JP3119314B2 - 固定化リパーゼ及びその製法 - Google Patents
固定化リパーゼ及びその製法Info
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、有機溶媒中でのエステ
ル交換反応において高活性を有し、かつ加水分解などの
副反応をほとんど生じない固定化リパーゼ及びその製法
に関するものである。
ル交換反応において高活性を有し、かつ加水分解などの
副反応をほとんど生じない固定化リパーゼ及びその製法
に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】リパーゼ（EC 3.1.1.3）は、古くからそ
の存在が知られているにもかかわらず、基質が水に不溶
性の油脂であり、常温では固体のものもあることから、
アミラーゼやプロテアーゼに比べるとその利用は著しく
遅れ、消化剤やフレーバー剤の加工等に限られていた。
しかし最近になって、リパーゼを洗剤用酵素として使用
したり、油脂の高度化加工、エステル合成や交換、さら
には光学異性体の分割に利用しようとする研究が盛んに
行われるようになり、工業的に最も注目されている酵素
の一つとなってきた。また、油脂の高度化加工、エステ
ル合成やエステル交換、及び光学異性体の分割等は、
(1) 脂溶性基質の溶解度を高める、(2) 熱学的平衡を合
成へシフトさせる、または(3) 副反応として生じる加水
分解反応を回避するなどの利点から有機溶媒中で行なわ
れることが多い。しかし、リパーゼを有機溶媒中でその
ままあるいは不適当な固定化をして用いた場合、分散
性、水分の不足または添加剤による阻害などにより、ほ
とんど活性を示さないか、あるいは微弱な活性しか示さ
ない。したがって、有用なリパーゼの工業的利用を飛躍
的に拡大させるためには、有機溶媒中で活性の高いリパ
ーゼを供給することが必要である。
の存在が知られているにもかかわらず、基質が水に不溶
性の油脂であり、常温では固体のものもあることから、
アミラーゼやプロテアーゼに比べるとその利用は著しく
遅れ、消化剤やフレーバー剤の加工等に限られていた。
しかし最近になって、リパーゼを洗剤用酵素として使用
したり、油脂の高度化加工、エステル合成や交換、さら
には光学異性体の分割に利用しようとする研究が盛んに
行われるようになり、工業的に最も注目されている酵素
の一つとなってきた。また、油脂の高度化加工、エステ
ル合成やエステル交換、及び光学異性体の分割等は、
(1) 脂溶性基質の溶解度を高める、(2) 熱学的平衡を合
成へシフトさせる、または(3) 副反応として生じる加水
分解反応を回避するなどの利点から有機溶媒中で行なわ
れることが多い。しかし、リパーゼを有機溶媒中でその
ままあるいは不適当な固定化をして用いた場合、分散
性、水分の不足または添加剤による阻害などにより、ほ
とんど活性を示さないか、あるいは微弱な活性しか示さ
ない。したがって、有用なリパーゼの工業的利用を飛躍
的に拡大させるためには、有機溶媒中で活性の高いリパ
ーゼを供給することが必要である。
【０００３】従来より、リパーゼを有機溶媒中で作用さ
せる例としては、種々報告されているが、クリバノフら
による豚膵臓由来のリパーゼを用いた低含水量の有機溶
媒中でのエステル交換反応の報告〔サイエンス(Scienc
e)224, 1249(1984)〕、山根らによるシュードモナス属
由来のリパーゼを用いて、糖類と共にセライトに固定化
することにより、より高いラクトン化反応を得た報告
〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリン
グ(Biotechnol.Bioeng.)36, 1063(1990)〕などがある。
また、クリバノフらはリパーゼを至適ｐＨの緩衝液に溶
解後、凍結乾燥を行うことにより、水と混和しない溶媒
中で高い反応効率を得たことを報告〔プロシーディング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・ア
メリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82,3192(1985)〕して
いるが、その後、山根らによって高純度のリパーゼを用
いた固定化酵素の調製において、ｐＨを調節するために
加えた無機塩類はむしろ反応を阻害することが報告され
た〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリ
ング(Biotechnol.Bioeng.)36, 1063(1990)〕。従って、
水と混和しない有機溶媒中でリパーゼを有効に用いるた
めには、糖類などの安定化剤を添加し、担体を用いて分
散性を向上させた固定化酵素が比較的有効であると考え
られていた。しかし、これらの何れの報告によっても、
リパーゼの添加量に対して有機溶媒中での活性は十分で
なく、工業的に用いるためには過剰のリパーゼを添加す
る必要がある。また、水と混和しない又は水不溶の有機
溶媒中でリパーゼを反応させる際に微量の水が必要であ
るが、水の含有量が高くなると副反応である加水分解反
応を生じ、エステル合成及びエステル交換反応等にとっ
て問題となるため、リパーゼに適した水分の調整が必要
である。
せる例としては、種々報告されているが、クリバノフら
による豚膵臓由来のリパーゼを用いた低含水量の有機溶
媒中でのエステル交換反応の報告〔サイエンス(Scienc
e)224, 1249(1984)〕、山根らによるシュードモナス属
由来のリパーゼを用いて、糖類と共にセライトに固定化
することにより、より高いラクトン化反応を得た報告
〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリン
グ(Biotechnol.Bioeng.)36, 1063(1990)〕などがある。
また、クリバノフらはリパーゼを至適ｐＨの緩衝液に溶
