駆
体に相当する、新規なアミノ酸配列:Ser-Thr-Ile-Pro-
Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Ar
g-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-
Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Cys-Arg-Gly-Pro-Ar
g-Leu-Gly-Val-Arg-Thr-Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-
Ser-Gln-Pro-Cys-Gly-Arg-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Al
a-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Ala-Trp-Ala-Gln-Pro-Gly
(配列番号:2)を含有するポリペプチド(II)、(3)
HCVゲノムの新規なカプシド蛋白における、新規なア
ミノ酸配列:Ser-Thr-Ile-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Th
r-Lys-Arg-Asn-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-
Phe-Pro-Gly-Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Le
u-Leu-Pro-Arg-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-
Thr-Arg-Lys-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Tr
p-Arg-Gln-Pro-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-
Arg-Ala-Trp-Ala-Gln-Pro-Gly(配列番号:3)を含有
するポリペプチド(III)、(4)ポリペプチド(I)と
T7ファージ遺伝子10産物もしくはヒト・インターロ
イキン2とから成る融合蛋白質(IVもしくはV)、(5)
ポリペプチド(II)とT7ファージ遺伝子10産物もし
くはヒト・インターロイキン2とから成る融合蛋白質
(VIもしくはVII)、(6)ポリペプチド(III)とT7
ファージ遺伝子10産物もしくはヒト・インターロイキ
ン2とから成る融合蛋白質(VIIIもしくはIX)、(7)
ポリペプチド(I、IIもしくはIII)をコードする塩基配
列を含有する組換えDNA(A、BもしくはC)、
(8)ポリペプチド(IV、V、VI、VII、VIIIもしくはX
I)をコードする塩基配列を含有する組換えDNA
(D、E、F、G、HもしくはI)、(9)組換えDN
A(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、
(H)、もしくは(I)を含有するベクターで形質転換さ
れた形質転換体、および(10)上記(9)を培地に培
養し、培養物中にポリペプチド(I)、(II)もしくは(I
II)、または融合蛋白(IV)、(V)、(VI)、(VII)、(VII
I)もしくは(IX)を生成蓄積せしめ、これを採取する
ことを特徴とする該ポリペプチドあるいは該融合蛋白質
の製造法である。上記ポリペプチド(I)をコードする
塩基配列を含有する組換えDNAとしては、たとえば塩
基配列:5'-TGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCACGACTAGGAAG
ACTTCCGAGCGGTCGCAACCTTGTGGAAGG-3'(配列番号:4)
などが挙げられる。上記ポリペプチド(II)をコードす
る塩基配列を含有する組換えDNAとしては、たとえば
塩基配列:5'-AGCACGATTCCCAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTA
ACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAAGTTCCCGGGCGGTGGTCAGATC
GTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGTGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCG
CACGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTTGTGGAAGGCGACAAC
CTATCCCCAAGGCTCGCCGACCCGAGGGCAGGGCCTGGGCTCAGCCCGGG
-3'(配列番号:5)などが挙げられる。上記ポリペプ
チド(III)をコードする塩基配列を含有する組換えD
NAとしては、たとえば塩基配列:5'-AGCACGATTCCCAAA
CCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAA
GTTCCCGGGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCA
GGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCG
CAACCTCGTGGATGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGACCCGAGGG
CAGGGCCTGGGCTCAGCCCGGG-3'(配列番号:6)などが挙
げられる。上記T7ファージ遺伝子10の塩基配列は、
ファージ本来の配列でもよく、またインクルージョン・
ボディーを形成するT7ファージ遺伝子10産物の性質
を変えないように変化したものであれば何でも良い。I
L−2遺伝子としては、その産物がインクルージョン・
ボディーを形成できるものであれば何でもよく、たとえ
ばヒトIL−2遺伝子[特開昭61-78799号公報]やその
変異型遺伝子、たとえば成熟型ヒトIL−2の125位
のシステイン残基がセリン残基に置換されたもの[特開
昭59-93093号公報]、該IL−2のアミノ末端のトラン
ケート型変異体[特開昭60-126088号公報]、該IL−
2のカルボキシル末端のトランケート型変異体、該IL
−2のアミノ末端あるいはカルボキシル末端のアミノ酸
の一部が欠損しているか、あるいは他のアミノ酸に置換
された変異体、該IL−2のアミノ末端あるいはカルボ
キシル末端にアミノ酸残基あるいはペプチドの付加され
た変異体などの遺伝子が挙げられる。
【0005】本発明で得られた新規なHCVポリペプチ
ドをコードするRNAは、NANB型肝炎患者のプラズ
マあるいは肝臓から得ることができる。これらの材料か
らRNAを調製する方法としては、グアニジン・チオシ
アネート法[J. M. Chirgwinら、バイオケミストリー
(Biochemistry), 18, 5294 (1979)]などが挙げられ
る。このようにして得られたRNAに既報[WO 89/0466
9]のHCVゲノムの5'末端領域に基づいて合成された
アンチセンス・プライマー(A)を添加した後、リバー
ス・トランスクリプターゼを加えてcDNAを合成する
ことができる。このcDNA標品に既報[H. Okamoto
ら、Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (1990)]のHC−J
1の5’側末端コード領域に相当するセンス・プライマ
ー(B)とアンチセンス・プライマー(C)を添加し、
製造業者(たとえば、Cetus/Perkin-Elmer) のキットの
指示書に従ってPCRを行うことができる。増幅された
cDNAを自体公知の方法、たとえばアガロース電気泳
動で分離した後、ゲルから回収することができる。この
cDNAの塩基配列はジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止法[T. Messingら、Nucl. Acids Res., 9, 309 (198
1)]によって決定することができる。
ドをコードするRNAは、NANB型肝炎患者のプラズ
マあるいは肝臓から得ることができる。これらの材料か
らRNAを調製する方法としては、グアニジン・チオシ
アネート法[J. M. Chirgwinら、バイオケミストリー
(Biochemistry), 18, 5294 (1979)]などが挙げられ
る。このようにして得られたRNAに既報[WO 89/0466
9]のHCVゲノムの5'末端領域に基づいて合成された
アンチセンス・プライマー(A)を添加した後、リバー
ス・トランスクリプターゼを加えてcDNAを合成する
ことができる。このcDNA標品に既報[H. Okamoto
ら、Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (1990)]のHC−J
1の5’側末端コード領域に相当するセンス・プライマ
ー(B)とアンチセンス・プライマー(C)を添加し、
製造業者(たとえば、Cetus/Perkin-Elmer) のキットの
指示書に従ってPCRを行うことができる。増幅された
cDNAを自体公知の方法、たとえばアガロース電気泳
動で分離した後、ゲルから回収することができる。この
cDNAの塩基配列はジデオキシヌクレオチド合成鎖停
止法[T. Messingら、Nucl. Acids Res., 9, 309 (198
1)]によって決定することができる。
【0006】クローン化されたcDNAを有するプラス
ミドはそのまま、あるいは所望により適当な制限酵素で
切り出して別のベクターに挿入して用いることができ
る。ベクターとしては、宿主に対応して複製できるもの
であれば何でもよい。宿主がエシェリキア属菌(Escher
ichia coli, 大腸菌) の場合には、大腸菌由来のプラス
ミド、例えばpBR322[F.Bolivarら, Gene, 2, 9
5 (1979)],pBR325,pUCl2、pUCl3な
どが挙げられる。宿主がバチルス(Bacillus)属菌の場
合には、スタフィロコッカス(Staphylococcus)由来プ
ラスミド、例えばpUBl10 (T. J. Gryczan and D.
Dubnau,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 128 (197
8)],pTP5[N. Noguchi,Gene, 2, 95 (1979)],
pCl94[D. Dubnau, エキスペリメンタル・マニピ
ュレーション・オブ・ジーン・エクスプレッション(Ex
perimental Manipulation of Gene Expression; ed. M.
Inouye), 83頁、アカデミック・プレス(Academic Pre
ss), (1983)]などが挙げられる。宿主が酵母である場
合には、酵母由来プラスミド、例えばpSHl9[S. H
arashimaら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー(Mol. Cell. Biol.),4, 771(1984)], pSH
l9−1(ヨーロッパ特許出願公開 EP-A-0235430)など
が挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、例えばpB
R322にSV40のoriの挿入されたpSV2−X
[R. C. Mulligan and P. Berg,Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA, 78,2072(1981)],pcD−X[H. Okayama a
nd P. Berg,Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)]など
が挙げられる。
ミドはそのまま、あるいは所望により適当な制限酵素で
切り出して別のベクターに挿入して用いることができ
る。ベクターとしては、宿主に対応して複製できるもの
であれば何でもよい。宿主がエシェリキア属菌(Escher
ichia coli, 大腸菌) の場合には、大腸菌由来のプラス
ミド、例えばpBR322[F.Bolivarら, Gene, 2, 9
5 (1979)],pBR325,pUCl2、pUCl3な
どが挙げられる。宿主がバチルス(Bacillus)属菌の場
合には、スタフィロコッカス(Staphylococcus)由来プ
ラスミド、例えばpUBl10 (T. J. Gryczan and D.
