JP3107584B2 - 抗生物質ge2270因子b1、b2、c1、c2、d1、d2、eおよびt - Google Patents

抗生物質ge2270因子b1、b2、c1、c2、d1、d2、eおよびt

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JP3107584B2 JP03069327A JP6932791A JP3107584B2 JP 3107584 B2 JP3107584 B2 JP 3107584B2 JP 03069327 A JP03069327 A JP 03069327A JP 6932791 A JP6932791 A JP 6932791A JP 3107584 B2 JP3107584 B2 JP 3107584B2
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バイオサーチ・イタリア・ソチエタ・ペル・アチオニ
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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】本発明は、抗生物質GE2270因子
1、B2、C1、C2、D1、D2、EおよびTと命名する
新規な抗生物質、それらの付加塩、その製剤学的組成物
および、とくにそれらに対して感受性の微生物を包含す
る感染症の処理における、薬物としてのそれらの使用に
関する。
【0002】本発明の組成物は、また、動物、例えば、
家禽、ブタ、反芻動物などにおける成長促進剤として活
性である。
【0003】本発明の化合物は、プラノビスポラ・ロセ
ア(Planobispora rosea)ATCC
53773またはその抗生物質GE2270産生変異型
または突然変異の培養物から分離される。とくに、それ
らは菌糸体およびまた培養した微生物の発酵ブロス中に
見いだされる。
【0004】プラノビスポラ・ロセア(Planobi
spora rosea)ATCC53773は土の試
料から分離され、そしてブダベスト条約の規定に従い1
988年6月14日にアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション(the American Type
Culture Collection)(ATC
C)、米国マリイランド州20852ロックビレ、パー
クダウン12301に受託された。
【0005】この菌株は受け入れ番号ATCC5377
3を与えられた。
【0006】この菌株は、抗生物質GE2270因子A
と命名された新規な抗生物質と関連して欧州特許出願公
開第359062号(対応する米国特許出願第401,
278)号に既に記載された。
【0007】本発明の化合物は、前述の微生物の菌株
を,常態で最も豊富な分画である、抗生物質GE227
0因子Aと一緒に産生される。
【0008】抗生物質GE2270因子B1、B2
1、C2、D1、D2、EおよびTの産生は、それを産生
することができるプラノビスポラ(Planobisp
ora)菌株、すなわち、プラノビスポラ・ロセア(P
lanobispora rosea)ATCC537
73またはその抗生物質GE2270産生変異型または
突然変異を、好気性条件下に、炭素、窒素、および無機
塩類の同化可能な源を含有する水性栄養培地中で培養す
ることによって達成される。発酵分野において通常使用
する栄養培地の多数を使用できるが、ある種の培地は好
ましい。好ましい炭素源はグルコース、マンノース、ガ
ラクトース、澱粉、コーンミールなどである。好ましい
窒素源はアンモニア、硝酸塩、ダイズミール、ペプト
ン、肉エキス、酵母エキス、トリプトン、アミノ酸など
である。培地中に添加することができる無機塩類の例
は、ナトリウム、カリウム、鉄、亜鉛、コバルト、マグ
ネシウム、カルシウム、アモニウム、塩化物、炭酸塩、
硫酸塩、リン酸塩、硝酸塩などを生成することができる
普通の可溶性塩類である。
【0009】通常、抗生物質産生菌株は震盪フラスコ中
で前培養し、次いでこの培養物を使用して、実質的な量
の抗生物質の産生のためのジャー発酵槽を植え継ぎす
る。前培養に使用する培地はより大きい発酵に使用する
ものと同一であることができるが、他の培地をまた使用
することができる。抗生物質GE2270を産生する菌
株は、20〜40℃、好ましくは24〜35℃の温度に
おいて成長させることができる。
【0010】発酵の間、抗生物質の産生はブロスまたは
菌糸体の抽出物の試料を抗生物質の活性について、例え
ば、バイオアッセイまたはTLCまたはHPLCの手順
により監視することができる。
【0011】抗生物質GE2270に対して感受性の有
機体、例えば、枯草菌(Bacillus subti
lis)および黄色ブドウ球菌(S.aureus)を
試験有機体として使用することができる。バイオアッセ
イは、便利には、寒天平板上の寒天拡散法により実施さ
れる。抗生活性の最大の産生は、一般に、発酵の第2日
と第8日との間において起こる。
【0012】抗生物質GE2270因子B1、B2
1、C2、D1、D2、EおよびTは、菌株プラノビスポ
ラ・ロセア(Planobispora rosea)
ATCC53773、あるいはそのGE2270産生突
然変異または変異型を培養することによって産生され、
そしてある量の産生物が発酵ブロスから分離することが
できる場合でさえ、主として菌糸体中に見いだされる。
【0013】プラノビスポラ・ロセア(Planobi
spora rosea)ATCC53773の形態学
的特徴プラノビスポラ・ロセア(Planobispo
ra rosea)ATCC53773はほとんどの培
地上でよく成長する。栄養菌糸体は、長いおよび不規則
に枝分かれするフィラメント(0.5〜1.0マイクロ
メートル)を形成し、これらのフィルムは寒天を浸透
し、そしてその表面上で成長する緻密な成長を形成す
る。菌糸体は、液体または固体の培地中で成長するかど
うかにかかわらず、断片化しない状態に止まる。その色
は試験した培地の大部分の上で薄いさんご色ないしピン
クのさんご色の範囲である。気性菌糸体はわずかの横の
枝をもつ、長い、波状の、細長い菌糸から形成され、そ
して空気中で寒天表面に対して本質的に平行に成長す
る。
【0014】気性菌糸体は、存在するとき、白色−ピン
クの色を有する。胞子嚢は気性菌糸体に沿って単一にま
たは群で形成され、そして約6.0〜8.0ミクロンの
長さおよび約1.0〜1.2ミクロンの幅である。それ
らは短い胞子嚢柄(1.0〜2.0マイクロメートルの
長さ)により菌糸に結合している。紡錘形の直線状の胞
子(3.0〜3.5×1.0×1.2マイクロメート
ル)の縦方向の対が各胞子嚢中に形成されている。胞子
嚢において、胞子は横方向の隔膜により分離されてい
る。胞子嚢のエンベロープからの解放後、胞子は用毛目
の鞭毛により運動性となる。
【0015】プラノビスポラ・ロセア(Planobi
spora rosea)ATCC53773の培養特
性培養の特性の検査のために、プラノビスポラ・ロセア
(Planobispora rosea)ATCC5
3773は、シャーリング(Shirling)および
ゴットリーブ(Gottlieb)[シャーリング(S
hirling)E.B.およびゴットリーブ(Got
tlieb)D.1966−ストレプトミセス属の種の
特性決定の方法(Method for charac
terization of Streptomyce
s species)−Int.Syst.Bacte
riol.16、313−340]により示唆されるの
種の種々の標準の培地上で、ワクスマン(Waksma
n、S.A.1961−アクチノミセテス(Actin
omycetes)−ザ・ウィリアムス・アンド・ウィ
リキンソウンス・カンパニー(The William
s and Wilkins Co.)バルチモア;V
ol.2、328−334]により推奨されるいくつか
の培地を添加して培養した。
【0016】色の決定は、必要に応じて、メルズ(Ma
erz)A.およびM.レア・ポール(Rea Pau
l)、1950、色の辞書(A Dictionary
of Color)−第2版、マク・グロー・ヒル・
ブック・カナパニー・インコーポレーテッド(McGr
aw−Hill Book Company In
c.)、ニューヨーク]の方法により実施した。
【0017】有機体が異なる炭素源を利用する能力は、
シャーリング(Shirling)およびゴットリーブ
(Gottlieb)によりに記載されている方法によ
り研究した。
【0018】培養および生理学的特性および炭素源の利
用は、表I、II、IIIに報告する。
【0019】表Iにおける読みは、28℃において2週
のインキュベーション後に取った。
【0020】
【表6】
【0021】
【表7】
【0022】
【表8】
【0023】
【表9】 この試験のために、培地No.8を使用し、そして28
〜30℃において2週のインキュベーション後、結果を
評価する。
【0024】温度に対する感受性 最適な成長温度は28℃〜37℃の範囲である。15℃
および50℃において成長は観測されず、そして20℃
において中程度の成長が観測される。
【0025】化学分類学的特性 細胞壁の分析 細胞壁中に存在するアミノ酸の分析は、ベッカー(Be
cker)らが記載する方法により実施した[「全細胞
の加水分解物のペイパークロマトグラフィーによるノカ
ルジア属およびストレプトミセス属の間の急速分化(R
apd differentiation betwe
en Nocardia and Streptomy
ces by paper chromatograp
hy ofwhole cell hydryzate
s)、アプライド・マイクロバイオロジー(Appl.
