JP3126729B2 - サーモコッカス由来の熱安定性プロテアーゼ - Google Patents

サーモコッカス由来の熱安定性プロテアーゼ

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Description

【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は熱安定性プロテアーゼの分野に関する。更に
詳しくは、本発明は新規な熱安定性プロテアーゼ、これ
らの酵素の調製方法及びこれらの酵素を含んでなる洗剤
組成物に関する。
背景技術 熱高温性古細菌が、硫黄鉱物及び海底の熱水系から分
離されている。（ケリー.R.M.及びデミング.J.W.;Biote
ch.Progress,４,47−62（1988）参照）。サーモコッカ
スの群は、熱安定性プロテアーゼ及びアミラーゼを含ん
でいるものと想像されていた（ステーター.K.O.;J.Che
m.Technol.Biotechnol.,42（４）,315−317（198
8））。しかし、サーモコッカス由来のプロテアーゼ
は、これまで単離されておらず或は研究されていない。
発明の要約 本発明の範囲内に於いて、法外な熱安定性及び熱的活
性を示す新規酵素が提供される。従って、第一の面に於
いて、本発明は8.0〜10.0に最適pHを有し更に75〜100℃
に最適温度を有するプロテアーゼを提供する。他の面に
於いて、本発明は8.0〜10.0に最適pH、75〜100℃に最適
温度及びサーモコッカス・ステテリ（Thermococcus ste
tteri）,DSM No.5262;又はサーモコッカス・リトラリス
（Thermococcus litoralis）,DSM No.5474由来のプロテ
アーゼの免疫化学的性質と同一である免疫化学的性質を
有するプロテアーゼを提供する。
更に別の面に於いて、本発明はこれらのプロテアーゼ
の調製方法を提供するものであり、この方法は、炭素及
び窒素源及び無機塩を含有する適当な栄養培地中でサー
モコッカス（Thermococcus）のプロテアーゼ生産株を培
養し、次いで目的の酵素を回収することを含んでなる。
このプロセスの好ましい態様に於いて、サーモコッカ
ス・ステテリ（Thermococcus stetteri）の菌株；又は
サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litorali
s）の菌株を培養する。
このプロセスの更に好ましい態様に於いて、サーモコ
ッカス・ステテリ（Thermococcus stetteri）,DSM No.5
262;又はサーモコッカス・リトラリス（Thermococcus l
itoralis）,DSM No.5474;又はそれらの突然変異体又は
変異体を培養する。
発明の詳細な説明 サーモコッカス（Thermococcus）に関する増殖実験
は、これらの生物が極めて熱安定性及び熱的活性の蛋白
質水分解酵素を分泌することを今や示している。これら
の酵素は極端な条件のもとで蛋白質分解活性を有する。
サーモコッカス（Thermococcus）の性質は、サーモコッ
カス・ステテリ（Thermococcus stetteri）、及びサー
モコッカス・リトラリス（Thermococcus litoralis）よ
り実証されている。サーモコッカス・ステテリ（Thermo
coccus stetteri）の菌株は、No.5262としてDSMから入
手可能であり、更にサーモコッカス・リトラリス（Ther
mococcus litoralis）の菌株は、No.5474としてDSMから
入手可能である。
図面から明らかなように、サーモコッカス（Thermoco
ccus）から入手可能なプロテアーゼは、6.0〜10.0に最
適pH及び75〜100℃に最適温度を有することを特徴とす
る。
図１から明らかなように、サーモコッカス・ステテリ
（Thermococcus stetteri）から得られるプロテアーゼ
は、45℃未満〜100℃の範囲内の温度に於いて更に5.5未
満〜10超の範囲内のpHに於いて活性である。プロテアー
ゼは、75〜85℃の範囲内に於いて、更に詳しくは80℃付
近に於いて最適温度を有し更にpH8〜10、更に詳しくは
約9.0に於いて最適pHを有する。
図２から明らかなように、サーモコッカス・リトラリ
ス（Thermococcus litoralis）から得ることの出来るプ
ロテアーゼは、60℃未満〜100℃を越える温度範囲に於
いて活性であり更に6.5未満から11を越えるpH範囲に於
いて活性である。プロテアーゼは、90〜100℃の範囲内
に於いて、更に詳しくは約95℃に於いて最適温度を有し
更にpH8〜10の範囲内に於いて、更に詳しくは約pH9.0に
最適pHを有する。
表１に於いて、サーモコッカス（Thermococcus）sp.
