JP3117328B2 - Novel cyclic isomatooligosaccharide synthase, method for producing the same, and method for producing cyclic isomatooligosaccharide - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、デキストランから環状
イソマルトオリゴ糖を生成する新規な環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素、その製造法及び該酵素を用いるデキス
トランからの環状イソマルトオリゴ糖の製造法に関する
ものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to a novel cyclic isomatooligosaccharide synthase for producing cyclic isomatooligosaccharides from dextran, a method for producing the same, and a method for producing cyclic isomaltooligosaccharides from dextran using the enzyme. is there.

【０００２】[0002]

【従来の技術】グルコースがα−１、６結合により環状
に結合した環状イソマルトオリゴ糖は、従来全く知られ
ておらず、本発明者等が、デキストラン含有培地中で、
土壌より単離した１菌株を培養して得られる培養液より
初めて単離された新規化合物であり、既に特許出願を行
なっている。(特願平４−３４９４４４号明細書)。2. Description of the Related Art Cyclic isomato-oligosaccharides in which glucose is cyclically linked by α-1,6 bonds have not been known at all, and the present inventors have proposed a method in which a dextran-containing medium is used.
A novel compound isolated for the first time from a culture obtained by culturing one strain isolated from soil, and a patent application has already been filed. (Japanese Patent Application No. 4-349444).

【０００３】しかしながら、この方法は、微生物の培養液
から該オリゴ糖を分離するものであり、培地由来の不純
物が多く混在しているため精製に多大の労力を要する難
点があった。However, this method separates the oligosaccharide from the culture solution of the microorganism, and has a drawback that a great deal of labor is required for purification due to the presence of many impurities derived from the culture medium.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、該オ
リゴ糖を培養物からの分離精製法によらず、酵素法によ
り該オリゴ糖の製造を可能にする新規酵素を見出し、該
酵素を用いて、デキストランより有用性大なる該オリゴ
糖を製造する方法を提供することにある。SUMMARY OF THE INVENTION An object of the present invention is to find a novel enzyme which enables the production of the oligosaccharide by an enzymatic method without using a method for separating and purifying the oligosaccharide from a culture, Another object of the present invention is to provide a method for producing the oligosaccharide having greater utility than dextran.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】そこで、本発明者等は、
上記の新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を得るた
めに、鋭意検討した結果、環状イソマルトオリゴ糖生産
菌であるバチルス・エスピー．Ｔ−３０４０株をデキス
トラン含有培地中で培養して得られる培養液中に、該酵
素が菌体外酵素として存在していること、また、該酵素
を培養液より分離精製し、本酵素を用いデキストランか
ら環状イソマルトオリゴ糖を生成させれば、反応液より
該オリゴ糖を効率よく採取することができる等の知見を
得、本発明を完成させた。Means for Solving the Problems Accordingly, the present inventors have
As a result of intensive studies to obtain the above novel cyclic isomatooligosaccharide synthase, Bacillus sp. The enzyme is present as an extracellular enzyme in a culture solution obtained by culturing the T-3040 strain in a dextran-containing medium, and the enzyme is separated and purified from the culture solution, and this enzyme is used. The present inventors have found that, if a cyclic isomalt oligosaccharide is produced from dextran, the oligosaccharide can be efficiently collected from the reaction solution, and the present invention has been completed.

【０００６】すなわち本発明は、以下の理化学的性質を
有する新規な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素である。 作用 デキストラン等のα−１、６結合より成るグルコースポ
リマーに作用し、分子内糖転移反応により環状イソマル
トオリゴ糖を生成する。That is, the present invention is a novel cyclic isomatooligosaccharide synthase having the following physicochemical properties. Action Acts on a glucose polymer composed of α-1,6 bonds such as dextran to produce a cyclic isomatooligosaccharide by an intramolecular transglycosylation reaction.

【０００７】基質特異性 α−１、６結合を主鎖とするデキストランには作用する
が、構造中に一部グルコースのα−１、６結合を有す
る、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ ｐＨ５．５付近で作用し、ｐＨ４．５〜８．５の範囲で
安定である。Substrate specificity It acts on dextran having an α-1,6 bond as a main chain, but does not act on amylopectin, pullulan, etc., which have α-1,6 bonds of glucose partially in the structure. Optimum pH and stable pH It works around pH 5.5 and is stable in the range of pH 4.5 to 8.5.

【０００８】さらに、本発明は、バチルス属に属し、前
記の環状イソマルトオリゴ糖合成酵素生産能を有する微
生物をデキストラン含有培地に培養し、培養物より該酵
素を採取することを特徴とする新規な環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素の製造法であり、さらにまた、本発明
は、デキストランに前記の環状イソマルトオリゴ糖合成
酵素を作用させ環状イソマルトオリゴ糖を生成せしめる
ことを特徴とする環状イソマルトオリゴ糖の製造法であ
る。Further, the present invention provides a novel method comprising culturing a microorganism belonging to the genus Bacillus and having the ability to produce cyclic isomatooligosaccharide synthase in a dextran-containing medium, and collecting the enzyme from the culture. The present invention relates to a method for producing a cyclic isomatooligosaccharide synthase, and the present invention further provides a method for producing a cyclic isomatooligosaccharide, wherein the cyclic isomatooligosaccharide synthase is caused to act on dextran to produce a cyclic isomatooligosaccharide. Is the law.

【０００９】上記環状イソマルトオリゴ糖の製造法にお
いて、前記の環状イソマルトオリゴ糖合成酵素に代え
て、バチルス属に属し前記の環状イソマルトオリゴ糖合
成酵素生産能を有する微生物をデキストラン含有培地に
培養して得られる培養液の除菌混合物を用いて同様に環
状イソマルトオリゴ糖を製造することができる。以下、
本発明を詳細に説明する。In the above method for producing a cyclic isomatooligosaccharide, a microorganism belonging to the genus Bacillus and having the ability to produce the cyclic isomatooligosaccharide synthase is cultured in a dextran-containing medium instead of the cyclic isomatooligosaccharide synthase. Cyclic isomaltooligosaccharides can be similarly produced using the eradication mixture of the obtained culture solution. Less than,
The present invention will be described in detail.

