JP3125633B2 - Method and kit for processing paraffin-embedded tissue specimen as sample for gene analysis - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の利用分野】本発明は遺伝子分析用試料としての
パラフィン包埋組織標本の処理方法及びそれに用いられ
る処理用キットに関する。The present invention relates to a method for processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis and a processing kit used for the method.

【０００２】[0002]

【発明の背景】近年、病理学の分野において、遺伝子疾
患、感染症、悪性腫瘍などの診断やこれらの遺伝子の異
常などの検索のために遺伝子の分析が行われている。特
に、１９８５年、Ｇｏｅｌｚらによって、ホルマリン固
定パラフィン包埋組織からの核酸鎖の抽出が初めて可能
になり（Ｇｏｅｌｚ，Ｓ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．：Ｂｉｏｃ
ｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１
３０：１１８〜１２６，１９８５）、それに基づいて種
々の分子生物学的検索ができることが報告されて以来、
主にヘマトキシリン−エオジン（Ｈ・Ｅ）重染色などで
形態観察をして組織病理学的な背景が明らかな検体に対
し、レトロスペクティブな検索として、ポリメラーゼ
チェイン リアクション法（ＰＣＲ法）などによる遺伝
子分析が行われている。BACKGROUND OF THE INVENTION In recent years, in the field of pathology, gene analysis has been performed for diagnosis of genetic diseases, infectious diseases, malignant tumors and the like, and search for abnormalities of these genes. In particular, in 1985, Goelz et al. Made it possible for the first time to extract nucleic acid chains from formalin-fixed, paraffin-embedded tissues (Goelz, SE et al .: Bioc).
hem. Biophys. Res. Commun. , 1
30: 118-126, 1985), and since it has been reported that various molecular biological searches can be performed based thereon,
For a specimen whose histological pathology is clear by morphological observation mainly by hematoxylin-eosin (HE) double staining, a polymerase chain reaction is performed as a retrospective search.
Gene analysis by the chain reaction method (PCR method) and the like has been performed.

【０００３】従来の核酸鎖採取等の遺伝子分析用試料と
してのパラフィン包埋組織標本の処理方法としては、脱
パラフィンされた組織細胞を界面活性剤とタンパク質分
解酵素等とを含む溶液でおよそ室温〜50℃、４〜48時間
処理して破壊した後、フェノールやクロロホルム等の有
機溶媒を加えて、核酸鎖を含む水相と変性タンパク質等
を含む有機溶媒相とに分ける二相分離方式により核酸鎖
以外の不純物を除去し、次いでアルコールを加えて水相
中の核酸鎖を沈澱させる方法が一般的である（実験医
学，Ｖｏｌ．８，Ｎｏ．９，８４〜８８頁，１９９０
年，羊土社）。[0003] As a conventional method for treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis such as nucleic acid strand collection, deparaffinized tissue cells are treated with a solution containing a surfactant, proteolytic enzyme and the like at about room temperature to below room temperature. After processing at 50 ° C. for 4 to 48 hours to destroy the nucleic acid chain, add an organic solvent such as phenol or chloroform, and separate the nucleic acid chain into an aqueous phase containing nucleic acid chains and an organic solvent phase containing denatured proteins etc. In general, a method of removing impurities other than the above and then adding an alcohol to precipitate the nucleic acid chain in the aqueous phase (Experimental Medicine, Vol. 8, No. 9, pp. 84-88, 1990)
Year, Yodosha).

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】しかし、上記の如き遺
伝子分析用試料としてのパラフィン包埋組織標本の処理
方法は、界面活性剤とタンパク質分解酵素とを同時に用
いて比較的温和な条件下、より具体的にはおよそ室温〜
50℃で脱パラフィンされた組織細胞の破壊処理を行なう
為、核酸鎖の回収率を高めるには、該変性・分解反応を
長時間（通常、４〜48時間）行わなければならないとい
う問題を有している。また、脱パラフィンされた組織細
胞の破壊処理後に行われるフェノールやクロロホルム等
を使用しての二相分離方式での核酸鎖以外の不純物の除
去方法もまた、有機溶媒相と水相とを分離操作する手間
と時間を要し、且つその操作の煩雑さは外来核酸鎖の混
入の要因にもなるという問題を有している。更に、この
方法により得られる核酸鎖は、ＰＣＲ法による遺伝子増
幅反応に対する阻害物質が充分に除去されていない為、
ＰＣＲ法を利用した遺伝子分析の試料として使用するに
は問題が多い。However, the method for treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis as described above requires a relatively mild condition using a surfactant and a protease at the same time. Specifically, about room temperature ~
There is a problem that the denaturation / decomposition reaction must be performed for a long time (usually 4 to 48 hours) in order to increase the recovery rate of the nucleic acid chain because the deparaffinizing tissue cells are destroyed at 50 ° C. are doing. In addition, a method of removing impurities other than nucleic acid chains by a two-phase separation method using phenol, chloroform, etc. performed after destruction of deparaffinized tissue cells is also performed by separating an organic solvent phase and an aqueous phase. It takes a lot of time and effort, and the operation is complicated, which causes the contamination of foreign nucleic acid chains. Furthermore, the nucleic acid strand obtained by this method has not sufficiently removed the inhibitor for the gene amplification reaction by the PCR method,
There are many problems in using it as a sample for gene analysis using the PCR method.

【０００５】一方、脱パラフィンされた組織細胞を界面
活性剤（ＳＤＳ）を含む溶液（タンパク質分解酵素等は
含まない）中、37℃、15分間処理し、次いで、この溶液
にタンパク質分解酵素（プロテイナーゼＫ）を加えて更
に37℃、12時間処理することにより組織細胞を破壊した
後、フェノール及びクロロホルムを加え、常法により以
後の操作を行っている例もある〔Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ
Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．８，ｐ５４
３−５４６（１９９１）〕。この方法は、他の従来法と
比べると処理時間がかなり短くなってはいるが、それで
も未だ12時間以上を要し、また、細胞破壊処理後の不純
物の除去も、依然として二相分離方式で行われているの
で、操作が煩雑であり、且つその操作の煩雑さは外来核
酸鎖の混入の要因にもなるという問題を抱えている。更
に、この方法により得られる核酸鎖も、ＰＣＲ法による
遺伝子増幅反応に対する阻害物質が充分には除去されて
いない為、ＰＣＲ法を利用した遺伝子分析用の試料とし
て使用するには未だ問題が多い。On the other hand, the deparaffinized tissue cells are treated at 37 ° C. for 15 minutes in a solution containing a surfactant (SDS) (not containing proteolytic enzymes and the like), and then the proteolytic enzymes (proteinases) are added to the solution. K) and further treated at 37 ° C. for 12 hours to destroy the tissue cells, and then phenol and chloroform are added, and the subsequent operation is performed in a usual manner in some cases [Laboratory]
Medicine, vol. 22, no. 8, p54
3-546 (1991)]. Although the processing time of this method is considerably shorter than other conventional methods, it still takes 12 hours or more, and the removal of impurities after the cell disruption treatment is still performed by the two-phase separation method. Therefore, there is a problem that the operation is complicated, and the complicated operation is also a factor of contamination of the foreign nucleic acid chain. Furthermore, the nucleic acid strand obtained by this method also has many problems in using it as a sample for gene analysis using the PCR method, because the inhibitor for the gene amplification reaction by the PCR method is not sufficiently removed.

【０００６】[0006]

【発明の目的】本発明は、上記した如き状況に鑑み成さ
れたものであり、短時間で容易に核酸鎖を得ることが可
能な、遺伝子分析用試料としてのパラフィン包埋組織標
本の処理方法、ＰＣＲ法による遺伝子増幅反応に好適な
高純度の核酸鎖を短時間で容易に得ることが可能な、遺
伝子分析用試料としてのパラフィン包埋組織標本の処理
方法、並びに、それらに用いられるキットを提供するこ
とを目的とする。SUMMARY OF THE INVENTION The present invention has been made in view of the above-mentioned circumstances, and provides a method for processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, which can easily obtain a nucleic acid chain in a short time. A method for treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, which can easily obtain a high-purity nucleic acid chain suitable for a gene amplification reaction by a PCR method in a short time, and a kit used therefor. The purpose is to provide.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明は、パラフィンを
除去したパラフィン包埋組織標本とタンパク質変性作用
を有する界面活性剤とを含有する水性懸濁液を60℃以上
で加熱処理することを特徴とする、遺伝子分析用試料と
してのパラフィン包埋組織標本の処理方法の発明であ
る。The present invention is characterized in that an aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing effect is heat-treated at 60 ° C. or higher. It is an invention of a method for processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis.

【０００８】また、本発明は、パラフィンを除去したパ
ラフィン包埋組織標本とタンパク質変性作用を有する界
面活性剤とを含有する水性懸濁液を60℃以上で加熱処理
した後、更にこれにタンパク質分解酵素を作用させるこ
とを特徴とする、遺伝子分析用試料としてのパラフィン
包埋組織標本の処理方法の発明である。[0008] The present invention also relates to a method for heat-treating an aqueous suspension containing paraffin-embedded tissue specimens from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing action at 60 ° C or higher, and further subjecting it to protein degradation. It is an invention of a method for treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, characterized by allowing an enzyme to act.

【０００９】更に、本発明は、パラフィンを除去したパ
ラフィン包埋組織標本とタンパク質変性作用を有する界
面活性剤とを含有する水性懸濁液を60℃以上で加熱処理
した後、更にこれにタンパク質分解酵素を作用させ、次
いで核酸鎖を沈殿させることを特徴とする、遺伝子分析
用試料としてのパラフィン包埋組織標本の処理方法の発
明である。Further, the present invention provides an aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein-denaturing effect, which is subjected to heat treatment at 60 ° C. or higher, and further subjected to protein degradation. It is an invention of a method for treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, which comprises reacting an enzyme and then precipitating a nucleic acid chain.

【００１０】また、本発明は、パラフィンを除去したパ
ラフィン包埋組織標本とタンパク質変性作用を有する界
面活性剤とを含有する水性懸濁液を60℃以上で加熱処理
した後、更にこれにタンパク質分解酵素を作用させ、次
いで該反応液にタンパク質変性作用を有する有機化合物
含有溶液を作用させた後、核酸鎖を沈殿させることを特
徴とする、遺伝子分析用試料としてのパラフィン包埋組
織標本の処理方法の発明である。[0010] Further, the present invention provides a method for treating a water suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing effect at a temperature of 60 ° C. or higher, and further subjecting it to protein degradation. A method for treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, which comprises reacting an enzyme and then a solution containing an organic compound having a protein denaturing effect on the reaction solution, and then precipitating a nucleic acid chain. Invention.

【００１１】更にまた、本発明は、(i)タンパク質変性
作用を有する界面活性剤、(ii)タンパク質分解酵素、及
び(iii)ヒドロキシ安息香酸を含有する溶液を組み合わ
せてなることを特徴とする、遺伝子分析用試料としての
パラフィン包埋組織標本の処理用キットの発明である。Further, the present invention is characterized by comprising a combination of a solution containing (i) a surfactant having a protein denaturing effect, (ii) a protease, and (iii) hydroxybenzoic acid. It is an invention of a kit for processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis.

【００１２】また、本発明は、パラフィンを除去したパ
ラフィン包埋組織標本とタンパク質変性作用を有する界
面活性剤とを含有する水性懸濁液を加熱処理した後、こ
れにタンパク質分解酵素を作用させ、次いで該反応液に
ヒドロキシ安息香酸含有アルコール水溶液を作用させた
後、核酸鎖を沈殿させることを特徴とする、遺伝子分析
用試料としてのパラフィン包埋組織標本の処理方法の発
明である。[0012] Further, the present invention provides a method for preparing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and an aqueous suspension containing a surfactant having a protein denaturing effect, followed by subjecting the aqueous suspension to a protease. Next, the present invention provides a method for treating a paraffin-embedded tissue sample as a sample for gene analysis, which comprises reacting an aqueous solution of hydroxybenzoic acid-containing alcohol on the reaction solution and then precipitating a nucleic acid chain.

【００１３】即ち、本発明者等は、上記目的を達成すべ
く鋭意研究を重ねた結果、遺伝子分析用試料としてのパ
ラフィン包埋組織標本を処理する方法に於いて、従来の
処理方法である界面活性剤とタンパク質分解酵素とを同
時に用いて比較的温和な条件下で行う、脱パラフィンさ
れた組織細胞の破壊処理の代わりに、パラフィンを除去
したパラフィン包埋組織標本とタンパク質変性作用を有
する界面活性剤とを含有する水性懸濁液を60℃以上で加
熱処理するか、或は該加熱処理後タンパク質分解酵素を
作用させれば、従来法に於ける問題点、即ち組織細胞の
破壊処理に長時間を要するという点が解消され、該処理
時間を大幅に短縮し得ることを見出した。更に、パラフ
ィンを除去したパラフィン包埋組織標本とタンパク質変
性作用を有する界面活性剤とを含有する水性懸濁液を加
熱処理した後、タンパク質分解酵素を作用させ、次いで
従来法で行われるフェノールやクロロホルム等を用いた
二相分離方式によるタンパク質変性・除去操作を行なう
代わりに、タンパク質変性作用を有する有機化合物含有
溶液（例えばフェノール性水酸基を有する有機化合物を
含むアルコール水溶液等）を用いて一相式のタンパク質
変性・除去操作を行えば、従来法に於ける問題点、即ち
分離操作が必要なため操作が煩雑となり且つ外来核酸鎖
が混入する可能性が高くなるという点や、ＰＣＲ反応を
阻害する物質の除去が不十分であるという点等が解消さ
れ、操作手順を簡略化でき、操作時間を短縮し得るこ
と、更にはＰＣＲ法による遺伝子増幅反応に対する阻害
物質の混入が少なくＰＣＲ法に好適な核酸鎖を得ること
ができることを見出し、本発明を完成するに至った。That is, the present inventors have conducted intensive studies to achieve the above object, and as a result, in a method of processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, an interface which is a conventional processing method is used. Instead of deparaffinized tissue cell destruction performed under relatively mild conditions using an activator and proteolytic enzyme simultaneously, a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant that has a protein denaturing effect If the aqueous suspension containing the agent is subjected to heat treatment at 60 ° C. or higher, or after the heat treatment, a protease is allowed to act, which is a problem in the conventional method, that is, a long-lasting treatment for destruction of tissue cells. It has been found that the problem that time is required has been resolved, and that the processing time can be significantly reduced. Further, after an aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing effect is subjected to heat treatment, a proteolytic enzyme is allowed to act, and then phenol or chloroform, which is performed by a conventional method, is used. Instead of performing a protein denaturing / removing operation by a two-phase separation method using a compound or the like, a one-phase type using an organic compound-containing solution having a protein denaturing action (for example, an aqueous alcohol solution containing an organic compound having a phenolic hydroxyl group) is used. If protein denaturation / removal operation is performed, the problems in the conventional method, that is, the separation operation is required, the operation becomes complicated and the possibility of contamination by foreign nucleic acid chains increases, and substances that inhibit the PCR reaction The point that the removal is insufficient, the operation procedure can be simplified, and the operation time can be shortened. It is found that it is possible to obtain a suitable nucleic acid strand in the PCR method contamination less of inhibitor to the gene amplification reaction by the PCR method, and completed the present invention.