由来のプロテアーゼに関するいくつかの性質を示す。
免疫化学的性質は、交差反応同定試験により免疫化学
的に決定され得る。同定試験は、周知のオウテルロニー
（Ouchterlony）二重免疫拡散手順により又はタンデム
交差免疫電気泳動により行なうことが出来る;N.H.アク
セルセン;Handbook of Immunoprecipitation−in−Gel
Techniques;バックウェル サイエンティフィック パ
ブリケイションズ（1983）５章及び14章。語句「抗原の
同一性」及び「部分的抗原の同一性」は同書、５章、19
章及び20章に記載されている。
プロテアーゼの調製 本発明によるプロテアーゼは、炭素及び窒素源及び無
機塩を含有する適当な栄養培地中でサーモコッカス（Th
ermococcus）のプロテアーゼ生産株を培養し次いで公知
の方法により目的の酵素を回収することによって生産さ
れ得る。
本発明に係るプロテアーゼは、組換えDNA−技術によ
り生産することも出来る。
洗剤組成物 本発明に係るプロテアーゼの独特な性質のため、これ
らの酵素は工業的適用の面に於いて、例えば洗剤産業で
用いる為非常に興味が有る。
本発明の洗剤組成物は、１種以上の界面活性剤を含む
ことができ、この活性剤は、アニオン、カチオン、非イ
オン、両性又は双性イオン型又はそれらの混合物であっ
てよい。アニオン界面活性剤の典型的例は、直鎖アルキ
ルベンゼンスルホネート（LAS）；アルキルスルフェー
ト（AS）；αオレフィンスルホネート（AOS）；アルコ
ールエトキシスルホネート（AES）および天然脂肪酸の
アルカリ金属塩である。非イオン界面活性剤の例は、ア
ルキルポリエチレングリコールエーテル；ノニルポリエ
チレングリコールエーテル；スクロースおよびグルコー
スの脂肪酸エステル；ポリエトキシル化アルキルグリコ
シドのエステルである。
本発明の洗剤組成物は又他の公知の洗剤成分、例えば
ビルダー、漂白剤、漂白活性化剤、凝固防止剤、金属イ
オン封鎖剤、抗土壌−再沈着剤、香料、酵素用安定化剤
および漂白剤、製剤化助剤、けい光増白剤、起泡増進
剤、キレート剤、充てん剤、布帛柔軟剤等をも含有でき
る。本発明の洗剤組成物は、J.ファルベェに記載される
如くに実質的に同じ方法で製剤化できる〔Falbe,J.;Sur
factants in Consumer Products.Theory,Technology an
d Application;Springer Verlag 1987、特に“Frame fo
rmulations for liquid/powder heavy−duty detergent
s"の章を参照〕。
現在以下のように企図される。すなわち、本発明の洗
剤組成物は、洗液１当たり蛋白質分解酵素0.0005〜0.
5CPUに相当する量の酵素調製品を含有できる。
本発明の洗剤組成物は、好都合の形態で、例えば粉
末、液体等に製剤化できる。
本発明の洗剤組成物は、１種以上の他の酵素、例えば
リパーゼ；アミラーゼ；セルラーゼ；および／又はペル
オキシダーゼを含み、これらは洗剤組成物中に好都合に
含まれる。
本発明のプロテアーゼは、洗剤プロテアーゼを含有す
る別個の添加剤を添加することにより、又は異なる酵素
を含んでなる一緒にした添加剤を添加することにより洗
剤組成物中に含ましめることができる。
本発明の添加剤は、例えば粒質物、液体、スラリー等
として製剤化できる。好ましい洗剤用添加剤配合物は、
無粉塵性粒質物、液体、特に安定化液体、スラリー、又
は保護された酵素である。無粉塵性粒質物は、例えば英
国特許1,362,365および米国特許4,106,991に従って調製
でき、更に所望により公知方法でコートできる。洗剤用
酵素は造粒前又は造粒後に混合できる。液体酵素調製品
は、例えばポリオール例えばプロピレングリコール；糖
又は糖アルコール；乳酸又はホウ酸等を確立された方法
に従って添加することにより安定化できる。他の酵素安
定化剤は周知である。保護された酵素は、ヨーロッパ特
許238,216に開示された方法に従って調製できる。
次に実施例により更に本発明を説明する。
例1. サーモコッカス・ステテリ（Thermococcus stetteri）
の培養 サーモコッカス・ステテリ（Thermococcus stetter
i）,DSM No.5262を、以下の組成（１当り）を有する
栄養培地中で培養した： 食塩 25.00g NH4Cl 0.33g CaCl2・2H2O 0.33g MgCl2・6H2O 0.33g KCl 0.33g KH2PO4 0.33g 微量元素溶液 （DSM培地320参照） 1.0 ml ビタミン溶液 （DSM培地320参照） 10.0 ml トリプチカーゼBBL 5.00g 粉末硫黄 10.00g レザズリン 1.00mg Na2S・9H2O 0.50g pH5.7 硫化ナトリウム及び硫黄を有しない培地を、20分間ボ