Microbiol.)、12、421−423、19
64]。
【0026】全細胞の加水分解物の分析は、メソ−ジア
ミノピメリン酸の存在を明らかにした。
【0027】次の文献による方法に従い、純粋な細胞壁
の調製物を分析すると、グリシンは存在しなかった:カ
ワモト,I、O.テツオ、およびN.タカシ、「ミクロ
モノスポラ・オリバソテロスポラ、ミクロモノスポラ・
サガミエンシスおよび関係する有機体の細胞壁の組成
(Cell wall composition of
Mcromonospora olivastrosp
ora,Mcromonospora sagamie
nsis and related organism
s)、ジャーナル・オブ・バクテリオロジー(J.Ba
ctriology)、146、527−534、19
81。
【0028】全細胞の糖のパターン 全細胞の加水分解物中の糖含量の分析は、レチェバリア
ー(lechevalier)M.P.[「臨床的な重
要性をもつ好気性アクチノミセテスの同定(Ident
ification of aerobe actin
omycetesof clinical impor
tance)」、J.Lab.Clin.Med.
、934−944、1968]に記載されている方法
により、スタネク(Staneck)J.L.および
G.D.ロバーツ[「薄層クロマトグラフィーによる好
気性アクチノミセテスの同定に対して簡素化したアプロ
ーチ(Simlified approach to
identification of aerobic
actinomycetes by thin la
yer chromatography)」、アプライ
ド・マイクロバイオロジー(Appl.Microbi
ol.)、28、226−231、1974]に記載さ
れている薄層クロマトグラフィーのセルロースシートを
使用して、次の溶媒系:酢酸エチル−ピリジン−水(1
00:35:25 v/v)を実施した。
【0029】得られた結果は、マズロース(3−O−メ
チル−D−ガラクトース)の存在およびアラビノースお
よびガラクトースの不存在を示した。
【0030】菌株プラノビスポラ・ロセア(Plano
bispora rosea)ATCC53773の同
一性この菌株は、属プラノビスポラ(Planobis
pora)に割り当て、そして次の形態学および化学的
特性のためにプラノビスポラ・ロセア(Planobi
spora rosea)として分類した: a)細胞壁中のメソ−ジアミノピペリン酸の存在および
グリシンの不存在(細胞壁の化学型III) b)細胞壁の加水分解物中のマズロースの存在(全細胞
の糖のパターンB) c)1対の移動性胞子を含有する長い円形の胞子嚢の気
性菌糸体上の形成 d)栄養菌糸体のピンク色 上に報告したプラノビスポラ・ロセア(Planobi
spora rosea)ATCC53773の形態学
的特性は、次の文献に記載されているプラノビスポラ・
ロセア(Planobispora rosea)の菌
株のそれらと実質的に異ならない:J.E.チーマン
(Thiemann)ら、「ジ・アクチノミセタレス
(The Actinomycetales)」、Th
e JenaIntern.Symp.on Taxo
n.、1968年9月、H.プラウサー(Prause
r)編、イエナ。それはアメリカン・タイプ・カルチャ
ー・コレクション(the American Typ
e Culture Collection)に受託さ
れ、ここで受け入れ番号23866を与えられた。この
菌株について、抗生物質の産生は記載されなかった。
【0031】他の微生物の場合のように、GE2270
を産生する菌株の特性は変動を受ける。例えば、この菌
株の人工的変異型および突然変異を種々の既知の突然変
異原、例えば、紫外線、X線、高い周波数の波、放射
能、および化学物質、例えば、亜硝酸、N−メチル−
N’−ニトロ−N−ニトロソキナジジン、および多数の
他のもので処理することによって得ることができる。プ
ラノビスポラ属(Planobispora)の種に属
しそして抗生物質GE2270を産生するすべての自然
および人工の変異型は、本発明の目的に対して菌株プラ
ノビスポラ・ロセア(Planobispora ro
sea)ATCC53773に等しいと認められる。
【0032】前述したように、抗生物質GE2270因
子B1、B2、C1、C2、D1、D2、EおよびTは、一般
に、産生菌株の菌糸体中に主として見いだされるが、少
量の物質はまた発酵ブロス中に見いだされる。
【0033】本発明の抗生物質の回収および分離 菌糸体または産生微生物の発酵ブロスからの抗生物質G
E2270因子B1、B2、C1、C2、D1、D2、Eおよ
びTの回収は、それ自体既知の認識に従い、例えば、溶
媒を使用する抽出、非溶媒の添加による沈澱または溶液
のpHの変化、分配クロマトグラフィー、吸着クロマト
グラフィー、逆相分配クロマトグラフィー、イオン交換
クロマトグラフィー、分子排除クロマトグラフィーなど
により実施する。
【0034】菌糸体から本発明の抗生物質を回収する好
ましい手順は、濾過または遠心した菌糸体を水混和性有
機溶媒で抽出し、抽出物を濃縮し、そして粗製抗生物質
を、必要に応じて沈澱剤を添加して、沈澱により、水性
残留物を水不混和性有機溶媒で抽出することによるか、
あるいは吸着クロマトグラフィーおよび引き続いて所望
の産生物を吸着マトリックスから溶離することによって
回収することを包含する。
【0035】発酵ブロスから本発明の抗生物質を回収す
る好ましい手順は、水不混和性有機溶媒を使用する抽
出、引き続く濃縮した抽出物からの、必要に応じて沈澱
剤の添加後の、沈澱、あるいはその水性残留物水不混和
性溶媒によりそれ以上の抽出を包含する。あるいは、発
酵ブロスは吸着マトリックスと接触させ、次いで極性溶
離混合物を使用する溶離により実施することができる。
このクロマトグラフィーの手順は、また、発酵ブロスそ
れ自体への代わりに発酵ブロスから得られた濃縮した抽
出物に適用することができる。
【0036】用語「水混和性溶媒」は、ここで使用する
とき、現在この分野においてこの用語に与えられた意味
を有することを意図し、そして、使用条件下に、合理的
に広い濃縮範囲において水と混和性である溶媒を呼ぶ。
【0037】菌糸体物質からの本発明の抗生物質の抽出
において使用することができる水混和性有機溶媒の例
は、次の通りである:(C1−C3)アルカノール、例え
ば、メタノール、エタノールおよびプロパノール;フェ
ニル(C1−C3)アルカノール、例えば、ベンジルアル
カノール;低級ケトン、例えば、(C3−C4)ケトン、
例えば、アセトンおよびエチルメチルケトン;環状エー
テル、例えば、ジオキサンおよびテトラヒドロフラン;
グリコールおよびそれらの部分的エーテル化生成物、例
えば、エチレングリコール、例えば、プロピレングリコ
ールおよびエチレングリコールモノメチルエーテル;低
級アミド、例えば、ジメチルホルムアミド、ジエチルホ
ルムアミド;およびジメチルスルホキシド。
【0038】用語「水不混和性溶媒」は、ここで使用す
るとき、現在この分野においてこの用語に与えられた意
味を有することを意図し、そして、使用条件下に、意図
する用途に適する、合理的に広い濃縮範囲において水と
わずかに混和性であるか、あるいは事実上不混和性であ
る溶媒を呼ぶ。
【0039】発酵ブロスからの本発明の抗生物質の抽出
において使用することができる不水混和性有機溶媒の例
は、次の通りである:線状、分枝鎖状または環状である
ことができる通常の炭化水素、例えば、ヘキサンまたは
シクロヘキサン;ハロゲン化炭化水素、例えば、クロロ
ホルム、四塩化炭素、ジクロロエタン、フルオロブロモ
エタン、ジブロモエタン、トリクロロプロパン、クロロ
トリフルオロオクタンなど;芳香族炭化水素、例えば、
トルエン、キシレンなど;少なくとも4個の炭素原子の
エステル、例えば、酢酸エチル、酢酸プロピル、酪酸エ
チルなど;線状、分枝鎖状または環状であることができ
る少なくとも4個の炭素原子のアルカノール、例えば、
ブタノール、1−ペンタノール、2−ペンタノール、3
−ペンタノール、1−ヘキサノール、2−ヘキサノー
ル、3−ヘキサノール、3,3−ジメチル−1−ブタノ
ール、4−メチル−1−ペンタノール;3−メチル−1
−ペンタノール、2,2−ジメチル−3−ペンタノー
ル、2,4−ジメチル−3−ペンタノール、4,4−ジ
メチル−2−ペンタノール、5−メチル−2−ヘキサノ
ール、1−ヘプタノール、2−ヘプタノール、5−メチ
ル−1−ヘキサノール、2−エチル−1−ヘキサノー
ル、2−メチル−3−ヘキサノール、1−オクタノー
ル、2−オクタノール、シクロペンタノール、2−シク
ロペンチルエタノール、3−シクロペンチル−1−プロ
パノール、シクロヘキサノール、シクロペンタノール、
シクロオクタノール、2,3−ジメチルシクロヘキサノ
ール、4−エチルシクロヘキサノール、シクロオクチル
メタノール、6−メチル−5−ヘプテン−2−オール、
1−ノナノール、2−ノナノール、1−デカノール、2
−デカノールおよび3−デカノール;直鎖状または分枝
鎖状のアルキルエーテルおよびそれらの混合物、例え
ば、エチルエーテル、プロピルエーテル、ブチルエーテ
ルなど;およびそれらの混合物または官能性誘導体。
【0040】この分野において知られているように、産
生物の抽出は塩化によるか、あるいは抽出溶媒中に可溶
性の抗生物質とイオン対を形成する適切な有機塩を添加
することによって改良することができる。
【0041】抽出後、実質的な量の有機溶媒を含有する
水性相を回収されるとき、それから水を共沸蒸留するこ