【００１０】先ず、新規な環状イソマルトオリゴ糖（サ
イクロイソマルトヘプタオース、サイクロイソマルトオ
クタオース及びサイクロイソマルトノナオース）の理化
学的性質及びその性質に基づきこれらの物質が環状オリ
ゴ糖であることについて説明する。 １．元素分析の結果、以下のようになり各々グルコース
の環状7量体、8量体、9量体であることが判った。 サイクロイソマルトヘプタオース；Ｃ ₄₂ Ｈ ₇₀ Ｏ ₃₅ ・3H ₂ Ｏとして 計算値 Ｃ：42.43％ Ｈ：6.44％ 測定値 Ｃ：42.78％ Ｈ：6.33％ サイクロイソマルトオクタオース；Ｃ ₄₈ Ｈ ₈₀ Ｏ ₄₀ ・4Ｈ ₂ Ｏとして 計算値 Ｃ：42.11％ Ｈ：6.48％ 測定値 Ｃ：42.37％ Ｈ：6.24％ サイクロイソマルトノナオース ；Ｃ ₅₄ Ｈ ₉₀ Ｏ ₄₅ ・5Ｈ ₂ Ｏとして 計算値 Ｃ：41.86％ Ｈ：6.51％ 測定値 Ｃ：41.53％ Ｈ：6.18％ 2. 分子量は、日立製作社製の質量分析計 80Bにより分
析したマススペクトル分析のデータから サイクロイソマルトヘプタオース；1 1 3 4 サイクロイソマルトオクタオース；1 2 9 6 サイクロイソマルトノナオース ；1 4 5 8 であり、いずれも分子式から推定される値と一致した。First, based on the physicochemical properties of novel cyclic isomaltoligosaccharides (cycloisomaltoheptaose, cycloisomaltooctaose and cycloisomaltononaose) and the fact that these substances are cyclic oligosaccharides, explain. 1. As a result of elemental analysis, the results were as follows, and it was found that glucose was a cyclic heptamer, octamer, and 9-mer. Cyclo iso _{maltoheptaose; C 42 H 70 O 35 ·} 3H 2 O Calculated C: 42.43% H: 6.44% measured value C: 42.78% H: 6.33% cyclo isomalto oct maltoheptaose; C ₄₈ H ₈₀ O ₄₀ · 4H ₂ O calculated C: 42.11% H: 6.48% measured value C: 42.37% H: 6.24% cyclo iso martenot na _{ose; C 54 H 90 O 45 ·} 5H 2 O calculated C: 41.86% H: 6.51 % Measured value C: 41.53% H: 6.18% 2. The molecular weight was obtained from data of mass spectrum analysis using a mass spectrometer 80B manufactured by Hitachi, Ltd .; cycloisomaltoheptaose; 113 4 cycloisomaltooctaose; 12 9 6 cycloisomaltononaose; 144 8, all of which agreed with the values deduced from the molecular formula.

【００１１】3. 融点は、やなぎもと社製の融点測定機
により測定した結果、明確に融解せず、下記の温度域で
変色したので、分解温度を示したが、夫々、 サイクロイソマルトヘプタオース；234〜238℃ サイクロイソマルトオクタオース；238〜241℃ サイクロイソマルトノナオース ；239〜242℃ であった。3. The melting point was measured by a melting point measuring device manufactured by Yanagimoto Co., Ltd. As a result, it did not melt clearly and discolored in the following temperature range, indicating the decomposition temperature. Ace; 234-238 ° C Cycloisomaltooctaose; 238-241 ° C Cycloisomaltononaose; 239-242 ° C.

【００１２】4. 紫外線吸収スペクトルは、日立製作社
製の分光光度計 775で測定した結果、いずれも特徴的な
吸収は認められなかった。従ってアミノ基、カルボキシ
ル基等の官能基は持っていないことが示唆された。 5. 該物質の外赤外線吸収スペクトルを日本分光社製IR
スペクトルメーターモデルFT/IR-7300で測定した結果を
図１に示した。図１において、Ａ、Ｂ、Ｃは夫々グルコ
ースの環状7量体、8量体、9量体を示す。その結果、い
ずれもα−1、6結合に特有の917±2cm^-14.1と768±1cm
^-14.1に吸収ピークを示した。従って、該オリゴ糖がα
−1、6結合を有していることが示唆された。4. The ultraviolet absorption spectrum was measured with a spectrophotometer 775 manufactured by Hitachi, Ltd., and no characteristic absorption was observed. Therefore, it was suggested that it did not have a functional group such as an amino group and a carboxyl group. 5. Determine the external infrared absorption spectrum of the substance by IR
FIG. 1 shows the results of measurement with a spectrum meter model FT / IR-7300. In FIG. 1, A, B, and C represent cyclic heptamer, octamer, and 9-mer of glucose, respectively. As a result, both 917 ± 2cm ^-1 4.1 and 768 ± 1cm specific to α-1, 6 bond
^The absorption peak was shown at ^-1 4.1. Therefore, the oligosaccharide is α
It was suggested to have -1,6 bonds.

【００１３】6. 溶剤に対する溶解性は、いずれのオリ
ゴ糖も室温で最低20mg/ml以上の濃度で水に溶けた。 7. 呈色反応は、いずれのオリゴ糖もソモギ−ネルソン
法で発色しなかったことから、還元末端が存在していな
いことを強く示唆している。 8. 該物質は、いずれも中性の白色物質である。6. Regarding solubility in solvents, all oligosaccharides were soluble in water at room temperature at a concentration of at least 20 mg / ml or more. 7. In the color reaction, none of the oligosaccharides developed color by the Somogi-Nelson method, which strongly suggests that no reducing end is present. 8. The substances are all neutral white substances.

【００１４】9. 該物質の日本電子社製のNMRスペクトル
メーターモデルNM-FX200による13C-NMR分析の結果から
いずれも、6本のシグナルが認められただけであって、
環状構造を支持していた。また、イソマルトヘプタオー
スの解析から、該物質の結合様式がα−1、6結合である
こと強く示唆された。次に、該物質の酵素的解析結果を
示す。9. From the result of 13C-NMR analysis of the substance by an NMR spectrometer model NM-FX200 manufactured by JEOL Ltd., only six signals were observed in each case.
It supported an annular structure. In addition, the analysis of isomaltheptaose strongly suggested that the binding mode of the substance was α-1,6 bond. Next, the results of enzymatic analysis of the substance are shown.

【００１５】10. 図2に示したように、1％濃度の該物質
に対してエキソ型デキストラナーゼであるグルコデキス
トラナーゼを40℃で24時間作用させたが、全く水解され
なかった。なお、同条件下でイソマルトヘキサオース及
びイソマルトヘプタオースは、完全に水解された。従っ
て直鎖イソマルトオリゴ糖ではないことを示唆してい
る。10. As shown in FIG. 2, glucodextranase, which is an exo-type dextranase, was allowed to act on the substance at a concentration of 1% at 40 ° C. for 24 hours, but was not hydrolyzed at all. Under the same conditions, isomaltohexaose and isomaltoheptaose were completely hydrolyzed. Therefore, it is suggested that it is not a linear isomaltoligosaccharide.