イルし、氷上で冷却し次いで窒素雰囲気下で分散した。
次いで培地を窒素雰囲気下硫黄を含有する100mlのバイ
アル中に充填した。殺菌の為、培地を100℃で１時間各
々３日間連続して加熱した。
10％の増殖した予備培養物に接種する前、培地を、10
ml/の殺菌性中性硫化ナトリウム（５％溶液）を添加
することにより還元した。細菌を、80℃で24〜36時間培
養した。
蛋白分解活性の分析 分析用混合物は、50mMのトリス／グリシン緩衝液（pH
9.0）に溶解された0.25％のカゼイン（ハンマーステ
ン）を含有していた。250μ酵素サンプルを、2350μ
の分析用混合物に、80℃で添加することにより反応を
開始した。サンプル（各々500μ）を、30分、60分、9
0分、120分後に採取した。氷上で冷却し次いで500mlの
三塩化酢酸（10％）を添加することにより反応を停止し
た。混合物を室温で30分間放置し次いで12,000r.p.m.で
10分間遠心分離した。上澄みの吸光度を、ブランクに対
し280nmで測定した。1Uの酵素を、言及した条件下１分
当り１μmolのチロシンを遊離する酵素の量として定義
する。
プロテアーゼの特性 カゼイン（ハンマーステン）を、緩衝液混合物中0.25
％の濃度で、5.5〜10のpH値で且つ45〜100℃の温度で溶
解したが、該緩衝液混合物は、20mMのMES（２−〔Ｎ−
モルホリノ〕エタンスルホン酸）、20mMのHEPES（Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸）及び20mMのグリシンから構成されていた。
図１に示すように、プロテアーゼの活性レベルは、約
pH9.0で最大に達していた。約5.5のpH値で30％の活性が
測定され更に10.0のpH値で約70％の活性が測定出来た。
基質カゼインに対する最適の蛋白分解活性は80℃で生じ
た。約30％の酵素活性が45℃で測定された。
例2. サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litorali
s）の培養 サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus litoral
is）,DSM No.5474を、以下の組成（１当り）を含有す
る栄養培地中で培養した： 食塩 19.45g MgCl2・6H2O 12.60g Na2SO4 3.42g CaCl2・2H2O 2.38g KCl 0.55g Na2CO3 0.61g KBr 0.08g SrCl2 57.2 mg Na2HPO4 10.0 mg メタシリケート ナトリウム 4.0 mg NaF 2.4 mg KNO3 1.6 mg レザズリン 100.0 mg 酵母エキス 1.0 g バクトペプトン 5.0 g 粉末硫黄 10.0 g Na2S・9H2O 0.5 g 蒸留水1000mlを添加pH6.5 硫化ナトリウム及び硫黄を有しない培地を、20分間ボ
イルし、氷上で冷却し次いで窒素雰囲気下で分散した。
次いで培地を窒素雰囲気下で硫黄を有する100mlのバイ
アル中に充填した。殺菌の為、培地を100℃で１時間各
々３日間連続して加熱した。
接種前、培地を10ml/の殺菌性中性硫化ナトリウム
（５％溶液）を添加することにより還元した。培地を、
10％の増殖した予備培養物を接種し次いで最後に85℃で
24〜36時間インキュベートした。
蛋白質分解活性のための分析 分析用混合物は、50mMのトリス／グリシン緩衝液（pH
9.0）に溶解した0.25％カゼイン（ハンマーステン）を
含有した。250μの酵素サンプルを、2350μ分析用
混合物に、90℃で添加することにより反応を開始した。
サンプル（各々500μ）を、30分、60分、90分、120分
後に採取した。冷却し次いで500mlの三塩化酢酸（10
％）を添加することにより反応を停止した。混合物を室
温で30分間放置し次いで然る後12,000r.p.m.で10分間遠
心分離した。上澄みの吸光度を、ブランクに対し280nm
で測定した。1Uの酵素を、言及した条件のもと１分当り
１μmolのチロシンを遊離する酵素の量として定義す
る。
プロテアーゼの特性 カゼイン（ハンマーステン）を、緩衝液混合物中0.25
％の濃度で、6.5〜11のpH値で且つ60〜100℃の温度で溶
解したが、該緩衝液混合物は、20mMのMES（２−〔Ｎ−
モルホリノ〕エタンスルホン酸）、20mMのHEPES（Ｎ−
２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンス
ルホン酸）及び20mMのグリシンから構成されていた。
図２に示すように、プロテアーゼの活性レベルは、約
pH9.0で最大に達した。5.5及び11のpH値で約10％の活性
が検出出来た。基質カゼインに対する最適蛋白分解活性