とは便利であることがある。一般に、これは水と最小の
共沸混合物を形成することができる溶媒を添加し、次い
で必要に応じて沈澱剤を添加して、所望の産生物を沈澱
させることを必要とする。水と最小の共沸混合物を形成
することができる溶媒の代表的な例は、次の通りであ
る:n−ブタノール、ベンゼン、トルエン、ブチルエー
テル、四塩化炭素、クロロホルム、シクロヘキサン、
2,5−ジメチルフラン、ヘキサンおよびm−キシレ
ン;好ましい溶媒はn−ブタノールである。
【0042】沈澱剤の例は、次の通りである:石油エー
テル、低級アルキルエーテル、例えば、エチルエーテ
ル、プロピルエーテルおよびブチルエーテル、および低
級アルキルケトン、例えば、アセトン。
【0043】前述の粗製塩化メチレンの回収後、本発明
の単一の抗生物質の分離前に、この混合物をそれ以上の
精製/濃縮工程にかけることが必要であることがある。
クロマトグラフィーの手順が、この場合において、第1
の選択である。
【0044】前述したように、本発明の抗生物質は通常
抗生物質GE2270因子Aと同時産生され、そしてそ
れに比較して小さい分画を表す。したがって、因子Aを
残留する抗微生物的に活性な分画から分離すること、お
よびこれらの「小さい」分画を分離前に濃縮して、本発
明の単一の抗生物質を適当な量で回収することが必要で
ある。
【0045】前述の工程において便利に使用することが
できるクロマトグラフィー系の例は、次の通りである:
ポリスチレンまたは混合したポリスチレン−ジビニルベ
ンゼン樹脂、例えば、アンバーライト(Amberli
te)XAD2またはXAD4[ローム・アンド・ハー
ス(Rohm and Haas)、ドウウェクス(D
owex)S112[ダウ・ケミカル・カンパニー(D
ow Chemical Co.)]およびダイアイオ
ン(Diaion)HP20(ミツビシ);アクリル樹
脂、例えば、XAD7またはXAD8(ローム・アンド
・ハース);ポリアミド、例えば、ポリカプロラクタ
ム、ナイロンおよび架橋したピリビニルピロリドン、一
般に、1〜5の範囲の孔体積(ml/g)、1〜100
の範囲の表面積(m2/g)、0.15〜0.50の範
囲の見掛けの密度、100〜3000の範囲の平均孔直
径(オングストローム単位)および粒子大きさの少なく
とも40%が300マイクロメートル以下である粒子大
きさ分布を有する、例えば、ポリアミド−CC6、ポリ
アミド−SC6、ポリアミド−CC6.6、ポリアミド
−CC6ACおよびポリアミド−SC6AC[マチェレ
イ−ネイゲル・アンド・カンパニー(Macherey
−Nagel & Co.)、西ドイツ]、ポリビニル
ピロリドン樹脂PVP−CL[アルドリッヒ・ヘミー社
(Aldrich Chemie GmbH & C
o.)、西ドイツ]、ポリアミド樹脂PA400[M.
ボエルム社(M.Woelm AG)、西ドイツ];お
よび炭素。ポリスチレンおよびアクリル樹脂の場合にお
いて、好ましい溶離剤は水混和性溶媒、例えば、前述の
ものである;とくに、ポリアミドの場合において、溶離
剤は好ましくは水混和性溶媒、例えば、前述のものの水
性混合物であるが、炭素について、好ましい溶離剤は低
級ケトン、例えば、アセトンまたは低級アルコール、例
えば、メタノールである。
【0046】前述の工程において便利に使用することが
できるそれ以上のクロマトグラフィーの手順は、また、
次のものを包含する:静止相のクロマトグラフィー、例
えば、シリカゲル、アルミナ、ケイ藻土など、溶媒から
作られる有機溶離相は次のものを包含する:ハロゲン化
炭化水素、低級アルカノール、エーテル、および既に上
に述べたタイプの高級ケトンおよびそれらの混合物。
【0047】便利には、また、いわゆる立体排除クロマ
トグラフィーを使用してすぐれた結果を得ることができ
る。とくに、ヒドロキシル基の大部分がアルキル化され
ている、制御された孔の架橋デキストラン、例えば、セ
ファデックス(Sephadex)LH−20[ファー
マシア・ファイン・ケミカルス(FarmaciaFi
ne Chemicals)Ab]はこの場合において
使用するのに有用である。
【0048】前述の通常の手順に従い、本発明の化合物
のほかに、なを少量の抗生物質GE2270因子Aを含
有することができる、精製された混合物が通常得られ
る。
【0049】精製された混合物からの抗生物質GE22
70因子B1、B2、C1、C2、D1、D2、EおよびTの
分離は、この分野において知られている方法により実施
することができる。
【0050】クロマトグラフィーの技術、例えば、前述
のものは分離の目的にとくに好ましいが、逆相クロマト
グラフィーは好ましい分離技術であると思われる。普通
の逆相クロマトグラフィーに加えて、また、逆相カラム
を使用する調製用HPLCは通常使用される。
【0051】このクロマトグラフィー技術における静止
相は、種々の機能的誘導体を有しそして前述の種類の水
混和性溶媒の水性混合物で溶離する、通常使用されるも
のの1つ、例えば、シラン化シリカゲルであることがで
きる。
【0052】官能化シラン化シリカゲルの例は、(C8
−C22)アルキル基を有するもの、例えば、官能性は、
例えば、オクタデシルシランまたはオクチルシランの部
分、またはシクロヘキサン、フェニル、および同様な官
能基により表されるものである。これらの樹脂は商業的
に入手可能であり、そして本発明のにおいて通常使用で
きる同様なまたはなお改良された性質を有する新しい添
加は正式に登録されている。
【0053】ことに好ましい調製用HPLC技術は、オ
クタデシル官能化シリカゲルおよびアセトニトリル、テ
トラヒドロフランおよび水性アモニウムホルメートを含
有する溶離混合物を使用して。
【0054】ことに好ましい溶離の方法は約25:75
の相Aおよび相Bの混合物を使用する溶離により代表さ
れ、ここで相Aはアセトニトリル:テトラヒドロフラ
ン:40ミリモルのアモニウムホルメート、40:4
0:20であり、そして相Bは同一成分であるが、比率
10:10:80の混合物である。
【0055】分画はそれらの含量に従い、例えば、普通
の紫外線検出器を254nmにおいて使用する溶離のプ
ロフィルに従い収集し、次いで溶媒をそれ自体既知の技
術(例えば、減圧下の蒸発、凍結乾燥など)に従い除去
して、本発明の純粋な抗生物質の因子を分離し、この因
子を、必要に応じて、低級アルコール、例えば、メタノ
ール、エタノール、プロパノールおよびイソプロパノー
ルから結晶化することができる。
【0056】この分野において通常のように、産生なら
びに回収および精製の工程は、種々の分析手順、例え
ば、感受性の微生物についてのバイオアッセイ、例え
ば、ペイパーのディスクまたは寒天拡散アッセイ、TL
CまたはHPLC、例えば、UVまたは微生物の検出工
程を包含する。
【0057】好ましいHPLC分析技術は、逆相HPL
Cにより代表され、これはシラン化シリカゲルの多孔質
の球形粒子、例えば、C−8アルキル基で官能化され、
均一な直径を有するシリカゲル[例えば、5マイクロメ
ートルのベイカーボンド(BakerbondR)C
8、ベイカー・リサーチ・プロダクツ(Baker R
esearch Products)、米国]のカラ
ム、および極性水混和性溶媒、例えば、前述のものの直
線の勾配混合物である溶離剤を極性の増加する勾配で使
用する。
【0058】この場合において、好ましい溶離混合物は
次の通りである: 相A:CH3NH:テトラヒドロフラン:40ミリモル
のHCOONH4、40:40:40 相B:CH3NH:テトラヒドロフラン:40ミリモル
のHCOONH4、10:10:80 好ましい溶離の方法は約20分で相B中の20%〜30
%の相Aの直線の勾配により代表されるが、流速は約
1.8ml/分でありそして紫外線の検出は254nm
においてである。
【0059】抗生物質GE2270因子B 、B 、C
、C 、D 、D 、EおよびTの物理化学的特性 A) パーキン・エルマー(Perkin Elme
r)320型を使用して記録した紫外線吸収スペクトル
は次の吸収大を示す:抗生物質GE2270因子
、B 、C 、C 、D 、D およびE
【0060】
【表10】 抗生物質GE2270因子T
【0061】
【表11】 B) 次の吸収大ν(cm−1)を示すヌジョール
における赤外吸収スペクトル(抗生物質GE2270
因子D、D、EおよびT):
【0062】
【表12】因子D 3700−3100;3020−2750(nujo
l);1645;1570−1490;1460および
1375(nujol);1305;1260−110
0;1100−870;840;800;760;72
0(nujol);700因子D 3700−3100;3020−2750(nujo
l);1645;1570−1490;1460および
1375(nujol);1305;1260−110
0;1100−870;840;800;760;72
0(nujol);700因子E: 3700−3100;3020−2750(nujo
l);1645;1570−1490;1460および
1375(nujol);1305;1260;125
0−1070;1015;985−900;840;8
00;760;740;720(nujol);700因子T: 3700−3120;3100;3020−2750
(nujol);1655;1570−1490;14
60および1375(nujol);1410;130
0;1240;1200−1000;980;930;
890;840;805;765;745;720(n
ujol);700C) 内部標準としてTMS(0.