【００１６】11. １％濃度の該物質に対しエンド型デキ
ストラナーゼを作用させたところグルコース及びイソマ
ルトースにまで分解された。従って、これらのオリゴ糖
は、グルコースを唯一の構成糖としており、かつα−
1、6結合のみからなることを示唆している。 以上1.〜11.までの結果より、該物質は、いずれもグル
コース7〜9分子がα−1、6 結合した、環状オリゴ糖で
あると判断された。なお、これら環状イソマルトオリゴ
糖の構造式は、次の通りである。11. When endo-dextranase was allowed to act on the substance at a concentration of 1%, it was degraded to glucose and isomaltose. Therefore, these oligosaccharides have glucose as the only constituent sugar and have α-
It suggests that it consists of only 1,6 bonds. From the results of 1. to 11. above, it was determined that all of the substances were cyclic oligosaccharides in which 7 to 9 glucose molecules were α-1,6 linked. The structural formulas of these cyclic isomaltoligosaccharides are as follows.

【００１７】[0017]

【化２】 Embedded image

【００１８】以上詳述した如く、該環状オリゴ糖は、従
来公知の環状オリゴ糖とはその性質を異にし、グルコー
スのα−1、6結合からなる、環状オリゴ糖である点で全
く新しい環状オリゴ糖である。本物質は、環状構造であ
るため、包接作用を有しており、サイクロデキストリン
とは、異なったサイズの物質の安定化、可溶化等に有用
である。そして、具体的には医薬品、食品等の包接剤に
用いられる。As described in detail above, the cyclic oligosaccharide has a property different from that of a conventionally known cyclic oligosaccharide, and is a completely new cyclic oligosaccharide having a α-1,6 bond of glucose. Oligosaccharides. Since this substance has a cyclic structure, it has an inclusion function, and is useful for stabilizing and solubilizing substances of different sizes from cyclodextrin. And, specifically, it is used as a clathrate for pharmaceuticals, foods and the like.

【００１９】次に、本発明の新規な環状イソマルトオリ
ゴ糖合成酵素の酵素化学的性質について述べる。 作用 デキストラン等のα−１、６結合よりなるグルコースポ
リマーに作用し、分子内糖転移反応によりサイクロイソ
マルトオリゴ糖を生成する。Next, the enzymatic properties of the novel cyclic isomatooligosaccharide synthase of the present invention will be described. Action Acts on a glucose polymer composed of α-1,6 linkages such as dextran to produce cycloisomaltooligosaccharides by an intramolecular transglycosylation reaction.