【００１４】本発明に於いて用いられるパラフィン包埋
組織標本としては、採取した組織材料、例えば、膵臓、
大腸、大腸癌、筋肉、膀胱、腎臓、肺、脳、リンパ腫等
を組織・細胞の微細構造を保存すると共に標本作製の前
処置を施すために、タンパク質凝固作用を有するような
薬液、例えば、ホルマリン液、グルタール・アルデヒド
液、ホルマリン・アルコール混液、アルコール液、Ｂｏ
ｕｉｎ液、Ｚｅｎｋｅｒ液、Ｈｅｌｙ液、オスミウム
液、カルノア液等で固定処理した後にパラフィンで包埋
した標本等、核酸鎖を含む標本であって通常この分野で
パラフィン包埋組織標本と呼ばれるものが全て挙げられ
る。The paraffin-embedded tissue specimen used in the present invention includes a collected tissue material such as pancreas,
A drug solution having a protein coagulation action, such as formalin, for preserving the fine structure of tissues and cells and preparing for preparation of specimens of colon, colon cancer, muscle, bladder, kidney, lung, brain, lymphoma, etc. Solution, glutar / aldehyde solution, formalin / alcohol mixture, alcohol solution, Bo
Specimens containing nucleic acid chains, such as specimens fixed in Uin's solution, Zenker's solution, Hely's solution, osmium solution, Carnoy's solution, and then embedded in paraffin, which are usually called paraffin-embedded tissue specimens in this field. No.

【００１５】本発明に於いて用いられるパラフィン包埋
組織標本からパラフィンを除去する方法としては、通常
この分野でパラフィン包埋組織標本からパラフィンを除
去する方法であれば何れにても良く、例えば、パラフィ
ン包埋組織標本に非水溶性有機溶剤を加え攪拌振とう
し、遠心後上清を除きパラフィンを除去する方法等が挙
げられる。また、これらの方法で使用される、パラフィ
ンを溶解、除去する為の非水溶性有機溶剤としては、通
常この分野でパラフィンを溶解、除去する為に使用され
ているものであれば何れにても良く、特に限定されない
が、例えばキシレン、Ｄ−リモネン、オクタン等が好ま
しく挙げられる。なかでも、人体に対する毒性の点等を
考慮するとＤ−リモネン等が好ましく用いられる。ま
た、これらの使用量としては、試料である組織標本の厚
さ等によって異なる為一概には言えないが、該組織標本
を充分に浸漬し得る程度の量を用いれば足りる。As a method for removing paraffin from a paraffin-embedded tissue specimen used in the present invention, any method may be used as long as it is a method for removing paraffin from a paraffin-embedded tissue specimen in this field. A method of adding a water-insoluble organic solvent to a paraffin-embedded tissue sample, shaking and shaking, removing the supernatant after centrifugation, and removing paraffin is mentioned. Further, as the water-insoluble organic solvent for dissolving and removing paraffin used in these methods, any water-soluble organic solvent which is generally used for dissolving or removing paraffin in this field can be used. Although not particularly limited, for example, xylene, D-limonene, octane and the like are preferable. Among them, D-limonene and the like are preferably used in consideration of toxicity to the human body. In addition, the amount of use of these varies depending on the thickness of the tissue sample as a sample, and cannot be unconditionally determined. However, it is sufficient to use an amount that can sufficiently immerse the tissue sample.

【００１６】本発明に於いて用いられる界面活性剤とし
ては、タンパク質の変性作用を有するものとしてこの分
野で一般に用いられているものであれば陽イオン性界面
活性剤、陰イオン性界面活性剤、非イオン性界面活性
剤、両性界面活性剤の何れでも良く、特に限定されない
が、具体的には例えばドデシルトリメチルアンモニウム
ブロミド、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド、
セチルトリメチルアンモニウムブロミド等の陽イオン性
界面活性剤、例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）、Ｎ−ラウロイルザルコシンナトリウム、コール酸
ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等の陰イオン
性界面活性剤、例えばポリオキシエチレンオクチルフェ
ニルエーテル（例えばローム アンド ハース社商品
名：トリトンＸ−１００等）、ポリオキシエチレンソル
ビタンモノラウレート（例えば花王（株）商品名：トゥ
イーン２０等）、ポリオキシエチレンソルビタンモノオ
レエート（例えば花王（株）商品名：トゥイーン８０
等）、ｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド等の非イオン
性界面活性剤、例えば３−〔（３−コラミドプロピル）
ジメチルアンモニオ〕−１−プロパンスルホネート、ホ
スファチジルエタノールアミン等の両性界面活性剤等が
代表的なものとして挙げられる。これらの内、ＳＤＳ等
の陰イオン性界面活性剤はタンパク質変性作用が強いの
で特に好ましく用いられる。また、これらの界面活性剤
は単独又は混合して使用することができることは言うま
でもない。The surfactant used in the present invention may be a cationic surfactant, an anionic surfactant, or a surfactant which is generally used in this field as having a protein denaturing action. Nonionic surfactants, any of amphoteric surfactants may be used, and are not particularly limited. Specifically, for example, dodecyltrimethylammonium bromide, dodecyltrimethylammonium chloride,
Cationic surfactants such as cetyltrimethylammonium bromide such as sodium dodecyl sulfate (SD
S), anionic surfactants such as sodium N-lauroylsarcosine, sodium cholate, sodium deoxycholate, and the like, for example, polyoxyethylene octyl phenyl ether (for example, Rohm and Haas company name: Triton X-100, etc.), Polyoxyethylene sorbitan monolaurate (for example, Kao Corporation product name: Tween 20), polyoxyethylene sorbitan monooleate (for example, Kao Corporation product name: Tween 80)
Nonionic surfactants such as n-octyl-β-D-glucoside, for example, 3-[(3-cholamidopropyl)
Representative examples thereof include amphoteric surfactants such as [dimethylammonio] -1-propanesulfonate and phosphatidylethanolamine. Of these, anionic surfactants such as SDS are particularly preferably used because of their strong protein denaturing action. Needless to say, these surfactants can be used alone or as a mixture.

【００１７】本発明の遺伝子分析用試料としてのパラフ
ィン包埋組織標本の処理方法の一つは、前述の如きパラ
フィンを除去したパラフィン包埋組織標本とタンパク質
変性作用を有する界面活性剤とを含有する水性懸濁液を
調製し、この水性懸濁液を60℃以上で加熱処理すること
により実施することができる。パラフィンを除去したパ
ラフィン包埋組織標本とタンパク質変性作用を有する界
面活性剤とを含有する水性懸濁液を調製する方法として
は、最終的にパラフィンを除去したパラフィン包埋組織
標本とタンパク質変性作用を有する界面活性剤とを含有
する水性懸濁液が得られる方法であれば良く、特に限定
されないが、最も一般的な方法としては、パラフィンを
除去したパラフィン包埋組織標本に、タンパク質変性作
用を有する界面活性剤を含有する水溶液を加え、該パラ
フィンを除去したパラフィン包埋組織標本を懸濁する方
法が好ましく挙げられる。One of the methods for treating a paraffin-embedded tissue sample as a sample for gene analysis of the present invention comprises the paraffin-embedded tissue sample from which paraffin has been removed as described above and a surfactant having a protein denaturing action. It can be carried out by preparing an aqueous suspension and heat-treating the aqueous suspension at 60 ° C. or higher. As a method of preparing an aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein-denaturing effect, a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been finally removed and a protein-denaturing effect are used. Any method may be used as long as an aqueous suspension containing a surfactant having the same can be obtained, and is not particularly limited, but the most common method has a protein denaturing effect on a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed. A preferred method is to add an aqueous solution containing a surfactant and suspend the paraffin-embedded tissue specimen from which the paraffin has been removed.

【００１８】本発明に於いて用いられる界面活性剤の使
用濃度としては、使用する界面活性剤の種類により多少
異なるが、例えば、タンパク質変性作用を有する界面活
性剤を含有する水溶液中の濃度としては、通常0.01〜10
％（W/V）好ましくは0.1〜２％（W/V）の濃度範囲が挙
げられるThe concentration of the surfactant used in the present invention varies somewhat depending on the type of the surfactant used. For example, the concentration in an aqueous solution containing a surfactant having a protein denaturing effect is as follows. , Usually 0.01-10
% (W / V), preferably 0.1 to 2% (W / V).

【００１９】また、パラフィンを除去したパラフィン包
埋組織標本とタンパク質変性作用を有する界面活性剤と
を含有する水性懸濁液中には、例えばリン酸緩衝剤、ク
エン酸緩衝剤、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン（Ｔｒｉｓ）緩衝剤、グリシン緩衝剤、グット緩衝剤
等の緩衝剤、例えば塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩
化マグネシウム、塩化リチウム等の塩類等が含まれてい
ても良い。更に要すれば、例えばエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸
（ＥＧＴＡ）及びそれらの塩等のヌクレアーゼ阻害剤等
が適宜含まれていてもよい。尚、タンパク質変性作用を
有する界面活性剤がヌクレアーゼ活性抑制作用をも有す
る場合は、上記のようなヌクレアーゼ阻害剤等を使用す
る必要はないことは言うまでもない。これらの使用濃度
としては、核酸鎖の遊離を妨げない範囲であれば特に限
定されないが、例えば、タンパク質変性作用を有する界
面活性剤を含有する水溶液中の濃度としては、緩衝剤は
通常１〜500mM、好ましくは５〜200mMの範囲で用いら
れ、また、塩類は通常１〜500mMの範囲で必要に応じて
添加される。該水溶液のpHとしては、核酸鎖の遊離を妨
げない範囲であれば特に限定されないが、通常２〜12、
好ましくは５〜９の範囲から適宜選択される。また、ヌ
クレアーゼ阻害剤は、阻害剤の種類により異なるため一
概には規定できないが、例えばＥＤＴＡを用いる場合に
は該水溶液中の濃度として、通常0.1〜200mM、好ましく
は１〜10mMの範囲で用いられる。In an aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing action, for example, a phosphate buffer, a citrate buffer, and tris (hydroxymethyl ) A buffer such as an aminomethane (Tris) buffer, a glycine buffer, or a good buffer, for example, salts such as sodium chloride, potassium chloride, magnesium chloride, and lithium chloride may be contained. If necessary, a nuclease inhibitor such as, for example, ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), glycol etherdiaminetetraacetic acid (EGTA) and a salt thereof may be appropriately contained. When a surfactant having a protein denaturing action also has a nuclease activity inhibitory action, it goes without saying that it is not necessary to use such a nuclease inhibitor or the like. These concentrations are not particularly limited as long as they do not prevent release of the nucleic acid chain.For example, as the concentration in an aqueous solution containing a surfactant having a protein denaturing effect, the buffer is usually 1 to 500 mM. It is preferably used in the range of 5 to 200 mM, and salts are usually added in the range of 1 to 500 mM as needed. The pH of the aqueous solution is not particularly limited as long as the release of the nucleic acid chain is not hindered.
Preferably, it is appropriately selected from the range of 5 to 9. Further, the nuclease inhibitor cannot be specified unconditionally because it differs depending on the type of the inhibitor.For example, when EDTA is used, the concentration in the aqueous solution is usually 0.1 to 200 mM, preferably 1 to 10 mM. .

【００２０】本発明の処理方法に於ける加熱条件として
は、加熱温度は、通常60℃以上、好ましくは70℃乃至懸
濁液の沸点以下、より好ましくは80℃乃至懸濁液の沸点
以下の範囲から、また、加熱時間は、通常２分以上、好
ましくは５分以上の範囲から夫々適宜選択され、通常は
30分間も加熱すれば十分である。尚、懸濁液の沸点は、
外圧の変化、該懸濁液中の含有物質の組成及び濃度等の
変化に応じてある程度変動することは言うまでもない。As the heating conditions in the treatment method of the present invention, the heating temperature is usually 60 ° C. or higher, preferably 70 ° C. to the boiling point of the suspension, more preferably 80 ° C. to the boiling point of the suspension. The heating time is appropriately selected from the range of usually 2 minutes or more, preferably 5 minutes or more.
Heating for 30 minutes is enough. The boiling point of the suspension is
Needless to say, it fluctuates to some extent according to changes in the external pressure and changes in the composition and concentration of the substances contained in the suspension.

【００２１】本発明の処理方法をより具体的に記載すれ
ば、例えば以下の如くである。The processing method of the present invention will be described more specifically, for example, as follows.

【００２２】即ち、パラフィン包埋組織切片（通常厚さ
約10μm程度）をテストチューブに入れ、例えばキシレ
ン、リモネン等の非水溶性有機溶剤を適当量（組織切片
を浸漬し得る程度）加えよく攪拌振とうした後、常温に
て遠心後上清を除きパラフィンを除去する（２回）。次
に適当量の例えばエタノール等の揮発性の有機溶媒を加
え攪拌振とう後、常温にて遠心し、上清を除いて非水溶
性有機溶剤を除去（２回）した後、得られたペレットを
乾燥処理する。続いて該ペレットに0.01〜10％（W/V）
のタンパク質変性作用を有する界面活性剤を含んだ水溶
液を添加し、該ペレットを懸濁する。次いで、得られた
懸濁液を例えば70℃以上で２分以上加熱すればよい。
尚、上記の方法で処理された遺伝子分析用試料（以下、
遺伝子分析用試料Ａと称す。）は、そのままＰＣＲ法に
よる遺伝子分析等の試料として使用することも可能であ
り、また、これを更に、この分野で通常使用されている
方法によって核酸鎖を採取・精製する際の試料とするこ
とも可能である。That is, a tissue section of paraffin-embedded tissue (usually about 10 μm in thickness) is placed in a test tube, and a suitable amount of a water-insoluble organic solvent such as xylene, limonene or the like (to the extent that the tissue section can be immersed) is added and stirred well. After shaking, centrifugation is performed at room temperature, and the supernatant is removed to remove paraffin (twice). Next, an appropriate amount of a volatile organic solvent such as ethanol is added, and the mixture is shaken with stirring, centrifuged at room temperature, the supernatant is removed, and the water-insoluble organic solvent is removed (twice). Is dried. Subsequently, the pellets are added at 0.01-10% (W / V)
An aqueous solution containing a surfactant having a protein denaturing effect is added, and the pellet is suspended. Next, the obtained suspension may be heated at, for example, 70 ° C. or more for 2 minutes or more.
In addition, the sample for gene analysis processed by the above method (hereinafter, referred to as
It is referred to as sample A for gene analysis. ) Can be used as it is as a sample for gene analysis or the like by the PCR method, and further used as a sample for collecting and purifying a nucleic acid chain by a method usually used in this field. Is also possible.

【００２３】上記の処理方法を実施した後、即ちパラフ
ィンを除去したパラフィン包埋組織標本とタンパク質変
性作用を有する界面活性剤とを含有する水性懸濁液を加
熱処理した後に、更にタンパク質分解酵素を作用させ
て、遺伝子分析用試料としてのパラフィン包埋組織標本
を処理することによっても、ＰＣＲ法による遺伝子分析
等の試料を調製することも可能である。このようにする
ことによっても、従来法と比べて操作手順を簡略化でき
るので操作時間を大幅に短縮することが可能となる。ま
た、タンパク質分解酵素を用いて処理することによりパ
ラフィン包埋組織標本からの核酸鎖の採取効率がより高
くなるという効果等も生じる。After carrying out the above-mentioned treatment method, that is, after subjecting an aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein-denaturing effect to heat treatment, the protease is further purified. It is also possible to prepare a sample for gene analysis or the like by the PCR method by treating and treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis. By doing so, the operation procedure can be simplified as compared with the conventional method, so that the operation time can be greatly reduced. In addition, the treatment using a proteolytic enzyme also has the effect of increasing the efficiency of collecting nucleic acid chains from a paraffin-embedded tissue specimen.