解後、凍結乾燥を行うことにより、水と混和しない溶媒
中で高い反応効率を得たことを報告〔プロシーディング
ス・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエ
ンシズ・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・ア
メリカ(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82,3192(1985)〕して
いるが、その後、山根らによって高純度のリパーゼを用
いた固定化酵素の調製において、ｐＨを調節するために
加えた無機塩類はむしろ反応を阻害することが報告され
た〔バイオテクノロジー・アンド・バイオエンジニアリ
ング(Biotechnol.Bioeng.)36, 1063(1990)〕。従って、
水と混和しない有機溶媒中でリパーゼを有効に用いるた
めには、糖類などの安定化剤を添加し、担体を用いて分
散性を向上させた固定化酵素が比較的有効であると考え
られていた。しかし、これらの何れの報告によっても、
リパーゼの添加量に対して有機溶媒中での活性は十分で
なく、工業的に用いるためには過剰のリパーゼを添加す
る必要がある。また、水と混和しない又は水不溶の有機
溶媒中でリパーゼを反応させる際に微量の水が必要であ
るが、水の含有量が高くなると副反応である加水分解反
応を生じ、エステル合成及びエステル交換反応等にとっ
て問題となるため、リパーゼに適した水分の調整が必要
である。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的はリパー
ゼの有機溶媒中でのエステル交換反応において高い活性
を有し、かつ副反応である加水分解活性をほとんど生じ
ない固定化リパーゼ及びその製法を提供することであ
る。
ゼの有機溶媒中でのエステル交換反応において高い活性
を有し、かつ副反応である加水分解活性をほとんど生じ
ない固定化リパーゼ及びその製法を提供することであ
る。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは種々鋭意研
究した結果、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
またはグッド緩衝剤を含むことにより上記目的が達成さ
れることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発
明はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびグ
ッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種または２種以上
の化合物、固定化担体およびリパーゼを含有することを
特徴とする固定化リパーゼである。本発明の固定化リパ
ーゼはさらに種類を含有してもよい。また本発明はトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびグッド緩衝
剤よりなる群から選ばれた１種または２種以上の化合
物、固定化担体およびリパーゼを含有し、かつ水分を
０. １〜３０重量％含有する固定化リパーゼである。さ
らに本発明はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
およびグッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種または
２種以上の化合物を含む緩衝液中で固定化担体にリパー
ゼを固定化し、乾燥することを特徴とする固定化リパー
ゼの製造法およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンおよびグッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種ま
たは２種以上の化合物を含む緩衝液中で固定化担体にリ
パーゼを固定化し、乾燥した後、湿度４０〜１００％の
空気中で吸湿させることにより、あるいは乾燥時に残留
水分量を調節することにより、水分を０．１〜３０重量
％含有させることを特徴とする固定化リパーゼの製造法
である。
究した結果、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
またはグッド緩衝剤を含むことにより上記目的が達成さ
れることを見出し、本発明に到達した。すなわち、本発
明はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびグ
ッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種または２種以上
の化合物、固定化担体およびリパーゼを含有することを
特徴とする固定化リパーゼである。本発明の固定化リパ
ーゼはさらに種類を含有してもよい。また本発明はトリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびグッド緩衝
剤よりなる群から選ばれた１種または２種以上の化合
物、固定化担体およびリパーゼを含有し、かつ水分を
０. １〜３０重量％含有する固定化リパーゼである。さ
らに本発明はトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン
およびグッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種または
２種以上の化合物を含む緩衝液中で固定化担体にリパー
ゼを固定化し、乾燥することを特徴とする固定化リパー
ゼの製造法およびトリス（ヒドロキシメチル）アミノメ
タンおよびグッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種ま