は95℃で生じた。約90％の酵素活性が100℃で測定され
更に約30％の酵素活性が60℃で測定された。
図面の簡単な説明 図１は、サーモコッカス・ステテリ（Thermococcus s
tetteri）から得られたプロテアーゼの酵素活性と温度
及びpHとの関係を示す。
図２は、サーモコッカス・リトラリス（Thermococcus
litoralis）；から得られたプロテアーゼの酵素活性と
温度及びpHとの関係を示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭56−64786（ＪＰ，Ａ) Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，247（１) （1987），ｐ．121−133 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (12)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】次の特性： （ａ）pH8〜10に最適pHを有する； （ｂ）75℃〜85℃又は90℃〜100℃に最適温度を有す
    る； （ｃ）サーモコッカス（Thermococcus）属微生物由来で
    ある； （ｄ）下記（１）又は（２）のいずれかの基質特異性： を有する； ことを特徴とするセリンプロテアーゼ。
  2. 【請求項２】次の特性： （ａ）８〜10に最適pHを有する； （ｂ）75℃〜85℃又は90℃〜100℃に最適温度を有す
    る； （ｃ）サーモコッカス・ステテリー（Thermococcus ste
    tteri）,DSM No.5262、又はサーモコッカス・リトラリ
    ス（Thermococcus litoralis）,DSM No.5474由来のプロ
    テアーゼの免疫化学的性質と同一の免疫化学的性質を有
    する； （ｄ）下記（１）又は（２）のいずれかの基質特異性： を有する； ことを特徴とするセリンプロテアーゼ。
  3. 【請求項３】サーモコッカス・ステテリー（Thermococc
    us stetteri）又はサーモコッカス・リトラリス（Therm
    ococcus litoralis）種の菌株由来である、請求項１又
    は２に記載のセリンプロテアーゼ。
  4. 【請求項４】サーモコッカス・ステテリー（Thermococc
    us stetteri）,DSM No.5262又はサーモコッカス・リト
    ラリス（Thermococcus litoralis）,DSM No.5474由来の
    請求項３記載のプロテアーゼ。
  5. 【請求項５】炭素、窒素および無機塩を含有する適当な
    栄養培地中、サーモコッカス（Thermococcus）のプロテ
    アーゼ生産株を培養し、次いで目的の酵素を回収するこ
    とを含んでなる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の
    セリンプロテアーゼの製造方法。
  6. 【請求項６】サーモコッカス・ステテリー（Thermococc
    us stetteri）又はサーモコッカス・リトラリス（Therm
    ococcus litoralis）の菌株を培養する、請求項５に記
    載の方法。
  7. 【請求項７】サーモコッカス・ステテリー（Thermococc
    us stetteri）,DSM No.5262又はサーモコッカス・リト
    ラリス（Thermococcus litoralis）,DSM No.5474又はそ
    れらの突然変異体又は変異体を培養する請求項６に記載
    の方法。
  8. 【請求項８】請求項１〜４のいずれか１項に記載のセリ
    ンプロテアーゼを含んでなる、無粉塵性の粒質物、液
    体、スラリー又は保護された酵素の形態にある、タンパ
    ク質分解洗剤用添加物。
  9. 【請求項９】前記液体が安定化液体である、請求項８に
    記載の洗剤用添加物。
  10. 【請求項１０】請求項１〜４のいずれか１項に記載のセ
    リンプロテアーゼを含んでなる、プロテアーゼ含有洗剤
    組成物。
  11. 【請求項１１】更に１種以上の他の酵素を含んでなる、
    請求の範囲第10項記載の洗剤組成物。
  12. 【請求項１２】前記他の酵素がアミラーゼ、リパーゼ、
    セルラーゼ、又はペルオキシダーゼである請求項11に記
    載の洗剤組成物。
JP03511046A 1990-06-15 1991-06-14 サーモコッカス由来の熱安定性プロテアーゼ Expired - Fee Related JP3126729B2 (ja)

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