Dubnau,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 128 (197
8)],pTP5[N. Noguchi,Gene, 2, 95 (1979)],
pCl94[D. Dubnau, エキスペリメンタル・マニピ
ュレーション・オブ・ジーン・エクスプレッション(Ex
perimental Manipulation of Gene Expression; ed. M.
Inouye), 83頁、アカデミック・プレス(Academic Pre
ss), (1983)]などが挙げられる。宿主が酵母である場
合には、酵母由来プラスミド、例えばpSHl9[S. H
arashimaら、モレキュラー・アンド・セルラー・バイオ
ロジー(Mol. Cell. Biol.),4, 771(1984)], pSH
l9−1(ヨーロッパ特許出願公開 EP-A-0235430)など
が挙げられる。宿主が動物細胞の場合には、例えばpB
R322にSV40のoriの挿入されたpSV2−X
[R. C. Mulligan and P. Berg,Proc.Natl. Acad. Sc
i. USA, 78,2072(1981)],pcD−X[H. Okayama a
nd P. Berg,Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)]など
が挙げられる。
【0007】クローン化されたcDNAは5’末端に翻
訳開始コドン(ATG)を有し、また3’末端に翻訳終
止コドン(TAG、TGAあるいはTAA)を有してい
てもよい。さらに該cDNAを発現させるためにその上
流にプロモーター配列、プロモーター−プレ−プロ配列
あるいはプロモーター−シグナル配列を接続する。本発
明に用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に
用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいか
なるものでもよい。宿主が大腸菌である場合には、tr
pプロモーター、lacプロモーター、λPL(Lは下
付きのLである)プロモーター、T7プロモーター、t
acプロモーター、lppプロモーター、recAプロ
モーターなどが挙げられ、とりわけT7プロモーターが
好ましい。宿主がバチルス属菌である場合には、SPO
1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロ
モーター、MWPプロモーターなどが挙げられ、とりわ
けMWPプロモーターが好ましい。宿主が酵母である場
合には、GAPDHプロモーター、PGKプロモータ
ー、PHO5プロモーター、ADHプロモーター、PH
O81プロモーターなどが挙げられ、とりわけGAPD
Hプロモーターが好ましい。宿主が動物細胞である場合
には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスの
プロモーターなどが挙げられる。プロモーターは対応す
る遺伝子より調製することができる。また、化学合成す
ることもできる。
訳開始コドン(ATG)を有し、また3’末端に翻訳終
止コドン(TAG、TGAあるいはTAA)を有してい
てもよい。さらに該cDNAを発現させるためにその上
流にプロモーター配列、プロモーター−プレ−プロ配列
あるいはプロモーター−シグナル配列を接続する。本発
明に用いられるプロモーターとしては、遺伝子の発現に
用いる宿主に対応して適切なプロモーターであればいか
なるものでもよい。宿主が大腸菌である場合には、tr
pプロモーター、lacプロモーター、λPL(Lは下
付きのLである)プロモーター、T7プロモーター、t
acプロモーター、lppプロモーター、recAプロ
モーターなどが挙げられ、とりわけT7プロモーターが
好ましい。宿主がバチルス属菌である場合には、SPO
1プロモーター、SPO2プロモーター、penPプロ
モーター、MWPプロモーターなどが挙げられ、とりわ
けMWPプロモーターが好ましい。宿主が酵母である場
合には、GAPDHプロモーター、PGKプロモータ
ー、PHO5プロモーター、ADHプロモーター、PH
O81プロモーターなどが挙げられ、とりわけGAPD
Hプロモーターが好ましい。宿主が動物細胞である場合
には、SV40由来のプロモーター、レトロウイルスの
プロモーターなどが挙げられる。プロモーターは対応す
る遺伝子より調製することができる。また、化学合成す
ることもできる。
【0008】シグナル配列およびプレ−プロ配列は、宿
主で機能するものであれば何でもよい。大腸菌の場合に
は、β−ラクタマーゼ遺伝子のシグナル配列、エンテロ
トキシン遺伝子のシグナル配列、アルカリ性ホスファタ
ーゼ遺伝子のシグナル配列、OmpA遺伝子のシグナル
配列などが挙げられる。バチルス属菌の場合には、α−
アミラーゼ遺伝子のシグナル配列、中性プロテアーゼ遺
伝子のシグナル配列、MWP遺伝子のシグナル配列など
が挙げられる。酵母の場合には、卵白リゾチーム遺伝子
のシグナル配列、ヒト・リゾチーム遺伝子のシグナル配
列、インベルターゼ遺伝子のシグナル配列、α−ファク
ター遺伝子のプレ−プロ配列などが挙げられる。動物細
胞の場合には、インターロイキン2遺伝子のシグナル配
列などが挙げられる。このようにして構築されたDNA
(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、(H)あ
るいは(I)を含有するベクターを用いて、形質転換体
を製造する。宿主としては、例えばエシェリキア属菌、
バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。エシ
ェリキア属菌としては、エシェリキア・コリK12DH
1[B. Low,Proc. Natl. Acad. Sci.USA,60, 160 (1
968)]、C600[R. K. Appleyard,ジェネティックス
(Genetics), 39, 440 (1954)]、MM294[K. Back
manら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (1976)
]などが挙げられる。バチルス属菌としては、例えば
バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)MI114
[K. Yoshimuraら、Gene. 24, 255 (1983)]、207−
21[K. Ohmuraら、ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー(J. Biochem.), 95, 87 (1984)]、バチルス・
ブレビス47[S. Udaka. アグリカルチュラル・バイオ
ロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.), 40, 5
23 (1976)]などが挙げられる。酵母としては、例えば
サッカロマイセス・セレビシェ(Saccharomyses cerevi
siae)AH22R~[A.Miyanoharaら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 80,1 (1983)],NA87−11A、D
KD−5D、NA74−3A、NA74−3Aρ~[Y.K
aisho ら、イースト(Yeast) , 5, 91 (1989)]やシゾ
サッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e) ATCC38399(h~ leul-32), TH168(h
90 ade6-M210 ural leul)[M. Kishida and C. Shimad
a, カレント・ジェネティクス(Current Genetics), 10,
443 (1986)]などが挙げられる。動物細胞としては、
例えば付着細胞であるサルCOS−7細胞、サルVer
o細胞、チャイニーズ・ハムスター(CHO)細胞、マ
ウスL細胞、ヒトFL細胞、および浮遊細胞であるマウ
スミエローマ細胞(SP2/0など)、マウスYAC−
1細胞、マウスMethA細胞、マウスP388細胞、
マウスEL−4細胞などが挙げられる。
主で機能するものであれば何でもよい。大腸菌の場合に
は、β−ラクタマーゼ遺伝子のシグナル配列、エンテロ
トキシン遺伝子のシグナル配列、アルカリ性ホスファタ
ーゼ遺伝子のシグナル配列、OmpA遺伝子のシグナル
配列などが挙げられる。バチルス属菌の場合には、α−
アミラーゼ遺伝子のシグナル配列、中性プロテアーゼ遺
伝子のシグナル配列、MWP遺伝子のシグナル配列など
が挙げられる。酵母の場合には、卵白リゾチーム遺伝子
のシグナル配列、ヒト・リゾチーム遺伝子のシグナル配
列、インベルターゼ遺伝子のシグナル配列、α−ファク
ター遺伝子のプレ−プロ配列などが挙げられる。動物細
胞の場合には、インターロイキン2遺伝子のシグナル配
列などが挙げられる。このようにして構築されたDNA
(A)、(B)、(C)、(D)、(E)、(F)、(G)、(H)あ
るいは(I)を含有するベクターを用いて、形質転換体
を製造する。宿主としては、例えばエシェリキア属菌、
バチルス属菌、酵母、動物細胞などが挙げられる。エシ
ェリキア属菌としては、エシェリキア・コリK12DH
1[B. Low,Proc. Natl. Acad. Sci.USA,60, 160 (1
968)]、C600[R. K. Appleyard,ジェネティックス
(Genetics), 39, 440 (1954)]、MM294[K. Back
manら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 73, 4174 (1976)
]などが挙げられる。バチルス属菌としては、例えば
バチルス・サチルス(Bacillus subtilis)MI114
[K. Yoshimuraら、Gene. 24, 255 (1983)]、207−
21[K. Ohmuraら、ジャーナル・オブ・バイオケミス
トリー(J. Biochem.), 95, 87 (1984)]、バチルス・
ブレビス47[S. Udaka. アグリカルチュラル・バイオ
ロジカル・ケミストリー(Agric. Biol. Chem.), 40, 5
23 (1976)]などが挙げられる。酵母としては、例えば
サッカロマイセス・セレビシェ(Saccharomyses cerevi
siae)AH22R~[A.Miyanoharaら、Proc. Natl. Ac
ad. Sci. USA, 80,1 (1983)],NA87−11A、D
KD−5D、NA74−3A、NA74−3Aρ~[Y.K
aisho ら、イースト(Yeast) , 5, 91 (1989)]やシゾ
サッカロマイセス・ポンベ(Schizosaccharomyces pomb
e) ATCC38399(h~ leul-32), TH168(h