00ppm)[δ、ppm、m]を使用するDMSO−
(ヘキサジューテロジメチルスルホキシド)中の次
のシグナルの群を示すH−NMRスペクトル(抗生物
質GE2270因子D 、D 、EおよびT)(s=一
重線、br s=広い一重線、d=二重線、dd=二重
線の二重線、t=三重線、m=多重線、Py=ピリジ
ン、Tz=チアゾール)因子D (500MHzにおいて記録した): 8.88、d、(NH);8.70、d、(2NH);
8.57、s、8.50、s、8.25、s、8.2
1、sおよび7.35、s、(5チアゾールのCH);
8.40、m、(グリシンのNH);8.28−8.2
1、m、(ピリジンのCH);7.32−7.20、
m、(芳香族のCHおよび第一アミドのNH);7.0
0、s、6.64、s、6.53、s、(第一アミドの
NH);5.95、d、(OH);5.29−5.1
5、m、(αCH);5.04、m、(フェニルセリン
のβCH);4.81、mおよび4.56、m、(オキ
サゾリンのCH);4.30−3.80、m、(グリ
シンのCHおよびプロリンアミドのCH);2.7
2、m、および1.43、m、(アスパラギンのC
);2.60、s、(CH);2.21−1.9
1、(m)、(イソプロピルのCHおよびプロリンアミ
ドのCH);0.90(d)および0.86(d)、
(バリンのCH因子D (500MHzにおいて記録した): 9.00、d、(NH);8.69、br s(2N
H);8.59、s、8.53、s、8.29、sおよ
び7.35、s、(チアゾールのCH);8.38、
m、(グリシンのNH);8.40および8.26
(m)、(PyのCH);7.37−7.18、m、
(芳香族のCH、第一アミドのNH);6.97、s、
(第一アミドのNH);6.03、dおよびt、(2O
H);5.28−5.16、m、(αCH);5.0
3、m、(βCH);4.97、m、[CH(O
H)];4.79および4.55、m、(オキサゾリン
のCH);3.97−3.76、m、(グリシンのC
およびプロリンアミドのCH);2.71、mおよ
び1.28、m、(N−メチルアスパラギンのC
);2.18−1.89、m、(イソプロピルのC
HおよびプロリンアミドのCH);0.88、dおよ
び0.84、d、(バリンのCH因子E (500MHzにおいて記録した): 8.95、d、(NH);8.73、d、(NH);
8.60、s、(TzのCH);8.57、d、(N
H);8.53、s、(TzのCH);8.42、m、
(PyのCH);8.31、m、(NH);8.28、
m、(PyのCH);8.24、s、(TzのCH);
7.33、s、(TzのCH);7.31−7.20、
m、(芳香族のCH、第一アミドのNH);6.98、
s、6.91、s、6.62、s、(第一アミドのN
H);6.04、d、(OH);5.95、t、(O
H);5.28−5.14、m、(αCH);5.0
3、m、(βCH);4.99、m、[CH(O
H)];4.81、ddおよび4.57、dd、(オキ
サゾリンのCH);4.26(m)および3.79
(m)、(グリシンのCH);4.25、m、3.9
8、m、3.82、m、(プロリンアミドのCH);
2.77、m、および1.25、m、(アスパラギンの
CH);2.20、m、および1.89、m、(バリ
ンのβCHおよびプロリンアミドのCH);0.9
0、d、0.84、d、(バリンのCH因子T (250MHzにおいて記録した): 8.95、d、(NH);8.70、d、(2NH);
8.66、s、8.65、s、8.60、8.30、s
および7.38、s、(4チアゾールおよび1オキサゾ
ールのCH);7.35−7.24、m、(芳香族のC
Hおよび第一アミドのNH);6.68(第一アミドの
NH);5.96、d、(OH);5.34−5.1
8、m、(αCH);5.05、m、(βCH);5.
03、s、[CH(OCH)];4.32、mおよ
び3.82、m、(グリシンのCH);4.48、
m、4.04、mおよび3.63、m、(プロリンアミ
ドのCH);3.40、s、(OCH);2.73、
mおよび1.41、m、(N−メチルアスパラギンのC
);2.60、s、(CH);2.49、d、
(N−メチルアスパラギンのCH);2.27−1.
88、m、(イソプロピルのCHおよびプロリンアミド
のCH);0.89、d、(バリンのCH) 図1および図2は、それぞれ、抗生物質GE2270因
子Eおよび因子TのH−NMRスペクトルを示す。
【0063】D) 次の逆相HPLC系における保持時
間(R)(抗生物質GE2270因子B、B、C
、C、D、D、EおよびT):カラム :ベイカーボンド(Bakerbond)C8
(5μm)4.6×250mm[Bakerbondは
J.T.ベイカー・リサーチ・プロダクト(Baker
Research Product)、米国ニュージ
ャージイ州08865フィリスバーグ、により供給され
る逆相オクチルシリルシリカゲルのHPLCカラムの商
品名である]流速 :1.8ml/分相A :CHCN:テトラヒドロフラン:40mM
COONH 40:40:20相B :CHCN:テトラヒドロフラン:40mM
COONH 10:10:80溶離 :20分における相Aの20%〜30%の直線勾検出 :UV254nm 結果は次の通りである:
【0064】
【表13】 E) 主たるFAB−MSピーク[クレイトス(Kra
tos)MS−50二重収束質量分析計で得た、6kV
の電圧および1mAの電流において8kVの加速電圧お
よびXeガス(ソースイオンゲージ上に示される2×1
−5トルの圧力)のサドルフィールド(saddle
field)原子ガンを使用する、試料は0.1
酸を含有するチオグリセロールのマトリックスと混合す
る]は、次の通りである。値はプロトン化した分子イオ
ンの最低のアイソトープにほとんどが相当するようであ
る。
【0065】
【表14】 上に報告した物理化学的データに基づいて、次の構造式
を抗生物質GE2270因子D1、D2、EおよびTに試
験的に割り当てることができる:因子D1
【0066】
【化1】 因子D2
【0067】
【化2】 因子E
【0068】
【化3】 因子T
【0069】
【化4】 本発明の化合物の抗微生物活性は、1系列の標準の生体
外の試験により実証することができる。
【0070】最小阻止濃度(MIC)をマイクロブロス
の希釈法により決定した。接種は104〜105CFU/
mlであった。すべての微生物は37℃において培養し
た。MICは18〜24時間において読んだが、ただし
淋菌(Neisseriagonorrhaeae)、
バクテリオイデス・フラギリス(B.fragili
s)、およびプロピオンバクテリウム・アクネ(P.a
cne)は48時間であった。淋菌(Neisseri
a gonorrhaeae)は5%のCO2の雰囲気
中でインキュベーションした;嫌気性菌は嫌気性ガス混
合物中でインキュベーションした。培地は次の通りであ
った:連鎖球菌属、エンテココッカス・フェカリス(E
nterococcus faecalis)、大腸菌
(Escherichia coli)、プロテウス・
ブルガリス(Proteus vulgaris)、お
よび緑膿菌(Pseudomonas aerugin
osa)についてオキソイド(Oxoid)のアイソ−
センチテスト(Iso−Sensitest)のブロ
ス;淋菌(Neisseria gonorrhaea
e)について1%のBBLアイソビタレックス(Iso
Vitalex)を補充したディフコ(Difco)の
GCベースのブロス;プロピオンバクテリウム・アクネ
(P.acne)およびバクテリオイデス・フラギリス
(B.fragilis)(105CFU/ml)につ
いてディフコ−ウィルキンス−チャグレン(Difco
−Wilkins−Chalgren)ブロス。
【0071】
【表15】
【0072】
【表16】 それらの性質にかんがみて、本発明の化合物はヒトまた
は動物についての薬物の調製において活性成分として使
用することができる。
【0073】とくに、抗生物質GE2270因子B1
2、C1、C2、D1、D2、EおよびTは主としてグラ
ム陽性バクテリアおよびグラム陽性ならびにグラム陰性
の嫌気性菌に対して活性である。それは、また、メチシ
リン、アミノグルコシドまたはグリコペプチドの抗生物
質と交差抵抗性をもたない、連鎖球菌の心内膜炎におい
て非常に活性であるように思われる。
【0074】こうして、本発明の抗生物質の主な治療学
的適応は、それに対して感受性の微生物の存在に関する