【００２４】本発明に於いて用いられるタンパク質分解
酵素としては通常この分野でタンパク質を分解する目的
で使用されるものであれば特に限定されないが、例えば
パパイン、プロティナーゼＫ、プロナーゼ等が好ましく
挙げられる。これらタンパク質分解酵素の処理温度は、
通常37〜70℃、好ましくは40〜60℃であり、処理時間
は、処理温度やその他の要因によっても左右されるが、
通常５〜300分、好ましくは60〜120分程度である。ま
た、これらの使用時の濃度としては、通常タンパク質分
解工程に於ける反応溶液中の濃度として0.01〜10mg／ml
の範囲で用いられる。尚、タンパク質分解酵素として、
本発明の加熱条件下、例えば70℃以上の高温条件下でも
触媒活性を示す、熱安定（耐熱）性タンパク質分解酵素
を使用する場合には、本発明に於いてパラフィンを除去
したパラフィン包埋組織標本とタンパク質変性作用を有
する界面活性剤とを含有する水性懸濁液を加熱処理する
際に、同時にタンパク質分解酵素を作用させることがで
き、更に操作手順を簡略化できる。The proteolytic enzyme used in the present invention is not particularly limited as long as it is usually used for the purpose of decomposing proteins in this field, and preferred examples thereof include papain, proteinase K, and pronase. The processing temperature of these proteases is
Usually 37-70 ° C, preferably 40-60 ° C, and the processing time depends on the processing temperature and other factors,
Usually, it is about 5 to 300 minutes, preferably about 60 to 120 minutes. The concentration at the time of use is usually 0.01 to 10 mg / ml as the concentration in the reaction solution in the protein degradation step.
Used in the range. In addition, as a proteolytic enzyme,
When using a heat-stable (heat-resistant) proteinase that exhibits catalytic activity under the heating conditions of the present invention, for example, a high temperature condition of 70 ° C. or higher, the paraffin-embedded tissue from which paraffin has been removed in the present invention When the aqueous suspension containing the specimen and the surfactant having a protein denaturing action is heat-treated, the protease can be allowed to act simultaneously, and the operation procedure can be further simplified.

【００２５】上記の遺伝子分析用試料としてのパラフィ
ン包埋組織標本の処理方法を実施するためには、例えば
以下の如く行えば良い。In order to carry out the above-described method of processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, the following method may be used, for example.

【００２６】即ち、前述の処理方法で処理された遺伝子
分析用試料Ａ（即ち、パラフィンを除去したパラフィン
包埋組織標本とタンパク質変性作用を有する界面活性剤
とを含有する水性懸濁液を加熱処理したもの）に、更
に、0.01〜10mg／mlのタンパク質分解酵素を添加し、例
えば40〜60℃で60〜120分間反応させることにより実施
することができる〔尚、ここでタンパク質分解酵素を添
加する際に、プロテアーゼの賦活剤であるジチオスレイ
トール（ＤＴＴ）等のチオール化合物を加えることは任
意であるが、特にタンパク質分解酵素としてパパインを
使用した場合は、該チオール化合物を添加することが望
ましい。〕。尚、上記の方法で得られた遺伝子分析用試
料（以下、遺伝子分析用試料Ｂと称す。）は、そのまま
ＰＣＲ法による遺伝子分析等の試料として使用すること
も可能であり、また、これを更に、この分野で通常使用
されている方法によって核酸鎖を採取・精製する際の試
料として使用することも可能である。That is, a sample A for gene analysis (ie, an aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing effect) treated by the above-described treatment method is subjected to heat treatment. Can be carried out by further adding 0.01 to 10 mg / ml of a protease and reacting the mixture at, for example, 40 to 60 ° C. for 60 to 120 minutes [where the protease is added. At this time, it is optional to add a thiol compound such as dithiothreitol (DTT) which is a protease activator, but it is desirable to add the thiol compound particularly when papain is used as a protease. ]. The sample for gene analysis (hereinafter, referred to as sample B for gene analysis) obtained by the above method can be used as it is as a sample for gene analysis by a PCR method. It can also be used as a sample when collecting and purifying a nucleic acid chain by a method usually used in this field.

【００２７】即ち、上記の如き遺伝子分析用試料として
のパラフィン包埋組織標本の処理方法を実施した後、即
ちパラフィンを除去したパラフィン包埋組織標本とタン
パク質変性作用を有する界面活性剤とを含有する水性懸
濁液を加熱処理し、得られた懸濁液にタンパク質分解酵
素を作用させた後に、更に核酸鎖を沈殿採取して、ＰＣ
Ｒ法による遺伝子分析等の試料を得ることも可能であ
る。このようにして、遺伝子分析用試料としてのパラフ
ィン包埋組織標本を処理しても、従来法と比べて操作手
順を簡略化できるので操作時間を大幅に短縮することが
できる。That is, after the above-described method for treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis is carried out, that is, it contains a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing action. The aqueous suspension was heat-treated, and the resulting suspension was allowed to react with proteolytic enzymes.
It is also possible to obtain a sample for gene analysis by the R method. In this way, even when a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis is processed, the operation procedure can be simplified as compared with the conventional method, so that the operation time can be greatly reduced.

【００２８】本発明に於いて核酸鎖を沈殿させる為に
は、この分野で核酸鎖を沈殿させるために通常用いられ
るものであれば特に限定されないが、例えばアルコール
類等が用いられる。アルコール類としては、この分野で
核酸鎖を沈殿させるために通常用いられるものであれば
特に限定されないが、例えばエタノール、イソプロパノ
ール等が好ましく挙げられ、目的の核酸鎖を沈殿させる
際には、採取した核酸鎖を含む溶液に対して通常0.5〜
３倍量のアルコール類が用いられる。In the present invention, the method of precipitating a nucleic acid chain is not particularly limited as long as it is generally used for precipitating a nucleic acid chain in this field. For example, alcohols and the like are used. Alcohols are not particularly limited as long as they are commonly used for precipitating nucleic acid chains in this field, but preferably include, for example, ethanol, isopropanol, etc., and are collected when precipitating a target nucleic acid chain. Usually 0.5 to the solution containing the nucleic acid chain
Three times the amount of alcohol is used.

【００２９】上記の遺伝子分析用試料としてのパラフィ
ン包埋組織標本の処理方法を実施するためには、例えば
以下の如く行えば良い。In order to carry out the above-described method of processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, the following method may be used, for example.

【００３０】即ち、前述の処理方法で処理された遺伝子
分析用試料Ｂ（即ち、パラフィンを除去したパラフィン
包埋組織標本とタンパク質変性作用を有する界面活性剤
とを含有する水性懸濁液を加熱処理し、得られた懸濁液
にタンパク質分解酵素を作用させて得られたもの）に、
0.5〜３倍量のアルコール類を添加し、混合した後、室
温にて10分間静置する。尚、ここで核酸鎖を沈殿させ易
くするために、例えばＮａＣｌ、酢酸ナトリウム等の塩
類をアルコール類と共に適宜加えることは任意である。
静置後遠心し、核酸鎖を沈殿させた後、上清を除き、沈
殿に例えば70％エタノール等を適当量添加して洗浄、遠
心し、上清を除いた後乾燥処理すれば目的とする遺伝子
分析用試料（以下、遺伝子分析用試料Ｃと称す。）を得
ることができる。尚、上記の方法で得られた遺伝子分析
用試料Ｃを、ＰＣＲ法による遺伝子分析等の試料として
使用する場合には、これを更にこの分野で通常使用され
ている方法、例えば、ＴＥ緩衝液（10mMトリス−塩酸緩
衝液、１mM ＥＤＴＡ含有、pH8.0）等に再溶解し、適当
量のＲＮａｓｅを添加後、37〜55℃で１〜90分間処理
し、ＲＮＡを消化する方法等で処理し得られた精製ＤＮ
Ａを使用するのが望ましい。That is, the sample B for gene analysis (that is, an aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing effect) treated by the above-described treatment method is subjected to heat treatment. And the suspension obtained by the action of proteolytic enzymes)
After 0.5 to 3 times the amount of alcohol is added and mixed, the mixture is allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Here, in order to facilitate precipitation of the nucleic acid chain, it is optional to appropriately add salts such as, for example, NaCl and sodium acetate together with alcohols.
After standing, centrifugation is performed to precipitate the nucleic acid chain, and the supernatant is removed. The precipitate is washed with an appropriate amount of, for example, 70% ethanol, centrifuged, centrifuged, and the supernatant is removed. A sample for gene analysis (hereinafter, referred to as sample C for gene analysis) can be obtained. When the sample C for gene analysis obtained by the above method is used as a sample for gene analysis or the like by a PCR method, it is further used in a method generally used in this field, for example, a TE buffer ( Redissolve in 10 mM Tris-HCl buffer, 1 mM EDTA, pH 8.0), add an appropriate amount of RNase, treat at 37-55 ° C for 1-90 minutes, and digest with RNA. Obtained purified DN
It is desirable to use A.

【００３１】また、前述の遺伝子分析用試料としてのパ
ラフィン包埋組織標本の処理方法を実施した後、即ちパ
ラフィンを除去したパラフィン包埋組織標本とタンパク
質変性作用を有する界面活性剤とを含有する水性懸濁液
を加熱処理し、得られた懸濁液にタンパク質分解酵素を
作用させた後に、タンパク質変性作用を有する有機化合
物含有溶液を作用させ、更に、核酸鎖を沈殿採取する方
法により遺伝子分析用試料としてのパラフィン包埋組織
標本を処理しても、従来法と比べて操作手順を簡略化で
きるので操作時間を短縮することができ、且つＰＣＲ法
による遺伝子増幅反応に対する阻害物質の混入が少なく
ＰＣＲ法に好適な核酸鎖を採取することができる。Further, after the above-described method for treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis is performed, that is, an aqueous solution containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing effect. The suspension is subjected to a heat treatment, and a proteolytic enzyme is allowed to act on the resulting suspension. Then, a solution containing an organic compound having a protein denaturing effect is acted on. Even when processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample, the operation procedure can be simplified as compared with the conventional method, so that the operation time can be shortened, and the contamination of the PCR-based gene amplification reaction with an inhibitory substance is small, and A nucleic acid chain suitable for the method can be collected.

【００３２】本発明に於いて用いられるタンパク質変性
作用を有する有機化合物としては、そのような性質を有
するものであって水にある程度溶解する性質を有するも
のであれば特に限定されないが、例えばフェノール性水
酸基を有する有機化合物が好ましく挙げられる。フェノ
ール性水酸基を有する化合物の具体例としては、例えば
フェノール、ｏ−，ｍ−，ｐ−ヒドロキシ安息香酸、２
−アミノ−４−クロロフェノール、ｍ−アミノフェノー
ル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、カテコール、グア
ヤコール、ハイドロキノン、ｐ−ヒドロキシフェネチル
アルコール、プロトカテキュ酸、ｐ−（メトキシエチ
ル）フェノール等が挙げられる。なかでも、ヒト皮膚に
対して非腐食性のもの、例えばヒドロキシ安息香酸等が
好ましく、特にｍ−ヒドロキシ安息香酸が好ましく用い
られる。これらフェノール性水酸基を有する有機化合物
の使用濃度は、化合物の種類によって異なるが、一般に
タンパク質を変性させる工程に於ける反応溶液中の濃度
として０．０１％（Ｗ／Ｖ）以上２０％（Ｗ／Ｖ）未満
の範囲で用いられる。尚、ｍ−ヒドロキシ安息香酸を使
用する場合には、該反応溶液中の濃度として１〜１０％
（Ｗ／Ｖ）の範囲が好ましく用いられる。The organic compound having a protein denaturing effect used in the present invention is not particularly limited as long as it has such properties and has a property of being soluble in water to some extent. Preferred are organic compounds having a hydroxyl group. Specific examples of the compound having a phenolic hydroxyl group include, for example, phenol, o-, m-, p-hydroxybenzoic acid,
-Amino-4-chlorophenol, m-aminophenol, methyl p-hydroxybenzoate, catechol, guaiacol, hydroquinone, p-hydroxyphenethyl alcohol, protocatechuic acid, p- (methoxyethyl) phenol and the like. Above all, those which are non-corrosive to human skin, such as hydroxybenzoic acid, are preferred, and m-hydroxybenzoic acid is particularly preferred. The concentration of the organic compound having a phenolic hydroxyl group used varies depending on the type of the compound, but is generally 0.01% (W / V) or more and 20% (W / V) as the concentration in the reaction solution in the step of denaturing the protein. V). When m-hydroxybenzoic acid is used, the concentration in the reaction solution is 1 to 10%.
The range of (W / V) is preferably used.

【００３３】本発明に於いてタンパク質を変性させるた
めに使用する有機化合物含有溶液としては、タンパク質
を変性させる作用を有している上記した如き有機化合物
を含む溶液であれば特に限定されない。尚、該溶液中に
は該有機化合物を溶解させるために、例えばエタノー
ル、イソプロパノール等のアルコール類やアセトン等の
水溶性有機溶媒を含んでいてもよく、なかでもエタノー
ル、イソプロパノール等のアルコール類は、核酸鎖を沈
殿させる際に悪影響を与えないので好ましく用いられ
る。これら水溶性有機溶媒は該溶液中の濃度として通常
１０〜９０％（Ｗ／Ｖ）の範囲で適宜用いられる。ま
た、該有機化合物を含む溶液のｐＨとしては、用いる有
機化合物によって異なる為一概にはいえないが、何れに
してもタンパク質変性作用に支障のない範囲であればよ
く、一般に４〜１０の範囲から適宜選択される。尚、有
機化合物としてｍ−ヒドロキシ安息香酸を使用する場合
には、該溶液のｐＨは５〜８の範囲から適宜選択され
る。尚、何れの場合であっても有機化合物は該溶液中に
均一に溶解していなければならないことはいうまでもな
い。該方法、即ち、ｍ−ヒドロキシ安息香酸等の有機化
合物を含有する溶液を作用させる方法により処理した場
合には、細胞破壊処理後の不純物除去を一相式で行うこ
とができるので、操作が容易であり、且つ外来核酸鎖の
混入も防げるので、特に好ましい方法と言うことができ
る。The organic compound-containing solution used for denaturing the protein in the present invention is not particularly limited, as long as it is a solution containing the above-mentioned organic compound having a protein denaturing action. In addition, in order to dissolve the organic compound in the solution, for example, ethanol, alcohols such as isopropanol and water-soluble organic solvents such as acetone may be included, among which ethanol and alcohols such as isopropanol are It is preferably used because it does not adversely affect the precipitation of the nucleic acid chain. These water-soluble organic solvents are appropriately used usually in a concentration of 10 to 90% (W / V) in the solution. Further, the pH of the solution containing the organic compound varies depending on the organic compound to be used, and cannot be unconditionally determined, but in any case, it may be within a range that does not hinder the protein denaturing action. It is appropriately selected. When m-hydroxybenzoic acid is used as the organic compound, the pH of the solution is appropriately selected from the range of 5 to 8. In any case, it is needless to say that the organic compound must be uniformly dissolved in the solution. When the treatment is performed by this method, that is, a method in which a solution containing an organic compound such as m-hydroxybenzoic acid is allowed to act, impurities can be removed after the cell disruption treatment in a one-phase system, so that the operation is easy. In addition, it can be said that the method is particularly preferable because foreign nucleic acid chains can be prevented from being mixed.