90 ade6-M210 ural leul)[M. Kishida and C. Shimad
a, カレント・ジェネティクス(Current Genetics), 10,
443 (1986)]などが挙げられる。動物細胞としては、
例えば付着細胞であるサルCOS−7細胞、サルVer
o細胞、チャイニーズ・ハムスター(CHO)細胞、マ
ウスL細胞、ヒトFL細胞、および浮遊細胞であるマウ
スミエローマ細胞(SP2/0など)、マウスYAC−
1細胞、マウスMethA細胞、マウスP388細胞、
マウスEL−4細胞などが挙げられる。
【0009】エシェリキア属菌を形質転換するには、例
えばT. Maniatisら、Molecular Cloning,Cold Spring
Harbor Laboratory, 249頁 (1982)などに記載の方法に
従って行われる。バチルス属菌を形質転換する方法とし
ては、S. Chang and S. N. Cohen,モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティクス(Mol. Gen. Genet.),
168, 111 (1979) などに記載の方法に従って行われ
る。酵母を形質転換するには、例えば A. Hinnenら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載の
方法に従って行われる。動物細胞を形質転換するには、
例えば M. Wiglerら、セル(Cell), 14, 725 (1978)に
記載の方法に従って行われる。このようにして得られた
形質転換体をそれ自体公知の方法で培養する。宿主がエ
シェリキア属菌である形質転換体を培養する際、培地と
しては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地
[J. H. Miller, エクスペリメンツ・イン・モレキュラ
ー・ジェネティクス(Experiments in Molecular Genet
ics),431頁, Cold Spring Harbor Laboratory, (197
2)]が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率
よく働かせるために、例えばイソプロピルチオガラクト
シド(IPTG)やインドリル−3−アクリル酸のよう
な薬剤を加えることができる。培養は通常約15〜43
℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加
えることもできる。宿主がバチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培地としては、例えばL−ブロス培
地、T2培地[S. Udaka, Agric. Biol. Chem.,40, 52
3(1976)]などが挙げられる。培養は通常約15〜37
℃で約6〜96時間行い、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えばバークホールダー(Burkhold
er)最小培地[K. L. Bostainら、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA,77, 4504 (1980)]などが挙げられる。培地のp
Hは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約2
0〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気
や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培
養する際、培地としては、例えば約5〜20%の胎児牛
血清を含むMEM培地[H.Eagle, サイエンス(Scien
ce), 130, 432 (1959)]、DMEM培地[R. Dulbecco
and G. Freeman, ヴィロロジー(Virology), 8, 396 (1
959)]、RPMI−1640培地[G. E. Moreら、ジャ
ーナル・オブ・ジ・アメリカン・メディカル・アソシエ
ーション(J.Am. Med. Assoc.), 199, 519 (1967)]、
199培地[J. F. Morganら、プロシージング・オブ・
ザ・ソサイエティ・フォー・エクスペリメンタル・バイ
オロジー・アンド・メディスン(Proc. Soc. Exp. Bio
l. Med.), 73,1 (1950)]などが挙げられる。培養は通
常約30〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。本発明によれば、上記培養物か
ら、HCV由来の新規なポリペプチドを単離するには、
自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うこと
ができる。これらの公知の分離・精製法としては、塩折
や溶媒沈澱などの溶解度を利用する方法、透析法、限外
ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する
方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を
利用する方法、アフィニティクロマトグラフィーなどの
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられ
る。
えばT. Maniatisら、Molecular Cloning,Cold Spring
Harbor Laboratory, 249頁 (1982)などに記載の方法に
従って行われる。バチルス属菌を形質転換する方法とし
ては、S. Chang and S. N. Cohen,モレキュラー・アン
ド・ジェネラル・ジェネティクス(Mol. Gen. Genet.),
168, 111 (1979) などに記載の方法に従って行われ
る。酵母を形質転換するには、例えば A. Hinnenら、Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)に記載の
方法に従って行われる。動物細胞を形質転換するには、
例えば M. Wiglerら、セル(Cell), 14, 725 (1978)に
記載の方法に従って行われる。このようにして得られた
形質転換体をそれ自体公知の方法で培養する。宿主がエ
シェリキア属菌である形質転換体を培養する際、培地と
しては、例えばグルコース、カザミノ酸を含むM9培地
[J. H. Miller, エクスペリメンツ・イン・モレキュラ
ー・ジェネティクス(Experiments in Molecular Genet
ics),431頁, Cold Spring Harbor Laboratory, (197
2)]が好ましい。ここに必要によりプロモーターを効率
よく働かせるために、例えばイソプロピルチオガラクト
シド(IPTG)やインドリル−3−アクリル酸のよう
な薬剤を加えることができる。培養は通常約15〜43
℃で約3〜24時間行い、必要により、通気や撹拌を加
えることもできる。宿主がバチルス属菌である形質転換
体を培養する際、培地としては、例えばL−ブロス培
地、T2培地[S. Udaka, Agric. Biol. Chem.,40, 52
3(1976)]などが挙げられる。培養は通常約15〜37
℃で約6〜96時間行い、必要により通気や撹拌を加え
ることもできる。宿主が酵母である形質転換体を培養す
る際、培地としては、例えばバークホールダー(Burkhold
er)最小培地[K. L. Bostainら、Proc. Natl. Acad. Sc
i. USA,77, 4504 (1980)]などが挙げられる。培地のp
Hは約5〜8に調整するのが好ましい。培養は通常約2
0〜35℃で約24〜72時間行い、必要に応じて通気
や撹拌を加える。宿主が動物細胞である形質転換体を培
養する際、培地としては、例えば約5〜20%の胎児牛
血清を含むMEM培地[H.Eagle, サイエンス(Scien
ce), 130, 432 (1959)]、DMEM培地[R. Dulbecco
and G. Freeman, ヴィロロジー(Virology), 8, 396 (1
959)]、RPMI−1640培地[G. E. Moreら、ジャ
ーナル・オブ・ジ・アメリカン・メディカル・アソシエ
ーション(J.Am. Med. Assoc.), 199, 519 (1967)]、
199培地[J. F. Morganら、プロシージング・オブ・
ザ・ソサイエティ・フォー・エクスペリメンタル・バイ
オロジー・アンド・メディスン(Proc. Soc. Exp. Bio
l. Med.), 73,1 (1950)]などが挙げられる。培養は通
常約30〜40℃で約15〜60時間行い、必要に応じ
て通気や撹拌を加える。本発明によれば、上記培養物か
ら、HCV由来の新規なポリペプチドを単離するには、
自体公知の分離・精製法を適切に組み合わせて行うこと
ができる。これらの公知の分離・精製法としては、塩折
や溶媒沈澱などの溶解度を利用する方法、透析法、限外
ろ過法、ゲルろ過法、およびSDS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利用する
方法、イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電の差を
利用する方法、アフィニティクロマトグラフィーなどの
特異的親和性を利用する方法、逆相高速液体クロマトグ
ラフィーなどの疎水性の差を利用する方法、等電点電気
泳動法などの等電点の差を利用する方法などが挙げられ
る。
【0010】
【作用および効果】本発明で得られる新規ポリペプチド
は、サブタイプの存在するHCVゲノムのなかではよく
アミノ酸配列の保存された領域であるために、HCV抗
体の検出のための抗原として用いることができる。すな
わち、たとえば、本発明のポリペプチドを抗原として固
相に固定したものおよび酵素を標識したまたはラジオア
イソトープでラベルしたヒト由来の抗体であって該HC
V抗体と結合能を有するものを試薬として用い、患者の
血清を検体として用い、サンドイッチEIAまたはRI
Aを行うことにより、該患者の血清中のHCV抗体を検
出することができる。さらに、該ポリペプチドはHCV
感染を予防するためのワクチンの免疫原として、またH
CV感染者の治療に用いる免疫療法剤として用いること
ができる。なお、本願明細書や図面において、塩基やア
ミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB
Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を次に挙げる。またアミノ酸に関して光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければL−体を示すも