たは２種以上の化合物を含む緩衝液中で固定化担体にリ
パーゼを固定化し、乾燥した後、湿度４０〜１００％の
空気中で吸湿させることにより、あるいは乾燥時に残留
水分量を調節することにより、水分を０．１〜３０重量
％含有させることを特徴とする固定化リパーゼの製造法
である。
【０００６】本発明に用いるトリス（ヒドロキシメチ
ル）アミノメタン（以下、Ｔｒｉｓと略称する）は緩衝
剤の一種である。この緩衝剤は塩酸とともにＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液として使用する。また本発明に用いるグッ
ド緩衝剤としては、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル
ホン酸（ＭＥＳ）、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）
−２，２′，２″−ニトリロトリエタノール（Bis-tri
s）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤ
Ａ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホ
ン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−
モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−ト
リス（ホドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンス
ルホン（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−
トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン (Tricin
e)、グルシンアミド、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエ
チル）グリシン (Bicine) 、Ｎ−トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル−２−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰ
Ｓ）、シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥ
Ｓ）、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡ
ＰＳ）などが挙げられる。好ましくは、例えば水酸基を
有する緩衝剤としてＮ，Ｎ−ビス（２- ヒドロキシエチ
ル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスル
ホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチル−２−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰ
Ｓ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ア
ミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチルグリシン (Tricine)などが挙げられ
る。Ｔｒｉｓまたはグッド緩衝剤の量は、０．０５〜５
０重量％、好ましくは０．２〜１０重量％である。これ
らのＴｒｉｓまたはグッド緩衝剤は、ｐＨの維持になる
とともに水分の保持能力を有する。
ル）アミノメタン（以下、Ｔｒｉｓと略称する）は緩衝
剤の一種である。この緩衝剤は塩酸とともにＴｒｉｓ−
ＨＣｌ緩衝液として使用する。また本発明に用いるグッ
ド緩衝剤としては、２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスル
ホン酸（ＭＥＳ）、２，２−ビス（ヒドロキシメチル）
−２，２′，２″−ニトリロトリエタノール（Bis-tri
s）、Ｎ−（２−アセトアミド）イミノジ酢酸（ＡＤ
Ａ）、ピペラジン−Ｎ，Ｎ′−ビス（２−エタンスルホ
ン酸）（ＰＩＰＥＳ）、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）
−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、３−（Ｎ−
モルホリノ）プロパンスルホン酸（ＭＯＰＳ）、Ｎ−ト
リス（ホドロキシメチル）メチル−２−アミノエタンス
ルホン（ＴＥＳ）、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジ
ン−Ｎ′−２−エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−
トリス（ヒドロキシメチル）メチルグリシン (Tricin
e)、グルシンアミド、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエ
チル）グリシン (Bicine) 、Ｎ−トリス（ヒドロキシメ
チル）メチル−２−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰ
Ｓ）、シクロヘキシルアミノエタンスルホン酸（ＣＨＥ
Ｓ）、シクロヘキシルアミノプロパンスルホン酸（ＣＡ
ＰＳ）などが挙げられる。好ましくは、例えば水酸基を
有する緩衝剤としてＮ，Ｎ−ビス（２- ヒドロキシエチ
ル）−２−アミノエタンスルホン酸（ＢＥＳ）、Ｎ−２
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスル
ホン酸（ＨＥＰＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチ
ル）メチル−２−アミノプロパンスルホン酸（ＴＡＰ
Ｓ）、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−２−ア
ミノエタンスルホン酸（ＴＥＳ）、Ｎ−トリス（ヒドロ
キシメチル）メチルグリシン (Tricine)などが挙げられ
る。Ｔｒｉｓまたはグッド緩衝剤の量は、０．０５〜５
０重量％、好ましくは０．２〜１０重量％である。これ
らのＴｒｉｓまたはグッド緩衝剤は、ｐＨの維持になる
とともに水分の保持能力を有する。
【０００７】上記緩衝剤に加えて糖類を使用するとさら
に有機溶媒中でのエステル交換反応において高い活性が
見られる。糖類は水分の保持とともに、リパーゼの安定
化を行う。本発明に用いる糖類としては、いずれのもの
でも良いが、例えばグルコース、ガラクトースなどの単
糖類、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコー
ル、シュークロース、ラクトース、トレハロースなどの
二糖類などが挙げられる。糖類の量は、０．１〜３０重
量％、好ましくは１〜１０重量％である。
に有機溶媒中でのエステル交換反応において高い活性が
見られる。糖類は水分の保持とともに、リパーゼの安定
化を行う。本発明に用いる糖類としては、いずれのもの
でも良いが、例えばグルコース、ガラクトースなどの単
糖類、マンニトール、ソルビトールなどの糖アルコー
ル、シュークロース、ラクトース、トレハロースなどの
二糖類などが挙げられる。糖類の量は、０．１〜３０重
量％、好ましくは１〜１０重量％である。
【０００８】本発明に用いるリパーゼとしては、いずれ
のリパーゼでもよいが、例えばシュードモナス属、ムコ
ール属、クロモバクテリウム属、リゾプス属、アスペル
ギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属などの微生物
由来のリパーゼ、あるいは動物臓器由来のリパーゼなど
が挙げられる。さらにＤＮＡ組換え技術により生産され
るリパーゼであってもよい。
のリパーゼでもよいが、例えばシュードモナス属、ムコ
ール属、クロモバクテリウム属、リゾプス属、アスペル
ギルス属、ペニシリウム属、フザリウム属などの微生物
由来のリパーゼ、あるいは動物臓器由来のリパーゼなど
が挙げられる。さらにＤＮＡ組換え技術により生産され
るリパーゼであってもよい。
【０００９】また、本発明に用いる固定化担体として
は、リパーゼが固定化される担体であればいずれの担体
でも良いが、例えば商品名、ハイフロスーパーセル(Joh
n Manville Sales社製) などの珪藻土、イオン交換樹
脂、ゲル濾過担体などのポリマー担体、シリカゲル及び
多孔性ガラスなどが挙げられる。固定担体の形状は、微
粒子状、ビーズ状、膜状あるいは繊維状などいずれの形
状のものでも良いが、好ましくは微粒子状、あるいはビ
ーズ状のものが良い。
は、リパーゼが固定化される担体であればいずれの担体
でも良いが、例えば商品名、ハイフロスーパーセル(Joh
n Manville Sales社製) などの珪藻土、イオン交換樹
脂、ゲル濾過担体などのポリマー担体、シリカゲル及び
多孔性ガラスなどが挙げられる。固定担体の形状は、微
粒子状、ビーズ状、膜状あるいは繊維状などいずれの形
状のものでも良いが、好ましくは微粒子状、あるいはビ
ーズ状のものが良い。
【００１０】本発明において固定化リパーゼを製造する
には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび
グッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種または２種以
上の化合物を含む緩衝液中で固定化担体にリパーゼを固
定化し、乾燥する。固定化担体にリパーゼを固定化する
方法としては、結合、吸着、沈着及び包括などのいずれ
の方法でも良いが、例えば適当なｐＨに調製した上記緩
衝剤を含有する緩衝液中に必要に応じて糖類を添加した
後、リパーゼ及び固定化担体を混和し、固定化担体の表
面もしくは微細孔にリパーゼを吸着または結合させる等
の方法が挙げられる。固定化する条件は、０〜５０℃、
好ましくは５〜３０℃の温度で１０分間〜１週間、好ま
しくは１〜４８時間静置あるいは攪拌しながら保存すれ
ばよい。次いで凍結乾燥、減圧乾燥、加熱乾燥等により
乾燥することができる。このようにして得られた固定化
リパーゼは有機溶媒中でのエステル交換反応における活
性が著しく高い。
には、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよび
グッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種または２種以
上の化合物を含む緩衝液中で固定化担体にリパーゼを固
定化し、乾燥する。固定化担体にリパーゼを固定化する
方法としては、結合、吸着、沈着及び包括などのいずれ
の方法でも良いが、例えば適当なｐＨに調製した上記緩
衝剤を含有する緩衝液中に必要に応じて糖類を添加した
後、リパーゼ及び固定化担体を混和し、固定化担体の表
面もしくは微細孔にリパーゼを吸着または結合させる等
の方法が挙げられる。固定化する条件は、０〜５０℃、
好ましくは５〜３０℃の温度で１０分間〜１週間、好ま
しくは１〜４８時間静置あるいは攪拌しながら保存すれ
ばよい。次いで凍結乾燥、減圧乾燥、加熱乾燥等により
乾燥することができる。このようにして得られた固定化
リパーゼは有機溶媒中でのエステル交換反応における活
性が著しく高い。
【００１１】また本発明の固定化リパーゼを製造するに
は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびグ
ッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種または２種以上
の化合物を含む緩衝液中で固定化担体にリパーゼを固定