【００３４】上記の遺伝子分析用試料としてのパラフィ
ン包埋組織標本の処理方法を実施するためには、例えば
以下の如く行えば良い。In order to carry out the above-mentioned method of processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, the following method may be used, for example.

【００３５】即ち、前述の処理方法で処理された遺伝子
分析用試料Ｂ（即ち、パラフィンを除去したパラフィン
包埋組織標本とタンパク質変性作用を有する界面活性剤
とを含有する水性懸濁液を加熱処理し、得られた懸濁液
にタンパク質分解酵素を作用させて得られたもの）に、
更に、タンパク質変性作用を有する有機化合物を含有す
る溶液を添加し、室温にて数秒乃至数時間反応させタン
パク質を変性させた後、遠心して上清を別のチューブに
移す。次に、その上清に0.5〜３倍量のアルコール類を
添加し、混合した後室温にて10分間静置する。尚、ここ
で核酸鎖を沈殿させ易くするために、例えばＮａＣｌ、
酢酸ナトリウム等の塩類をアルコール類と共に適宜加え
ることは任意である。静置後遠心し核酸鎖を沈殿させた
後、上清を除き、沈殿に例えば70％エタノール等を適当
量添加して洗浄、遠心し、上清を除いた後乾燥処理すれ
ば目的とする遺伝子分析用試料（以下、遺伝子分析用試
料Ｄと称す。）を得ることができる。尚、上記の方法で
得られた遺伝子分析用試料Ｄを、ＰＣＲ法による遺伝子
分析等の試料として使用する場合には、これを更にこの
分野で通常使用されている方法、例えば、ＴＥ緩衝液
（10mMトリス−塩酸緩衝液、１mM ＥＤＴＡ含有、pH8.
0）等に再溶解し、適当量のＲＮａｓｅを添加後、37〜5
5℃で１〜90分間処理し、ＲＮＡを消化する方法等で処
理し得られた精製ＤＮＡを使用するのが望ましい。That is, the sample B for gene analysis (that is, an aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein-denaturing effect) treated by the above-described treatment method is subjected to heat treatment. And the suspension obtained by the action of proteolytic enzymes)
Further, a solution containing an organic compound having a protein denaturing action is added, and the mixture is allowed to react at room temperature for several seconds to several hours to denature the protein, followed by centrifugation and transfer of the supernatant to another tube. Next, 0.5 to 3 volumes of alcohols are added to the supernatant, mixed, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Here, in order to facilitate precipitation of the nucleic acid chain, for example, NaCl,
It is optional to appropriately add salts such as sodium acetate together with alcohols. After standing, centrifugation is performed to precipitate the nucleic acid chain, and the supernatant is removed. The precipitate is washed with an appropriate amount of, for example, 70% ethanol, centrifuged, and the supernatant is removed. An analysis sample (hereinafter, referred to as a gene analysis sample D) can be obtained. When the sample D for gene analysis obtained by the above method is used as a sample for gene analysis or the like by a PCR method, it is further used in a method generally used in this field, for example, a TE buffer ( 10 mM Tris-HCl buffer, 1 mM EDTA, pH 8.
0) etc., and after adding an appropriate amount of RNase, 37 to 5
It is preferable to use a purified DNA obtained by treating at 5 ° C. for 1 to 90 minutes and digesting RNA.

【００３６】本発明の遺伝子分析用試料としてのパラフ
ィン包埋組織標本の処理用キットは、前述の遺伝子分析
用試料としてのパラフィン包埋組織標本の処理方法をよ
り効果的に実施するために使用されるもので、(i)タン
パク質変性作用を有する界面活性剤、(ii)タンパク質分
解酵素、及び(iii)ヒドロキシ安息香酸を含有する溶液
を組み合わせてなるものであり、夫々の構成要素の好ま
しい態様、具体例等については先に述べた通りである。The kit for processing a paraffin-embedded tissue sample as a sample for gene analysis of the present invention is used to more effectively carry out the above-described method for processing a paraffin-embedded tissue sample as a sample for gene analysis. And (i) a surfactant having a protein denaturing action, (ii) a protease, and (iii) a solution containing hydroxybenzoic acid, and a preferred embodiment of each component, Specific examples and the like are as described above.

【００３７】以下に実施例、比較例、参考例により本発
明を更に詳細に説明するが、本発明はこれらによって何
ら限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to Examples, Comparative Examples, and Reference Examples, but the present invention is not limited thereto.

【００３８】[0038]

【実施例】【Example】

実施例１．ｍ−ヒドロキシ安息香酸を用いたＤＮＡ採取
法 ヒトのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片（肝臓：
厚さ10μm,約15mm×25mm）１枚を1.5mlテストチューブ
に入れ、Ｄ−リモネン（商品名：レモゾール，和光純薬
工業（株）製）を１ml加えて、マイクロチューブミキサ
ー（ＭＴー３６０，トミー精工製）にて３分間攪拌し
た。常温にて３分間，12,000rpmで遠心後上清を除きパ
ラフィンを除去した（２回）。次に１mlのエタノールを
加え上記ミキサーにて攪拌した後、常温にて３分間12,0
00rpmで遠心し、上清を除くことにより僅かに残ってい
るＤ−リモネンを除去し（２回）、乾燥処理した。続い
て得られたペレットに11mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
0、1.11％ＳＤＳ、5.6mM ＥＤＴＡを含有。）180μlを
添加した後、90℃で10分間加熱した。その後、１M ＤＴ
Ｔ20μlと20mg／mlのパパイン溶液10μlを添加した後、
50℃で90分間反応させた。更に、10％（W/V）ｍーヒド
ロキシ安息香酸を含む40％（V/V）イソプロパノール水
溶液（pH6.0）を200μl加え室温にて30分間反応させ
た。12,000rpmにて、５分間遠心分離し、デカンテーシ
ョンにより上清を別のチューブに移し換えた。その上清
に３M ＮａＣｌ水溶液40μlとイソプロパノール900μl
を添加し混合した後、室温にて10分間静置させ、12,000
rpmで15分間遠心して核酸鎖を沈澱させた。上清を除
き、沈澱に70％エタノール１mlを添加攪拌し、４℃にて
５分間15,000rpmで遠心した後、上清を除き、乾燥処理
して目的の核酸鎖を得た。最後に、得られた核酸鎖をＴ
Ｅ緩衝液（10mMトリス−塩酸緩衝液、1mM ＥＤＴＡ含
有、pH8.0）20μlに再度溶解して、10mg／ml ＲＮａｓ
ｅを１μl添加し、50℃で１時間処理しＤＮＡサンプル
とした。このＤＮＡサンプルは、螢光法によりその収量
を確認し、更にＰＣＲ法によりβ−グロビン遺伝子の増
幅を試みた（ＰＣＲ法条件：94℃、１分間；55℃、２分
間；72℃、３分間。35回）。尚、蛍光法によるＤＮＡの
定量は、以下の方法で行った。得られたＤＮＡサンプル
１μlに２M ３，５−ジアミノ安息香酸・２ＨＣｌを10
μl加えて攪拌した後、60℃で30分間反応させて、更に
0.6N 過塩素酸溶液１mlを加え、蛍光検出器にて蛍光強
度（Ｅｘ＝415nm、Ｅｍ＝515nm）を測定した。また、こ
れと同時に既知濃度のＤＮＡを使用して、ＤＮＡ標準品
を作製し、その測定結果により得られた標準曲線により
各ＤＮＡサンプル中のＤＮＡ量を算出した。ＤＮＡサン
プル中のＤＮＡ収量等を表１に、また、ＰＣＲ法により
増幅したＤＮＡを、エチジウムブロミド0.5μg／mlを含
む、１×ＴＡＥ緩衝液（0.04M Ｔｒｉｓ−酢酸、１mM
ＥＤＴＡ pH7.8）を用いて作製した３％アガロースゲ
ルを使用して100V定電圧で20〜30分電気泳動した後、Ｕ
Ｖイルミネーターを使用してＤＮＡを蛍光検出した結果
を図１（レーン２）にそれぞれ示す。尚、図１中レーン
１は分子量マーカー〔φｘ１７４ ｐｈａｇｅ ＤＮＡ／
ＨａｅIII、（株）ニッポンジーン製〕の結果を示す。
また「←」印はヒトβ−グロビン遺伝子の増幅領域（11
0bp)を示す。Embodiment 1 FIG. DNA collection method using m-hydroxybenzoic acid Human formalin-fixed paraffin-embedded tissue section (liver:
One piece of 10 μm thick, about 15 mm × 25 mm) is placed in a 1.5 ml test tube, 1 ml of D-limonene (trade name: Remozole, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is added, and a micro tube mixer (MT-360, (Made by Tommy Seiko) for 3 minutes. After centrifugation at 12,000 rpm for 3 minutes at room temperature, the supernatant was removed to remove paraffin (twice). Next, 1 ml of ethanol was added, and the mixture was stirred with the above mixer.
The mixture was centrifuged at 00 rpm to remove a small amount of D-limonene by removing the supernatant (twice), followed by drying. Subsequently, 11 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
0, containing 1.11% SDS, 5.6 mM EDTA. ) After adding 180 μl, it was heated at 90 ° C. for 10 minutes. Then 1M DT
After adding 20 μl of T and 10 μl of a 20 mg / ml papain solution,
The reaction was performed at 50 ° C. for 90 minutes. Further, 200 μl of a 40% (V / V) aqueous solution of isopropanol (pH 6.0) containing 10% (W / V) m-hydroxybenzoic acid was added, and reacted at room temperature for 30 minutes. After centrifugation at 12,000 rpm for 5 minutes, the supernatant was transferred to another tube by decantation. 40 μl of 3 M NaCl aqueous solution and 900 μl of isopropanol were added to the supernatant.
Was added and mixed, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
The nucleic acid strand was precipitated by centrifugation at rpm for 15 minutes. The supernatant was removed, 1 ml of 70% ethanol was added to the precipitate, and the mixture was stirred and centrifuged at 4 ° C. for 5 minutes at 15,000 rpm. Then, the supernatant was removed and dried to obtain a target nucleic acid chain. Finally, the obtained nucleic acid chain is
Redissolved in 20 μl of E buffer (10 mM Tris-HCl buffer, 1 mM EDTA, pH 8.0) to give 10 mg / ml RNas
e was added thereto and treated at 50 ° C. for 1 hour to obtain a DNA sample. The yield of this DNA sample was confirmed by the fluorescence method, and the amplification of the β-globin gene was attempted by the PCR method (PCR conditions: 94 ° C for 1 minute; 55 ° C for 2 minutes; 72 ° C for 3 minutes). 35 times). The quantification of DNA by the fluorescence method was performed by the following method. To 1 μl of the obtained DNA sample, 10% of 2M 3,5-diaminobenzoic acid · 2HCl was added.
After adding and stirring, react at 60 ° C for 30 minutes.
1 ml of a 0.6N perchloric acid solution was added, and the fluorescence intensity (Ex = 415 nm, Em = 515 nm) was measured with a fluorescence detector. At the same time, a DNA standard was prepared using a known concentration of DNA, and the amount of DNA in each DNA sample was calculated from a standard curve obtained from the measurement results. The DNA yield and the like in the DNA sample are shown in Table 1, and the DNA amplified by the PCR method was added to a 1 × TAE buffer (0.04 M Tris-acetic acid, 1 mM) containing 0.5 μg / ml of ethidium bromide.
After electrophoresis at a constant voltage of 100 V for 20 to 30 minutes using a 3% agarose gel prepared using EDTA (pH 7.8),
The results of fluorescence detection of DNA using a V illuminator are shown in FIG. 1 (lane 2). In FIG. 1, lane 1 is a molecular weight marker [φx174 phage DNA /
HaeIII, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.].
The “←” mark indicates the amplified region of the human β-globin gene (11
0bp).

【００３９】比較例１．従来法（フェノールを用いた方
法）によるＤＮＡ採取 ヒトのホルマリン固定パラフィン包埋組織切片（肝臓：
厚さ10μm,約15mm×25mm）１枚を1.5mlテストチューブ
に入れ、Ｄ−リモネンを１ml加えて、マイクロチューブ
ミキサー（ＭＴ−３６０，トミー精工製）にて３分間攪
拌した。常温にて３分間，12,000rpmで遠心後上清を除
きパラフィンを除去した（２回）。次に１mlのエタノー
ルを加え上記ミキサーにて攪拌した後、常温にて３分間
12,000rpmで遠心し、上清を除くことにより僅かに残っ
ているＤ−リモネンを除去し（２回）、乾燥処理した。
次いで、得られたペレットに、１％ＳＤＳ、0.1mg／ml
プロティナーゼＫ（或いはパパイン）を含むＳＳＣ緩衝
液（0.15M塩化ナトリウム及び0.015M酢酸ナトリウム含
有。pH7.0）300μlを添加した後、48℃で48時間反応さ
せた。途中、１mg／mlプロティナーゼＫ溶液（または１
mg／mlパパイン溶液）50μlを３回加えた。その後、等
量のフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
混液（25：24：１）を加えて混合後、５分間6,000rpmで
遠心し、上層の水相をピペッティングにより別のチュー
ブに移した（２回）。得られた水相に等量のクロロホル
ム／イソアミルアルコール混液（24：１）を加えて混合
後、５分間6,000rpmで遠心し上層を新しいチューブに移
した（２回）。得られた上層溶液にこれに対し３／50容
量の５M塩化ナトリウム溶液と2.5倍量のエタノールを加
えて攪拌後、−80℃にて15分間放置した。次いで４℃に
て20分間15,000rpmで遠心し上清を除き、ペレットに70
％エタノールを加え混合後、４℃にて５分間15,000rpm
で遠心し上清を除き乾燥処理し、目的の核酸鎖を得た。
最後に、得られた核酸鎖をＴＥ緩衝液20μlに再度溶解
して、10mg／ml ＲＮａｓｅを１μl添加し、50℃で１時
間処理しＤＮＡサンプルとした。このＤＮＡサンプル
は、螢光法によりその収量を確認し、更に実施例１と同
じ条件でＰＣＲ法によりβ−グロビン遺伝子の増幅を試
みた。尚、蛍光法によるＤＮＡの定量は、以下の方法で
行った。得られたＤＮＡサンプル１μlに２M ３，５−
ジアミノ安息香酸・２ＨＣｌを10μl加えて攪拌した
後、60℃で30分間反応させて、更に0.6N 過塩素酸溶液
１mlを加え、蛍光検出器にて蛍光強度（Ｅｘ＝415nm、
Ｅｍ＝515nm）を測定した。また、これと同時に既知濃
度のＤＮＡを使用して、ＤＮＡ標準品を作製し、その測
定結果により得られた標準曲線により各ＤＮＡサンプル
中のＤＮＡ量を算出した。ＤＮＡサンプル中のＤＮＡ収
量等を表１に、また、ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡ
を、エチジウムブロミド0.5μg／mlを含む、１×ＴＡＥ
緩衝液（0.04M Ｔｒｉｓ−酢酸、１mM ＥＤＴＡ pH7.
8）を用いて作製した３％アガロースゲルを使用して100
V定電圧で20〜30分電気泳動した後、ＵＶイルミネータ
ーを使用してＤＮＡを蛍光検出した結果を図１（レーン
３）にそれぞれ実施例１の結果と併せて示す。Comparative Example 1 DNA collection by conventional method (method using phenol) Human formalin-fixed paraffin-embedded tissue section (liver:
One piece (10 μm thick, about 15 mm × 25 mm) was placed in a 1.5 ml test tube, 1 ml of D-limonene was added, and the mixture was stirred with a micro tube mixer (MT-360, manufactured by Tommy Seiko) for 3 minutes. After centrifugation at 12,000 rpm for 3 minutes at room temperature, the supernatant was removed to remove paraffin (twice). Next, add 1 ml of ethanol and stir with the above mixer, then at room temperature for 3 minutes
The mixture was centrifuged at 12,000 rpm, and D-limonene remaining slightly was removed by removing the supernatant (twice), followed by drying.
Next, 1% SDS, 0.1 mg / ml was added to the obtained pellet.
After adding 300 μl of SSC buffer (containing 0.15 M sodium chloride and 0.015 M sodium acetate, pH 7.0) containing proteinase K (or papain), the mixture was reacted at 48 ° C. for 48 hours. On the way, 1 mg / ml proteinase K solution (or 1
(50 mg / ml papain solution) was added three times. Thereafter, an equal volume of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture (25: 24: 1) was added and mixed, followed by centrifugation at 6,000 rpm for 5 minutes, and the upper aqueous phase was transferred to another tube by pipetting (twice). ). An equal amount of a mixed solution of chloroform / isoamyl alcohol (24: 1) was added to the obtained aqueous phase, mixed, and then centrifuged at 6,000 rpm for 5 minutes to transfer the upper layer to a new tube (twice). To the obtained upper layer solution, a 3/50 volume of a 5 M sodium chloride solution and 2.5 times the volume of ethanol were added, and the mixture was stirred and left at -80 ° C for 15 minutes. Then centrifuge at 4 ° C for 20 minutes at 15,000 rpm to remove the supernatant.
% Ethanol, mix at 4 ℃ for 5 minutes at 15,000rpm
And dried by removing the supernatant to obtain the target nucleic acid chain.
Finally, the obtained nucleic acid chain was redissolved in 20 μl of TE buffer, 1 μl of 10 mg / ml RNase was added, and the mixture was treated at 50 ° C. for 1 hour to obtain a DNA sample. The yield of this DNA sample was confirmed by the fluorescence method, and the amplification of the β-globin gene was attempted by the PCR method under the same conditions as in Example 1. The quantification of DNA by the fluorescence method was performed by the following method. 1 μl of the obtained DNA sample was added to 2 M 3,5-
After adding 10 μl of diaminobenzoic acid · 2HCl and stirring, the mixture was reacted at 60 ° C. for 30 minutes, 1 ml of a 0.6N perchloric acid solution was further added, and the fluorescence intensity (Ex = 415 nm,
Em = 515 nm). At the same time, a DNA standard was prepared using a known concentration of DNA, and the amount of DNA in each DNA sample was calculated from a standard curve obtained from the measurement results. Table 1 shows the DNA yield and the like in the DNA sample, and the DNA amplified by the PCR method.
With 1 × TAE containing 0.5 μg / ml of ethidium bromide
Buffer solution (0.04 M Tris-acetic acid, 1 mM EDTA pH7.
8) 100% using 3% agarose gel prepared using
After electrophoresis at a constant voltage of V for 20 to 30 minutes, the results of fluorescence detection of DNA using a UV illuminator are shown in FIG. 1 (lane 3) together with the results of Example 1.