のとする。 DNA :デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン SDS :ドデシル硫酸ナトリウム Gly :グリシン(G) Ala :アラニン(A) Val :バリン(V) Leu :ロイシン(L) Ile :イソロイシン(I) Ser :セリン(S) Thr :スレオニン(T) Cys :システイン(C) 1/2 Cys:ハーフシスチン Met :メチオニン(M) Glu :グルタミン酸(E) Asp :アスパラギン酸(D) Lys :リジン(K) Arg :アルギニン(R) His :ヒスチジン(H) Phe :フェニールアラニン(F) Tyr :チロシン(Y) Trp :トリプトファン(W) Pro :プロリン(P) Asn :アスパラギン(N) Gln :グルタミン(Q) Apr :アンピシリン耐性遺伝子(注:rは上付き
のrを表す) Tcr :テトラサイクリン耐性遺伝子(注:rは上
付きのrを表す) なお、本発明のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配
列の一部が修飾(付加、除去、その他のアミノ酸への置
換など)されてもよい。
は、サブタイプの存在するHCVゲノムのなかではよく
アミノ酸配列の保存された領域であるために、HCV抗
体の検出のための抗原として用いることができる。すな
わち、たとえば、本発明のポリペプチドを抗原として固
相に固定したものおよび酵素を標識したまたはラジオア
イソトープでラベルしたヒト由来の抗体であって該HC
V抗体と結合能を有するものを試薬として用い、患者の
血清を検体として用い、サンドイッチEIAまたはRI
Aを行うことにより、該患者の血清中のHCV抗体を検
出することができる。さらに、該ポリペプチドはHCV
感染を予防するためのワクチンの免疫原として、またH
CV感染者の治療に用いる免疫療法剤として用いること
ができる。なお、本願明細書や図面において、塩基やア
ミノ酸などを略号で表示する場合、IUPAC−IUB
Commision on Biochemical Nomenclatureによる略号あ
るいは当該分野における慣用略号に基づくものであり、
その例を次に挙げる。またアミノ酸に関して光学異性体
があり得る場合は、特に明示しなければL−体を示すも
のとする。 DNA :デオキシリボ核酸 A :アデニン T :チミン G :グアニン C :シトシン SDS :ドデシル硫酸ナトリウム Gly :グリシン(G) Ala :アラニン(A) Val :バリン(V) Leu :ロイシン(L) Ile :イソロイシン(I) Ser :セリン(S) Thr :スレオニン(T) Cys :システイン(C) 1/2 Cys:ハーフシスチン Met :メチオニン(M) Glu :グルタミン酸(E) Asp :アスパラギン酸(D) Lys :リジン(K) Arg :アルギニン(R) His :ヒスチジン(H) Phe :フェニールアラニン(F) Tyr :チロシン(Y) Trp :トリプトファン(W) Pro :プロリン(P) Asn :アスパラギン(N) Gln :グルタミン(Q) Apr :アンピシリン耐性遺伝子(注:rは上付き
のrを表す) Tcr :テトラサイクリン耐性遺伝子(注:rは上
付きのrを表す) なお、本発明のポリペプチドにおいて、そのアミノ酸配
列の一部が修飾(付加、除去、その他のアミノ酸への置
換など)されてもよい。
【0011】
【実施例】以下の実施例により本発明をより具体的に説
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
後述の実施例5で得られた形質転換体エシェリキア コ
リ(Escherichia coli)MM294(DE3)/pHC
a101CFおよびE.coli MM294(DE
3)/pHCb101CF、は平成2年11月9日から
財団法人発酵研究所(IFO)に受託番号IFO 15
107およびIFO 15108としてそれぞれ寄託さ
れており、又これらの形質転換体は平成2年11月22
日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(F
RI)に寄託番号FERM BP−3171及びFER
M BP−3172としてそれぞれ寄託されている。
明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
後述の実施例5で得られた形質転換体エシェリキア コ
リ(Escherichia coli)MM294(DE3)/pHC
a101CFおよびE.coli MM294(DE
3)/pHCb101CF、は平成2年11月9日から
財団法人発酵研究所(IFO)に受託番号IFO 15
107およびIFO 15108としてそれぞれ寄託さ
れており、又これらの形質転換体は平成2年11月22
日から通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(F
RI)に寄託番号FERM BP−3171及びFER
M BP−3172としてそれぞれ寄託されている。
【0012】後述の実施例10で得られた形質転換体エ
シェリキア コリ(Escherichia coli)MM294(D
E3)/pHCa201CFは平成3年9月5日から財
団法人発酵研究所(IFO)に受託番号IFO 152
21として、又この形質転換体は平成3年9月11日か
ら通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(FR
I)に寄託番号FERM BP−3562として寄託さ
れている。
シェリキア コリ(Escherichia coli)MM294(D
E3)/pHCa201CFは平成3年9月5日から財
団法人発酵研究所(IFO)に受託番号IFO 152
21として、又この形質転換体は平成3年9月11日か
ら通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所(FR
I)に寄託番号FERM BP−3562として寄託さ
れている。
【0013】実施例1 C100−3抗体陽性血漿由来
cDNAからのHCV遺伝子の増幅 ベックマン(Beckman)製の超遠心ローターSW28用チ
ューブに10mM Tris−HCl(pH8.0)を
含む12mlの20%(w/v)庶糖を注入した後、C
100−3抗体陽性の血漿23mlを重層して室温、2
8,000回転/分(rpm)で4時間、超遠心分離を行っ
た。70ml分の該血漿から得られた沈澱を50mM
Tris−HCl(pH8.0),200mM NaC
l、10mMEDTA、2%(w/v)SDS、1mg
/ml Proteinase K(メルク社製)を含む
溶液3mlで溶解し、65℃、1時間静置した。この溶
液に等容量のフェノールとクロロホルムを加えて水層を
抽出した後、該水相に5μgのグリコーゲン、10分の
1倍容量の3M酢酸ナトリウム溶液(pH4.8)、2倍
容量のエタノールを加えて−20℃で一昼夜静置した。
この液をエッペンドルフ微量遠心機で室温、10,00
0rpmで10分間遠心分離にかけ、得られた沈澱(核酸
画分)を30μlの蒸留水で溶解した。一方、既報のH
CV塩基配列[H. Okamotoら、Jpn. J. Exp. Med., 60,
167 (1990); WO 89/04669; 特開平2−500880]
の5’末端を塩基番号1とした時、2023〜2042
に相当するアンチセンス・プライマーNo.2:5' C C
T C C G A T G A C A C A A G G A G G 3'(配列番号:
7)、塩基番号325〜347[H. Okamotoら、Jpn.
J. Exp. Med., 60, 167 (1990)]に対応するセンス・プ
ライマーNo.217:5' C A A G A T C T C G G A T
G A G C A C G A T T C C C A A A C C T CA 3'(配列
番号:8)、塩基番号679〜701[H. Okamotoら、
Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (1990)] に対応するアン
チセンス・プライマーNo.219:5' C T A G A T C
T T C A G A G G G T A T C G A T G A C C T T A C C
CA A 3'(配列番号:9)、をそれぞれ合成し、cDN
A作製用プライマーとして用いた。上記核酸画分の10
分の1量(3μl)にプライマーNo.2を60pmol
加えて75℃、10分間保温した後、氷中で急冷した。
次に50mM Tris−HCl(pH8.3)、75m
M KCl、3mM MgCl2、0.4mM 各dNT
P、10mM DTT、200unitsリバース・ト
ランスクリプターゼ[SuperScript(Trade Mark) RT(Lif
e Technologies, Inc.)]を含有する溶液中で42℃、
1時間のcDNA合成反応を行い、70℃、10分間加
熱して反応を停止させた。得られたcDNA画分の5分
の1量に2種類のプライマー(No.217と219;各
100pmol)を加え、シータス/パーキン−エルマ
ー(Cetus/Perkin-Elmer) により供給されたキット指示
書に従って、94℃、1分間、55℃、2分間、72
℃、3分間の反応を40回繰り返すPCRを行った。
cDNAからのHCV遺伝子の増幅 ベックマン(Beckman)製の超遠心ローターSW28用チ
ューブに10mM Tris−HCl(pH8.0)を
含む12mlの20%(w/v)庶糖を注入した後、C
100−3抗体陽性の血漿23mlを重層して室温、2
8,000回転/分(rpm)で4時間、超遠心分離を行っ
た。70ml分の該血漿から得られた沈澱を50mM
Tris−HCl(pH8.0),200mM NaC
l、10mMEDTA、2%(w/v)SDS、1mg
/ml Proteinase K(メルク社製)を含む
溶液3mlで溶解し、65℃、1時間静置した。この溶
液に等容量のフェノールとクロロホルムを加えて水層を
抽出した後、該水相に5μgのグリコーゲン、10分の
1倍容量の3M酢酸ナトリウム溶液(pH4.8)、2倍
容量のエタノールを加えて−20℃で一昼夜静置した。
この液をエッペンドルフ微量遠心機で室温、10,00
0rpmで10分間遠心分離にかけ、得られた沈澱(核酸
画分)を30μlの蒸留水で溶解した。一方、既報のH
CV塩基配列[H. Okamotoら、Jpn. J. Exp. Med., 60,
167 (1990); WO 89/04669; 特開平2−500880]
の5’末端を塩基番号1とした時、2023〜2042
に相当するアンチセンス・プライマーNo.2:5' C C
T C C G A T G A C A C A A G G A G G 3'(配列番号:
7)、塩基番号325〜347[H. Okamotoら、Jpn.