化し、乾燥した後、湿度４０〜１００％の空気中で吸湿
させることにより、あるいは乾燥時に残留水分量を調節
することにより、水分を０．１〜３０重量％含有させ
る。本発明の固定化リパーゼに水分を０. １〜３０重量
％、好ましくは１〜１０％含有させることにより、さら
に著しくリパーゼの有機溶媒中でのエステル交換反応活
性を上昇させることができる。水分を含有させる方法と
しては、乾燥時に水分含有量を調節する方法及び乾燥後
に所定量の水分を含有させる方法のいずれの方法でも良
い。望ましくは乾燥後、直接水を添加することなく、湿
度４０〜１００％の空気で吸湿させることにより、ある
いは乾燥時に残留水分量を調節することにより、高いエ
ステル交換反応活性を有し、加水分解などの副反応を伴
わない固定化リパーゼを製造することができる。
は、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタンおよびグ
ッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種または２種以上
の化合物を含む緩衝液中で固定化担体にリパーゼを固定
化し、乾燥した後、湿度４０〜１００％の空気中で吸湿
させることにより、あるいは乾燥時に残留水分量を調節
することにより、水分を０．１〜３０重量％含有させ
る。本発明の固定化リパーゼに水分を０. １〜３０重量
％、好ましくは１〜１０％含有させることにより、さら
に著しくリパーゼの有機溶媒中でのエステル交換反応活
性を上昇させることができる。水分を含有させる方法と
しては、乾燥時に水分含有量を調節する方法及び乾燥後
に所定量の水分を含有させる方法のいずれの方法でも良
い。望ましくは乾燥後、直接水を添加することなく、湿
度４０〜１００％の空気で吸湿させることにより、ある
いは乾燥時に残留水分量を調節することにより、高いエ
ステル交換反応活性を有し、加水分解などの副反応を伴
わない固定化リパーゼを製造することができる。
【００１２】次に本発明の固定化リパーゼの活性測定法
を示す。反応液として、５０ｍＭ２, ２, ２- トリフル
オロエチルオクタノエート（ＴＦＥＯ）及び０．２Ｍエ
タノールを含む乾燥ジイソプロピルエーテル１０ｍｌを
スターラーバーの入った共栓付試験管に採り、撹拌しな
がら２５. ５℃で１０分間予備加温する。これに固定化
リパーゼ約２０ｍｇを添加し、１〜２０分間に数回サン
プリングし、キャピラリーガスクロマトグラフィー（Ｄ
Ｂ−５、（Ｊ＆ＷScientific 社製）１６０℃）にて、
未反応のＴＦＥＯ及び生成したエチルオクタノエート
（ＥＯ）を定量する。ＴＦＥＯ及びＥＯのリテンション
タイムは約２. １４及び２. ５４分である。反応転換率
の対数を反応時間に対してプロットし、得られた直線の
傾きにより反応初期速度を求め、これより１分間に生成
するＥＯ量を求めて、酵素活性を算出する。なお、１分
間に１マイクロモルのＥＯを生成する酵素活性を１Ｕと
する。本発明の固定化リパーゼは油脂の高度化加工、エ
ステル合成やエステル交換あるいは光学異性体の分割等
に使用される。
を示す。反応液として、５０ｍＭ２, ２, ２- トリフル
オロエチルオクタノエート（ＴＦＥＯ）及び０．２Ｍエ
タノールを含む乾燥ジイソプロピルエーテル１０ｍｌを
スターラーバーの入った共栓付試験管に採り、撹拌しな
がら２５. ５℃で１０分間予備加温する。これに固定化
リパーゼ約２０ｍｇを添加し、１〜２０分間に数回サン
プリングし、キャピラリーガスクロマトグラフィー（Ｄ
Ｂ−５、（Ｊ＆ＷScientific 社製）１６０℃）にて、
未反応のＴＦＥＯ及び生成したエチルオクタノエート
（ＥＯ）を定量する。ＴＦＥＯ及びＥＯのリテンション
タイムは約２. １４及び２. ５４分である。反応転換率
の対数を反応時間に対してプロットし、得られた直線の
傾きにより反応初期速度を求め、これより１分間に生成
するＥＯ量を求めて、酵素活性を算出する。なお、１分
間に１マイクロモルのＥＯを生成する酵素活性を１Ｕと
する。本発明の固定化リパーゼは油脂の高度化加工、エ
ステル合成やエステル交換あるいは光学異性体の分割等
に使用される。
【００１３】
【実施例】以下実施例を挙げて本発明を具体的に示す。 実施例１ 表１に示す所定のｐＨに調製した２０ｍＭの各種緩衝液
１０ｍｌに、シュードモナス属由来リパーゼ（東洋紡
製）１０ｍｇ及び商品名、ハイフロスーパーセル(John-
Manville Sales社製) を添加し、４℃にて２日自然乾燥
した後、減圧乾燥し、各固定化リパーゼの活性を測定し
た。その結果を表１に示す。
１０ｍｌに、シュードモナス属由来リパーゼ（東洋紡
製）１０ｍｇ及び商品名、ハイフロスーパーセル(John-
Manville Sales社製) を添加し、４℃にて２日自然乾燥
した後、減圧乾燥し、各固定化リパーゼの活性を測定し
た。その結果を表１に示す。
【００１４】
【表１】 リン酸緩衝液、ブリトンロビンソン緩衝液では、リン酸
塩により活性発現の阻害が認められたが、Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液中では、緩衝液無添加、リン酸緩衝液、及び
ブリトンロビンソン緩衝液と比較して高いエステル交換
反応の力価となった。また、該固定化リパーゼの最適ｐ
Ｈは該リパーゼの水溶液中での至適ｐＨとよく一致し
た。なお、いずれの固定化リパーゼも、上記有機溶媒中
でのエステル交換反応の際に加水分解反応などの副反応
は全く認められなかった。
塩により活性発現の阻害が認められたが、Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ緩衝液中では、緩衝液無添加、リン酸緩衝液、及び
ブリトンロビンソン緩衝液と比較して高いエステル交換
反応の力価となった。また、該固定化リパーゼの最適ｐ
Ｈは該リパーゼの水溶液中での至適ｐＨとよく一致し