【００４０】[0040]

【表１】 [Table 1]

【００４１】表１の結果から明らかな如く、本発明の方
法（実施例１）と従来法（比較例１）に於いて、同等の
ＤＮＡ収量を得るための総操作時間を比較すると、本発
明の方法は従来法に比べその総操作時間が著しく短縮さ
れていることが判る。これは、種々の要因が重なった為
の結果ではあるが、主な要因としては以下のような点が
挙げられる。即ち、従来法では界面活性剤とタンパク質
分解酵素とを同時に用いてタンパク質変性分解を行うた
め、核酸鎖の回収率を高めるために該反応を長時間（48
時間）行った後にフェノール、クロロホルム等を用いた
二相分離方式でタンパク質の変性・除去操作を行う必要
がある。これに対して本発明方法においては、同様な工
程を、界面活性剤によるタンパク質を変性する為の加熱
処理、次にタンパク質分解酵素を用いたタンパク質の分
解、その後にタンパク質変性作用を有する有機化合物を
含む溶液を用いて一相式でタンパク質を変性・除去する
という工程によって行うため、短時間に従来法と同程度
の収率で核酸鎖を抽出することが可能になったのであ
る。更に、表１及び図１の結果から明らかな如く、本発
明の方法と従来法の結果を比較するとＤＮＡ収量に差は
認められなかったが、得られたＤＮＡをＰＣＲ法により
増幅させたところ、本発明の方法で抽出したＤＮＡにつ
いてはβ−グロビン遺伝子の増幅断片が認められたのに
対し、従来法で抽出したＤＮＡについてはそれが認めら
れなかった。このことから本発明の方法で抽出したＤＮ
Ａは、従来法により得られたそれに比べてＰＣＲ法によ
る遺伝子分析に適していることが判る。As is apparent from the results in Table 1, the total operation time for obtaining the same DNA yield in the method of the present invention (Example 1) and the conventional method (Comparative Example 1) was compared. It can be seen that the total operation time of the method is significantly reduced as compared with the conventional method. This is a result of the overlap of various factors, but the main factors include the following. That is, in the conventional method, protein denaturation and degradation are performed simultaneously using a surfactant and a proteolytic enzyme.
Time), it is necessary to carry out denaturation / removal of the protein by a two-phase separation method using phenol, chloroform or the like. On the other hand, in the method of the present invention, a similar step is carried out by a heat treatment for denaturing the protein with a surfactant, then the degradation of the protein using a protease, and then an organic compound having a protein denaturing action. Since the protein solution is denatured / removed in a single phase using a solution containing the nucleic acid, it is possible to extract the nucleic acid chain in a short time with the same yield as the conventional method. Furthermore, as is clear from the results of Table 1 and FIG. 1, when the results of the method of the present invention were compared with the results of the conventional method, no difference was observed in the DNA yield, but when the obtained DNA was amplified by the PCR method, The DNA extracted by the method of the present invention showed an amplified fragment of the β-globin gene, whereas the DNA extracted by the conventional method did not. From this, the DN extracted by the method of the present invention was used.
It can be seen that A is more suitable for gene analysis by PCR than that obtained by the conventional method.

【００４２】参考例１．実施例１及び比較例１で得られ
たＤＮＡサンプル中のＰＣＲ阻害物の検出 実施例１及び比較例１で得られたＤＮＡサンプル13μl
にそれぞれＤＮａｓｅ70Uを添加し、37℃、１時間反応
させてヒト由来のＤＮＡを消化した後、等量のフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコール混液（25：2
4：１）を加えて混合後、５分間6,000rpmで遠心し、上
層の水相を別のチューブに移し、ＤＮａｓｅを除去し
た。得られた水相に、これに対し３／50容量の５M塩化
ナトリウム溶液と2.5倍量のエタノールを加えて攪拌
後、−80℃にて15分間放置し、次いで４℃にて20分間1
5,000rpmで遠心し上清を除き、ペレットに70％エタノー
ルを１ml添加して洗浄した後乾燥処理した。得られたペ
レットにＴＥ緩衝液13μlを添加、溶解したものを、下
記の試験用のサンプル液とした。サンプル液の２、４又
は７μlをそれぞれ100attomoleのラットｃＤＮＡと混合
し、ＰＣＲ法（条件：94℃、45秒；60℃、45秒；72℃、
２分間。30回）によりラット グルコース３リン酸脱水
素酵素（Ｇ３ＰＤＨ）遺伝子（983bp領域）の増幅を行
った後、エチジウムブロミド0.5μg／mlを含む、１×Ｔ
ＡＥ緩衝液（0.04MＴｒｉｓ−酢酸、１mM ＥＤＴＡ pH
7.8）を用いて作製した３％アガロースゲルを使用して1
00V定電圧で20〜30分電気泳動した後、ＵＶイルミネー
ターを使用して目的のバンドを蛍光検出した。結果を図
２に示す。尚、図２中の各レーン番号は以下の試料を使
用した結果を夫々示す。 Ｌａｎｅ １及び６： 分子量マーカー（φｘ１７４
ｐｈａｇｅ ＤＮＡ／ＨａｅIII） ２： 比較例１由来のサンプル液無添加 ３： 比較例１由来のサンプル液２μｌ添加 ４： 比較例１由来のサンプル液４μｌ添加 ５： 比較例１由来のサンプル液７μｌ添加 ７： 実施例１由来のサンプル液無添加 ８： 実施例１由来のサンプル液２μｌ添加 ９： 実施例１由来のサンプル液４μｌ添加 １０： 実施例１由来のサンプル液７μｌ添加 また、図２中「←」印はラットＧ３ＰＤＨ遺伝子の増幅
領域（983bp）を示す。Reference Example 1 Detection of PCR inhibitors in DNA samples obtained in Example 1 and Comparative Example 1 13 μl of DNA sample obtained in Example 1 and Comparative Example 1
Were added to each, and reacted at 37 ° C. for 1 hour to digest human-derived DNA. An equal amount of a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture (25: 2
After adding and mixing 4: 1), the mixture was centrifuged at 6,000 rpm for 5 minutes, and the upper aqueous phase was transferred to another tube to remove DNase. To the obtained aqueous phase, 3/50 volume of a 5M sodium chloride solution and 2.5 volumes of ethanol were added, and the mixture was stirred, left at -80 ° C for 15 minutes, and then at 4 ° C for 20 minutes.
The supernatant was removed by centrifugation at 5,000 rpm, and the pellet was washed by adding 1 ml of 70% ethanol and then dried. 13 μl of a TE buffer solution was added to and dissolved in the obtained pellet, and this was used as a sample solution for the following test. 2, 4, or 7 μl of the sample solution was mixed with 100 attomole rat cDNA, respectively, and PCR was performed (conditions: 94 ° C., 45 seconds; 60 ° C., 45 seconds; 72 ° C.,
2 minutes. 30 times) to amplify the rat glucose triphosphate dehydrogenase (G3PDH) gene (983 bp region), and then add 0.5 μg / ml of ethidium bromide to 1 × T
AE buffer (0.04 M Tris-acetic acid, 1 mM EDTA pH
7.8) using 3% agarose gel
After electrophoresis at 00V constant voltage for 20 to 30 minutes, the target band was subjected to fluorescence detection using a UV illuminator. The results are shown in FIG. In addition, each lane number in FIG. 2 shows the result using the following samples, respectively. Lanes 1 and 6: molecular weight markers (φx174
phage DNA / HaeIII) 2: no addition of the sample solution derived from Comparative Example 1 3: addition of 2 μl of the sample solution derived from Comparative Example 1 4: addition of 4 μl of the sample solution derived from Comparative Example 1 5: addition of 7 μl of the sample solution derived from Comparative Example 1 7 2: No addition of sample liquid derived from Example 1 8: Addition of 2 μl of sample liquid derived from Example 1 9: Addition of 4 μl of sample liquid derived from Example 1 10: Addition of 7 μl of sample liquid derived from Example 1 "" Indicates an amplified region (983 bp) of the rat G3PDH gene.

【００４３】図２の結果から、実施例１由来のサンプル
液を添加した試料では各ラット遺伝子の増幅バンドの量
的変化は見られないが、比較例１由来のサンプル液を添
加した試料ではその添加量の増加に応じてラット遺伝子
の増幅率が低下する（増幅バンドの幅が小さくなる）傾
向が見られることが判る。このことは、比較例１で得ら
れたＤＮＡをＰＣＲ法により増幅させても目的の遺伝子
を検出し得なかった原因が、該ＤＮＡ中に混入したＰＣ
Ｒ法に対する反応阻害物によるものであることを示唆し
ており、従来の処理方法（比較例１）ではＰＣＲ法に対
する反応阻害物を充分に除去できないと判断される。こ
れに対し、本発明の処理方法によれば、ＰＣＲ法の反応
を阻害する物質の混入がほとんどなく、ＰＣＲ法の試料
として好適な核酸鎖が得られることが判る。From the results shown in FIG. 2, no quantitative change in the amplification band of each rat gene was observed in the sample to which the sample solution derived from Example 1 was added, but the change was not observed in the sample to which the sample solution derived from Comparative Example 1 was added. It can be seen that there is a tendency that the amplification rate of the rat gene decreases (the width of the amplification band decreases) as the amount of addition increases. This is due to the fact that the target gene could not be detected even when the DNA obtained in Comparative Example 1 was amplified by the PCR method.
This suggests that it is due to a reaction inhibitor to the R method, and it is judged that the reaction inhibitor to the PCR method cannot be sufficiently removed by the conventional treatment method (Comparative Example 1). On the other hand, according to the processing method of the present invention, it is found that there is almost no contamination of the substance that inhibits the reaction of the PCR method, and a nucleic acid chain suitable as a sample for the PCR method can be obtained.

【００４４】実施例２．加熱処理によるパラフィン包埋
組織標本からのＤＮＡ採取 ホルマリン固定パラフィン包埋組織標本（ラット肝臓）
から４枚の組織切片（厚さ10μm,約10mm×20mm）を切り
出す。組織切片を１枚づつ1.5mlテストチューブに入
れ、夫々にＤ−リモネン１ml加えて、マイクロチューブ
ミキサー（ＭＴー３６０，トミー精工製）にて３分間攪
拌した後、常温にて３分間，12,000rpmで遠心処理して
上清を除きパラフィンを除去した（２回）。次に各テス
トチューブに１mlのエタノールを加え上記ミキサーにて
攪拌した後、常温にて３分間12,000rpmで遠心処理して
上清を除くことにより僅かに残っているＤ−リモネンを
除去し（２回）、乾燥処理した。次いで、夫々のテスト
チューブに11mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.0、1.11％Ｓ
ＤＳ、5.6mM ＥＤＴＡを含有。）180μlを添加した後、
これら４つのテストチューブのうち３つについては、10
0℃で夫々３分、５分、10分間加熱した。その後、１M
ＤＴＴ20μlと20mg／mlのパパイン溶液10μlを添加した
後、50℃で90分間反応させた。残りの１のテストチュー
ブについては、加熱処理せずに、１M ＤＴＴ20μlと20m
g／mlのパパイン溶液10μlを更に添加した後、50℃で90
分間反応させた。反応終了後、得られた各サンプル溶液
の10μlを、エチジウムブロミド0.5μg／mlを含む、１
×ＴＡＥ緩衝液（0.04M Ｔｒｉｓ−酢酸、１mM ＥＤＴ
Ａ pH7.8）を用いて作製した１％アガロースゲルを使
用して100V定電圧で20〜30分電気泳動した後、ＵＶイル
ミネーターを使用して目的のバンドを蛍光検出してＤＮ
Ａの遊離状態を確認した。尚、図３中の各レーン番号は
以下の試料を使用した結果を夫々示す。 Ｌａｎｅ １：分子量マーカー〔λ ｐｈａｇｅ ＤＮＡ
／ＨｉｎｄIII、（株）ニッポンジーン製〕 ２：加熱処理なし ３：１００℃、３分間加熱 ４：１００℃、５分間加熱 ５：１００℃、１０分間加熱Embodiment 2 FIG. DNA collection from paraffin-embedded tissue specimen by heat treatment Formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimen (rat liver)
Cut out four tissue sections (thickness: 10 μm, about 10 mm × 20 mm). Tissue sections were placed one by one into 1.5 ml test tubes, 1 ml of D-limonene was added to each, and the mixture was stirred with a micro tube mixer (MT-360, manufactured by Tommy Seiko) for 3 minutes and then at room temperature for 3 minutes at 12,000 rpm. Then, the supernatant was removed to remove paraffin (twice). Next, 1 ml of ethanol was added to each test tube, and the mixture was stirred with the above mixer, and then centrifuged at 12,000 rpm for 3 minutes at room temperature to remove the supernatant to remove a small amount of D-limonene (2). Times) and dried. Then, 11 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0, 1.11% S) was added to each test tube.
DS, containing 5.6 mM EDTA. ) After adding 180 μl,
For three of these four test tubes, 10
Heat at 0 ° C. for 3 minutes, 5 minutes and 10 minutes, respectively. Then 1M
After adding 20 μl of DTT and 10 μl of a 20 mg / ml papain solution, the mixture was reacted at 50 ° C. for 90 minutes. For the remaining one test tube, without heat treatment, 20 µl of 1 M DTT and 20 m
After addition of a further 10 μl of a papain solution at 50 ° C.
Allowed to react for minutes. After completion of the reaction, 10 μl of each of the obtained sample solutions was added to 0.5 μg / ml of ethidium bromide.
X TAE buffer (0.04 M Tris-acetic acid, 1 mM EDT
A pH 7.8), electrophoresed at 100 V constant voltage for 20 to 30 minutes using a 1% agarose gel, and detected the target band with a UV illuminator to detect fluorescence.
The release state of A was confirmed. In addition, each lane number in FIG. 3 shows the result using the following samples, respectively. Lane 1: Molecular weight marker [λ phage DNA
/ HindIII, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.] 2: No heat treatment 3: Heat at 100 ° C for 3 minutes 4: Heat at 100 ° C for 5 minutes 5: Heat at 100 ° C for 10 minutes