【００２０】基質特異性 α−１、６結合を主鎖とするデキストランには作用する
が、構造中に一部グルコースのα−１、６結合を有す
る、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ ｐＨ５．５付近で作用し、ｐＨ４．５〜８．５の範囲で
安定である。作用適温の範囲 45℃付近に作用適温を有する。 温度等による失活の条件 15分処理で40℃まで安定であり、50℃以上15分間の処理
によりほぼ失活する。 阻害及び活性化 Cu ²⁺ 、Hg ²⁺ で95％以上阻害され、Ca ²⁺ により約60％、Sr
²⁺ 、Ba ²⁺ 、Ni ²⁺ 、Mn ²⁺ 、Zn ²⁺ 及びMg ²⁺ で約30-40％活性
化される。 分子量 SDS PAGE法で、98,000である。 精製法 1％デキストラン40（名糖産業社製）、1％ペプトン（極
東製薬工業社製）、0.5％NaCl及び0.1％イーストエキス
（ディフコ社製）からなる液体培地（水道水使用、pH7.
0）100mlを500ml容坂口フラスコに入れ、120℃で20分
間、殺菌処理を行った。これに、バチルス・エスピーＴ
−３０４０菌株（FERM BP-4132）保存スラントより１白
金耳接種し、30℃で１日間振盪培養した。本培養液1000
mlを上記と同様の培地組成と殺滅菌条件により調製した
300Lの培地を含有する500L容タンクに接種し、30℃、0.
25vvm、70rpmの条件で３日間通気攪拌培養を行なった。
培養終了後、培養液300Lをマイクローザを用いた膜処理
により除菌し、得られた除菌液をさらに分子量6000カッ
トのフォロファイバーにより6.3Lにまで濃縮した後、濃
縮液を900mlずつ−20℃に凍結保存した。900mlの濃縮液
を用いて、環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の精製を行
なった。まず、本濃縮液を解凍後、1mM EDTA含有の10mM
リン酸緩衝液（pH7.0）に対して4℃で１晩透析処理を行
なった。透析物 を遠心分離して不溶物を除去した後、上
澄液を同緩衝液で平衡化したDEAE−セファロースCL6Bカ
ラムにアプライした。同緩衝液で洗浄後、0〜0.8MのNaC
l濃度勾配により吸着タンパク質を溶出した。集めた活
性画分320mlに対して、終濃度1.0Mになるように硫安を
加え、遠心分離により不溶物を除去した。上澄液を以下
の操作による分取用HPLCで精製した。上澄液を1.0M硫
安、10mM EDTA含有の100mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平
衡化したTSKgel phenyl5PWカラムにアプライし、同緩衝
液で洗浄後、1.0〜0Mの硫安濃度勾配により吸着タンパ
ク質を溶出した。集めた活性画分150mlに対して、終濃
度1.0Mになるように硫安を加え、遠心分離により不溶物
を除去した。上澄液を再度1.0M硫安、10mM EDTA含有の1
00mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したTSKgel phenyl
5PWカラムにアプライし、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液
中の硫安濃度を0.3Mまで下げたステップグラジエントで
１度洗浄した後、0.3〜0Mの硫安濃度勾配により吸着タ
ンパク質を溶出した。集めた活性画分88mlを限外濾過で
約1mlに濃縮した後、1mM EDTA含有の10mMリン酸緩衝液
（pH7.0）20mlを加えて塩濃度を稀釈した。本溶液を1mM
EDTA含有の10mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したTS
Kgel DEAE5PWカラムにアプライし、同緩衝液で洗浄後、
0.15MのNaClで１度洗浄した後、0.15〜0.4MのNaCl濃度
勾配により吸着タンパク質を溶出した。集めた活性画分
12mlを0.9mlまで限外濃縮した。10mM EDTA及び200mM Na
Cl含有の100mMリン酸緩衝液（pH7.0）で平衡化したTSKg
elG300SWカラムに0.3mlずつ酵素溶液をアプライし、同
緩衝液により溶出した。本操作を残り0.6mlについて同
様に行なった（0.3mlずつ２回）。得られた活性画分を
集めて精製を終了した。本画分をSDS PAGEに供すると、
分子量98,000 付近に唯一のバンドが認められる。 力価測定法 100mM酢酸緩衝液（pH5.5）0.40mlと酵素液0.10mlを混合
し、40℃で３分間予備加温する。基質として4％デキス
トラン40水溶液0.50mlを加え良く混合し、そのまま正確
に１時間、40℃で保温する。1時間後、沸騰水中で５分
間煮沸することにより、反応を停止する。反応液を糖質
分析用カラム（TSKgel Amide80；東ソー社製）を用いた
HPLCにより分析し、生成したサイクロイソマルトオリゴ
糖を定量する。本条件下で１分間に1μモルのサイクロ
イソマルトオリゴ糖生成を触媒す る酵素量を１単位とす
る。 Substrate specificity: It acts on dextran having an α-1,6 bond as a main chain, but does not act on amylopectin, pullulan, etc., which partially have α-1,6 bonds of glucose in the structure. Optimum pH and stable pH It works around pH 5.5 and is stable in the range of pH 4.5 to 8.5. Working temperature range The working temperature range is around 45 ° C. Deactivation condition by temperature, etc.Stable up to 40 ° C by 15 minutes treatment, treatment at 50 ° C or more for 15 minutes
Is almost inactivated. Inhibition and activation 95% or more inhibition by Cu ²⁺ and Hg ²⁺ , about 60% by Ca ²⁺ , Sr
Approximately 30-40% activity on ²⁺ , Ba ²⁺ , Ni ²⁺ , Mn ²⁺ , Zn ²⁺ and Mg ²⁺
Be transformed into Its molecular weight is 98,000 as determined by SDS PAGE. Purification method: 1% dextran 40 (Meito Sangyo Co., Ltd.), 1% peptone (Polar
Higashi Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.5% NaCl and 0.1% yeast extract
(Difco) liquid medium (using tap water, pH 7.
0) Put 100ml into 500ml Sakaguchi flask, 120 ℃ for 20 minutes
Meanwhile, a sterilization treatment was performed. In addition, Bacillus SP T
-3040 strain (FERM BP-4132) 1 white from stock slant
A gold ear was inoculated and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day. Main culture 1000
ml was prepared using the same medium composition and sterilization conditions as above.
Inoculate a 500 L tank containing 300 L of medium, 30 ° C, 0.
Aeration and agitation culture was performed for 3 days under the conditions of 25 vvm and 70 rpm.
After cultivation, membrane treatment of 300 L of culture solution using Microza
And the resulting eradication solution is further cut to a molecular weight of 6,000 c.
After concentrating to 6.3 L with forofiber,
The condensed liquid was stored frozen at −20 ° C. in 900 ml portions. 900ml concentrate
To purify cyclic isomaltooligosaccharide synthase
became. First, after thawing this concentrate, 10 mM containing 1 mM EDTA
Dialyze against phosphate buffer (pH 7.0) at 4 ° C overnight.
became. After centrifuging the dialysate to remove insolubles,
DEAE-Sepharose CL6B was used to equilibrate the supernatant with the same buffer.
I applied to the rum. After washing with the same buffer, 0 to 0.8 M NaC
The adsorbed protein was eluted by a 1 concentration gradient. Activities collected
Ammonium sulfate to a final concentration of 1.0 M
In addition, insolubles were removed by centrifugation. Supernatant below
The product was purified by preparative HPLC according to the procedure described above. 1.0 M sulfuric acid
Low in 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 10 mM EDTA.
Apply to equilibrated TSKgel phenyl5PW column and buffer
After washing with liquid, the adsorption
Substance was eluted. Final concentration of 150 ml of collected active fraction
Add ammonium sulfate to a concentration of 1.0M and centrifuge to remove insolubles.
Was removed. The supernatant was reconstituted with 1.0 M ammonium sulfate and 10 mM EDTA.
TSKgel phenyl equilibrated with 00mM phosphate buffer (pH 7.0)
Apply to a 5PW column, wash with the same buffer,
With a step gradient in which the ammonium sulfate concentration in the
After washing once, the adsorber was treated with a 0.3 to 0 M ammonium sulfate concentration gradient.
The protein was eluted. Ultrafiltration of 88 ml of the collected active fraction
After concentrating to about 1 ml, 10 mM phosphate buffer containing 1 mM EDTA
(PH 7.0) 20 ml was added to dilute the salt concentration. 1 mM of this solution
TS equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing EDTA
After applying to Kgel DEAE5PW column and washing with the same buffer,
After washing once with 0.15M NaCl, 0.15-0.4M NaCl concentration
The adsorbed protein was eluted by the gradient. Active fraction collected
12 ml was ultraconcentrated to 0.9 ml. 10 mM EDTA and 200 mM Na
TSKg equilibrated with 100 mM phosphate buffer containing Cl (pH 7.0)
Apply 0.3 ml of the enzyme solution to the elG300SW column, and
Eluted with buffer. Repeat this operation for the remaining 0.6 ml.
(0.3 ml twice). The obtained active fraction
Collected and finished purification. When this fraction is subjected to SDS PAGE,
Only one band is observed around 98,000 molecular weight. Titration method 100mM acetate buffer (pH 5.5) mixed 0.40ml enzyme solution 0.10ml
And preheat at 40 ° C for 3 minutes. 4% dex as substrate
Add 0.50 ml of Tolan 40 aqueous solution and mix well.
For 1 hour at 40 ° C. After 1 hour, 5 minutes in boiling water
The reaction is stopped by boiling for a while. Carbohydrate reaction solution
An analytical column (TSKgel Amide80; manufactured by Tosoh Corporation) was used.
Cycloisomaltooligo produced by HPLC analysis
Quantify the sugar. Under these conditions, 1 μmol cyclone per minute
To the amount of enzyme you catalyze isomalto-oligosaccharides produced as one unit
You.

【００２１】以上詳述した如く、本酵素は、公知の環状
オリゴ糖合成酵素であるサイクロデキストリングルカノ
トランスフェラーゼ（以下、ＣＧＴａｓｅと略称す
る。；ＥＣ ２．４．１．１９）、サイクロイヌロオリ
ゴ糖合成酵素（以下、ＩＦＴａｓｅと略称する。）及び
サイクロソフォラオース合成酵素とはその性質を異に
し、デキストランよりグルコースのα−１、６結合から
なる環状オリゴ糖を生成する点で新規な酵素である。
尚、本酵素は、ＣＧＴａｓｅ及びＩＦＴａｓｅと同様に
分子内糖転移反応以外に、分子間糖転移反応により、サ
イクロイソマルトオリゴ糖と適当なＯＨアクセプターか
らＯＨアクセプターが結合したイソマルトオリゴ糖を生
成する反応（カップリング反応）及びイソマルトオリゴ
糖から種々の重合度のイソマルトオリゴ糖を生成する反
応（不均化反応）を触媒する多機能酵素である。As described in detail above, the present enzyme is a known cyclic oligosaccharide synthase, cyclodextrin glucanotransferase (hereinafter abbreviated as CGTase; EC 2.4.1.19), cycloinulooligo. It is a novel enzyme that differs from saccharide synthase (hereinafter abbreviated as IFTase) and cyclosophorose synthase in that it produces a cyclic oligosaccharide composed of α-1,6 bonds of glucose from dextran. is there.
In addition to the intramolecular glycosyltransfer reaction as well as the CGTase and IFTase, the present enzyme produces an isomaltoligosaccharide in which a cycloisomaltooligosaccharide and an appropriate OH acceptor are combined with an OH acceptor by an intermolecular glycosyltransfer reaction ( It is a multifunctional enzyme that catalyzes a reaction (coupling reaction) and a reaction (disproportionation reaction) for producing isomato-oligosaccharides of various degrees of polymerization from isomalt-oligosaccharides.