感染の処置においてである。
【0075】用語「処置」は、また、予防、治療および
治癒を包含することを意図する。
【0076】この処置を受ける患者は、霊長類を包含す
る、必要な動物、例えば、ヒト、および他の動物、例え
ば、ウマ、ウシ、ブタおよびヒツジ、および一般に家禽
およびペットである。
【0077】本発明の化合物は、そのままであるいは製
剤学的に許容されうる担体と混合して投与することがで
きそして、また、他の抗微生物剤、例えば、ペニシリ
ン、セファロスポリン、アミノグルコシドおよびグリコ
ペプチドと一緒に投与することができる。こうして、結
合の治療は、最初に投与したものの治療学的効果が、引
き続いて投与したとき、完全に消滅しないような方法に
おいて、活性化合物の順次の、同時のおよび分離した投
与を包含する。
【0078】好ましい製剤学的配合物は、完全なまたは
損傷を受けた皮膚または粘膜への局所的適用に適当な配
合物により代表される。このような配合物の例は、粉
末、軟膏、クリームおよびローションである。これらの
配合物における賦形剤は、次の通りである:通常の製剤
学的に許容されうる賦形剤、例えば、油を含む軟膏基剤
(例えば、セチルエステルろう、オレイン酸、オリーブ
油、パラフィン、鯨ろう、スターチグリセライト);吸
収性軟膏基剤(例えば、無水ラノリン、親水性ペトロラ
タム);乳化軟膏基剤(例えば、セチルアルコール、グ
リセリルモノステアレート、ラノリン、ステアリン
酸);水溶性軟膏基剤(例えば、グリコールエーテルお
よびそれらの誘導体、例えば、ポリエチレングリコー
ル、ポリ(オキシ−1,2−エタンジイル)−アルファ
−ヒドロ−オメガ−ヒドロキシ−オクタデカノエート、
ポリソルベート、およびポリエチレングリコールモノ−
ステアレート。
【0079】これらの配合物は、他の既知の賦形剤、例
えば、防腐剤を含有することができ、そしてこの分野に
おいて知られているように調製され、そして参考文献、
例えば、次の参考文献に報告されている:レミントンの
製剤の科学(Remington’s Pharmac
eutical Science)、第7版、198
5、マック・パブリシング・カンパニー(Mack P
ublishing Co.)。
【0080】本発明の化合物は、また、それ自体既知の
方法に従う非経口的投与に適当な配合物に配合すること
ができ、そして参考文献、例えば、前述の参考文献に報
告されている。
【0081】例えば、本発明の化合物は、安定剤、例え
ば、ポリプロピレングリコールまたはジメチルアセトア
ミドおよび表面活性剤、例えば、ポリオキシエチレンソ
ルビタンモノ−オレエートまたはポリエトキシル化ヒマ
シ油を使用して注射用の無菌の水中で配合する。
【0082】非経口的投与のための典型的な配合物の例
は、最終調製物について10mgの抗生物質GE227
0因子B1、B2、C1、C2、D1、D2、EおよびT、1
0〜20%の表面活性剤、例えば、ポリオキシエチレン
ソルビタン脂肪酸、ポリオキシエチレンヒマシ油誘導体
またはポリオキシエチレン水素化ヒマシ油誘導体および
0〜20%、好ましくは10〜20%の可溶化剤、例え
ば、ポリエチレングリコール、ジメチルアセタミド、ジ
メチルホルムアミド、t−ブチル−N−ヒドロキシカル
バメート、1,2−、1,3−または1,4−ブタンジ
オール、エチルオレエート、テトラヒドロフルフリル−
ポリエチレン−グリコール200、ジメチルイソソウバ
イド、ベンジルアルコールなどを含有する。好ましい安
定剤はプロピレングリコールである。
【0083】ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エス
テルは、商業的に入手可能である、そしてそれらのある
ものは商品名「ツイーン」で販売されている。それら
は、また、「ポリソルベート」の非登録名で知られてい
る。それらの例は、ポリソルベート20、21、40、
60、61、65、80、81および85である。ポリ
ソルベート80(ソルビタン−モノ−9−オクタデカノ
エート、ポリ(オキシ−−1,2−エタンジイル)誘導
体)は本発明の配合物における使用に好ましい。ポリオ
キシエチレンヒマシ油およびポリオキシエチレン水素化
ヒマシ油は、また、商業的に入手可能である。それらの
あるものは、「クレモフォール(Cremopho
r)」で販売されている。このような化合物の例は、ク
レモフォール(Cremophor)EL(ポリエトキ
シル化ヒマシ油)、クレモフォール(Cremopho
r)RH40(ポリエトキシル化水素化ヒマシ油)、ク
レモフォール(Cremophor)RH60(PEG
60水素化ヒマシ油)またはエマクフォール(Emul
phor)ELー719(ポリオキシエチル化水素化ヒ
マシ油である。
【0084】好ましくは、注射のための配合物は7±
0.5の範囲のpHを有する。必要に応じて、適当な緩
衝化剤で調製物のpHを調節することは好ましいことが
ある。便利には、トリス(すなわち、トリヒドロキシメ
チルアミノメタン)またはホスフェートを緩衝化剤とし
て使用することができる。
【0085】非経口的投与のために好ましい配合物は、
次の通りである:クレモフォール(Cremophor
R)EL(ポリオキシル35ヒマシ油USP/NF)2
0%、ポリエチレングリコール5〜20%、好ましくは
10〜20%である。
【0086】一般に、これらの配合物は、活性成分を有
機溶媒中に溶解し、次いで表面活性剤成分を添加し、そ
して最後に注射用の無菌の水で所望の体積に希釈するこ
とによって調製することができる。
【0087】他の賦形剤、例えば、防腐剤または安定剤
をこの分野において知られているように添加することが
できる。
【0088】非経口的配合物の例は次の通りである: 抗生物質GE2270因子T 10mg PEG40ヒマシ油(CremophorEL) 0.2ml ポリエチレングリコール 0.2ml メチルパラヒドロキシベンゾエート 0.5mg プロピルパラヒドロキシベンゾエート 0.05mg 注射用の水、十分量 1ml 上の配合物において、10mgの抗生物質GE2270
因子T代わりに、10mgの抗生物質GE2270因子
1、B2、C1、C2、D1、D2、またはEを使用するこ
とができる。
【0089】あるいは、活性成分は使用前の再構成のた
めの凍結乾燥した粉末として調製することができる。
【0090】凍結乾燥した物質は活性成分および界面活
性剤、例えば、ポリエチレングリコール60水素化ヒマ
シ油を含有する混合物から出発する場合、それは便利に
は水性媒質単独で、有機溶媒の添加なしに、再構成する
ことができる。
【0091】必要に応じて、普通に凍結乾燥助剤を添加
して、粉末の形態の凍結乾燥した物質を得ることができ
る。
【0092】好ましくは、すべてのこれらの配合物は、
本発明の抗生物質に対して感受性の微生物を包含する感
染の処置において静脈内に投与するために使用する。
【0093】胃腸において嫌気性菌に起因する偽膜性全
腸炎または他の病気の処置において、本発明の化合物の
有効量を適当な製剤学的形態、例えば、カプセル剤、錠
剤または水性懸濁液の形態で投与することができる。
【0094】活性成分の投与量は、多数の因子、例え
ば、患者のタイプ、年令および状態、特定の活性成分お
よび投与のために選択した配合物、投与のスケジュール
などに依存する。
【0095】一般に、有効な抗微生物の投与量は単一の
単位投与の形態当たりに使用する。反復した適用/投
与、例えば、2〜6回/日は一般に好ましい。有効な投
与量は、一般に、0.5〜50mg/kg体重/日の範
囲である。
【0096】好ましい局所的調製物は、1〜10%の本
発明の化合物を含有する軟膏である。
【0097】いずれにしても、医師は所定の場合におけ
る所定の患者に最適な投与量を決定することができるで
あろう。
【0098】ヒトおよび獣医学において薬物として使用
するほかに、本発明の化合物は、また、動物の成長促進
剤として使用することができる。
【0099】この目的に、本発明の化合物は適当な飼料
で経口的投与される。正確な使用する濃度は、正常の量
の飼料を消費するとき、成長促進的に有効な量で活性剤
を提供するために要求される濃度である。
【0100】本発明の活性化合物の動物の飼料への添加
は、好ましくは、活性化合物を有効量で含有する適当な
飼料プレミックスを調製し、そしてこのプレミックスを
完全な規定食に混入することによって達成される。
【0101】あるいは、活性成分を含有する中間の濃縮
物または飼料補助剤を飼料中に配合することができる。