【００４５】図３の結果から明らかな如く、加熱処理を
施さなかった場合（レーン２）では、ＤＮＡ領域で蛍光
が殆ど観察されないこと、即ち、組織からのＤＮＡの遊
離量が非常に少ないことが判る。また、レーン３〜５の
結果から、加熱処理を行うことによって組織からのＤＮ
Ａの遊離量が著しく増加することや、加熱時間に相関し
て遊離したＤＮＡ量が増加することも判る。As is clear from the results in FIG. 3, when no heat treatment was performed (lane 2), almost no fluorescence was observed in the DNA region, that is, the amount of released DNA from the tissue was very small. I understand. Further, from the results of lanes 3 to 5, it was found that DN from the tissue was obtained by performing heat treatment.
It can also be seen that the amount of released A significantly increases, and that the amount of released DNA increases in association with the heating time.

【００４６】実施例３．加熱処理によるパラフィン包埋
組織標本からのＤＮＡ採取 ヒトのカルノア固定パラフィン包埋組織標本（肝臓）か
ら11枚の組織切片（厚さ10μm,約10mm×20mm）を切り出
す。組織切片を１枚づつ1.5mlテストチューブに入れ、
夫々にＤ−リモネン１ml加えて、マイクロチューブミキ
サー（ＭＴー３６０，トミー精工製）にて３分間攪拌し
た後、常温にて３分間，12,000rpmで遠心処理して上清
を除きパラフィンを除去した（２回）。次に各テストチ
ューブに１mlのエタノールを加え上記ミキサーにて攪拌
した後、常温にて３分間12,000rpmで遠心処理して上清
を除くことにより僅かに残っているＤ−リモネンを除去
し（２回）、乾燥処理した。次いで夫々のテストチュー
ブに11mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.0、1.11％ＳＤＳ、
5.6mM ＥＤＴＡを含有。）180μlを添加した後、所定の
温度及び時間で加熱処理したものに、夫々１M ＤＴＴ20
μlと20mg／mlのパパイン溶液10μlを添加した後、50℃
で90分間反応させた。更に、10％（W/V）ｍーヒドロキ
シ安息香酸を含む40％（V/V）イソプロパノール水溶液
（pH6.0）を200μl加え室温にて30分間反応させた。12,
000rpmにて、５分間遠心分離し、デカンテーションによ
り上清を別のチューブに移し換えた。その上清に３M Ｎ
ａＣｌ水溶液40μlとイソプロパノール900μlを添加し
混合した後、室温にて10分間静置させ、12,000rpmで15
分間遠心して核酸鎖を沈澱させた。上清を除き、沈澱に
70％エタノール１mlを添加攪拌し、４℃にて５分間15,0
00rpmで遠心した後、上清を除き、乾燥処理して目的の
核酸鎖を得た。最後に、得られた核酸鎖をＴＥ緩衝液
（10mMトリス−塩酸緩衝液、1mM ＥＤＴＡ含有、pH8.
0）20μlに再度溶解して、10mg／ml ＲＮａｓｅを１μl
添加し、50℃で１時間処理しＤＮＡサンプルとした。得
られた各ＤＮＡサンプル中のＤＮＡ収量を、蛍光法によ
り確認した。尚、蛍光法によるＤＮＡの定量は、以下の
方法で行った。得られたＤＮＡサンプル１μlに２M
３，５−ジアミノ安息香酸・２ＨＣｌを10μl加えて攪
拌した後、60℃で30分間反応させて、更に0.6N 過塩素
酸溶液１mlを加え、蛍光検出器にて蛍光強度（Ｅｘ＝41
5nm、Ｅｍ＝515nm）を測定した。また、これと同時に既
知濃度のＤＮＡを使用して、ＤＮＡ標準品を作製し、そ
の測定結果により得られた標準曲線により各ＤＮＡサン
プル中のＤＮＡ量を算出した。各ＤＮＡサンプル中のＤ
ＮＡ収量を表２に示す。Embodiment 3 FIG. DNA Collection from Paraffin-Embedded Tissue Specimen by Heat Treatment Eleven tissue sections (10 μm thick, about 10 mm × 20 mm) are cut out from a human Carnoy-fixed paraffin-embedded tissue specimen (liver). Place each tissue section into a 1.5 ml test tube,
1 ml of D-limonene was added to each, and the mixture was stirred for 3 minutes with a micro tube mixer (MT-360, manufactured by Tommy Seiko), and then centrifuged at 12,000 rpm for 3 minutes at room temperature to remove the supernatant and remove paraffin. (Twice). Next, 1 ml of ethanol was added to each test tube, and the mixture was stirred with the above mixer, and then centrifuged at 12,000 rpm for 3 minutes at room temperature to remove the supernatant to remove a small amount of D-limonene (2). Times) and dried. Then, 11 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0, 1.11% SDS,
Contains 5.6 mM EDTA. ) After adding 180 μl, heat-treated at a predetermined temperature and time, and added 1M DTT20
After adding 10 μl of 20 μl and 20 mg / ml papain solution,
For 90 minutes. Further, 200 μl of a 40% (V / V) aqueous solution of isopropanol (pH 6.0) containing 10% (W / V) m-hydroxybenzoic acid was added, and reacted at room temperature for 30 minutes. 12,
The mixture was centrifuged at 000 rpm for 5 minutes, and the supernatant was transferred to another tube by decantation. Add 3M N to the supernatant.
After adding and mixing 40 μl of an aCl aqueous solution and 900 μl of isopropanol, the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and then stirred at 12,000 rpm for 15 minutes.
The nucleic acid strand was precipitated by centrifugation for minutes. Remove supernatant and allow for precipitation
Add 1 ml of 70% ethanol, stir, and add 15.0 ml
After centrifugation at 00 rpm, the supernatant was removed and dried to obtain the target nucleic acid chain. Finally, the obtained nucleic acid chain was treated with a TE buffer (10 mM Tris-HCl buffer, containing 1 mM EDTA, pH 8.
0) Redissolve in 20 μl and add 10 μg / ml RNase to 1 μl
The mixture was added and treated at 50 ° C. for 1 hour to obtain a DNA sample. The DNA yield in each of the obtained DNA samples was confirmed by a fluorescence method. The quantification of DNA by the fluorescence method was performed by the following method. 2 M per 1 μl of the obtained DNA sample
After adding 10 μl of 3,5-diaminobenzoic acid · 2HCl and stirring, the mixture was reacted at 60 ° C. for 30 minutes, further 1 ml of 0.6N perchloric acid solution was added, and the fluorescence intensity was detected by a fluorescence detector (Ex = 41).
5 nm, Em = 515 nm). At the same time, a DNA standard was prepared using a known concentration of DNA, and the amount of DNA in each DNA sample was calculated from a standard curve obtained from the measurement results. D in each DNA sample
Table 2 shows the NA yield.

【００４７】[0047]

【表２】 [Table 2]

【００４８】表２の結果から明らかな如く、室温で放置
した場合（加熱処理を施さなかった場合）のＤＮＡ収量
に比べて、70℃で２分及び10分間加熱処理を行った場合
のＤＮＡ収量は２倍以上、80℃、90℃及び100℃で加熱
処理を行った場合は、約３倍以上となり、加熱処理を行
うことによりＤＮＡ収量が著しく増加することが判る。As is clear from the results shown in Table 2, the DNA yield obtained when the heat treatment was performed at 70 ° C. for 2 minutes and 10 minutes was compared with the DNA yield obtained when the sample was left at room temperature (when no heat treatment was performed). Is 2 times or more, and when the heat treatment is performed at 80 ° C., 90 ° C. and 100 ° C., it becomes about 3 times or more, and it is understood that the heat treatment significantly increases the DNA yield.

【００４９】実施例４．加熱処理の有無によるパラフィ
ン包埋組織標本からのＤＮＡ採取量の変化 ヒトのホルマリン固定パラフィン包埋組織標本（肝臓）
から２枚の組織切片（厚さ10μm,約10mm×20mm）を切り
出した。該組織切片を１枚づつ1.5mlテストチューブに
入れ、夫々にＤ−リモネンを１ml加えて、マイクロチュ
ーブミキサー（ＭＴー３６０，トミー精工製）にて３分
間攪拌した後、常温にて３分間，12,000rpmで遠心処理
して上清を除きパラフィンを除去した（２回）。次に各
テストチューブに１mlのエタノールを加え上記ミキサー
にて攪拌した後、常温にて３分間12,000rpmで遠心処理
して上清を除くことにより僅かに残っているＤ−リモネ
ンを除去し（２回）、乾燥処理した。次いで、夫々のテ
ストチューブに11mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.0、0.55
％ＳＤＳ、5.6mM ＥＤＴＡを含有。）20μlを添加した
後、一方のテストチューブについてのみ90℃で10分間加
熱処理した。他方のテストチューブについては加熱処理
を行わなかった。次いで、各テストチューブを常温にて
５分間、10,000rpmで遠心処理して得られた上清をＤＮ
Ａサンプルとした。最後に、得られたＤＮＡサンプルの
うち0.5μlについて、ＰＣＲ法によりｋ−ｒａｓ遺伝子
の増幅反応を行った（ＰＣＲ法条件：94℃、１分間；55
℃、２分間；72℃、３分間。45回）。ＰＣＲ法により増
幅したＤＮＡを、エチジウムブロミド0.5μg／mlを含
む、１×ＴＡＥ緩衝液（0.04M Ｔｒｉｓ−酢酸、１mM
ＥＤＴＡ pH7.8）を用いて作製した2.5％アガロースゲ
ルを使用して100V定電圧で20〜30分電気泳動した後、Ｕ
Ｖイルミネーターを使用してＤＮＡを蛍光検出した結果
を図４に示す。尚、図４中、レーン１は分子量マーカー
〔φｘ１７４ ｐｈａｇｅ ＤＮＡ／ＨａｅIII、（株）
ニッポンジーン製〕の結果を、レーン２は加熱処理を行
わずに得られたＤＮＡサンプルについての結果を、レー
ン３は加熱処理を行って得られたＤＮＡサンプルについ
ての結果を夫々示す。また図４中、「←」印はｋ−ｒａ
ｓ遺伝子の増幅領域（108bp）を示す。図４の結果から
明らかな如く、加熱処理を行ったもの（レーン３）と加
熱処理を行わないもの（レーン２）とを比較すると、明
らかに加熱処理したものの方がｋ−ｒａｓ遺伝子の増幅
量が多く、ＰＣＲ分析の感度が増加していること、即
ち、加熱処理を行ったものの方がＤＮＡの収量が大幅に
増加していることが判る。Embodiment 4 FIG. Changes in DNA collection from paraffin-embedded tissue specimens with and without heat treatment Human formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimens (liver)
, Two tissue sections (10 μm thick, about 10 mm × 20 mm) were cut out. Each of the tissue sections was placed in a 1.5 ml test tube, 1 ml of D-limonene was added to each, and the mixture was stirred for 3 minutes with a micro tube mixer (MT-360, manufactured by Tommy Seiko), and then at room temperature for 3 minutes. The supernatant was removed by centrifugation at 12,000 rpm to remove paraffin (twice). Next, 1 ml of ethanol was added to each test tube, and the mixture was stirred with the above mixer, and then centrifuged at 12,000 rpm for 3 minutes at room temperature to remove the supernatant to remove a small amount of D-limonene (2). Times) and dried. Next, 11 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0, 0.55
% SDS, containing 5.6 mM EDTA. ) After adding 20 μl, only one test tube was heated at 90 ° C. for 10 minutes. No heat treatment was performed on the other test tube. Next, the supernatant obtained by centrifuging each test tube at 10,000 rpm for 5 minutes at room temperature was DN
Sample A was used. Finally, 0.5 μl of the obtained DNA sample was subjected to the amplification reaction of the k-ras gene by PCR (PCR conditions: 94 ° C., 1 minute; 55).
° C, 2 minutes; 72 ° C, 3 minutes. 45 times). The DNA amplified by the PCR method was mixed with 1 × TAE buffer (0.04 M Tris-acetic acid, 1 mM) containing 0.5 μg / ml of ethidium bromide.
After electrophoresis at 100 V constant voltage for 20 to 30 minutes using a 2.5% agarose gel prepared using EDTA (pH 7.8),
FIG. 4 shows the results of fluorescence detection of DNA using a V illuminator. In FIG. 4, lane 1 is a molecular weight marker [φx174 phage DNA / HaeIII, Inc.
Lane 2 shows the result of the DNA sample obtained without heat treatment, and lane 3 shows the result of the DNA sample obtained by heat treatment. In FIG. 4, the mark “←” indicates k-ra.
The s gene amplification region (108 bp) is shown. As is clear from the results in FIG. 4, when the heat-treated one (lane 3) is compared with the heat-treated one (lane 2), the heat-treated one clearly shows the amount of amplification of the k-ras gene. It can be seen that the sensitivity of the PCR analysis was increased, that is, the DNA yield was significantly increased in the case where the heat treatment was performed.