【００２２】次に、本酵素の製造法について述べる。本
発明において使用される微生物としては、バチルス属に
属し環状イソマルトオリゴ糖合成酵素を生成するもので
あれば、如何なるものでもよく、例えば、バチルス・エ
スピー．Ｔ−３０４０菌株等が挙げられる。Ｔ−３０４
０株は、土壌中から、スクリーニングして得た野性株で
あり、以下に本菌株の菌学的性質を示す。Next, a method for producing the present enzyme will be described. The microorganism used in the present invention may be any microorganism as long as it belongs to the genus Bacillus and produces a cyclic isomatooligosaccharide synthase. For example, Bacillus sp. T-3040 strain and the like. T-304
The 0 strain is a wild strain obtained by screening from the soil, and the bacteriological properties of the present strain are shown below.

【００２３】 (1)形態 1.形態 桿菌 2.運動性 認められる 3.胞子 有 胞子嚢 膨出 形 楕円形 位置 中立〜亜端立 4.グラム染色性 ＋ (2)生育状態 1.肉汁寒天平板培養 平滑、色素産生せず 2.肉汁寒天斜面培養 平滑、周辺なめらか、色素産生せず (3)生理学的性質 1.硝酸塩の還元 − 2.脱窒反応 − 3.ＭＲテスト − 4.ＶＰテスト − 5.インド−ルの生成 − 6.硫化水素の生成 − 7.デンプンの加水分解 ＋ 8.クエン酸の利用 − 9.無機窒素源の利用 硝酸塩 − アンモニウム塩 ＋ 10.ウレア−ゼ − 11.オキシダ−ゼ − 21.カタラ−ゼ ＋ 13.生育の範囲 温度 １０〜３７℃ 14.酸素に対する態度 好気的 15.Ｏ−Ｆテスト − 16.糖類に対する態度 酸の生成 ガスの生成 (1)L-アラビノ−ス ＋ − (2)D-キシロ−ス − − (3)D-グルコ−ス ＋ − (4)D-マンノ−ス − − (5)D-フラクト−ス − − (6)D-ガラクト−ス ＋ − (7)麦芽糖 ＋ − (8)ショ糖 ＋ − (9)乳糖 ＋ − (10)トレハロ−ス ＋ − (11)D-ソルビット − − (12)D-マンニット − − (13)イノシット − − (14)グリセリン − − (15)デンプン ＋ − Ｔ−３０４０菌株は、胞子を形成するグラム陽性桿菌で
あることからバチルス属に属する細菌であると同定し
た。更に、種の同定のために、バージェイズ・マニュア
ル・オブ・システィマティック・バクテリオロジー第２
巻に基づき、種々検討したが、種の確定までには至らな
かったため、バチルス属に属する１菌株として分類同定
し、バチルス・エスピー．Ｔ−３０４０とした。 な
お、バチルス・エスピー．Ｔ−３０４０は、工業技術院
生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭＢＰ−４１３２とし
て寄託されている。(1) Morphology 1. Morphology Bacteria 2. Motility observed 3. Spores with sporangia Swelling Oval position Neutral to subvertice 4. Gram stainability + (2) Growth state 1. Gravy agar plate Culture Smooth, no pigment production 2. Gravy agar slant culture Smooth, peripheral smooth, no pigment production (3) Physiological properties 1. Nitrate reduction-2. Denitrification reaction-3. MR test-4. VP test- 5. Formation of indole-6. Formation of hydrogen sulfide-7. Hydrolysis of starch + 8. Use of citric acid-9. Use of inorganic nitrogen source Nitrate-Ammonium salt + 10. Ureaase-11. Oxida -Ze-21. Catalase + 13. Range of growth Temperature 10-37 ° C 14. Attitude to oxygen Aerobic 15. OF test-16. Attitude to saccharides Acid production Gas production (1) L- Arabinose +-(2) D-xylose--(3) D-glucose +-(4) D-mannose--(5) D-fructoose- (6) D-galactose + − (7) Maltose + − (8) Sucrose + − (9) Lactose + − (10) Trehalose + − (11) D-Sorbit − − (12) D- Mannitol-(13) Inosit--(14) Glycerin--(15) Starch +-T-3040 strain was identified as a bacterium belonging to the genus Bacillus because it is a spore-forming gram-positive rod. In addition, for species identification, the Burj Jays Manual of Sistmatic Bacteriology II
Various studies were conducted on the basis of the volume, but the species was not determined. Therefore, the strain was classified and identified as one strain belonging to the genus Bacillus, and Bacillus sp. T-3040. In addition, Bacillus sp. T-3040 has been deposited as FERMBP-4132 at the National Institute of Bioscience and Biotechnology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.

【００２４】本発明における微生物の培養は、一般微生
物の好気的培養で採用される方法と同じ方法が用いられ
るが、通常は、液体培地による振盪培養法あるいは通気
撹拌培養法等が用いられる。培地としては、例えば、適
当な窒素源（例えば、ペプトン、ポリペプトン、バクト
トリプトン等のカゼイン分解物あるいはソイトン等の大
豆タンパク質分解物等）、炭素源（例えばグルコース、
グリセリン等の糖質類）、そして必要に応じて、酵母エ
キス、リンボフラビン等のビタミン類及びリン酸塩、マ
グネシウム塩、塩化ナトリウム、微量金属等のミネラル
類、そして本物質の原料となるデキストラン等を含んだ
ものが用いられる。ｐＨは、本菌が成育するｐＨ領域で
あればいずれでもよく、通常は、６〜８のｐＨ領域が好
ましい。For culturing microorganisms in the present invention, the same method as employed in aerobic cultivation of general microorganisms is used, but usually, a shaking culture method using a liquid medium or an aeration stirring culture method is used. As the medium, for example, an appropriate nitrogen source (for example, casein hydrolyzate such as peptone, polypeptone, bactotripton, or soybean protein hydrolyzate such as soytone), a carbon source (for example, glucose,
Carbohydrates such as glycerin) and, if necessary, vitamins such as yeast extract and limboflavin and minerals such as phosphates, magnesium salts, sodium chloride and trace metals, and dextran used as a raw material of the substance. Is used. The pH may be any pH range in which the present bacterium grows, and usually, a pH range of 6 to 8 is preferable.