た。なお、いずれの固定化リパーゼも、上記有機溶媒中
でのエステル交換反応の際に加水分解反応などの副反応
は全く認められなかった。
【００１５】実施例２ 表２に示す２０ｍＭの各種緩衝液（ｐＨ８. ０）５ｍｌ
に、シュードモナス属由来リパーゼ（東洋紡製）２０ｍ
ｇ及び商品名、ハイフロスーパーセル(John-Manville S
ales社製) ２ｇを添加し４℃にて１日間保存した後、凍
結乾燥法により乾燥した。その後２０℃、湿度９０％に
て、吸湿させて水分を調製した固定化リパーゼを得、そ
のエステル交換反応の活性を測定した。その結果を表２
に示す。
に、シュードモナス属由来リパーゼ（東洋紡製）２０ｍ
ｇ及び商品名、ハイフロスーパーセル(John-Manville S
ales社製) ２ｇを添加し４℃にて１日間保存した後、凍
結乾燥法により乾燥した。その後２０℃、湿度９０％に
て、吸湿させて水分を調製した固定化リパーゼを得、そ
のエステル交換反応の活性を測定した。その結果を表２
に示す。
【００１６】
【表２】
【００１７】緩衝液無添加のものと比較して、Ｔｒｉｓ
−ＨＣｌ緩衝液や種々のグッド緩衝液を添加した固定化
リパーゼは高い力価となった。又これらの中でも水酸基
を有する緩衝剤ではより活性が高くなっており、緩衝剤
の構造により固定化リパーゼの活性が影響を受けること
が推察できる。なお、いずれの固定化リパーゼも、上記
有機溶媒中でのエステル交換反応の際に加水分解反応な
どの副反応は全く認められなかった。
−ＨＣｌ緩衝液や種々のグッド緩衝液を添加した固定化
リパーゼは高い力価となった。又これらの中でも水酸基
を有する緩衝剤ではより活性が高くなっており、緩衝剤
の構造により固定化リパーゼの活性が影響を受けること
が推察できる。なお、いずれの固定化リパーゼも、上記
有機溶媒中でのエステル交換反応の際に加水分解反応な
どの副反応は全く認められなかった。
【００１８】実施例３ ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８. ０）５ｍｌ
にシュードモナス属由来リパーゼ（天野製薬製）１０ｍ
ｇ、商品名、ハイフロスーパーセル(John-Manville Sal
es社製）１ｇ及び表３に示す各種糖類７５ｍｇを添加し
て凍結乾燥した。又、その後２５℃、湿度９５％で１日
間吸湿させ、吸湿前後の固定化リパーゼの活性を測定し
た。その結果を表３に示す。
にシュードモナス属由来リパーゼ（天野製薬製）１０ｍ
ｇ、商品名、ハイフロスーパーセル(John-Manville Sal
es社製）１ｇ及び表３に示す各種糖類７５ｍｇを添加し
て凍結乾燥した。又、その後２５℃、湿度９５％で１日
間吸湿させ、吸湿前後の固定化リパーゼの活性を測定し
た。その結果を表３に示す。
【００１９】
【表３】 単糖類、二糖類あるいは糖アルコール等の各種糖類を添
加したものでは、いずれも無添加と比較してより高活性
となった。また、該固定化リパーゼを吸湿させることに
よって水分を含有させることで著しく活性が増大した。
なお、いずれの固定化リパーゼも、上記有機溶媒中での
エステル交換反応の際に加水分解反応などの副反応は全
く認められなかった。
加したものでは、いずれも無添加と比較してより高活性
となった。また、該固定化リパーゼを吸湿させることに
よって水分を含有させることで著しく活性が増大した。
なお、いずれの固定化リパーゼも、上記有機溶媒中での
エステル交換反応の際に加水分解反応などの副反応は全
く認められなかった。
【００２０】実施例４ ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８. ０）５ｍｌ
にシュードモナス属由来リパーゼ（天野製薬製）１０ｍ
ｇ、商品名、ハイフロスーパーセル(John-Manville Sal
es社製）１ｇ及び表４に示す各種糖類７５ｍｇを添加
し、４℃にて２日間自然乾燥した後、塩化カルシウムを
入れたデシケーター内で１日間減圧乾燥し、その後さら
に五酸化二リンを入れたデシケーター内で３日間減圧乾
燥して、水分を調製した固定化リパーゼを得、その活性
を測定した。その結果を表４に示す。
にシュードモナス属由来リパーゼ（天野製薬製）１０ｍ
ｇ、商品名、ハイフロスーパーセル(John-Manville Sal
es社製）１ｇ及び表４に示す各種糖類７５ｍｇを添加
し、４℃にて２日間自然乾燥した後、塩化カルシウムを
入れたデシケーター内で１日間減圧乾燥し、その後さら
に五酸化二リンを入れたデシケーター内で３日間減圧乾
燥して、水分を調製した固定化リパーゼを得、その活性
を測定した。その結果を表４に示す。
【００２１】
【表４】 塩化カルシウムを入れたデシケーター内での１日間の減
圧乾燥では水分が残留しているため、糖類を添加した固
定化リパーゼは無添加のものと比較するとより高い活性
を示すが、更に乾燥を進めると活性が低下し、糖の添加
効果は低下する。即ち、乾燥時に残留水分を調製するこ
とで、高い活性の固定化リパーゼが得られた。なお、い
ずれの固定化リパーゼも、上記有機溶媒中でのエステル
交換反応の際に加水分解反応などの副反応は全く認めら
れなかった。
圧乾燥では水分が残留しているため、糖類を添加した固
定化リパーゼは無添加のものと比較するとより高い活性
を示すが、更に乾燥を進めると活性が低下し、糖の添加
効果は低下する。即ち、乾燥時に残留水分を調製するこ
とで、高い活性の固定化リパーゼが得られた。なお、い
ずれの固定化リパーゼも、上記有機溶媒中でのエステル
交換反応の際に加水分解反応などの副反応は全く認めら
れなかった。
【００２２】実施例５ ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８. ０）５ｍｌ
に商品名、ハイフロスーパーセル(John-Manville Sales
社製）１ｇ、シュークロース７５ｍｇ及び表５に示す各
種リパーゼを添加した後、４℃にて２日間自然乾燥し、