J. Exp. Med., 60, 167 (1990)]に対応するセンス・プ
ライマーNo.217:5' C A A G A T C T C G G A T
G A G C A C G A T T C C C A A A C C T CA 3'(配列
番号:8)、塩基番号679〜701[H. Okamotoら、
Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (1990)] に対応するアン
チセンス・プライマーNo.219:5' C T A G A T C
T T C A G A G G G T A T C G A T G A C C T T A C C
CA A 3'(配列番号:9)、をそれぞれ合成し、cDN
A作製用プライマーとして用いた。上記核酸画分の10
分の1量(3μl)にプライマーNo.2を60pmol
加えて75℃、10分間保温した後、氷中で急冷した。
次に50mM Tris−HCl(pH8.3)、75m
M KCl、3mM MgCl2、0.4mM 各dNT
P、10mM DTT、200unitsリバース・ト
ランスクリプターゼ[SuperScript(Trade Mark) RT(Lif
e Technologies, Inc.)]を含有する溶液中で42℃、
1時間のcDNA合成反応を行い、70℃、10分間加
熱して反応を停止させた。得られたcDNA画分の5分
の1量に2種類のプライマー(No.217と219;各
100pmol)を加え、シータス/パーキン−エルマ
ー(Cetus/Perkin-Elmer) により供給されたキット指示
書に従って、94℃、1分間、55℃、2分間、72
℃、3分間の反応を40回繰り返すPCRを行った。
【0014】実施例2 HCVcDNAのクローニング
とその塩基配列の決定 上記PCR産物を1.2%アガロース電気泳動で分離し
た後、HCV塩基配列から予想される大きさ(約400
bp;塩基番号325〜701に相当)に相当する位置
のアガロースゲルからDNA断片を回収した。得られた
DNA断片をT4ポリヌクレオチド・キナーゼ[宝酒造
(株)製]と[γ−32P]−ATPにより5’末端をリ
ン酸化した後、T4DNAリガーゼ[宝酒造(株)製]
とATPによりプラスミドpUC118[宝酒造(株)
製]のHincII部位に挿入し、cDNA部分の塩基配
列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法[J. Messing
ら、Nucl.Acids Res., 9, 309, (1981)]によって決定
した。その結果、該DNA断片は既報の配列とは明らか
に異なる1種類のHCV cDNA(a型)を含んでい
ることが分かった。a型のcDNA断片を含むプラスミ
ドをpHCa101と命名し、cDNA部分の塩基配列
および塩基配列より予測されるアミノ酸配列を各々図1
と図2に示した。同様に他のC100−3抗体陽性血漿
由来cDNAについてもPCRを行った結果、a型と同
じ大きさの産物が回収された。塩基配列を解析したとこ
ろ H. Okamotoら[Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (199
0)]の報告したHC−J4株と全く同じHCV cDN
A以外に、新規なHCV cDNA(b型)がクローニ
ングされていることが判明した。そこで、上記b型cD
NAを有するプラスミドをpHCb101と命名した。
その塩基配列および塩基配列より予測されるアミノ酸配
列を各々図1と図2に示した。これらのa型とb型のc
DNAより予測されるアミノ酸配列は、従来知られてい
たHCVのアミノ酸配列と高い相同性を示したが、既知
のHCVポリペプチドと一致するものはなく、新規なH
CVポリペプチドであることが分かった。
とその塩基配列の決定 上記PCR産物を1.2%アガロース電気泳動で分離し
た後、HCV塩基配列から予想される大きさ(約400
bp;塩基番号325〜701に相当)に相当する位置
のアガロースゲルからDNA断片を回収した。得られた
DNA断片をT4ポリヌクレオチド・キナーゼ[宝酒造
(株)製]と[γ−32P]−ATPにより5’末端をリ
ン酸化した後、T4DNAリガーゼ[宝酒造(株)製]
とATPによりプラスミドpUC118[宝酒造(株)
製]のHincII部位に挿入し、cDNA部分の塩基配
列をジデオキシヌクレオチド合成鎖停止法[J. Messing
ら、Nucl.Acids Res., 9, 309, (1981)]によって決定
した。その結果、該DNA断片は既報の配列とは明らか
に異なる1種類のHCV cDNA(a型)を含んでい
ることが分かった。a型のcDNA断片を含むプラスミ
ドをpHCa101と命名し、cDNA部分の塩基配列
および塩基配列より予測されるアミノ酸配列を各々図1
と図2に示した。同様に他のC100−3抗体陽性血漿
由来cDNAについてもPCRを行った結果、a型と同
じ大きさの産物が回収された。塩基配列を解析したとこ
ろ H. Okamotoら[Jpn. J. Exp. Med., 60, 167 (199
0)]の報告したHC−J4株と全く同じHCV cDN
A以外に、新規なHCV cDNA(b型)がクローニ
ングされていることが判明した。そこで、上記b型cD
NAを有するプラスミドをpHCb101と命名した。
その塩基配列および塩基配列より予測されるアミノ酸配
列を各々図1と図2に示した。これらのa型とb型のc
DNAより予測されるアミノ酸配列は、従来知られてい
たHCVのアミノ酸配列と高い相同性を示したが、既知
のHCVポリペプチドと一致するものはなく、新規なH
CVポリペプチドであることが分かった。
【0015】実施例3 発現ベクターの構築−1 実施例2で得られたプラスミドpHCa101とpHC
b101を制限酵素BglIIで消化した後、それぞれか
ら0.38kbのDNA断片を分離した。これらの断片
をプラスミドpET−3xa[メソッズ・イン・エンザ
イモロジー(Methods in Enzymology. ed. D. V. Goedde
l), 185巻、68頁、アカデミック・プレス (Academic Pr
ess),(1990)]のBamHI部位に挿入し、プラスミドp
HCa101CFとpHCb101CFを作製した。
b101を制限酵素BglIIで消化した後、それぞれか
ら0.38kbのDNA断片を分離した。これらの断片
をプラスミドpET−3xa[メソッズ・イン・エンザ
イモロジー(Methods in Enzymology. ed. D. V. Goedde
l), 185巻、68頁、アカデミック・プレス (Academic Pr
ess),(1990)]のBamHI部位に挿入し、プラスミドp
HCa101CFとpHCb101CFを作製した。
【0016】実施例4 発現ベクターの構築−2 実施例2で得られたプラスミドpHCa101とpHC
b101を制限酵素KpnIで消化してそれぞれ開環し
た後、T4DNAポリメラーゼ処理により末端を平滑に
した。これらにBamHIリンカー(pCGGGATC
CCG)(NEB製)をT4 DNAリガーゼ[宝酒造
(株)製]を用いて付加した。該リンカーの付加したp
HCa101を更に制限酵素HindIIIとBamHIで
処理した後、プラスミドpUC8のHindIII部位と
BamHI部位との間に挿入してプラスミドpUCa−
KFを作製した。また、該リンカーの付加したpHCb
101を制限酵素XbaIとBamHIで消化した後、プ
ラスミドpUC18のXbaI部位とBamHI部位との
間に挿入してプラスミドpUCb−KFを作製した。こ
れらのプラスミドを制限酵素BglIIとBamHIで消
化し、それぞれから0.26kbのBglII−BamH
I断片を得た。これらの断片をプラスミドpET−3X
aのBamHI部位に挿入し、発現プラスミドpHCa
101KFとpHCb101KFを作製した。
b101を制限酵素KpnIで消化してそれぞれ開環し
た後、T4DNAポリメラーゼ処理により末端を平滑に
した。これらにBamHIリンカー(pCGGGATC
CCG)(NEB製)をT4 DNAリガーゼ[宝酒造
(株)製]を用いて付加した。該リンカーの付加したp
HCa101を更に制限酵素HindIIIとBamHIで
処理した後、プラスミドpUC8のHindIII部位と
BamHI部位との間に挿入してプラスミドpUCa−
KFを作製した。また、該リンカーの付加したpHCb
101を制限酵素XbaIとBamHIで消化した後、プ
ラスミドpUC18のXbaI部位とBamHI部位との
間に挿入してプラスミドpUCb−KFを作製した。こ
れらのプラスミドを制限酵素BglIIとBamHIで消
化し、それぞれから0.26kbのBglII−BamH
I断片を得た。これらの断片をプラスミドpET−3X
aのBamHI部位に挿入し、発現プラスミドpHCa
101KFとpHCb101KFを作製した。
【0017】実施例5 形質転換体の作製および発現 エシェリキア・コリ(Escherichia coli)MM294
に、T7ファージのRNAポリメラーゼ遺伝子を組み込
んだλファージDE3[F.W.Studierら、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.),
189, 113 (1986)]を溶原化させて作製したエシェリキ
ア・コリ(Escherichia coli)MM294(DE3)
を、実施例3および4で得られた発現ベクターpHCa
101CF、pHCb101CF、pHCa101KF
およびpHCb101KFを用いて形質転換し、形質転
換体E.coli MM294(DE3)/pHCa1
01CF(IFO 15107)、E.coli MM2
94(DE3)/pHCb101CF(IFO 151
08)、E.coli MM294(DE3)/pHC
a101KFおよびE.coli MM294(DE
3)/pHCb101KFをそれぞれ得た。各形質転換
体を、40μg/mlのアンピシリンを含む1.5ml
のLB培地で37℃、16時間培養した。得られた培養
液の0.5mlを10mlの同じ培地を含む200ml
容フラスコに移し、37℃で培養し、Klett値が1
70〜200になった時IPTGを終濃度0.1mMに