このような飼料を予備混合し、そして完全な規定食を調
製し、そして投与する方法は、例えば、次の参考文献に
記載されている:E.W.クランプトン(Crampt
on)ら、「アプライド・アニマル・ニュートリション
(Aplleid Animal Nutritio
n)」、W.H.フリードマン・アンド・カンパニー
(Freedman and Co.)、米国サンフラ
ンシスコ、1989またはD.C.チャーチ(Chur
ch)、「ライブストック・フィーズ・アンド・フィー
デイング(Livestock Feedsand F
eeding)」、オー・アンド・ビー・ブックス(O
andB books)、米国オレゴン州、197
7。
【0102】次の実施例によって、本発明をさらに説明
する。
【0103】
【実施例】実施例1 抗生物質GE2270の産生 プラノビスポラ・ロセア(Planobispora
rosea)ATCC53773の培養物を、オートミ
ールの傾斜培地上で28〜30℃において2週間成長さ
せ、次いで次の組成の100mlの種培地を含有する5
00mlのフラスコに接種するために使用する:でんぷ
ん 20g/l ポリペプトン 5g/l 酵母エキス 3g/l ビーフエキス 2g/l ダイズミール 2g/l 炭酸カルシウム 1g/l 蒸留水、十分量 100ml (pHを滅菌前に7.0に調節する) フラスコを回転震盪器(200rpm)で28〜30℃
において92時間インキュベーションする。次いで、得
られた培養物を使用して、同一培地を含有する4lのジ
ャー発酵槽を植え継ぎし、そして培養物を28〜30℃
において48時間撹拌しながら(約900rpm)およ
び通気しながら(約標準1リットルの空気/分)インキ
ュベーションする。
【0104】得られたブロスを、50lの次の産生培地
を含有する発酵槽に移す: そして、28〜30℃において約72時間インキュベー
ションする。
【0105】抗生物質の産生を、ペイパーディスクのア
ッセイにより最小デイビス培地上で成長した枯草菌(B
acillus subtilis)ATCC6633
を使用して監視する。阻害ゾーンを35℃において一夜
インキュベーション後評価する。
【0106】実施例2 a)粗製抗生物質GE2270の回収 前述の得られた発酵塊(50l)を収穫し、そして濾過
助剤(Clarcell)上で濾過する。
【0107】菌糸体を20lのメタノールで2回抽出
し、そしてプールした抽出物を減圧下に濃縮して水性残
留物が得られ、これを酢酸エチルで2回抽出する。粗製
抗生物質GE2270(6.06g)を濃縮した有機相
への石油エーテルの添加により沈澱させる。
【0108】b)抗生物質GE2270因子の粗製混合
物の分離 前述の手順に従い菌糸体から得られた粗製物を、テトラ
ヒドロフラン中に溶解し、そしてシリカゲル(230〜
400メッシュ)の存在下に減圧下に濃縮する。得られ
た固体の残留物を集め、そして塩化メチレン(CH2
2)中で調製した300gのシリカゲル(230〜4
00メッシュ)を含有するクロマトグラフィーのカラム
に適用する。カラムをまず塩化メチレン(2l)で展開
し、そして次の比の塩化メチレンおよびメタノールの
1.5lの混合物で順次に展開する:98/2;96/
4;92/8;90/10および88/12(v/
v)。
【0109】分画を集め、TLC、HPLCによるか、
あるいは枯草菌(Bacillussubtilis)
に対する微生物学的に分析し、そしてそれらの抗生物質
の含量に従いプールする。
【0110】抗生物質GE2270因子B1、B2
1、C2、D1、D2およびEに富み、そしてまたある量
の抗生物質GE2270因子Aを含有するプールした分
画を減圧下に濃縮して油状残留物が得られ、これから前
述の抗生物質因子の混合物(1.15g)を石油エーテ
ルで沈澱させる。
【0111】c)抗生物質GE2270因子B1、B2
1、C2、D1、D2およびEの分離および単離 抗生物質GE2270因子B1、B2、C1、C2、D1
2およびEを分離し、そして調製用HPLCにより2
50×20mmのヌクレオシル(Nucreosi
R)C18(オクタデシルシラン基で官能化したシリ
カゲル)(5μm)を使用して上で得られた粗製混合物
から精製し、そして相A:CH3CN:テトラヒドロフ
ラン:40ミリモルのNaBH4(40:40:2
0);相B:CH3CN:テトラヒドロフラン:40ミ
リモルのNaBH4(10:10:80)の混合物で溶
離した。抗生物質の混合物(6mg)を3mlの相Bお
よび1mlの相A中に可溶化し、そしてHPLC中に注
入し、これを14ml/分の流速で相Aおよび相Bの2
6:74混合物で溶離した。溶離した分画を254nm
の紫外線の吸収プロフィルに従い集めた。均質な含量を
有する引き続くクロマトグラフィーの溶離液の分画をプ
ールし、そして減圧下に濃縮してCH3CNを排除し
た。残留する溶液は、ペイパーディスクのアッセイによ
り黄色ブドウ球菌(Staphylococcus a
ureus)Tour L165に対する抗生活性を示
した。これらの溶液を少なくとも3回凍結乾燥して、H
PLC相からHCOONH4緩衝液残留物を完全に除去
した。
【0112】収率は次の通りであった:抗生物質GE2
270E、11mg;抗生物質GE2270因子D1
12mg;抗生物質GE2270因子D2、10mg;
抗生物質GE2270因子C1、2mg;抗生物質GE
2270因子C2、3mg;抗生物質GE2270因子
1、2mg;抗生物質GE2270因子B2、2mg。
【0113】実施例3 抗生物質GE2270因子Tの産生 a)菌株の発酵 寒天傾斜培地上で成長させたプラノビスポラ・ロセア
(Planobispora rosea)ATCC5
3773の培養物を、100mlの種培地(澱粉2%、
ポリペプトン0.5%、酵母エキス0.3%、ビーフエ
キス0.2%、ダイズミール0.2%、炭酸カルシウム
0.1%、滅菌前にpH7.0とした)を含有する2つ
の500mlのエルレンマイヤーフラスコ中に接種た。
種培地のこれらの500mlのエルレンマイヤーフラス
コを、28℃において96時間回転震盪器(200rp
m)でインキュベーションした培養物で接種する(5%
の接種物)。
【0114】培養物を28℃において回転震盪器(20
0rpm)で72時間インキュベーションし、次いで6
lの種培地を含有する10lのジャー発酵槽中に植え継
ぎした。1l/V/分の空気流れを使用しおよび900
rpmで撹拌しながら28℃において72時間インキュ
ベーションした後、培養物を200mlの産生培地(澱
粉2%、ペプトン0.25%、水素化カゼイン0.25
%、酵母エキス0.3%、ビーフエキス0.2%、ダイ
ズミール0.2%、炭酸カルシウム0.1%、滅菌前に
pH7.4とした)を含有するジャー発酵槽中に植え継
ぎした。
【0115】抗生物質GE2270因子Tの分離 126時間の発酵後、ブロスを収穫し、そして菌糸体を
ヒフロ(Hyflo)濾過助剤により集めた。菌糸体の
ケークを60および20lのアセトンで順次に抽出し、
そしてプールした抽出物を減圧下に濃縮した。粗製の抗
生物質の複合体を水の残留物から液体−固体セパレータ
ー中で遠心することによって分離した。湿潤した物質を
2−プロパノール中に可溶化し、そしてこの溶液を減圧
下に濃縮して水を除去した。粗製の抗生物質の複合体
(50g)を濃縮した残留物から沈澱させた。この粗製
の複合体は主要な量の抗生物質GE2270因子Aを抗
生物質GE2270因子Tおよび前述の他の少量の因子
とともに含有する。
【0116】前記の粗製複合体の他の成分からの因子T
の分離のために、6回の反復発酵からの調製物をプール
し、そして12lの塩化メチレン:メタノール(93:
7)中に可溶化した。不溶性物質を濾過により除去し、
そして抗生物質の複合体を含有する溶液を塩化メチレ
ン:メタノール(93:7)中で平衡化した13kg
(230〜400メッシュ)のシリカゲルのカラムに適
用した。抗生物質GE2270因子Tをカラムから塩化
メチレン:メタノール(93:7)で溶離することによ
って溶離した。それを含有する分画(HPLC分析)を
プールし、減圧下に濃縮し、そして乾燥すると、8gの
抗生物質GE2270因子Tが少量の不純物と一緒に得
られた。
【0117】15mgのこの粗製物質を0.2mlのジ
メチルホルムアミド:CH3CN:水(50:25:2
5)中に可溶化し、そしてリクロソーブ(Lichro
sorbR)C18(オキタデシルシラン化シリカゲ
ル)(7μm)を詰めたハイバー(Hiber)[E.