塩化カルシウム入りのデシケーター内で２５℃にて１日
間減圧乾燥により乾燥した。その後２５℃、湿度９５％
にて吸湿させて調製した固定化リパーゼの活性を測定し
た。その結果を表５に示す。
に商品名、ハイフロスーパーセル(John-Manville Sales
社製）１ｇ、シュークロース７５ｍｇ及び表５に示す各
種リパーゼを添加した後、４℃にて２日間自然乾燥し、
塩化カルシウム入りのデシケーター内で２５℃にて１日
間減圧乾燥により乾燥した。その後２５℃、湿度９５％
にて吸湿させて調製した固定化リパーゼの活性を測定し
た。その結果を表５に示す。
【００２３】
【表５】 いずれのリパーゼも、吸湿によって水分を含有させるこ
とにより、高力価となった。なお、いずれの固定化リパ
ーゼも、上記有機溶媒中のエステル交換反応の際に加水
分解反応などの副反応は全く認められなかった。
とにより、高力価となった。なお、いずれの固定化リパ
ーゼも、上記有機溶媒中のエステル交換反応の際に加水
分解反応などの副反応は全く認められなかった。
【００２４】実施例６ ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８. ０）１０ｍ
ｌにシュードモナス属由来リパーゼ（東洋紡製）１０ｍ
ｇ及び表６に示す各種固定化担体を１ｇ添加し、４℃に
て２日間自然乾燥した後、塩化カルシウム入りデシケー
ター内で２５℃にて１日間減圧乾燥した。その後２５
℃、湿度９５％にて吸湿させて調製した固定化リパーゼ
の活性を測定した。その結果を表６に示す。
ｌにシュードモナス属由来リパーゼ（東洋紡製）１０ｍ
ｇ及び表６に示す各種固定化担体を１ｇ添加し、４℃に
て２日間自然乾燥した後、塩化カルシウム入りデシケー
ター内で２５℃にて１日間減圧乾燥した。その後２５
℃、湿度９５％にて吸湿させて調製した固定化リパーゼ
の活性を測定した。その結果を表６に示す。
【００２５】
【表６】 いずれの固定化担体でも高力価の固定化リパーゼが得ら
れた。なお、いずれの固定化リパーゼも、上記有機溶媒
中でのエステル交換反応の際に加水分解反応などの副反
応は全く認められなかった。
れた。なお、いずれの固定化リパーゼも、上記有機溶媒
中でのエステル交換反応の際に加水分解反応などの副反
応は全く認められなかった。
【００２６】実施例７ ２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８.０）５ｍｌ
にシュードモナス属由来リパーゼ（天野製薬製）１０ｍ
ｇ、商品名、ハイフロスーパーセル(John-Manville Sal
es社製）１ｇ及び表７に示す各種糖類７５ｍｇを添加
し、４℃にて２日間自然乾燥した後、塩化カルシウム入
りデシケーター内で室温にて１日間乾燥して調製した固
定化リパーゼの活性を測定した。また活性測定時に反応
液に水を所定量添加し、固定化リパーゼ活性及び副反応
として生じる加水分解反応を測定した。なお全反応に占
める加水分解反応の割合は下記の計算式により算出し
た。エステル交換反応によって生成するＥＯのモル濃度
を［ＥＯ］、加水分解反応によって生じるオクタン酸
（ＯＡ）のモル濃度を［ＯＡ］とした。 加水分解反応の割合（％）＝［ＯＡ］／（［ＥＯ］＋
［ＯＡ］）×１００ その結果を表７に示す。
にシュードモナス属由来リパーゼ（天野製薬製）１０ｍ
ｇ、商品名、ハイフロスーパーセル(John-Manville Sal
es社製）１ｇ及び表７に示す各種糖類７５ｍｇを添加
し、４℃にて２日間自然乾燥した後、塩化カルシウム入
りデシケーター内で室温にて１日間乾燥して調製した固
定化リパーゼの活性を測定した。また活性測定時に反応
液に水を所定量添加し、固定化リパーゼ活性及び副反応
として生じる加水分解反応を測定した。なお全反応に占
める加水分解反応の割合は下記の計算式により算出し
た。エステル交換反応によって生成するＥＯのモル濃度
を［ＥＯ］、加水分解反応によって生じるオクタン酸
（ＯＡ）のモル濃度を［ＯＡ］とした。 加水分解反応の割合（％）＝［ＯＡ］／（［ＥＯ］＋
［ＯＡ］）×１００ その結果を表７に示す。
【００２７】
【表７】 糖類を添加しない固定化リパーゼでは水分を添加するに
従って活性は増大してきた（クリバノフらをはじめとし
て一般的に行なわれてきた方法）。しかし一方で加水分
解反応も生じ、最も活性が高くなる３０μｌ（全反応液
の約０. ３％）では、同時に加水分解反応も４９. ８％
とエステル交換と同程度生じた。シュークロース、トレ
ハロースを添加したものでは酵素活性発現に必要な微量
の水分を保持しているため、水を添加しないものでも固
定化リパーゼは高活性を示す。また水を添加すると、固
定化リパーゼ活性はほとんど変化しないが、加水分解反
応のみ増大し、１０μｌ（全反応液の０. １％）の添加
で約１５％の加水分解反応の割合となった。
従って活性は増大してきた（クリバノフらをはじめとし
て一般的に行なわれてきた方法）。しかし一方で加水分
解反応も生じ、最も活性が高くなる３０μｌ（全反応液
の約０. ３％）では、同時に加水分解反応も４９. ８％
とエステル交換と同程度生じた。シュークロース、トレ
ハロースを添加したものでは酵素活性発現に必要な微量
の水分を保持しているため、水を添加しないものでも固
定化リパーゼは高活性を示す。また水を添加すると、固
定化リパーゼ活性はほとんど変化しないが、加水分解反
応のみ増大し、１０μｌ（全反応液の０. １％）の添加
で約１５％の加水分解反応の割合となった。
【００２８】
【発明の効果】本発明の固定化リパーゼはトリス（ヒド
ロキシメチル）アミノメタンおよびグッド緩衝剤を含有
することにより、有機溶媒中でのエステル交換反応にお
いて高い活性を有し、かつ加水分解反応などの副反応を
ほとんど生じない。また水分を０．１〜３０重量％に調
整することにより有機溶媒中での高い活性を維持でき
る。したがって有機溶媒中に水分を添加してエステル交
換反応を行う必要がない。また糖類をさらに含有するこ