なるように加え、さらに37℃、3時間培養した。得ら
れた培養液の1mlから集めた菌体に50μlの蒸留水
と50μlの2倍濃度のサンプル緩衝液[50mM T
ris−HCl(pH6.8)−2mM EDTA−1
%SDS−1%メルカプトエタノール−8%グリセロー
ル−0.025%ブロムフェノールブルー]を加えて懸
濁し、100℃、10分間加熱した後、0.1%SDS
を含むポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけた。
泳動後、ゲルをクマジー・ブリリアント・ブルーあるい
は銀染色液で染めたところ、形質転換体E.coli
MM294(DE3)/pHCa101CFとE.co
li MM294(DE3)/pHCb101CFは約
46キロダルトンの位置に、またE.coli MM2
94(DE3)/pHCa101KFとE.coli
MM294(DE3)/pHCb101KFは約44キ
ロダルトンの位置にそれぞれ泳動する特異的な産物を発
現していることが分かった。
に、T7ファージのRNAポリメラーゼ遺伝子を組み込
んだλファージDE3[F.W.Studierら、ジャーナル・
オブ・モレキュラー・バイオロジー(J. Mol. Biol.),
189, 113 (1986)]を溶原化させて作製したエシェリキ
ア・コリ(Escherichia coli)MM294(DE3)
を、実施例3および4で得られた発現ベクターpHCa
101CF、pHCb101CF、pHCa101KF
およびpHCb101KFを用いて形質転換し、形質転
換体E.coli MM294(DE3)/pHCa1
01CF(IFO 15107)、E.coli MM2
94(DE3)/pHCb101CF(IFO 151
08)、E.coli MM294(DE3)/pHC
a101KFおよびE.coli MM294(DE
3)/pHCb101KFをそれぞれ得た。各形質転換
体を、40μg/mlのアンピシリンを含む1.5ml
のLB培地で37℃、16時間培養した。得られた培養
液の0.5mlを10mlの同じ培地を含む200ml
容フラスコに移し、37℃で培養し、Klett値が1
70〜200になった時IPTGを終濃度0.1mMに
なるように加え、さらに37℃、3時間培養した。得ら
れた培養液の1mlから集めた菌体に50μlの蒸留水
と50μlの2倍濃度のサンプル緩衝液[50mM T
ris−HCl(pH6.8)−2mM EDTA−1
%SDS−1%メルカプトエタノール−8%グリセロー
ル−0.025%ブロムフェノールブルー]を加えて懸
濁し、100℃、10分間加熱した後、0.1%SDS
を含むポリアクリルアミドゲルでの電気泳動にかけた。
泳動後、ゲルをクマジー・ブリリアント・ブルーあるい
は銀染色液で染めたところ、形質転換体E.coli
MM294(DE3)/pHCa101CFとE.co
li MM294(DE3)/pHCb101CFは約
46キロダルトンの位置に、またE.coli MM2
94(DE3)/pHCa101KFとE.coli
MM294(DE3)/pHCb101KFは約44キ
ロダルトンの位置にそれぞれ泳動する特異的な産物を発
現していることが分かった。
【0018】実施例6 T7ファージ遺伝子10産物とHCV
ポリペプチドとから成る融合蛋白遺伝子の大腸菌におけ
る発現 実施例5において得られた形質転換体 E. coli
MM294(DE3)/pHCa101CF 及び E.
coli MM294(DE3)/pHCb101CF
を50μg/mlのアンピシリンを含む20mlの培養液(1リッ
トルあたり、バクトトリプトン10g,イーストエキスト
ラクト5g,塩化ナトリウム5gを含む)中で37℃,一晩
振とう培養した後、その15mlを上記同培地300ml(1リ
ットル容フラスコ中)に移し、更に37℃で振とう培養を
行った。Klett 値が170〜200になった時点で最終濃度が
0.1mMになるように40mMのイソプロピル-β-D-チオガラ
クトピラノシド(IPTG)を750μl加えて、更に37℃で2時
間振とう培養し、菌体を遠心分離によって集めた。
ポリペプチドとから成る融合蛋白遺伝子の大腸菌におけ
る発現 実施例5において得られた形質転換体 E. coli
MM294(DE3)/pHCa101CF 及び E.
coli MM294(DE3)/pHCb101CF
を50μg/mlのアンピシリンを含む20mlの培養液(1リッ
トルあたり、バクトトリプトン10g,イーストエキスト
ラクト5g,塩化ナトリウム5gを含む)中で37℃,一晩
振とう培養した後、その15mlを上記同培地300ml(1リ
ットル容フラスコ中)に移し、更に37℃で振とう培養を
行った。Klett 値が170〜200になった時点で最終濃度が
0.1mMになるように40mMのイソプロピル-β-D-チオガラ
クトピラノシド(IPTG)を750μl加えて、更に37℃で2時
間振とう培養し、菌体を遠心分離によって集めた。
【0019】実施例7 T7ファージ遺伝子10産物とH
CVポリペプチドから成る融合蛋白の精製 実施例6において集めた菌体を10mlの懸濁バッファー
[50mM Tris-HCl(pH8.5)-100mM NaCl-1mM EDTA- 0.1mM
APMSF-0.5% Triton X-100]に懸濁し、超音波処理を
行った後、8℃,250×g,20分間遠心分離にかけて、上
澄液を得た。更にこの上澄液を8℃,5000×g,20分間
遠心分離にかけ沈殿物を得、これを4mlの1M尿素バッフ
ァー[1M尿素-50mM Tris-HCl(pH8.5)-100mM NaCl-1mM
EDTA-0.1mMAPMSF-0.5% Triton X-100]によく懸濁し
室温で1時間放置した。これを8℃,5000×g,20分間遠
心分離にかけ沈殿物を得、この沈殿物を4mlの4M尿素
バッファー[4M尿素-50mM Tris-HCl(pH8.5)-100mM NaC
l-1mM EDTA-0.1mM APMSF-0.5% Triton X-100]によく
懸濁し室温で1時間放置した。これを8℃,5000×g,2
0分間遠心分離にかけ沈殿物を得、この沈殿物を4mlの
8M尿素バッファー[8M尿素-50mM Tris-HCl(pH8.5)-10
0mM NaCl-1mM EDTA-0.1mM APMSF-0.5% TritonX-100]
によく懸濁し、4℃で一晩放置した。これを8℃,5000
×g,20分間遠心分離にかけ上澄液を得た。これに半量
の2倍の濃度の Laemmli buffer を加え、100℃,10分間
加熱した。冷却後13000rpm,5分間遠心分離にかけ、上
澄液を得た。これをSDS-ポリアクリルアミドゲルでの電
気泳動にかけた後、銀染色を行ったところ、約46キロダ
ルトンの位置に単一バンドが得られた。
CVポリペプチドから成る融合蛋白の精製 実施例6において集めた菌体を10mlの懸濁バッファー
[50mM Tris-HCl(pH8.5)-100mM NaCl-1mM EDTA- 0.1mM
APMSF-0.5% Triton X-100]に懸濁し、超音波処理を
行った後、8℃,250×g,20分間遠心分離にかけて、上
澄液を得た。更にこの上澄液を8℃,5000×g,20分間
遠心分離にかけ沈殿物を得、これを4mlの1M尿素バッフ
ァー[1M尿素-50mM Tris-HCl(pH8.5)-100mM NaCl-1mM
EDTA-0.1mMAPMSF-0.5% Triton X-100]によく懸濁し
室温で1時間放置した。これを8℃,5000×g,20分間遠
心分離にかけ沈殿物を得、この沈殿物を4mlの4M尿素
バッファー[4M尿素-50mM Tris-HCl(pH8.5)-100mM NaC
l-1mM EDTA-0.1mM APMSF-0.5% Triton X-100]によく
懸濁し室温で1時間放置した。これを8℃,5000×g,2
0分間遠心分離にかけ沈殿物を得、この沈殿物を4mlの
8M尿素バッファー[8M尿素-50mM Tris-HCl(pH8.5)-10
0mM NaCl-1mM EDTA-0.1mM APMSF-0.5% TritonX-100]
によく懸濁し、4℃で一晩放置した。これを8℃,5000
×g,20分間遠心分離にかけ上澄液を得た。これに半量
の2倍の濃度の Laemmli buffer を加え、100℃,10分間
加熱した。冷却後13000rpm,5分間遠心分離にかけ、上
澄液を得た。これをSDS-ポリアクリルアミドゲルでの電
気泳動にかけた後、銀染色を行ったところ、約46キロダ
ルトンの位置に単一バンドが得られた。
【0020】実施例8 大腸菌で作製したT7ファージ
遺伝子10産物とHCVポリペプチドから成る融合蛋白
とHCV−RNA陽性ヒト血清との反応 実施例7において、形質転換体E.coli MM29
4(DE3)/pHCa101CFおよびE.coli
MM294(DE3)/pHCb101CFから精製
された約46キロダルトンのT7ファージ遺伝子10産
物−HCVポリペプチド融合蛋白を以下それぞれ融合蛋
白AおよびBと称する。1%SDSを含む12.5%ポ
リアクリルアミドゲルの1レーンあたり、融合蛋白Aあ
るいはBの10μgを負荷した後、電気泳動を行った。
泳動後、ゲルにニトロセルロースフィルター(Schleich
er & Schuell,BA85)を密着させ、25mM Tris
−192mM Glycine−20% メタノールを
含む溶液中においてアクリルアミドゲル中の該融合蛋白
を電気的に転写した。転写後、フィルターをレーン毎に
切断し25% ブロックエース(雪印乳業製、大日本製
薬販売)に浸して室温で1時間振盪した。次に、TBS
−T溶液[10mM Tris−HCl(pH8.0)
−150mM NaCl−0.05% Tween2
0]でフィルターを10分間洗浄した後、TBS−T溶
液で100倍に希釈したヒト血清を各フィルター毎に添
加して室温で30分間振盪した。TBS−T溶液で各フ
ィルターを10分間洗浄した後、同溶液で3000倍に
希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒト免疫グロ
ブリン(多価)抗体(TAGO社)を各フィルター毎に添加
して室温で30分間振盪した。各フィルターをTBS−
T溶液で10分間洗浄した後、基質溶液[330μg/