Merck:ドイツ国ダーマシュタット]250×10
カラム中に注入し、そして4.5ml/分の流速におい
てCH3CN:H2O(60:40)で溶離した。抗生物
質GE2270因子Tを含有する分画(紫外線の検出、
254nm)を次いで集めた。
【0118】15の引き続くクロマトグラフィーの溶離
液からのこのタイプの分画をプールし、減圧下に濃縮
し、そして乾燥すると、150mgの精製された抗生物
質GE2270因子Tが得られた。
【0119】分析用HPLC化合物の調製 a)抗生物質GE2270の産生 プラノビスポラ・ロセア(Planobispora
rosea)ATCC53773の培養物を実施例1に
記載するように成長させた。
【0120】b)抗生物質GE2270の回収 上で得られた発酵塊(50l)を収穫し、そして濾過助
剤(Clarcell)の存在下に濾過する。
【0121】抗生物質GE2270は、ある量のそれを
また濾液から回収することができる場合でさえ、主とし
て菌糸体中に見いだされる。
【0122】a)濾液を約pH7.0に調節し、そして
酢酸エチル(50l)で抽出する。有機相を遠心により
分離し、そして小さい請求の範囲に減圧下に濃縮する。
次いで、得られた残留物を石油エーテルで処理して粗製
の抗生物質GE2270を沈澱させ、これを濾過により
集め、そして乾燥する。415mgの粗製抗生物質GE
2270複合体が得られる。
【0123】b)菌糸体を20lのメタノールで抽出
し、そしてプールした抽出物を減圧下に濃縮すると、水
性残留物が得られ、これを酢酸エチルで抽出する。粗製
抗生物質GE2270(6.06g)を濃縮有機相から
石油エーテルの添加により沈澱させる。
【0124】c)抗生物質GE2270因子Aの精製 前述の手順に従い菌糸体から得られた粗製物質(3g)
をテトラヒドロフラン中に溶解し、そしてシリカゲル
(230〜400メッシュ)の存在下に減圧下に濃縮す
る。得られた固体の残留物を集め、そして塩化メチレン
中で調製した300gのシリカゲル(230〜400メ
ッシュ)を含有するクロマトグラフィーのカラムに適用
する。カラムをまず塩化メチレン(2l)で展開し、次
いで順次に次の比の塩化メチレンおよびメタノールの
1.5lの混合物で溶離する:98/2;96/4;9
4/692/8;90/10および88/12(v/
v)。
【0125】分画を集め、TLC、HPLCによるか、
あるいは枯草菌(Bacillussubtilis)
に対して微生物学的に分析し、そしてそれらの抗生物質
の含量に従いプールする。
【0126】純粋な抗生物質GE2270因子A(HP
LCの保持時間、14.9分、参照、物理化学的デー
タ、点E、下)を含有するプールした分画を減圧下に濃
縮すると、油状残留物が得られ、これをテトラヒドロフ
ランで可溶化する。この溶液から、抗生物質GE227
0因子A(600mg)を石油エーテルの添加により沈
澱させる。
【0127】抗生物質GE2270因子Aの他の収穫物
を、前述のクロマトグラフィー合成により分離される
が、それを不純物の形態でを含有する他の分画から得ら
れる。また、これらの分画をプールし、濃縮し、そして
処理すると、前述の固体が得られる。この粗製の抗生物
質GE2270因子Aの調製物を、次の手順に従いHP
LCにより精製する:この沈澱の一部分(6mg)をア
セトニトリル:水、1:1(v/v)中に溶解し、そし
てリクロソーブ(LichrosorbR)RP8(シ
ラン化シリカゲル、7マイクロメートル)[E.Mer
ck:ドイツ国ダーマシュタット]250×10mmの
カラムのHPLCクロマトグラフィー系中に注入する。
【0128】溶離は溶液AおよびBの混合物のB中のA
の50%〜85%の直線の勾配で20分で、約4ml/
分の流速で実施する。溶液Aはアセトニトリルおよび1
8ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液の混合物70/3
0(v/v)、pH6、であるが、溶液Bはアセトニト
リルおよび18ミリモルのリン酸ナトリウム緩衝液の混
合物10/90(v/v)、pH6、である。
【0129】カラムをパーキン・エルマー(Perki
n Elmer)LC85紫外線検出器に330栄養培
地において接続する。均質な含量を有する11の引き続
くクロマトグラフィーの溶離液の分画をプールし、そし
て減圧下に濃縮してアセトニトリルを除去し、こうして
抗生物質GE2270因子Aを含有する分離された残留
溶液が得られる。これらの溶液を等しい体積の酢酸エチ
ルで2回抽出し、そして抗生物質の産生物を濃縮した有
機相から石油エーテルの添加により沈澱させることによ
って得る。濾過により回収しそして乾燥すると、27m
gの抗生物質GE2270因子Aが得られる。
【0130】抗生物質GE2270因子Aの物理化学的
特性: A)次の吸収最大を示す紫外線吸収スペクトル:
【0131】
【表17】 B)次の吸収最大(cm-1)を示すヌジョール法におけ
る赤外吸収スペクトル:
【0132】
【表18】 このスペクトルの主要な機能的赤外吸収バンドは、次の
ように割り当てられる:
【0133】
【表19】 C)内部標準としてTMS(0.00ppm)を使用す
るDMSO−d6(ヘキサジューテロジメチルスルホキ
シド)中の次のシグナル(ppm)の次の群を示す1
−NMRスペクトル;各シグナルについてのプロトンの
数はカッコ内に報告する:
【0134】
【表20】 D)内部標準としてTMS(0.00ppm)を使用す
るDMSO−d6中の125MHzにおける次のシグナ
ル(ppm)の次の群を示す13C−NMRスペクトル、
Qは第四級炭素原子またはC=O基を意味する:
【0135】
【表21】 E)次の条件下の逆相HPLC系により分析するとき、
保持時間(Rt)は14.9分である:カラム:ウルト
ラスフェアー(Ultrasphere)ODS(逆相
シラン化シリカゲル;5マイクロメートル)アルテック
ス(Altex)[ベックマン(Beckman)]
4.6mm(内径)×250mm 前カラム:ブラウンリー・ラブス(Brownlee
Labs)RP18(オクタデシルシランシリカゲル;
5マイクロメートル) 溶離液A:アセトニトリル:18ミリモルのリン酸ナト
リウム70:30(v/v)、pH7.0に調節した 溶離液B:アセトニトリル:18ミリモルのリン酸ナト
リウム10:90(v/v)、pH7.0に調節した 溶離のモード:45%〜70%の溶離剤B中の溶離剤A
の直線の勾配、20分 流速:1.8ml/分 紫外線検出器:254nm 内部標準:クロランフェニコール(Rt=3.7分) 保持時間を本発明の化合物の特性決定について上の節
D)において記載した条件下にに測定するとき、その値
は16.6分である。
【0136】F)試料を前以て約140℃に不活性雰囲
気下に乾燥した後、元素分析は次の組成を示す:炭素、
水素、窒素、硫黄; G)Rf値は次のクロマトグラフィー系において0.3
7である:ジクロロメタン:メタノール、9:1(v/
v)、シリカゲルの板(シリカゲル60F254、Mer
ck Co.)可視化:紫外線、254nm、黄色スポ
ット、ヨウ素蒸気、あるいは最小デイビス培地上で枯草
菌(Bacillussubtilis)ATCC66
33を使用するバイオオートグラフィー;内部標準:ク
ロランフェニコール(Rf0.56) H)FAB−MS分析はm/z1290.3±0.1ダ
ルトンにおいてプロトン化分子イオンの最低の分子量の
アイソトープを示す。スペクトルにおいて800m/z
分子量単位より上のすべてのピーク(アイソトープのピ
ークを数えない)は、クレイトス(Kratos)MS
−50二重収束質量分析計を次の実験条件下に使用して
分析すると、分子の20%より低かった:6kVの電圧
におけるXeの急速原子の衝突;グリセロールのマトリ
ックス;陽性のイオン化モードI)塩酸の加水分解物の
アミノ酸の分析は、次の自然のアミノ酸の存在を示す:
グリシン、(L)プロリンおよび(L)セリン、次の実
験条件下に:試料を105℃において1%のフェノール
を含有する6N HClの存在下に20時間加水分解
し、次いで次のようにして2工程で誘導化する:a)無
水プロパノール中の2モルのHClでカルボン酸官能基
のn−プロピルエステルの形成(90℃、1時間)、お
よび引き続く窒素下の乾燥;b)遊離のアミノ基をアミ
ドに、ペンタフルオロプロピオン酸無水物/無水ジクロ
ロメタン、1/9(v/v)で室温において1時間転化
し、次いで窒素下に乾燥する;そのようにして得られた
誘導化された残留物をジクロロメタン中に溶解し、そし
てGC−NSにより次の条件下にHP5985B系を使
用して分析する:カラム:キラルn−プロピオニル−L
−バリンt−ブチルアミドポリシロキサン被覆溶融シリ
カの毛管カラム(25cm×0.2mmの内径;C.
G.C.ANALYTIC);温度のプログラム:80
℃4分、次いで4℃/分;L)イオン化の研究はメチル
セロソルブ/水中の0.1N HClおよび0.1N
NaOHを使用する滴定によりイオン化性官能基を示さ
ない;弱塩基性官能基は非水性媒質(酢酸)中の0.1
HClO4を使用する滴定により明らかになる;M)比
旋光度[α]20 Dは±140.8である;無水エタノー
ル中で約5g/lの濃度で測定した。
【0137】本発明の主な特徴および態様は、次の通り
である。
【0138】1、次の特徴を有する、抗生物質GE22
70因子B1、抗生物質GE2270因子B2、抗生物質
GE2270因子C1、抗生物質GE2270因子C2
抗生物質GE2270因子D1、抗生物質GE2270
因子D2、抗生物質GE2270因子E、抗生物質GE
2270因子Tから選択される化合物:A)次の吸収最
大を示す紫外線吸収スペクトル:抗生物質GE2270因子B1、B2、C1、C2、D1
2およびE
【0139】
【表22】 抗生物質GE2270因子T
【0140】
【表23】 B)次の吸収最大ν(cm-1)を示すヌジョール法にお
ける赤外吸収スペクトル(抗生物質GE2270因子D
1、D2、EおよびT):
【0141】
【表24】 C)内部標準としてTMS(0.00ppm)[δ、p
pm、m]を使用するDMSO−d6(ヘキサジューテ
ロジメチルスルホキシド)中の次のシグナルの群を示す
1H−NMRスペクトル(s=一重線、br s=広い
一重線、d=二重線、dd=二重線の二重線、t=三重
線、m=多重線、Py=ピリジン、Tz=チアゾール)因子D1 (500MHzにおいて記録した):8.8
8、d、(NH);8.70、d、(2NH);8.5
7、s、8.50、s、8.25、s、8.21、sお
よび7.35、s、(5チアゾールのCH);8.4
0、m、(グリシンのNH);8.28−8.21、
m、(ピリジンのCH);7.32−7.20、m、
(芳香族のCHおよび第一アミドのNH);7.00、
s、6.64、s、6.53、s、(第一アミドのN
H);5.95、d、(OH);5.29−5.15、
m、(αCH);5.04、m、(フェニルセリンのβ
CH);4.81、mおよび4.56、m、(オキサゾ
リンのCH2);4.30−3.80、m、(グリシン
のCH2およびプロリンアミドのCH);2.72、
m、および1.43、m、(アスパラギンのCH2);
2.60、s、(CH3);2.21−1.91、
(m)、(イソプロピルのCHおよびプロリンアミドの
CH);0.90(d)および0.86(d)、(バリ
ンのCH3因子D2 (500MHzにおいて記録した):9.0
0、d、(NH);8.69、br s(2NH);
8.59、s、8.53、s、8.29、sおよび7.