【００５０】実施例５．加熱処理の有無並びにタンパク
質分解酵素処理時間とＤＮＡ収量の関係 ヒトのホルマリン固定パラフィン包埋組織標本（肝臓）
から10枚の組織切片（厚さ10μm,約10mm×20mm）を切り
出した。組織切片を１枚づつ1.5mlテストチューブに入
れ、夫々にＤ−リモネンを１ml加えて、マイクロチュー
ブミキサー（ＭＴー３６０，トミー精工製）にて３分間
攪拌した後、常温にて３分間，12,000rpmで遠心処理し
て上清を除きパラフィンを除去した（２回）。次に各テ
ストチューブに１mlのエタノールを加え上記ミキサーに
て攪拌した後、常温にて３分間12,000rpmで遠心処理し
て上清を除くことにより僅かに残っているＤ−リモネン
を除去し（２回）、乾燥処理した。次いで、夫々のテス
トチューブに11mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.0、0.55％
ＳＤＳ、5.6mM ＥＤＴＡを含有。）180μlを添加した
後、これら10個のテストチューブのうち５つについて
は、90℃で10分間加熱処理した。その後、各テストチュ
ーブに１M ＤＴＴ20μlと20mg／mlのパパイン溶液10μl
を添加した後、50℃で夫々0.5、1.5、５、23、31時間反
応させた。残りの５つのテストチューブについては加熱
処理行わずに、１M ＤＴＴ20μlと20mg／mlのパパイン
溶液10μlを添加した後、同様に50℃で夫々0.5、1.5、
５、23、31時間反応させた。反応終了後、更に、各テス
トチューブに10％（W/V）ｍーヒドロキシ安息香酸を含
む40％（V/V）イソプロパノール水溶液（pH6.0）を200
μl加え室温にて30分間反応させた。12,000rpmにて、５
分間遠心分離し、デカンテーションにより上清を別のチ
ューブに移し換えた。その上清に３M ＮａＣｌ水溶液40
μlとイソプロパノール900μlを添加し混合した後、室
温にて10分間静置させ、各テストチューブを12,000rpm
で15分間遠心して核酸鎖を沈澱させた。上清を除き、沈
澱に70％エタノール１mlを添加攪拌し、４℃にて５分間
15,000rpmで遠心した後、上清を除き、乾燥処理して目
的の核酸鎖を得た。最後に、得られた核酸鎖をＴＥ緩衝
液（10mMトリス−塩酸緩衝液、1mM ＥＤＴＡ含有、pH8.
0）20μlに再度溶解して、10mg／ml ＲＮａｓｅを１μl
添加し、50℃で１時間処理したものをＤＮＡサンプルと
した。得られた各ＤＮＡサンプル中のＤＮＡ収量を、蛍
光法により確認した。尚、蛍光法によるＤＮＡの定量
は、以下の方法で行った。得られたＤＮＡサンプル１μ
lに２M ３，５−ジアミノ安息香酸・２ＨＣｌを10μl加
えて攪拌した後、60℃で30分間反応させて、更に0.6N
過塩素酸溶液１mlを加え、蛍光検出器にて蛍光強度（Ｅ
ｘ＝415nm、Ｅｍ＝515nm）を測定した。また、これと同
時に既知濃度のＤＮＡを使用して、ＤＮＡ標準品を作製
し、その測定結果により得られた標準曲線により各ＤＮ
Ａサンプル中のＤＮＡ量を算出した。各ＤＮＡサンプル
中のＤＮＡ収量を表３に、またタンパク質分解酵素の反
応時間とＤＮＡ収量の関係を図５に夫々示す。尚、図５
中の−□−は、加熱処理を行った後にタンパク質分解酵
素を反応させた場合を、また−＋−は、加熱処理を行わ
ずにタンパク質分解酵素を反応させた場合を夫々示す。Embodiment 5 FIG. Relationship between the presence or absence of heat treatment, proteolytic enzyme treatment time and DNA yield Human formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimen (liver)
From which 10 tissue sections (10 μm thick, about 10 mm × 20 mm) were cut out. Tissue sections were placed one by one into 1.5 ml test tubes, 1 ml of D-limonene was added to each, and the mixture was stirred for 3 minutes with a micro tube mixer (MT-360, manufactured by Tommy Seiko), and then at room temperature for 3 minutes at 12,000. The supernatant was removed by centrifugation at rpm to remove paraffin (twice). Next, 1 ml of ethanol was added to each test tube, and the mixture was stirred with the above mixer, and then centrifuged at 12,000 rpm for 3 minutes at room temperature to remove the supernatant to remove a small amount of D-limonene (2). Times) and dried. Next, 11 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0, 0.55%) was added to each test tube.
SDS, containing 5.6 mM EDTA. 5) After the addition of 180 μl, 5 of these 10 test tubes were heat treated at 90 ° C. for 10 minutes. Then, add 20 μl of 1M DTT and 10 μl of 20 mg / ml papain solution to each test tube.
Was added, and reacted at 50 ° C. for 0.5, 1.5, 5, 23 and 31 hours, respectively. For the remaining five test tubes, without heat treatment, 20 μl of 1 M DTT and 10 μl of a 20 mg / ml papain solution were added, and then, at 50 ° C., 0.5, 1.5, and 1.5, respectively.
The reaction was carried out for 5, 23 and 31 hours. After the reaction was completed, a 40% (V / V) aqueous solution of isopropanol (pH 6.0) containing 10% (W / V) m-hydroxybenzoic acid was further added to each test tube for 200 hours.
μl was added and reacted at room temperature for 30 minutes. 5 at 12,000 rpm
After centrifugation for 10 minutes, the supernatant was transferred to another tube by decantation. The supernatant was added to a 3M NaCl aqueous solution 40
μl and 900 μl of isopropanol were added and mixed, and allowed to stand at room temperature for 10 minutes.
For 15 minutes to precipitate nucleic acid chains. The supernatant was removed, 1 ml of 70% ethanol was added to the precipitate, and the mixture was stirred.
After centrifugation at 15,000 rpm, the supernatant was removed and dried to obtain the target nucleic acid chain. Finally, the obtained nucleic acid chain was treated with a TE buffer (10 mM Tris-HCl buffer, containing 1 mM EDTA, pH 8.
0) Redissolve in 20 μl and add 10 μg / ml RNase to 1 μl
The mixture was added and treated at 50 ° C. for 1 hour to obtain a DNA sample. The DNA yield in each of the obtained DNA samples was confirmed by a fluorescence method. The quantification of DNA by the fluorescence method was performed by the following method. 1μ of the obtained DNA sample
After adding 10 μl of 2M 3,5-diaminobenzoic acid · 2HCl to the mixture and stirring, the mixture was reacted at 60 ° C. for 30 minutes, and further 0.6N
1 ml of perchloric acid solution was added, and the fluorescence intensity (E
x = 415 nm, Em = 515 nm). At the same time, a DNA standard was prepared using a known concentration of DNA, and each DN was determined by a standard curve obtained from the measurement results.
The amount of DNA in the A sample was calculated. Table 3 shows the yield of DNA in each DNA sample, and FIG. 5 shows the relationship between the reaction time of the protease and the yield of DNA. FIG.
In the graph,-□-indicates the case where the protease was reacted after the heat treatment, and-+-indicates the case where the protease was reacted without the heat treatment.

【００５１】[0051]

【表３】 [Table 3]

【００５２】表３及び図５の結果から明らかな如く、90
℃10分間加熱処理を行った後にタンパク質分解酵素を反
応させた場合は、タンパク質分解酵素を1.5時間反応さ
せた時点で既にＤＮＡ収量が2.06μg／切片に達してい
るが、これに対して加熱処理を行わずにタンパク質分解
酵素を反応させた場合は、タンパク質分解酵素を31時間
反応させても1.30μg／切片しかＤＮＡが得られないこ
とが判る。また、90℃10分間加熱処理を行った後にタン
パク質分解酵素を反応させた場合は、タンパク質分解酵
素を0.5時間反応させただけで、加熱処理を行わずにタ
ンパク質分解酵素を31時間反応させた場合と同等量以上
のＤＮＡを得ることができることも判る。以上のことか
ら、タンパク質変性作用を有する界面活性剤を用いて加
熱処理を行った後にタンパク質分解酵素を反応させるこ
とにより、従来法に比べ操作時間を大幅に短縮でき、且
つＤＮＡ収量を大幅に増加させることができることが判
る。As apparent from the results in Table 3 and FIG.
When the protease was reacted after heating at 10 ° C. for 10 minutes, the DNA yield had already reached 2.06 μg / section when the protease was reacted for 1.5 hours. When the proteolytic enzyme was reacted without performing the above, it was found that only 1.30 μg / section of DNA was obtained even when the proteolytic enzyme was reacted for 31 hours. In addition, when the protease was reacted after heating at 90 ° C. for 10 minutes, the protease was reacted for 0.5 hour only, and the protease was reacted for 31 hours without heating. It can also be seen that the same amount or more of DNA can be obtained. From the above, by performing the heat treatment using a surfactant having a protein denaturing effect and then reacting with the protease, the operation time can be significantly reduced as compared with the conventional method, and the DNA yield is greatly increased. You can see that it can be done.

【００５３】実施例６．界面活性剤（ＳＤＳ）添加の有
無によるＤＮＡ採取量の変化 ヒトのホルマリン固定パラフィン包埋組織標本（肝臓）
から４枚の組織切片（厚さ10μm,約８mm×５mm）を切り
出した。該組織切片を１枚づつ0.5mlテストチューブに
入れ、夫々にＤ−リモネンを0.5ml加えて、マイクロチ
ューブミキサー（ＭＴー３６０，トミー精工製）にて３
分間攪拌した後、常温にて３分間，12,000rpmで遠心処
理して上清を除きパラフィンを除去した。次に各テスト
チューブに0.5mlのエタノールを加え上記ミキサーにて
攪拌した後、常温にて３分間12,000rpmで遠心処理して
上清を除くことにより僅かに残っているＤ−リモネンを
除去し、乾燥処理した。次いで、これらのうち２本のテ
ストチューブには10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.0、5.6
mM ＥＤＴＡを含有。）20μlを添加し、そのうちの１本
は室温下で10分間放置し、他方は90℃で10分間加熱処理
した。また、残りの２本のテストチューブには10mMトリ
ス−塩酸緩衝液（pH7.0、0.55％ＳＤＳ、5.6mMＥＤＴＡ
を含有。）20μlを添加し、そのうち１本は室温下で10
分間放置し、他方は90℃で10分間加熱処理した。次い
で、各テストチューブを常温にて５分間、10,000rpmで
遠心処理し、得られた上清をＤＮＡサンプルとした。最
後に、得られたＤＮＡサンプルのうち４μlについて、
ＰＣＲ法によりｋ−ｒａｓ遺伝子の増幅反応を行った
（ＰＣＲ法条件：94℃、１分間；55℃、２分間；72℃、
３分間。45回）。ＰＣＲ法により増幅したＤＮＡを、エ
チジウムブロミド0.5μg／mlを含む、１×ＴＡＥ緩衝液
（0.04M Ｔｒｉｓ−酢酸、１mM ＥＤＴＡ pH7.8）を用
いて作製した2.5％アガロースゲルを使用して100V定電
圧で20〜30分電気泳動した後、ＵＶイルミネーターを使
用してＤＮＡを蛍光検出した。その結果を図６に示す。
尚、図６中、レーン１は分子量マーカー〔φｘ１７４
ｐｈａｇｅ ＤＮＡ／ＨａｅIII、（株）ニッポンジーン
製〕の結果を、レーン２は界面活性剤（ＳＤＳ）未含有
緩衝液を用い、加熱処理を行わないで得られたＤＮＡサ
ンプルについての結果を、レーン３は界面活性剤（ＳＤ
Ｓ）未含有緩衝液を用い、加熱処理を行なって得られた
ＤＮＡサンプルについての結果を、レーン４は界面活性
剤（ＳＤＳ）含有緩衝液を用い且つ加熱処理を行わない
で得られたＤＮＡサンプルについての結果を、またレー
ン５は界面活性剤（ＳＤＳ）含有緩衝液を用い且つ加熱
処理を行なって得られたＤＮＡサンプルについての結果
を夫々示す。また図６中、「←」印はｋ−ｒａｓ遺伝子
の増幅領域（108bp）を示す。図６の結果から明らかな
如く、界面活性剤未含有緩衝液を用い且つ加熱処理を行
わないで得られたＤＮＡサンプルを用いた場合（レーン
２）と、界面活性剤未含有緩衝液を用い、加熱処理を行
って得られたＤＮＡサンプルを用いた場合（レーン３）
は、何れもｋ−ｒａｓ遺伝子の増幅断片がほとんど認め
られないこと、即ち界面活性剤未含有緩衝液を用いた場
合では、得られたＤＮＡサンプル中のＤＮＡ収量は少な
く、加熱処理の有無による差はほとんどないことが判
る。また、界面活性剤含有緩衝液を用い、加熱処理を行
わないで得られたＤＮＡサンプルを用いた場合（レーン
４）では、ｋ−ｒａｓ遺伝子の増幅断片がほとんど認め
られないが、界面活性剤含有緩衝液を用い且つ加熱処理
を行って得られたＤＮＡサンプルを用いた場合（レーン
５）では、明らかにｋ−ｒａｓ遺伝子の増幅断片が認め
られる。即ち界面活性剤含有緩衝液を用いた場合では、
加熱処理を行うことにより得られたＤＮＡサンプル中の
ＤＮＡ収量を著しく増加させることができることが判
る。更に、界面活性剤含有緩衝液を用い且つ加熱処理を
行って得られたＤＮＡサンプルを用いた場合（レーン
５）と界面活性剤未含有緩衝液を用い、加熱処理を行っ
て得られたＤＮＡサンプルを用いた場合（レーン３）と
を比較すると、明らかにレーン５の方がｋ−ｒａｓ遺伝
子の増幅量が多く、ＰＣＲ分析の感度が増加しているこ
と、即ち、加熱処理を行う際に界面活性剤を共存させる
ことにより、得られたＤＮＡサンプル中のＤＮＡ収量が
大幅に増加することが判る。以上のことから、パラフィ
ン包埋組織標本から得られる試料を、界面活性剤を用い
て加熱処理することにより、容易に遺伝子分析用試料を
得ることができることが判る。Embodiment 6 FIG. Changes in DNA collection with and without surfactant (SDS) addition Human formalin-fixed paraffin-embedded tissue specimen (liver)
From which four tissue sections (thickness 10 μm, about 8 mm × 5 mm) were cut out. The tissue sections are placed one by one in a 0.5 ml test tube, and 0.5 ml of D-limonene is added to each, and the mixture is added to a micro tube mixer (MT-360, manufactured by Tommy Seiko).
After stirring for 1 minute, the mixture was centrifuged at 12,000 rpm for 3 minutes at room temperature to remove the supernatant and remove paraffin. Next, 0.5 ml of ethanol was added to each test tube, and the mixture was stirred with the above mixer. Then, centrifugation was performed at 12,000 rpm for 3 minutes at room temperature to remove the supernatant, thereby removing the slightly remaining D-limonene. It was dried. Next, two test tubes of these were filled with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0, 5.6).
Contains mM EDTA. ) 20 μl was added, one of which was left at room temperature for 10 minutes, and the other was heated at 90 ° C. for 10 minutes. Also, 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.0, 0.55% SDS, 5.6 mM EDTA) was added to the remaining two test tubes.
Contains. ) Add 20 μl, one of which is 10
The other was heat-treated at 90 ° C. for 10 minutes. Next, each test tube was centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes at room temperature, and the obtained supernatant was used as a DNA sample. Finally, for 4 μl of the obtained DNA sample,
The amplification reaction of the k-ras gene was performed by PCR (PCR conditions: 94 ° C, 1 minute; 55 ° C, 2 minutes; 72 ° C,
3 minutes. 45 times). The DNA amplified by the PCR method was subjected to 100 V determination using a 2.5% agarose gel prepared using 1 × TAE buffer (0.04 M Tris-acetic acid, 1 mM EDTA pH 7.8) containing 0.5 μg / ml of ethidium bromide. After electrophoresis at a voltage for 20 to 30 minutes, the DNA was fluorescently detected using a UV illuminator. FIG. 6 shows the result.
In FIG. 6, lane 1 is a molecular weight marker [φx174
lane 2 shows the results of a DNA sample obtained without using a buffer solution containing a surfactant (SDS) without heat treatment, and lane 3 shows the results of Surfactant (SD
S) The results of the DNA sample obtained by performing the heat treatment using the buffer solution containing no surfactant, and the lane 4 shows the DNA sample obtained using the buffer solution containing the surfactant (SDS) and not performing the heat treatment. And lane 5 shows the results for a DNA sample obtained by performing a heat treatment using a buffer containing a surfactant (SDS). In FIG. 6, the mark “←” indicates the amplified region (108 bp) of the k-ras gene. As is clear from the results in FIG. 6, when the DNA sample obtained using the buffer solution containing no surfactant and without heat treatment was used (lane 2), the buffer solution containing no surfactant was used. When using a DNA sample obtained by performing a heat treatment (lane 3)
Shows that almost no amplified fragment of the k-ras gene is observed, that is, when a buffer containing no surfactant is used, the DNA yield in the obtained DNA sample is small, It turns out that there is almost no. In the case of using a surfactant-containing buffer and a DNA sample obtained without heat treatment (lane 4), almost no amplified fragment of the k-ras gene was observed. When a DNA sample obtained by performing a heat treatment using a buffer solution was used (lane 5), an amplified fragment of the k-ras gene was clearly observed. That is, in the case of using a surfactant-containing buffer,
It turns out that the DNA yield in the DNA sample obtained by performing the heat treatment can be significantly increased. Furthermore, when the DNA sample obtained by using a buffer solution containing a surfactant and subjected to a heat treatment was used (lane 5), the DNA sample obtained by performing a heat treatment using a buffer solution containing no surfactant was used. When lane 5 was used (lane 3), the amount of k-ras gene amplification was clearly higher in lane 5 and the sensitivity of PCR analysis was increased. It can be seen that the coexistence of the activator greatly increases the DNA yield in the obtained DNA sample. From the above, it is understood that a sample for gene analysis can be easily obtained by subjecting a sample obtained from a paraffin-embedded tissue specimen to a heat treatment using a surfactant.