ml NBT(nitro blue tetrazolium)−165μg
/ml BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosp
hate)−100mM Tris−HCl(pH9.5)
−100mM NaCl−5mM MgCl2]に浸し
て室温で15分間静置した。その結果、HCV抗体測定
用キット(オーソ HCV Ab ELISAテスト、
オーソ社販売)陽性でHCV・RNA陽性の血清(#
2、3)および上記キット陰性でHCV・RNA陽性血
清(#1、4、5)は、融合蛋白AおよびBと反応する
ことが示された(図3)。なお、同時に陽性対照として
HCVに感染したチンパンジー血清(#16)を、陰性
対照として健常人血清(#0)をそれぞれ使用した。
遺伝子10産物とHCVポリペプチドから成る融合蛋白
とHCV−RNA陽性ヒト血清との反応 実施例7において、形質転換体E.coli MM29
4(DE3)/pHCa101CFおよびE.coli
MM294(DE3)/pHCb101CFから精製
された約46キロダルトンのT7ファージ遺伝子10産
物−HCVポリペプチド融合蛋白を以下それぞれ融合蛋
白AおよびBと称する。1%SDSを含む12.5%ポ
リアクリルアミドゲルの1レーンあたり、融合蛋白Aあ
るいはBの10μgを負荷した後、電気泳動を行った。
泳動後、ゲルにニトロセルロースフィルター(Schleich
er & Schuell,BA85)を密着させ、25mM Tris
−192mM Glycine−20% メタノールを
含む溶液中においてアクリルアミドゲル中の該融合蛋白
を電気的に転写した。転写後、フィルターをレーン毎に
切断し25% ブロックエース(雪印乳業製、大日本製
薬販売)に浸して室温で1時間振盪した。次に、TBS
−T溶液[10mM Tris−HCl(pH8.0)
−150mM NaCl−0.05% Tween2
0]でフィルターを10分間洗浄した後、TBS−T溶
液で100倍に希釈したヒト血清を各フィルター毎に添
加して室温で30分間振盪した。TBS−T溶液で各フ
ィルターを10分間洗浄した後、同溶液で3000倍に
希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒト免疫グロ
ブリン(多価)抗体(TAGO社)を各フィルター毎に添加
して室温で30分間振盪した。各フィルターをTBS−
T溶液で10分間洗浄した後、基質溶液[330μg/
ml NBT(nitro blue tetrazolium)−165μg
/ml BCIP(5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosp
hate)−100mM Tris−HCl(pH9.5)
−100mM NaCl−5mM MgCl2]に浸し
て室温で15分間静置した。その結果、HCV抗体測定
用キット(オーソ HCV Ab ELISAテスト、
オーソ社販売)陽性でHCV・RNA陽性の血清(#
2、3)および上記キット陰性でHCV・RNA陽性血
清(#1、4、5)は、融合蛋白AおよびBと反応する
ことが示された(図3)。なお、同時に陽性対照として
HCVに感染したチンパンジー血清(#16)を、陰性
対照として健常人血清(#0)をそれぞれ使用した。
【0021】実施例9 発現ベクターの構築−3 実施例2で得られたプラスミドpHCa101を制限酵
素BglIIで消化した後、0.38kbのDNA断片を
分離した。この断片をプラスミドpBT−3a[メソッ
ズ イン エンザイモロジー(Methods in Enzymolog
y),185,68 (1990)]のBamHI部位に挿入し、H
CVポリペプチドを直接発現するための発現プラスミド
pHCa201CFを作製した。
素BglIIで消化した後、0.38kbのDNA断片を
分離した。この断片をプラスミドpBT−3a[メソッ
ズ イン エンザイモロジー(Methods in Enzymolog
y),185,68 (1990)]のBamHI部位に挿入し、H
CVポリペプチドを直接発現するための発現プラスミド
pHCa201CFを作製した。
【0022】実施例10 形質転換体の作製および発現 実施例5のE.coli MM294(DE3)を実施
例9で得られた発現プラスミドpHCa201CFを用
いて形質転換し、形質転換体E.coliMM294
(DE3)/pHCa201CFを得た。本形質転換体
を実施例5と同一条件下で培養し、同一条件下でポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動後、ゲルを銀
染色液で染めたところ、本形質転換体は約14キロダル
トン(kDa)の位置に泳動する特異的な産物を発現し
ていることが分かった。なお、本形質転換体による14
kDaのHCVポリペプチド(コア蛋白)の生産量(図
4のレーン2)は、実施例5の形質転換体E.coli
MM294(DE3)/pHCa101CFによる約
46kDaのHCVポリペプチド(T7ファージの遺伝
子10産物とHCVコア蛋白から成る融合蛋白)の生産
量(図4のレーン3)の約1/3であった。
例9で得られた発現プラスミドpHCa201CFを用
いて形質転換し、形質転換体E.coliMM294
(DE3)/pHCa201CFを得た。本形質転換体
を実施例5と同一条件下で培養し、同一条件下でポリア
クリルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動後、ゲルを銀
染色液で染めたところ、本形質転換体は約14キロダル
トン(kDa)の位置に泳動する特異的な産物を発現し
ていることが分かった。なお、本形質転換体による14
kDaのHCVポリペプチド(コア蛋白)の生産量(図
4のレーン2)は、実施例5の形質転換体E.coli
MM294(DE3)/pHCa101CFによる約
46kDaのHCVポリペプチド(T7ファージの遺伝
子10産物とHCVコア蛋白から成る融合蛋白)の生産
量(図4のレーン3)の約1/3であった。
【0023】
【0024】
【配列表】配列番号:1 配列の長さ:23 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Thr Thr Arg Lys Thr Ser Glu 1 5 10 15 Arg Ser Gln Pro Cys Gly Arg 20。
【0025】配列番号:2 配列の長さ:79 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ser Thr Ile Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg 1 5 10 15 Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly 20 25 30 Val Tyr Leu Leu Pro Cys Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Thr Thr 35 40 45 Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Cys Gly Arg Arg Gln Pro Ile 50 55 60 Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75。
【0026】配列番号:3 配列の長さ:79 配列の型:アミノ酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:ペプチド 配列 Ser Thr Ile Pro Lys Pro Gln Arg Lys Thr Lys Arg Asn Thr Asn Arg 1 5 10 15 Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly 20 25 30 Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr 35 40 45 Arg Lys Thr Ser Glu Arg Ser Gln Pro Arg Gly Trp Arg Gln Pro Ile 50 55 60 Pro Lys Ala Arg Arg Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly 65 70 75。
【0027】配列番号:4 配列の長さ:69 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 TGCAGGGGCC CCAGGTTGGG TGTGCGCACG ACTAGGAAGA CTTCCGAGCG GTCGCAACCT 60 TGTGGAAGG 69。
【0028】配列番号:5 配列の長さ:237 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 AGCACGATTC CCAAACCTCA AAGAAAAACC AAACGTAACA CCAACCGCCG CCCACAGGAC 60 GTCAAGTTCC CGGGCGGTGG TCAGATCGTT GGTGGAGTTT ACCTGTTGCC GTGCAGGGGC 120 CCCAGGTTGG GTGTGCGCAC GACTAGGAAG ACTTCCGAGC GGTCGCAACC TTGTGGAAGG 180 CGACAACCTA TCCCCAAGGC TCGCCGACCC GAGGGCAGGG CCTGGGCTCA GCCCGGG 237。
【0029】配列番号:6 配列の長さ:237 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 AGCACGATTC CCAAACCTCA AAGAAAAACC AAACGTAACA CCAACCGCCG CCCACAGGAC 60 GTCAAGTTCC CGGGCGGTGG TCAGATCGTT GGTGGAGTTT ACCTGTTGCC GCGCAGGGGC 120 CCCAGGTTGG GTGTGCGCGC GACTAGGAAG ACTTCCGAGC GGTCGCAACC TCGTGGATGG 180 CGACAACCTA TCCCCAAGGC TCGCCGACCC GAGGGCAGGG CCTGGGCTCA GCCCGGG 237。