とにより、水分が保持され、高い活性が見られた。
ロキシメチル）アミノメタンおよびグッド緩衝剤を含有
することにより、有機溶媒中でのエステル交換反応にお
いて高い活性を有し、かつ加水分解反応などの副反応を
ほとんど生じない。また水分を０．１〜３０重量％に調
整することにより有機溶媒中での高い活性を維持でき
る。したがって有機溶媒中に水分を添加してエステル交
換反応を行う必要がない。また糖類をさらに含有するこ
とにより、水分が保持され、高い活性が見られた。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−174384（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−203192（ＪＰ，Ａ) 特開 平１−153097（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−130079（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−49684（ＪＰ，Ａ) 特開 昭48−91267（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 11/02
Claims (4)
- 【請求項１】 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンおよびグッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種また
は２種以上の化合物、単糖、糖アルコール、および二糖
類よりなる群から選ばれた１種または２種以上の化合
物、固定化担体ならびにリパーゼを含有することを特徴
とする固定化リパーゼ。 - 【請求項２】 水分を０．１〜３０重量％含有すること
を特徴とする請求項１記載の固定化リパーゼ。 - 【請求項３】 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンおよびグッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種また
は２種以上の化合物ならびに単糖、糖アルコール、およ
び二糖類よりなる群から選ばれた１種または２種以上の
化合物を含む緩衝液中で固定化担体にリパーゼを固定化
し、乾燥することを特徴とする固定化リパーゼの製造
法。 - 【請求項４】 トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ンおよびグッド緩衝剤よりなる群から選ばれた１種また
は２種以上の化合物ならびに単糖、糖アルコール、およ
び二糖類よりなる群から選ばれた１種または２種以上の
化合物を含む緩衝液中で固定化担体にリパーゼを固定化
し、乾燥した後、湿度４０〜１００％の空気中で吸湿さ
せることにより、あるいは乾燥時に残留水分量を調節す
ることにより、水分を０．１〜３０重量％含有させるこ
とを特徴とする固定化リパーゼの製造法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04102862A JP3119314B2 (ja) | 1992-04-22 | 1992-04-22 | 固定化リパーゼ及びその製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP04102862A JP3119314B2 (ja) | 1992-04-22 | 1992-04-22 | 固定化リパーゼ及びその製法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05292965A JPH05292965A (ja) | 1993-11-09 |
| JP3119314B2 true JP3119314B2 (ja) | 2000-12-18 |
Family
ID=14338730
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP04102862A Expired - Fee Related JP3119314B2 (ja) | 1992-04-22 | 1992-04-22 | 固定化リパーゼ及びその製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3119314B2 (ja) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BR112020010347A2 (pt) | 2017-11-24 | 2020-10-20 | Novozymes A/S | pequenas partículas enzimáticas para interesterificação |
| EP3744838A1 (en) | 2019-05-29 | 2020-12-02 | Novozymes A/S | Lipolytic polymer particles for esterification and interesterification |
| US20240076648A1 (en) | 2021-02-26 | 2024-03-07 | Novozymes A/S | Polystyrene/divinylbenzene particles for lipase immobilization |
-
1992
- 1992-04-22 JP JP04102862A patent/JP3119314B2/ja not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH05292965A (ja) | 1993-11-09 |
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