【００２５】培養条件は、例えば、通常２０〜４０℃、
好ましくは３０℃で、１６時間〜４日間好ましくは３日
間振盪培養または通気撹拌培養を行なう。以上のように
して得た培養物を用いて例えば、以下に示す酵素精製工
程により該環状オリゴ糖合成酵素を得る。上記培養物か
ら該酵素を分離するには遠心分離、膜濃縮等により除菌
及び濃縮するのみでよく、更に、必要に応じて、通常用
いられる酵素の精製法により上記粗酵素液から精製標品
を得る。Culture conditions are, for example, usually 20 to 40 ° C.
Shaking culture or aeration-agitation culture is preferably performed at 30 ° C. for 16 hours to 4 days, preferably 3 days. Using the culture thus obtained, the cyclic oligosaccharide synthase is obtained, for example, by the following enzyme purification step. To separate the enzyme from the culture, it is only necessary to remove and concentrate the bacteria by centrifugation, membrane concentration, etc., and, if necessary, further, a purified sample from the crude enzyme solution by a commonly used enzyme purification method. Get.

【００２６】本酵素の精製法は、通常の酵素分離精製方
法であれば如何なる方法でもよく、本製造法の場合、除
菌液を後記実施例に示した精製方法に従って処理するこ
とにより、高純度の環状オリゴ糖合成酵素標品を得るこ
とが出来る。更に、本酵素をデキストランに作用させて
サイクロイソマルトオリゴ糖を製造する。The method for purifying the present enzyme may be any method as long as it is an ordinary enzyme separation and purification method. In the case of the present production method, a high purity can be obtained by treating the sterilized solution according to the purification method described in Examples described later. Can be obtained. Further, the present enzyme is allowed to act on dextran to produce cycloisomaltooligosaccharides.

【００２７】反応条件は、温度１０〜６０℃、好ましく
は４０℃、ｐＨ４．５〜８．０、好ましくは５．０〜
６．５の範囲で、反応時間１０〜７２時間、好ましくは
４８時間行なう。また必要により反応液の撹拌及びメタ
ノール、エタノール等の有機溶媒の反応液への添加を行
なう。なお、本製造法の場合、精製酵素を用いずに、先
に述べた培養液の除菌濃縮液を用いても精製酵素と同等
の効率でサイクロイソマルトオリゴ糖を生成することが
できる。反応液より該オリゴ糖を採取する手段として
は、オリゴ糖精製法であれば如何なる方法でもよい。例
えば、冷却処理、有機溶媒添加処理、活性炭処理、ある
いは特異的に環状オリゴ糖を吸着するカラムクロマトグ
ラフィー、活性炭カラムクロマトグラフィー等の公知方
法を単独もしくは適宜組合わせて分離精製することがで
きる。The reaction conditions are a temperature of 10 to 60 ° C., preferably 40 ° C., a pH of 4.5 to 8.0, and preferably 5.0 to 8.0.
The reaction is carried out within the range of 6.5 to 10 to 72 hours, preferably 48 hours. If necessary, the reaction solution is stirred and an organic solvent such as methanol or ethanol is added to the reaction solution. In the case of the present production method, cycloisomaltooligosaccharides can be produced with the same efficiency as that of the purified enzyme even if the above-mentioned eradication concentrate of the culture solution is used without using the purified enzyme. As a means for collecting the oligosaccharide from the reaction solution, any method may be used as long as it is an oligosaccharide purification method. For example, separation and purification can be performed by a known method such as a cooling treatment, an organic solvent addition treatment, an activated carbon treatment, or a column chromatography specifically adsorbing a cyclic oligosaccharide, or an activated carbon column chromatography, alone or in an appropriate combination.

【００２８】[0028]

【実施例】以下に、実施例を挙げて本発明を更に具体的
に説明する。ただし、本発明はこれらの実施例により限
定されるものではない。 ［実施例１］１％デキストラン４０（名糖産業社製）、
１％ペプトン（極東製薬工業社製）、０.５％ ＮａＣｌ
及び０.１％イーストエキス（ディフコ社製）からなる
液体培地（水道水使用、ｐＨ ７.０)１００ｍｌを５０
０ｍｌ容坂口フラスコに分注し、１２０℃で２０分間殺
菌処理を行なったものに、バチルス・エスピー．Ｔ−３
０４０菌株（ＦＥＲＭ ＢＰ−４１３２)保存スラント
より１白金耳接種し、３０℃で１日間振盪培養して培養
物を得た。The present invention will be described more specifically below with reference to examples. However, the present invention is not limited by these examples. [Example 1] 1% dextran 40 (manufactured by Meito Sangyo),
1% peptone (Kyokuto Pharmaceutical Co., Ltd.), 0.5% NaCl
100 ml of a liquid medium (using tap water, pH 7.0) containing 0.1% yeast extract (manufactured by Difco Co.)
The mixture was dispensed into a 0 ml Sakaguchi flask, sterilized at 120 ° C. for 20 minutes, and added to Bacillus sp. T-3
040 strain (FERM BP-4132) was inoculated with one loopful of stock slant and cultured with shaking at 30 ° C. for 1 day to obtain a culture.

【００２９】本培養液１０００ｍｌを上記と同様の培地
組成と殺滅菌条件により調製した３００ｌの培地を含有
する５００ｌ容タンクに接種し、３０℃、０.２５ｖｖ
ｍ、７０ｒｐｍの条件で３日間通気撹拌培養を行ない、
培養終了後、培養液３００ｌをマイクローザ（旭化成工
業社製、限外濾過膜、登録商標名）を用いた膜処理によ
り除菌し、得られた除菌液を更に分子量６０００カット
のフォロファイバーにより６．３ｌに迄濃縮した後、濃
縮液を９００ｍｌずつ−２０℃に凍結保存した。1000 ml of the main culture was inoculated into a 500-liter tank containing 300 liters of a medium prepared under the same medium composition and sterilization conditions as above, and then inoculated at 30 ° C. and 0.25 vv.
m, aeration and agitation culture for 3 days under the conditions of 70 rpm,
After completion of the culture, 300 l of the culture solution was sterilized by membrane treatment using a Microza (manufactured by Asahi Kasei Kogyo Co., Ltd., ultrafiltration membrane, registered trademark), and the obtained sterilized solution was further passed through a 6000 fiber cut-off forofiber. After concentrating to 6.3 l, the concentrated solution was frozen and stored at -20 ° C in 900 ml portions.