【0030】配列番号:7 配列の長さ:20 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 CCTCCGATGA CACAAGGAGG 20。
【0031】配列番号:8 配列の長さ:34 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 CAAGATCTCG GATGAGCACG ATTCCCAAAC CTCA 34。
【0032】配列番号:9 配列の長さ:35 配列の型:核酸 トポロジー:直鎖状 配列の種類:cDNA to genomic RNA 配列 CTAGATCTTC AGAGGGTATC GATGACCTTA CCCAA 35。
【図1】本発明で得られたHCV cDNAのa型の塩
基配列およびb型の塩基配列をa型と比較して示した図
である。b型における「−」はa型のものと同じ塩基で
あることを示す。
基配列およびb型の塩基配列をa型と比較して示した図
である。b型における「−」はa型のものと同じ塩基で
あることを示す。
【図2】図1の塩基配列から予測されるアミノ酸配列を
示した図であり、b型における「−」はa型のものと同
じアミノ酸であることを示す。
示した図であり、b型における「−」はa型のものと同
じアミノ酸であることを示す。
【図3】実施例8に記載の融合蛋白AおよびBとHCV
・RNA陽性ヒト血清との反応を示す。
・RNA陽性ヒト血清との反応を示す。
【図4】プラスミドpET−3a,pHCa201CF
およびpHCa101CFを用いて、それぞれエシェリ
キア コリ MM294(DE3)を形質転換して得ら
れる形質転換体の生産物を、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動後、銀染色した結果を示す(実施例10参照)。
およびpHCa101CFを用いて、それぞれエシェリ
キア コリ MM294(DE3)を形質転換して得ら
れる形質転換体の生産物を、ポリアクリルアミドゲル電
気泳動後、銀染色した結果を示す(実施例10参照)。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12N 15/09 ZNA C12P 21/02 C C12P 21/02 A61K 39/29 // A61K 39/29 A61P 31/12 A61P 31/12 G01N 33/53 D G01N 33/53 33/569 L 33/569 33/576 Z 33/576 C12N 15/00 ZNAA (C12N 1/21 C12R 1:19) (C12P 21/02 C12R 1:19) (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C07K 14/00 - 19/00 C12N 15/00 - 15/90 C12P 21/00 - 21/08 CA(STN) REGISTRY(STN)
Claims (15)
- 【請求項1】アミノ酸配列: Cys-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Thr-Thr-Arg-Ly
s-Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Cys-Gly-Argからなる
ポリペプチド。 - 【請求項2】アミノ酸配列: Ser-Thr-Ile-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-As
n-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-
Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Cy
s-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Thr-Thr-Arg-Lys-
Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Cys-Gly-Arg-Arg-Gln-Pr
o-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Ala-Trp-
Ala-Gln-Pro-Glyからなるポリペプチド。 - 【請求項3】アミノ酸配列: Ser-Thr-Ile-Pro-Lys-Pro-Gln-Arg-Lys-Thr-Lys-Arg-As
n-Thr-Asn-Arg-Arg-Pro-Gln-Asp-Val-Lys-Phe-Pro-Gly-
Gly-Gly-Gln-Ile-Val-Gly-Gly-Val-Tyr-Leu-Leu-Pro-Ar
g-Arg-Gly-Pro-Arg-Leu-Gly-Val-Arg-Ala-Thr-Arg-Lys-
Thr-Ser-Glu-Arg-Ser-Gln-Pro-Arg-Gly-Trp-Arg-Gln-Pr
o-Ile-Pro-Lys-Ala-Arg-Arg-Pro-Glu-Gly-Arg-Ala-Trp-
Ala-Gln-Pro-Glyからなるポリペプチド。 - 【請求項4】請求項1記載のアミノ酸配列をコードする
塩基配列からなる組換えDNA。 - 【請求項5】請求項2記載のアミノ酸配列をコードする
塩基配列からなる組換えDNA。 - 【請求項6】請求項3記載のアミノ酸配列をコードする
塩基配列からなる組換えDNA。 - 【請求項7】塩基配列がTGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCA
CGACTAGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTTGTGGAAGGである請
求項4記載の組換えDNA。 - 【請求項8】塩基配列が AGCACGATTCCCAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAAGTTCCCG GGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGTGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCACGACT AGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTTGTGGAAGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGACCCGAGGGC AGGGCCTGGGCTCAGCCCGGGである請求項5記載の組換えD
NA。 - 【請求項9】塩基配列が AGCACGATTCCCAAACCTCAAAGAAAAACCAAACGTAACACCAACCGCCGCCCACAGGACGTCAAGTTCCCG GGCGGTGGTCAGATCGTTGGTGGAGTTTACCTGTTGCCGCGCAGGGGCCCCAGGTTGGGTGTGCGCGCGACT AGGAAGACTTCCGAGCGGTCGCAACCTCGTGGATGGCGACAACCTATCCCCAAGGCTCGCCGACCCGAGGGC AGGGCCTGGGCTCAGCCCGGGである請求項6記載の組換えD
NA。 - 【請求項10】T7ファージの遺伝子10産物と請求項
1、2あるいは3記載のポリペプチドとから成る融合蛋
白質。 - 【請求項11】ヒト・インターロイキン2と請求項1、
2あるいは3記載のポリペプチドとから成る融合蛋白
質。 - 【請求項12】請求項10記載の融合蛋白質をコードす
る塩基配列からなる組換えDNA。 - 【請求項13】請求項11記載の融合蛋白質をコードす
る塩基配列からなる組換えDNA。 - 【請求項14】請求項4、5、6、12または13記載
の組換えDNAを保持する形質転換体。 - 【請求項15】請求項14記載の形質転換体を培養し、
培養物中に請求項1、2、3、10あるいは11記載の
蛋白質を生成蓄積せしめ、これを採取することを特徴と
する該蛋白質の製造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP23761091A JP3130338B2 (ja) | 1990-11-09 | 1991-09-18 | ポリペプチドおよびその製造法 |
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP30261490 | 1990-11-09 | ||
JP3-7554 | 1991-01-25 | ||
JP2-302614 | 1991-01-25 | ||
JP755491 | 1991-01-25 | ||
JP23761091A JP3130338B2 (ja) | 1990-11-09 | 1991-09-18 | ポリペプチドおよびその製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH05194593A JPH05194593A (ja) | 1993-08-03 |
JP3130338B2 true JP3130338B2 (ja) | 2001-01-31 |
Family
ID=27277651
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP23761091A Expired - Fee Related JP3130338B2 (ja) | 1990-11-09 | 1991-09-18 | ポリペプチドおよびその製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP3130338B2 (ja) |
-
1991
- 1991-09-18 JP JP23761091A patent/JP3130338B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH05194593A (ja) | 1993-08-03 |
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