【００５４】[0054]

【発明の効果】以上述べた如く、本発明は、遺伝子分析
用試料としてのパラフィン包埋組織標本の処理方法とそ
の為の処理用キットを提供するものであり、本発明を利
用して遺伝子分析用試料としてのパラフィン包埋組織標
本を処理した場合には、従来法による処理方法に比較し
て操作が簡便であり、且つその実施に要する時間も極め
て短時間であるという効果、更には、不純物の混入、特
にＰＣＲ法の反応を阻害する物質の混入が少なく、例え
ばＰＣＲ法を利用した病理検査や遺伝子分析等の試料と
して好適な核酸鎖が得られるという効果等を奏するので
斯業に貢献するところ大なる発明である。As described above, the present invention provides a method for processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, and a processing kit therefor. When a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for processing is processed, the operation is simpler and the time required for performing the processing is extremely short as compared with the conventional processing method. Contamination, in particular, a substance that inhibits the reaction of the PCR method, and has an effect of obtaining a nucleic acid chain suitable for a sample such as a pathological test or a gene analysis using the PCR method. However, this is a great invention.

【００５５】尚、本発明に於いて、タンパク質変性作用
を有する有機化合物の一つとして使用されるヒドロキシ
安息香酸は、フェノール性水酸基を有する有機化合物の
一つであるが、飲食物の防カビ剤として広く用いられ、
人体に対し非腐食性である。そのヒドロキシ安息香酸を
二相分離方式をとらない遺伝子分析用試料としてのパラ
フィン包埋組織標本の処理方法に於けるタンパク質変性
剤として用いようとする試みは今まで全くなされていな
かった。In the present invention, hydroxybenzoic acid used as one of the organic compounds having a protein denaturing action is one of the organic compounds having a phenolic hydroxyl group. Widely used as
Non-corrosive to human body. Until now, no attempt has been made to use the hydroxybenzoic acid as a protein denaturant in a method for processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis without using a two-phase separation method.

【００５６】[0056]

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】実施例１及び比較例１で得られた、ＤＮＡサン
プルをポリメラーゼ チェインリアクション法（ＰＣＲ
法）で増幅した後に３％アガロースゲル電気泳動にかけ
た結果を示す。FIG. 1 shows a DNA sample obtained in Example 1 and Comparative Example 1 which was subjected to polymerase chain reaction (PCR).
3) shows the results of a 3% agarose gel electrophoresis after amplification by the method of Example 1.

【図２】参考例１で得られた、ラットｃＤＮＡをＰＣＲ
法で増幅した後に３％アガロースゲル電気泳動にかけた
結果を示す。FIG. 2 shows PCR of rat cDNA obtained in Reference Example 1.
3 shows the results of a 3% agarose gel electrophoresis after amplification by a conventional method.

【図３】実施例２で得られた、各ＤＮＡサンプルを３％
アガロースゲル電気泳動にかけ結果を示す。FIG. 3 shows that each DNA sample obtained in Example 2 was 3%
The results are shown by agarose gel electrophoresis.

【図４】実施例４で得られた、各ＤＮＡサンプルをＰＣ
Ｒ法で増幅した後に2.5％アガロースゲル電気泳動にか
け結果を示す。FIG. 4 shows that each DNA sample obtained in Example 4 was PC
After amplification by the R method, the result is shown by subjecting to 2.5% agarose gel electrophoresis.

【図５】実施例５で得られた、各ＤＮＡサンプル中のＤ
ＮＡ収量とタンパク質分解酵素の反応時間との関係を示
す。FIG. 5 shows D in each DNA sample obtained in Example 5.
The relation between NA yield and reaction time of proteolytic enzymes is shown.

【図６】実施例６で得られた、各ＤＮＡサンプルをＰＣ
Ｒ法で増幅した後に2.5％アガロースゲル電気泳動にか
けた結果を示す。FIG. 6 shows that each DNA sample obtained in Example 6 was PC
The result of subjecting to 2.5% agarose gel electrophoresis after amplification by the R method is shown.

【符号の説明】[Explanation of symbols]

図１に於いて、レーン１は分子量マーカーの結果を、レ
ーン２は実施例１で得られたＤＮＡサンプルのＰＣＲ法
による増幅結果を、レーン３は比較例１で得られたＤＮ
ＡサンプルのＰＣＲ法による増幅結果を夫々示す。ま
た、「←」印はヒトβ−グロビン遺伝子の増幅領域（11
0bp)を示す。図２に於いて、各レーン番号は以下の試料
を使用してＰＣＲ法による増幅を行った結果を夫々示
す。 Ｌａｎｅ １及び６： 分子量マーカー（φｘ１７４
ｐｈａｇｅ ＤＮＡ／ＨａｅIII） ２： 比較例１由来のサンプル液無添加 ３： 比較例１由来のサンプル液２μｌ添加 ４： 比較例１由来のサンプル液４μｌ添加 ５： 比較例１由来のサンプル液７μｌ添加 ７： 実施例１由来のサンプル液無添加 ８： 実施例１由来のサンプル液２μｌ添加 ９： 実施例１由来のサンプル液４μｌ添加 １０： 実施例１由来のサンプル液７μｌ添加 また、「←」印はラットＧ３ＰＤＨ遺伝子の増幅領域
（983bp）を示す。図３に於いて、各レーン番号は以下
の試料を使用した結果を夫々示す。 Ｌａｎｅ １：分子量マーカー〔λ ｐｈａｇｅ ＤＮＡ
／ＨｉｎｄIII、（株）ニッポンジーン製〕 ２：加熱処理なし ３：１００℃、３分間加熱 ４：１００℃、５分間加熱 ５：１００℃、１０分間加熱 図４に於いて、各レーン番号は以下の試料を使用してＰ
ＣＲ法による増幅を行った結果を夫々示す。 Ｌａｎｅ １： 分子量マーカー（φｘ１７４ ｐｈａ
ｇｅ ＤＮＡ／ＨａｅIII） ２： 加熱処理なし ３： ９０℃、１０分間加熱 また、「←」印はｋ−ｒａｓ遺伝子の増幅領域（108b
p）を示す。図５に於いて、−□−は、加熱処理を行っ
た後にタンパク質分解酵素を反応させた場合を、また−
＋−は、加熱処理を行わずにタンパク質分解酵素を反応
させた場合を夫々示す。図６に於いて、各レーン番号は
以下の試料を使用してＰＣＲ法による増幅を行った結果
を夫々示す。 Ｌａｎｅ １： 分子量マーカー（φｘ１７４ ｐｈａ
ｇｅ ＤＮＡ／ＨａｅIII） ２： 界面活性剤未含有緩衝液、加熱処理なし ３： 界面活性剤未含有緩衝液、９０℃、１０分間加熱 ４： 界面活性剤含有緩衝液、加熱処理なし ５： 界面活性剤含有緩衝液、９０℃、１０分間加熱 また、「←」印はｋ−ｒａｓ遺伝子の増幅領域（108b
p）を示す。In FIG. 1, lane 1 shows the result of the molecular weight marker, lane 2 shows the result of amplification of the DNA sample obtained in Example 1 by the PCR method, and lane 3 shows the DN obtained in Comparative Example 1.
The results of amplification of the A sample by the PCR method are shown. The mark “←” indicates the amplified region of the human β-globin gene (11
0bp). In FIG. 2, each lane number indicates the result of performing amplification by the PCR method using the following samples. Lanes 1 and 6: molecular weight markers (φx174
phage DNA / HaeIII) 2: no addition of the sample solution derived from Comparative Example 1 3: addition of 2 μl of the sample solution derived from Comparative Example 1 4: addition of 4 μl of the sample solution derived from Comparative Example 1 5: addition of 7 μl of the sample solution derived from Comparative Example 1 7 : No addition of sample liquid derived from Example 1 8: Addition of 2 μl of sample liquid derived from Example 1 9: Addition of 4 μl of sample liquid derived from Example 1 10: Addition of 7 μl of sample liquid derived from Example 1 The amplified region (983 bp) of the rat G3PDH gene is shown. In FIG. 3, each lane number indicates the result using the following sample. Lane 1: Molecular weight marker [λ phage DNA
/ HindIII, manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.] 2: No heat treatment 3: Heat at 100 ° C. for 3 minutes 4: Heat at 100 ° C. for 5 minutes 5: Heat at 100 ° C. for 10 minutes In FIG. 4, each lane number is as follows: P using sample
The results of amplification by the CR method are shown respectively. Lane 1: Molecular weight marker (φx174 pha
ge DNA / HaeIII) 2: no heat treatment 3: heating at 90 ° C. for 10 minutes “←” indicates an amplification region of the k-ras gene (108b
p). In FIG. 5,-□-indicates the case where the protease was reacted after the heat treatment, and-
+-Indicates the case where the protease was reacted without performing the heat treatment, respectively. In FIG. 6, each lane number indicates the result of amplification by the PCR method using the following samples. Lane 1: Molecular weight marker (φx174 pha
ge DNA / HaeIII) 2: Surfactant-free buffer, no heat treatment 3: Surfactant-free buffer, heated at 90 ° C. for 10 minutes 4: Surfactant-containing buffer, no heat treatment 5: Surfactant The buffer containing the agent, heated at 90 ° C. for 10 minutes. The “←” mark indicates the k-ras gene amplification region (108b
p).

Claims (11)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 パラフィンを除去したパラフィン包埋組
織標本とタンパク質変性作用を有する界面活性剤とを含
有する水性懸濁液を60℃以上で加熱処理することを特徴
とする、遺伝子分析用試料としてのパラフィン包埋組織
標本の処理方法。1. A sample for gene analysis, wherein an aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing effect is heat-treated at 60 ° C. or more. For processing paraffin-embedded tissue specimens. 【請求項２】 加熱処理の処理温度が70℃乃至水性懸濁
液の沸点以下である、請求項１に記載の方法。2. The method according to claim 1, wherein the treatment temperature of the heat treatment is from 70 ° C. to the boiling point of the aqueous suspension. 【請求項３】 請求項１又は２に記載の処理方法を行
い、更にこれにタンパク質分解酵素を作用させることを
特徴とする、遺伝子分析用試料としてのパラフィン包埋
組織標本の処理方法。3. A method for treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, which comprises carrying out the treatment method according to claim 1 or 2, and further causing a protease to act on the treatment method. 【請求項４】 請求項３に記載の処理方法を行い、次い
で核酸鎖を沈殿させることを特徴とする、遺伝子分析用
試料としてのパラフィン包埋組織標本の処理方法。4. A method for treating a paraffin-embedded tissue specimen as a sample for gene analysis, wherein the method according to claim 3 is performed, and then a nucleic acid chain is precipitated. 【請求項５】 請求項３に記載の処理方法を行い、更に
該反応液にタンパク質変性作用を有する有機化合物含有
溶液を作用させた後、核酸鎖を沈殿させることを特徴と
する、遺伝子分析用試料としてのパラフィン包埋組織標
本の処理方法。5. A method for gene analysis, comprising performing the treatment method according to claim 3, further reacting an organic compound-containing solution having a protein denaturing effect on the reaction solution, and then precipitating a nucleic acid chain. A method for processing a paraffin-embedded tissue specimen as a sample. 【請求項６】 タンパク質変性作用を有する有機化合物
含有溶液がフェノール性水酸基を有する有機化合物を含
むアルコール水溶液である、請求項５に記載の方法。6. The method according to claim 5, wherein the organic compound-containing solution having a protein denaturing action is an aqueous alcohol solution containing an organic compound having a phenolic hydroxyl group. 【請求項７】 フェノール性水酸基を有する有機化合物
がヒドロキシ安息香酸である、請求項６に記載の方法。7. The method according to claim 6, wherein the organic compound having a phenolic hydroxyl group is hydroxybenzoic acid. 【請求項８】 (i)タンパク質変性作用を有する界面活
性剤、(ii)タンパク質分解酵素、及び(iii)ヒドロキシ
安息香酸を含有する溶液を組み合わせてなることを特徴
とする、遺伝子分析用試料としてのパラフィン包埋組織
標本の処理用キット。8. A sample for gene analysis comprising a combination of (i) a surfactant having a protein denaturing action, (ii) a protease, and (iii) a solution containing hydroxybenzoic acid. For processing paraffin-embedded tissue specimens. 【請求項９】 タンパク質変性作用を有する界面活性剤
がＳＤＳである、請求項８に記載の処理用キット。9. The processing kit according to claim 8, wherein the surfactant having a protein denaturing action is SDS. 【請求項１０】 タンパク質分解酵素がパパインであ
る、請求項８又は９に記載の処理用キット。10. The processing kit according to claim 8, wherein the protease is papain. 【請求項１１】 パラフィンを除去したパラフィン包埋
組織標本とタンパク質変性作用を有する界面活性剤とを
含有する水性懸濁液を加熱処理した後、これにタンパク
質分解酵素を作用させ、次いで該反応液にヒドロキシ安
息香酸含有アルコール水溶液を作用させた後、核酸鎖を
沈殿させることを特徴とする、遺伝子分析用試料として
のパラフィン包埋組織標本の処理方法。11. An aqueous suspension containing a paraffin-embedded tissue specimen from which paraffin has been removed and a surfactant having a protein denaturing effect is subjected to heat treatment, and then a proteolytic enzyme is allowed to act on the aqueous suspension. A method for treating a paraffin-embedded tissue sample as a sample for gene analysis, comprising reacting an aqueous solution of a hydroxybenzoic acid-containing alcohol with the aqueous solution, followed by precipitation of a nucleic acid chain.