【００３０】９００ｍｌの濃縮液を用いて、環状イソマ
ルトオリゴ糖合成酵素の精製を行なった。先ず、本濃縮
液を解凍後、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭリン酸緩
衝液(ｐＨ７．０)に対して４℃で１晩透析処理を行なっ
た。透析物を遠心分離して不溶物を除去した後、上清液
を同緩衝液で平衡化したＤＥＡＥーセファロースＣＬ６
Ｂカラムにアプライした。同緩衝液で洗浄後、０〜０．
８ＭのＮａＣｌ濃度勾配により吸着蛋白質を溶出した。
集めた活性画分３２０ｍｌに対して、終濃度１．０Ｍに
なるように硫安を加え、遠心分離により不溶物を除去し
た。上清液を以下の操作による分取用ＨＰＬＣで精製し
た。上清液を１．０Ｍ硫安、１０ｍＭＥＤＴＡ含有の１
００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)で平衡化したＴＳＫ
ｇｅｌＰｈｅｎｙｌ５ＰＷカラムにアプライし、同緩衝
液で洗浄後、１．０〜０Ｍの硫安濃度勾配により吸着蛋
白質を溶出した。Using 900 ml of the concentrated solution, the cyclic isomatooligosaccharide synthase was purified. First, after thawing this concentrated solution, a dialysis treatment was performed overnight at 4 ° C. against a 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM EDTA. After the dialysate was centrifuged to remove insolubles, the supernatant was equilibrated with the same buffer to obtain DEAE-Sepharose CL6.
It was applied to the B column. After washing with the same buffer, 0 to 0.
The adsorbed protein was eluted with an 8M NaCl concentration gradient.
Ammonium sulfate was added to 320 ml of the collected active fractions to a final concentration of 1.0 M, and insolubles were removed by centrifugation. The supernatant was purified by preparative HPLC according to the following procedure. The supernatant was washed with 1.0 M ammonium sulfate and 1 mM containing 10 mM EDTA.
TSK equilibrated with 00 mM phosphate buffer (pH 7.0)
After applying to a gelPhenyl5PW column and washing with the same buffer, the adsorbed protein was eluted with a 1.0 to 0 M ammonium sulfate concentration gradient.

【００３１】集めた活性画分１５０ｍｌに対して、終濃
度１．０Ｍになるように硫安を添加し、遠心分離により
不溶物を除去した。上清液を再度１．０Ｍ硫安、１０ｍ
ＭＥＤＴＡ含有の１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)
で平衡化したＴＳＫｇｅｌＰｈｅｎｙｌ５ＰＷカラムに
アプライし、同緩衝液で洗浄後、同緩衝液中の硫安濃度
を０．３Ｍ迄下げたステップグラジエントで１度洗浄し
た後、０．３〜０Ｍの硫安濃度勾配により吸着タンパク
質を溶出した。Ammonium sulfate was added to 150 ml of the collected active fraction to a final concentration of 1.0 M, and insolubles were removed by centrifugation. The supernatant was re-dissolved in 1.0 M ammonium sulfate, 10 m
100 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing MEDTA
After applying to a TSKgelPhenyl5PW column equilibrated in step 1 and washing with the same buffer solution, washing once with a step gradient in which the ammonium sulfate concentration in the same buffer solution was reduced to 0.3 M, and then using a 0.3 to 0 M ammonium sulfate concentration gradient The adsorbed protein was eluted.

【００３２】集めた活性画分８８ｍｌを限外濾過で約１
ｍｌに濃縮した後、１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭリ
ン酸緩衝液(ｐＨ７．０)２０ｍｌを加えて塩濃度を稀釈
した。本溶液を１ｍＭ ＥＤＴＡ含有の１０ｍＭリン酸
緩衝液(ｐＨ７．０)で平衡化したＴＳＫｇｅｌ ＤＥＡ
Ｅ５ＰＷカラムにアプライし、同緩衝液で洗浄後、０．
１５ＭのＮａＣｌで１度洗浄した後、０．１５〜０．４
ＭのＮａＣｌ濃度勾配により吸着タンパクを溶出した。The collected active fraction (88 ml) was subjected to ultrafiltration for about 1 hour.
After concentration to 20 ml, 20 ml of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM EDTA was added to dilute the salt concentration. This solution was TSKgel DEA equilibrated with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 1 mM EDTA.
Apply to an E5PW column, wash with the same buffer,
After washing once with 15 M NaCl, 0.15 to 0.4
The adsorbed protein was eluted with an M NaCl concentration gradient.

【００３３】集めた活性画分１２ｍｌを０．９ｍｌ迄限
外濃縮した。１０ｍＭ ＥＤＴＡ及び２００ｍＭ Ｎａ
Ｃｌ含有の１００ｍＭリン酸緩衝液(ｐＨ７．０)で平衡
化したＴＳＫｇｅｌ Ｇ３０００ＳＷカラムに、０．３
ｍｌずつ酵素溶液をアプライし、同緩衝液により溶出し
た。本操作を残り０．６ｍｌについて同様に行なった
(０．３ｍｌずつ２回)。得られた活性画分を集めてＳＤ
Ｓ ＰＡＧＥに供したところ、シングルバンドを示した
ことから、他の夾雑蛋白質は除去されたと判断し精製を
終了させた。12 ml of the collected active fraction was ultra-concentrated to 0.9 ml. 10 mM EDTA and 200 mM Na
A 0.3 mM TSKgel G3000SW column equilibrated with 100 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing Cl was used.
The enzyme solution was applied in ml portions and eluted with the same buffer. This operation was similarly performed for the remaining 0.6 ml.
(2 times with 0.3 ml each). The obtained active fractions are collected and SD
When subjected to S PAGE, a single band was shown. Therefore, it was judged that other contaminating proteins had been removed, and the purification was terminated.

【００３４】この操作により、精製環状イソマルトオリ
ゴ糖合成酵素１２ｍｇを得た。そして、本精製酵素の理
化学的性質は前記の通りであった。本精製酵素をデキス
トランとインキュベーションしたところ、デキストラン
から環状イソマルトオリゴ糖の生成が確認された。 ［実施例２］バチルス・エスピー．Ｔ−３０４０株の培
養液３００ｌをマイクローザを用いた膜処理により除菌
し、得られた除菌液を更に分子量６０００カットのフォ
ロファイバーにより６．３ｌに迄濃縮した後、濃縮液を
９００ｍｌずつ−２０℃に凍結保存した。濃縮液の一部
を、デキストラン（名糖産業社製）１００ｇを１０ｍＭ
リン酸緩衝液(ｐＨ６．５)１０ｌに溶解した水溶液と混
合し、４０℃で４８時間インキュベーションを行なっ
た。活性炭を加えて煮沸することにより反応を停止さ
せ、かつ未反応のデキストランを吸着させた。活性炭を
除去した上清液を脱イオン水で平衡化した活性炭カラム
にアプライし、脱イオン水で洗浄後、エタノール濃度勾
配により吸着したオリゴ糖を溶出した。環状オリゴ糖画
分を集め、濃縮した後、脱イオン水で平衡化したＯＤＳ
カラムにアプライした。脱イオン水で洗浄後、エタノー
ル濃度勾配によりオリゴ糖を溶出し、各環状イソマルト
オリゴ糖画分を集め、凍結乾燥した。By this operation, 12 mg of purified cyclic isomaltooligosaccharide synthase was obtained. The physicochemical properties of the purified enzyme were as described above. When the purified enzyme was incubated with dextran, formation of cyclic isomaltoligosaccharide from dextran was confirmed. Example 2 Bacillus sp. 300 liters of the culture solution of the T-3040 strain was sterilized by membrane treatment using a microza, and the obtained sterilized solution was further concentrated to 6.3 liters with a 6000-cut forofiber, and then 900 ml of the concentrated solution was added. It was stored frozen at -20 ° C. A part of the concentrated solution was prepared by adding 100 g of dextran (manufactured by Meito Sangyo) to 10 mM.
The mixture was mixed with an aqueous solution dissolved in 10 l of a phosphate buffer (pH 6.5) and incubated at 40 ° C. for 48 hours. The reaction was stopped by adding activated charcoal and boiling, and unreacted dextran was adsorbed. The supernatant liquid from which the activated carbon had been removed was applied to an activated carbon column equilibrated with deionized water, washed with deionized water, and the adsorbed oligosaccharide was eluted with an ethanol concentration gradient. ODS equilibrated with deionized water after collecting and concentrating the cyclic oligosaccharide fraction
It was applied to the column. After washing with deionized water, the oligosaccharide was eluted with an ethanol concentration gradient, and each cyclic isomaltooligosaccharide fraction was collected and freeze-dried.