35、s、(チアゾールのCH);8.38、m、(グ
リシンのNH);8.40および8.26(m)、(P
yのCH);7.37−7.18、m、(芳香族のC
H、第一アミドのNH);6.97、s、(第一アミド
のNH);6.03、dおよびt、(2OH);5.2
8−5.16、m、(αCH);5.03、m、(βC
H);4.97、m、[CH2(OH)];4.79お
よび4.55、m、(オキサゾリンのCH2);3.9
7−3.76、m、(グリシンのCH2およびプロリン
アミドのCH);2.71、mおよび1.28、m、
(N−メチルアスパラギンのCH2);2.18−1.
89、m、(イソプロピルのCHおよびプロリンアミド
のCH2);0.88、dおよび0.84、d、(バリ
ンのCH3因子E (500MHzにおいて記録した):8.95、
d、(NH);8.73、d、(NH);8.60、
s、(TzのCH);8.57、d、(NH);8.5
3、s、(TzのCH);8.42、m、(PyのC
H);8.31、m、(NH);8.28、m、(Py
のCH);8.24、s、(TzのCH);7.33、
s、(TzのCH);7.31−7.20、m、(芳香
族のCH、第一アミドのNH);6.98、s、6.9
1、s、6.62、s、(第一アミドのNH);6.0
4、d、(OH);5.95、t、(OH);5.28
−5.14、m、(αCH);5.03、m、(βC
H);4.99、m、[CH2(OH)];4.81、
ddおよび4.57、dd、(オキサゾリンのC
2);4.26(m)および3.79(m)、(グリ
シンのCH2);4.25、m、3.98、m、3.8
2、m、(プロリンアミドのCH);2.77、m、お
よび1.25、m、(アスパラギンのCH2);2.2
0、m、および1.89、m、(バリンのβCHおよび
プロリンアミドのCH2);0.90、d、0.84、
d、(バリンのCH3因子T (250MHzにおいて記録した):8.95、
d、(NH);8.70、d、(2NH);8.66、
s、8.65、s、8.60、8.30、sおよび7.
38、s、(4チアゾールおよび1オキサゾールのC
H);7.35−7.24、m、(芳香族のCHおよび
第一アミドのNH);6.68(第一アミドのNH);
5.96、d、(OH);5.34−5.18、m、
(αCH);5.05、m、(βCH);5.03、
s、[CH2(OCH3)];4.32、mおよび3.8
2、m、(グリシンのCH2);4.48、m、4.0
4、mおよび3.63、m、(プロリンアミドのC
H);3.40、s、(OCH3);2.73、mおよ
び1.41、m、(N−メチルアスパラギンのCH);
2.60、s、(CH3);2.49、d、(N−メチ
ルアスパラギンのCH3);2.27−1.88、m、
(イソプロピルのCHおよびプロリンアミドのC
2);0.89、d、(バリンのCH3)D)次の逆相
HPLC系における保持時間(Rt)(抗生物質GE2
270因子B1、B2、C1、C2、D1、D2、Eおよび
T):カラム :ベイカーボンド(BakerbondR)C8
(5μm)4.6×250mm[Bakerbondは
J.T.ベイカー・リサーチ・プロダクト(Baker
Research Product)、米国ニュージ
ャージイ州08865フィリスバーグ、により供給され
る逆相オクチルシリルシリカゲルのHPLCカラムの商
品名である]流速 :1.8ml/分相A :CH3CN:テトラヒドロフラン:40ミリモル
のHCOONH440:40:20相B :CH3CN:テトラヒドロフラン:40ミリモル
のHCOONH410:10:80溶離 :20分における相Aの20%〜30%の直線の勾
検出 :UV254nm 結果は次の通りである:
【0142】
【表25】 E)質量FAB−MSピーク[クレイトス(Krato
s)MS−50二重収束質量分析計で得た、6kVの電
圧および1mAの電流において8kVの加速電圧および
Xeガス(ソースイオンゲージ上に示される2×10-5
トルの圧力)のサドルフィールド(saddle fi
eld)の原子ガンを使用する、試料は0.1モルの酢
酸を含有するチオグリコールのマトリックスと混合す
る]は、次の通りである:
【0143】
【表26】 2.次の式を有する抗生物質GE2270因子D1であ
る上記第1項記載の化合物:
【0144】
【化5】 3.次の式を有する抗生物質GE2270因子D2であ
る上記第1項記載の化合物:
【0145】
【化6】 4.次の式を有する抗生物質GE2270因子Eである
上記第1項記載の化合物:
【0146】
【化7】 5.次の式を有する抗生物質GE2270因子Tである
上記第1項記載の化合物:
【0147】
【化8】 6.プラノビスポラ・ロセア(Planobispor
a rosea)ATCC53773またはそのGE2
270産生突然変異体または変異型を深部好気性条件下
に発酵して得られる抗生物質の混合物をクロマトグラフ
ィー技術により分離することからなる、抗生物質GE2
270因子B1、抗生物質GE2270因子B2、抗生物
質GE2270因子C1、抗生物質GE2270因子
2、抗生物質GE2270因子D1、抗生物質GE22
70因子D2、抗生物質GE2270因子E、抗生物質
GE2270因子Tから選択される化合物の製造方法。
【0148】7、分離は逆相クロマトグラフィーにより
実施する、上記第6項記載の方法。 8、分離はHPLC逆相クロマトグラフィーにより実施
する、上記第6項記載の方法。
【0149】9、逆相クロマトグラフィーの静止相はC
8−C22アルキル官能基またはシクロヘキシルまたはフ
ェニル官能基により表される、上記第7または8項記載
の方法。
【0150】10、分離工程にかけるプラノビスポラ・
ロセア(Planobisporarosea)ATC
C53773またはそのGE2270産生突然変異また
は変異型を深部好気性条件下に発酵して得られた抗生物
質の混合物を、菌糸体から、水混和性溶媒で抽出し、次
いで濃縮した水性抽出物から、必要に応じて、水不混和
性有機溶媒を使用する抽出により、回収する、上記第6
〜9項のいずれかに記載の方法。
【0151】11、製剤学的に許容されうる担体と混合
して上記第1〜5項のいずれかに記載の化合物を含有す
る製剤学的組成物。
【0152】12、薬物として使用するのための上記第
1〜5項のいずれかに記載の化合物。
【0153】13、抗微生物的に使用する薬物を調製す
るための上記第1〜5項のいずれかに記載の化合物の使
用。
【0154】14、動物の成長促進剤として上記第1〜
5項のいずれかに記載の化合物の使用。
【図面の簡単な説明】
【図1】抗生物質GE2270因子Eおよび因子Tの1
H−NMRスペクトルを示す。
【図2】抗生物質GE2270因子Eおよび因子Tの1
H−NMRスペクトルを示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 FI C12R 1:01) (72)発明者 エルメネジルド・レステリ イタリア・バレーゼ・21040ジエレンツ アーノ・ビアロベロ57 (72)発明者 ピエトロ・フエラリ イタリア・ミラノ・20024ガルバニヤー テミラネーゼ・ビアエンリコトテイ60 /エイ (72)発明者 マウリツイオ・デナロ イタリア・ミラノ・20090オペラ・スポ ルテイングミラソレ34/21 (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C07D 513/22 A61K 31/44 A61P 31/00 C12P 17/18 CA(STN) REGISTRY(STN) WPI(DIALOG) BIOSIS(DIALOG)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 下記の構造式で示される、抗生物質GE
    2270因子B1、抗生物質GE2270因子B2、抗生
    物質GE2270因子C1、抗生物質GE2270因子
    2、抗生物質GE2270因子D1、抗生物質GE22
    70因子D2、抗生物質GE2270因子E及び抗生物
    質GE2270因子Tから選ばれる化合物: 【化9】
  2. 【請求項2】 プラノビスポラ・ロセア(Planob
    ispora rosea)ATCC53773または
    そのGE2270産生突然変異体または変異型を深部好
    気性条件下に発酵して得られる抗生物質の混合物をクロ
    マトグラフィー技術により分離することを特徴とする、
    抗生物質GE2270因子B1、抗生物質GE2270
    因子B2、抗生物質GE2270因子C1、抗生物質GE
    2270因子C2、抗生物質GE2270因子D1、抗生
    物質GE2270因子D2、抗生物質GE2270因子
    E及び抗生物質GE2270因子Tから選ばれる化合物
    の製造方法。
  3. 【請求項3】 請求項1記載の化合物を有効成分として
    含有することを特徴とする抗菌剤。
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