【００３５】得られた環状イソマルトオリゴ糖の重量
は、夫々サイクロイソマルトヘプタオース ２．１ｇ、
サイクロイソマルトオクタオース ４．６ｇ及びサイク
ロイソマルトノナオース １．０ｇであり環状体全体の
収率は、７．７％であった。得られた画分の純度は、Ｈ
ＰＬＣ分析からいずれも９８％以上であり、図３にこれ
らの環状体のＨＰＬＣのプロファイルを示した。The weight of the obtained cyclic isomaltooligosaccharide was 2.1 g of cycloisomaltoheptaose,
4.6 g of cycloisomaltooctaose and 1.0 g of cycloisomaltononanose were obtained, and the overall yield of the cyclic was 7.7%. The purity of the obtained fraction is H
All were 98% or more from the PLC analysis, and FIG. 3 shows the HPLC profiles of these cyclics.

【００３６】ＨＰＬＣ分析は、ＴＳＫ ｇｅｌ Ａｍｉ
ｄｅ（東ソー社製、分配・吸着クロマトグラフィー用充
填カラム）を用いて行なった。Ａは、サイクロイソマル
トヘプタオース画分、Ｂは、サイクロイソマルトオクタ
オース画分、Ｃは、サイクロイソマルトノナオース画分
及びＡは、スタンダードの分析結果である。The HPLC analysis was performed using TSK gel Ami
de (manufactured by Tosoh Corporation, packed column for distribution and adsorption chromatography). A is a cycloisomaltoheptaose fraction, B is a cycloisomaltooctaose fraction, C is a cycloisomaltonononaose fraction, and A is a standard analysis result.

【００３７】[0037]

【発明の効果】本発明により、新規な環状イソマルトオ
リゴ糖合成酵素を提供した。そして、この酵素を用いて
サイクロデキストリンとは異なった理化学的性質を有
し、サイクロデキストリンに比べて種々の長所を有する
新規な環状イソマルトオリゴ糖を極めて簡単な操作で高
純度に効率良く製造することができ、本発明は、産業上
極めて有用な発明である。According to the present invention, a novel cyclic isomatooligosaccharide synthase is provided. Using this enzyme, a novel cyclic isomaltoligosaccharide having physicochemical properties different from that of cyclodextrin and having various advantages over cyclodextrin can be efficiently produced with high purity by a very simple operation. The present invention is an industrially extremely useful invention.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】三種の環状イソマルトオリゴ糖の赤外線吸収ス
ペクトルを示す図である。FIG. 1 is a diagram showing infrared absorption spectra of three kinds of cyclic isomaltoligosaccharides.

【図２】三種の環状イソマルトオリゴ糖の酵素的解析結
果を示す図である。FIG. 2 is a diagram showing the results of enzymatic analysis of three types of cyclic isomatooligosaccharides.

【図３】三種の環状イソマルトオリゴ糖のＨＰＬＣのプ
ロファイルを示す図である。FIG. 3 shows HPLC profiles of three kinds of cyclic isomaltooligosaccharides.

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 19/16 Ｃ１２Ｒ 1:07） (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 C08B 37/00 C12P 19/00 - 19/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)Continuation of the front page (51) Int.Cl. ⁷ identification code FI (C12P 19/16 C12R 1:07) (58) Investigated field (Int.Cl. ⁷ , DB name) C12N 9/00-9/99 C08B 37/00 C12P 19/00-19/64 BIOSIS (DIALOG) MEDLINE (STN) WPI (DIALOG)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 以下の理化学的性質を有する新規な環状
イソマルトオリゴ糖合成酵素。 作用 デキストラン等のα−１，６結合より成るグルコースポ
リマーに作用し、分子内糖転移反応により下記式で表さ
れる環状イソマルトオリゴ糖を生成する。 【化１】 基質特異性 α−１，６結合を主鎖とするデキストランには作用する
が、構造式中に一部グルコースのα−１，６結合を有す
る、アミロペクチン、プルラン等には作用しない。 至適ｐＨ及び安定ｐＨ ｐＨ５．５付近で作用し、ｐＨ４．５〜８．５の範囲で
安定である。1. A novel cyclic isomatooligosaccharide synthase having the following physicochemical properties: Action Acts on a glucose polymer composed of α-1,6 bonds such as dextran to produce a cyclic isomaltoligosaccharide represented by the following formula by an intramolecular transglycosylation reaction. Embedded image Substrate specificity It acts on dextran having an α-1,6 bond as a main chain, but does not act on amylopectin, pullulan, etc., which have α-1,6 bond of glucose in the structural formula. Optimum pH and stable pH It works around pH 5.5 and is stable in the range of pH 4.5 to 8.5. 【請求項２】 バチルス属に属し、請求項１記載の酵素
生産能を有する微生物をデキストラン含有培地に培養
し、培養物より該酵素を採取することを特徴とする新規
な環状イソマルトオリゴ糖合成酵素の製造法。2. A novel cyclic isomatooligosaccharide synthase comprising culturing a microorganism belonging to the genus Bacillus and having the ability to produce an enzyme according to claim 1 in a dextran-containing medium, and collecting the enzyme from the culture. Manufacturing method. 【請求項３】 デキストランに、請求項１記載の酵素を
作用させ環状イソマルトオリゴ糖を生成せしめることを
特徴とする環状イソマルトオリゴ糖の製造法。3. A process for producing cyclic isomaltoligosaccharides, wherein the enzyme according to claim 1 is allowed to act on dextran to produce cyclic isomatooligosaccharides. 【請求項４】 デキストランに、バチルス属に属し請求
項１記載の酵素生産能を有する微生物をデキストラン含
有培地に培養して得られる培養液の除菌混合物を作用さ
せ環状イソマルトオリゴ糖を生成せしめることを特徴と
する環状イソマルトオリゴ糖の製造法。4. A method for producing a cyclic isomatooligosaccharide by allowing dextran to act on a bacterium belonging to the genus Bacillus and culturing the microorganism having the enzyme-producing ability according to claim 1 in a dextran-containing medium. A method for producing a cyclic isomaltooligosaccharide, comprising: