JP3070768B2 - カタラーゼ、その製法および使用 - Google Patents
カタラーゼ、その製法および使用Info
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- C11D3/38636—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase containing enzymes other than protease, amylase, lipase, cellulase, oxidase or reductase
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- Y10S134/901—Contact lens
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- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
- Y10S435/8215—Microorganisms
- Y10S435/911—Microorganisms using fungi
Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明は、新規なカタラーゼ調製品、その製造方法お
よび過酸化水素の除去におけるその使用に関する。
よび過酸化水素の除去におけるその使用に関する。
背景技術 カタラーゼ（ECL.11.1.6）は、過酸化水素の水および
酸素分子への分解を触媒する。該カタラーゼは、例えば
パスツール殺菌法又は漂白に対し、過酸化水素が添加さ
れる場合の適用に於て残留過酸化水素を除去するために
使用できる。
酸素分子への分解を触媒する。該カタラーゼは、例えば
パスツール殺菌法又は漂白に対し、過酸化水素が添加さ
れる場合の適用に於て残留過酸化水素を除去するために
使用できる。
かくして、染色前にアルカリ性過酸化水素処理により
漂白される布帛から過酸化水素を除去するため繊維産業
においてカタラーゼを用いることが示唆された（英国特
許2,216,149、特開平２−104781）。ペルオキシド漂白
は、通常高pHおよび高温で、例えば80〜100℃およびpH1
0又はそれ以上で行なわれ、そして従って中和および冷
却に対する要求を避けるため又は最少化するため高pHお
よび高温度で良好な安定性を有するカタラーゼを用いる
ことが望ましい。
漂白される布帛から過酸化水素を除去するため繊維産業
においてカタラーゼを用いることが示唆された（英国特
許2,216,149、特開平２−104781）。ペルオキシド漂白
は、通常高pHおよび高温で、例えば80〜100℃およびpH1
0又はそれ以上で行なわれ、そして従って中和および冷
却に対する要求を避けるため又は最少化するため高pHお
よび高温度で良好な安定性を有するカタラーゼを用いる
ことが望ましい。
カタラーゼは、動物源（例えば牛の肝臓）および多く
の異なる微生物の双方から公知である。特開平２−7657
9は、pH3〜８でアスペルギルスニガー株NFAG−２由来の
カタラーゼを開示する。英国特許2,216,149はペニシリ
ウム由来のカタラーゼは高pHで良好な安定性を有するこ
とを述べている。
の異なる微生物の双方から公知である。特開平２−7657
9は、pH3〜８でアスペルギルスニガー株NFAG−２由来の
カタラーゼを開示する。英国特許2,216,149はペニシリ
ウム由来のカタラーゼは高pHで良好な安定性を有するこ
とを述べている。
本発明の目的は、このようなプロセスに於いて使用す
るための改良されたカタラーゼを提供することを目的と
する。
るための改良されたカタラーゼを提供することを目的と
する。
発明の開示 本発明者等は、予期に反し次の内容を見出した。すな
わち、新規カタラーゼを、カタラーゼを産生することが
これまで報告されていない２つの属、シタリジウム（Sc
ytalidium）およびフミコラ（Humicola）から得ること
ができる。更に、本発明者等は、驚くべきことにこの新
規カタラーゼが公知のカタラーゼよりも高pHおよび高温
度でより良い安定性を有していることを見出した。
わち、新規カタラーゼを、カタラーゼを産生することが
これまで報告されていない２つの属、シタリジウム（Sc
ytalidium）およびフミコラ（Humicola）から得ること
ができる。更に、本発明者等は、驚くべきことにこの新
規カタラーゼが公知のカタラーゼよりも高pHおよび高温
度でより良い安定性を有していることを見出した。
従って、本発明は、約６〜８の至適pH並びにシタリジ
ウムのカタラーゼ産生株によって産生されるカタラーゼ
の免疫化学的性質と同一の免疫化学的性質を有すること
を特徴とするカタラーゼを提供する。もう一つの面に於
て、本発明は、シタリジウムの株から由来しそして40pp
mのポリビニルピロリドンの存在下、70℃、pH9〜10.5で
20分後少なくとも75％の残留活性を有することを特徴と
するカタラーゼ調製品を提供する。
ウムのカタラーゼ産生株によって産生されるカタラーゼ
の免疫化学的性質と同一の免疫化学的性質を有すること
を特徴とするカタラーゼを提供する。もう一つの面に於
て、本発明は、シタリジウムの株から由来しそして40pp
mのポリビニルピロリドンの存在下、70℃、pH9〜10.5で
20分後少なくとも75％の残留活性を有することを特徴と
するカタラーゼ調製品を提供する。
本発明は更にカタラーゼの製造方法を提供するもので
あり、この方法はフミコラ属又はシタリジウム属の株か
ら由来するカタラーゼをコードしそして発現する遺伝子
を含有する微生物を適当な栄養培地中で培養し、好まし
くは引き続き培養培地からカタラーゼを回収することを
含んでなる。最後に、本発明は過酸化水素の除去におけ
る該カタラーゼの使用を提供する。
あり、この方法はフミコラ属又はシタリジウム属の株か
ら由来するカタラーゼをコードしそして発現する遺伝子
を含有する微生物を適当な栄養培地中で培養し、好まし
くは引き続き培養培地からカタラーゼを回収することを
含んでなる。最後に、本発明は過酸化水素の除去におけ
る該カタラーゼの使用を提供する。
発明の詳細な説明 微生物 フミコラ−シタリジウム複合体（complex）は、D.H.
エリスにより、Trans.Br.Mycol.Soc.78（１）,129〜139
（1982）に記載されている。この複合体に属する全ての
単離物は２つの明確な種に位置づけできる：フミコライ
ンソレンス（クーニーアンドエマーソン）およびシタリ
ジウムサーモフィラム（クーニーアンドエマーソン）ア
ウストヴィック。
エリスにより、Trans.Br.Mycol.Soc.78（１）,129〜139
（1982）に記載されている。この複合体に属する全ての
単離物は２つの明確な種に位置づけできる：フミコライ
ンソレンス（クーニーアンドエマーソン）およびシタリ
ジウムサーモフィラム（クーニーアンドエマーソン）ア
ウストヴィック。
シタリジウム属の定義および分類は、ペサンテによ
り、1957,Annali Sper.Agr.N.S.,11,Suppl.:CCLXI−CCL
XVに、およびM.B.エリスにより（1971）,Dematiaceous
Hyphomycetes,Commonwealth Mycological Institute,Ke
w,Surrey,英国、28頁に記載されている。
り、1957,Annali Sper.Agr.N.S.,11,Suppl.:CCLXI−CCL
XVに、およびM.B.エリスにより（1971）,Dematiaceous
Hyphomycetes,Commonwealth Mycological Institute,Ke
w,Surrey,英国、28頁に記載されている。
S.サーモフィラムのカタラーゼ産生株の例は、株ATCC
28085,ATCC48409およびCBS671.88であり、更にH.インソ
レンスのカタラーゼ産生株は株UAMH2925,IMI158747およ
びATCC34627であり、アメリカンタイプ カルチュア
コレクション、セントラルビュロー ヴォール ジーメ
ル カルチュレン、ユニバーシティ オブ アルバータ
ミクロファンガス コレクションおよびハルバリアお
よびCABインタナショナル マイコロジカル インステ
ィチュートからそれぞれ公に入手可能である。
28085,ATCC48409およびCBS671.88であり、更にH.インソ
レンスのカタラーゼ産生株は株UAMH2925,IMI158747およ
びATCC34627であり、アメリカンタイプ カルチュア
コレクション、セントラルビュロー ヴォール ジーメ
ル カルチュレン、ユニバーシティ オブ アルバータ
ミクロファンガス コレクションおよびハルバリアお
よびCABインタナショナル マイコロジカル インステ
ィチュートからそれぞれ公に入手可能である。
フミコラ−シタリジウム複合体は、フミコラ グリゼ
−var.サーモイデア クーニーアンドエマーソン、H.イ
ンソレンス クーニーアンドエマーソンおよびトルラ
サーモフィラ クーニーアンドエマーソンとしてすでに
分類された好熱性ヒポミセテスを含み、クーニー、D.G.
アンドエマーソン、Ｒに於て記載されている：好熱性菌
類。それらの生物学上の説明、活性および分類。サンフ
ランシスコ：フリーマン（1964）。
−var.サーモイデア クーニーアンドエマーソン、H.イ
ンソレンス クーニーアンドエマーソンおよびトルラ
サーモフィラ クーニーアンドエマーソンとしてすでに
分類された好熱性ヒポミセテスを含み、クーニー、D.G.
アンドエマーソン、Ｒに於て記載されている：好熱性菌
類。それらの生物学上の説明、活性および分類。サンフ
ランシスコ：フリーマン（1964）。
株ATCC28805は、トルラサーモフィラとして既に分類
された。トルラサーモフィラはアウスヴィックによりシ
タリジウムサーモフィラムとして今や再分類されてい
る、P.C.K.,New Zealand Journal of Agricultural res
earch,19,25−33（1976）。
された。トルラサーモフィラはアウスヴィックによりシ
タリジウムサーモフィラムとして今や再分類されてい
る、P.C.K.,New Zealand Journal of Agricultural res
earch,19,25−33（1976）。
カタラーゼの産生 本発明のカタラーゼは、適当な炭素および窒素源を含
有する栄養培地（このような培地は業界公知である）上
で前記微生物株の好気性培養によって産生できる。40〜
60℃の範囲内の温度が増殖およびカタラーゼ産生に対し
て適当である。
有する栄養培地（このような培地は業界公知である）上
で前記微生物株の好気性培養によって産生できる。40〜
60℃の範囲内の温度が増殖およびカタラーゼ産生に対し
て適当である。
別に、本発明のカタラーゼは前記菌株からの適当な遺
伝情報を含有する形質転換された宿主生物を好気性培養
することにより産生できる。このような形質転換体は、
業界公知の方法により得ることができそして培養でき
る。
伝情報を含有する形質転換された宿主生物を好気性培養
することにより産生できる。このような形質転換体は、
業界公知の方法により得ることができそして培養でき
る。
カタラーゼは、（例えば濾過により）発酵培地から細
胞を除去し次いで（例えば限界濾過により）ブロスを濃
縮することにより回収できる。所望により、カタラーゼ
は公知方法により更に精製できる。
胞を除去し次いで（例えば限界濾過により）ブロスを濃
縮することにより回収できる。所望により、カタラーゼ
は公知方法により更に精製できる。
カタラーゼ調製品 プロテアーゼを含まないカタラーゼ調製品は、より良
き安定性のために一般に好ましい。本発明で用いられる
幾つかの菌株は、プロテアーゼを産生できるがしかし、
プロテアーゼを含まないカタラーゼ産生株は、突然変異
により又は公知の方法によりカタラーゼをコードする遺
伝子をプロテアーゼを含まない形質転換体に移入するこ
とによって得ることができる。
き安定性のために一般に好ましい。本発明で用いられる
幾つかの菌株は、プロテアーゼを産生できるがしかし、
プロテアーゼを含まないカタラーゼ産生株は、突然変異
により又は公知の方法によりカタラーゼをコードする遺
伝子をプロテアーゼを含まない形質転換体に移入するこ
とによって得ることができる。
カタラーゼ調製品は、固体又は液体の形態であってよ
い。貯蔵安定性の液体調製品は、中性に近いpHで公知の
安定剤、例えばプロピレングリコールを用いることによ
って生産できる。
い。貯蔵安定性の液体調製品は、中性に近いpHで公知の
安定剤、例えばプロピレングリコールを用いることによ
って生産できる。
免疫化学的性質 Ｓサーモフィラム株ATCC28085由来のカタラーゼの免
疫化学的性質と同一又は部分的同一を有し更に上記の熱
安定性を有するカタラーゼは又、本発明の範囲内であ
る。
疫化学的性質と同一又は部分的同一を有し更に上記の熱
安定性を有するカタラーゼは又、本発明の範囲内であ
る。
免疫化学的性質を交差反応同一性試験によって免疫学
的に測定できる。同一性試験は、周知のオクテルロニー
二重免疫拡散法又はアレクセン,N.H.（Handbook of Imm
unoprecipitation−in−Gel Techniques;ブラックウェ
ルサイエンティフィックパブリケーション（1983）、５
章および14章）に従った双頭交差免疫電気泳動によって
行うことができる。語句「抗原の同一性」および「部分
的抗原の同一性」は同書中、５章、19章および20章に記
載されている。
的に測定できる。同一性試験は、周知のオクテルロニー
二重免疫拡散法又はアレクセン,N.H.（Handbook of Imm
unoprecipitation−in−Gel Techniques;ブラックウェ
ルサイエンティフィックパブリケーション（1983）、５
章および14章）に従った双頭交差免疫電気泳動によって
行うことができる。語句「抗原の同一性」および「部分
的抗原の同一性」は同書中、５章、19章および20章に記
載されている。
抗原の同一性を明らかにするため、精製シタリジウム
サーモフィラムカタラーゼに対し上昇した家兎の抗血清
並びにS.サーモフィラムATCC48409およびCBS671.88並び
にH.インソレンスUAMH2925,IMI158747およびATCC34627
の培養物の上澄みおよびカタザイム（Catazyme）（登録
商標）のサンプル、アスペルギルスニガー由来のカタラ
ーゼ調製品を用い、オクテルロニー二重免疫拡散法を行
った。
サーモフィラムカタラーゼに対し上昇した家兎の抗血清
並びにS.サーモフィラムATCC48409およびCBS671.88並び
にH.インソレンスUAMH2925,IMI158747およびATCC34627
の培養物の上澄みおよびカタザイム（Catazyme）（登録
商標）のサンプル、アスペルギルスニガー由来のカタラ
ーゼ調製品を用い、オクテルロニー二重免疫拡散法を行
った。
得られたパターンは、シタリジウムおよびフミコラ株
によって産生されるカタラーゼの完全な同一性を示し、
そしてシタリジウムカタラーゼとA.ニガーカタラーゼ間
には、アクセルセンの本15章に記載される如く、同一性
は示されなかった。
によって産生されるカタラーゼの完全な同一性を示し、
そしてシタリジウムカタラーゼとA.ニガーカタラーゼ間
には、アクセルセンの本15章に記載される如く、同一性
は示されなかった。
熱安定性 本発明のカタラーゼの熱安定性は、従来技術の酵素よ
りもより良いものであり、そして少なくともpH10.5まで
は、pHに殆ど独立している。本発明のカタラーゼは、高
pHにより更に不安定となるA.ニガー由来の従来技術のカ
タラーゼよりも10℃高い温度（少なくとも70℃）に耐え
ることができる。
りもより良いものであり、そして少なくともpH10.5まで
は、pHに殆ど独立している。本発明のカタラーゼは、高
pHにより更に不安定となるA.ニガー由来の従来技術のカ
タラーゼよりも10℃高い温度（少なくとも70℃）に耐え
ることができる。
下記の表は、２つの酵素の熱安定性を比較する。各々
の酵素を0.05Mのホスフェート緩衝液又は0.18％の珪酸
ナトリウム＋0.05％のNa2CO3（後者は＊によって示され
る）中、指示された温度、pHおよび時間でインキュベー
トし、次いで残存活性をCIU（後述する）で測定した。4
0ppmのポリビニルピロリドンが全ての場合に存在した。
H2O2は存在しなかった。
の酵素を0.05Mのホスフェート緩衝液又は0.18％の珪酸
ナトリウム＋0.05％のNa2CO3（後者は＊によって示され
る）中、指示された温度、pHおよび時間でインキュベー
トし、次いで残存活性をCIU（後述する）で測定した。4
0ppmのポリビニルピロリドンが全ての場合に存在した。
H2O2は存在しなかった。
かくして、本発明のカタラーゼは、pH9〜10.5に於
て、60℃で60分後少なくとも90％の活性を保持しそして
70℃で20分後少なくとも75％、40分後少なくとも60％お
よび60分後少なくとも50％を保持する。
て、60℃で60分後少なくとも90％の活性を保持しそして
70℃で20分後少なくとも75％、40分後少なくとも60％お
よび60分後少なくとも50％を保持する。
貯蔵安定度 本発明のカタラーゼの水性溶液は、37℃で、pH5.5〜
7.0で４週間の貯蔵後検知できる活性の損失を示さなか
った。A.ニガー由来の従来のカタラーゼを用いた類似の
実験は90％未満の残留活性を示した。
7.0で４週間の貯蔵後検知できる活性の損失を示さなか
った。A.ニガー由来の従来のカタラーゼを用いた類似の
実験は90％未満の残留活性を示した。
酵素化学的性質 図１は本発明のカタラーゼ（例２の培養物の濾液）に
対する活性対pHを示し、A.ニガー由来の従来技術のカタ
ラーゼ（特開平２−76579）と比較した。本発明のカタ
ラーゼは、約pH7に活性の至適pH（一方、従来技術の酵
素は5.5）を有しそしてpH4〜９の範囲内に最大活性の90
％以上を有する全く水平なpH/活性曲線を有する。
対する活性対pHを示し、A.ニガー由来の従来技術のカタ
ラーゼ（特開平２−76579）と比較した。本発明のカタ
ラーゼは、約pH7に活性の至適pH（一方、従来技術の酵
素は5.5）を有しそしてpH4〜９の範囲内に最大活性の90
％以上を有する全く水平なpH/活性曲線を有する。
次の性質は、例５の精製酵素を用いて決定された。
分子量MW＝約92,000（ファラマファスト（Pharamap
hast）SDSによる） 等電点pI＝約4.5（ファラマファストIEFによる） 純粋な酵素蛋白質の特異点カタラーゼ活性 ＝約16,300 CIU/mg蛋白質（CIUについては
下記参照、ビュレット法によって測定される蛋白質）。
hast）SDSによる） 等電点pI＝約4.5（ファラマファストIEFによる） 純粋な酵素蛋白質の特異点カタラーゼ活性 ＝約16,300 CIU/mg蛋白質（CIUについては
下記参照、ビュレット法によって測定される蛋白質）。
過酸化水素の除去 本発明のカタラーゼは、パスツール殺菌法、漂白、悪
臭除去又は他の目的に対して過酸化水素が添加される全
ての適用に於て、残留の過酸化水素を除去するために用
いることができる。このような使用の例は繊維加工、コ
ンタクトレンズの洗浄および（特開平２−76579に記載
の如く）にしんの卵の処理である。
臭除去又は他の目的に対して過酸化水素が添加される全
ての適用に於て、残留の過酸化水素を除去するために用
いることができる。このような使用の例は繊維加工、コ
ンタクトレンズの洗浄および（特開平２−76579に記載
の如く）にしんの卵の処理である。
繊維産業に於て、漂白剤としてその使用後残留ペルオ
キシドを除去することにより均一な染色を確保するため
に使用できる。プロセスは、英国特許2,216,149および
特開平２−104781に記載されている。典型的には、カタ
ラーゼ処理は、60〜100℃、pH9〜11で10〜30分間、特に
60〜70℃、pH9〜10.5で10〜60分間起こる。典型的に
は、初期過酸化水素濃度は200〜2000rpmであり、そして
カタラーゼ用量は3,000〜30,000 CIU/（単位は以下に
記載）である。
キシドを除去することにより均一な染色を確保するため
に使用できる。プロセスは、英国特許2,216,149および
特開平２−104781に記載されている。典型的には、カタ
ラーゼ処理は、60〜100℃、pH9〜11で10〜30分間、特に
60〜70℃、pH9〜10.5で10〜60分間起こる。典型的に
は、初期過酸化水素濃度は200〜2000rpmであり、そして
カタラーゼ用量は3,000〜30,000 CIU/（単位は以下に
記載）である。
コンタクトレンズの日常の注意に於て、過酸化水素に
より消毒されそしてほゞ中性のpHの生理食塩溶液中カタ
ラーゼで処理される。良好な貯蔵安定性の故に、本発明
のカタラーゼはこの目的に十分適合し得る。
より消毒されそしてほゞ中性のpHの生理食塩溶液中カタ
ラーゼで処理される。良好な貯蔵安定性の故に、本発明
のカタラーゼはこの目的に十分適合し得る。
カタラーゼ測定 １カタラーゼ単位CIUは、pH7.0,25℃で毎分H2O2の１
μmoleを分解するであろう、一方H2O2濃度は1mlの反応
混合物当たり10.3μmolesから9.2μmolesに減少する。
過酸化水素の分解は、240nmで分光光度的に追跡され
る。
μmoleを分解するであろう、一方H2O2濃度は1mlの反応
混合物当たり10.3μmolesから9.2μmolesに減少する。
過酸化水素の分解は、240nmで分光光度的に追跡され
る。
例１ S.サーモフィラムの培養 30g/のデキストリン、50g/のファルマメディア
（pharmamedia）、0.2g/のMgSO4・7H2O、8g/のNa2H
PO4・12H2O、3g/のKH2PO4、0.1ml/プルロニックを
含有する培地100mlを、２個のじゃま板を備えた500mlの
エルレンマイヤーフラスコに入れた。120℃で20分間行
なわれる殺菌（オートクレーブ処理）前にpHを7.0に調
節した。殺菌した培地に、シタリジウムサーモフィラ
ム、ATCC28085の胞子形成増殖物を含有するバクトポテ
トデキストロース寒天（ディフコ）の小片を接種した。
この培養株を軌道振とう器上で250rpmで６日間まで40℃
で増殖せしめる。
（pharmamedia）、0.2g/のMgSO4・7H2O、8g/のNa2H
PO4・12H2O、3g/のKH2PO4、0.1ml/プルロニックを
含有する培地100mlを、２個のじゃま板を備えた500mlの
エルレンマイヤーフラスコに入れた。120℃で20分間行
なわれる殺菌（オートクレーブ処理）前にpHを7.0に調
節した。殺菌した培地に、シタリジウムサーモフィラ
ム、ATCC28085の胞子形成増殖物を含有するバクトポテ
トデキストロース寒天（ディフコ）の小片を接種した。
この培養株を軌道振とう器上で250rpmで６日間まで40℃
で増殖せしめる。
例２ S.サーモフィラムの培養 シタリジウムサーモフィラム、ATCC28085を、例１に
於けると同様に４〜６日間培養し、次いでこの培養物の
5mlを例１に於けると同様に100mlの培地に接種し、次い
でこの新たな培養株を例１に於けると類似の条件下で75
時間増殖せしめた。75時間後のpHは8.6であった。この
培養物の濾液は10,700CIU/mlのカタラーゼ力価を有して
いた。
於けると同様に４〜６日間培養し、次いでこの培養物の
5mlを例１に於けると同様に100mlの培地に接種し、次い
でこの新たな培養株を例１に於けると類似の条件下で75
時間増殖せしめた。75時間後のpHは8.6であった。この
培養物の濾液は10,700CIU/mlのカタラーゼ力価を有して
いた。
例３ H.インソレンスの培養 例１で用いた培地100mlに、フミコラインソレンスIMI
158747の十分な増殖物を含有するバクトポテトデキスト
ロース寒天（ディフコ）の小片を接種した。この培養株
を軌道振とう器上で250rpmで３日間まで30℃で増殖せし
めた。この培養物5mlを例１に於ける如く100mlの培地に
接種し、次いでこの新たな培養株を軌道振とう器上で25
0rpmで30℃で165時間増殖せしめた。165時間後のpHは8.
5であった。この培養物の濾液は3820CIU/mlのカタラー
ゼ力価を有していた。
158747の十分な増殖物を含有するバクトポテトデキスト
ロース寒天（ディフコ）の小片を接種した。この培養株
を軌道振とう器上で250rpmで３日間まで30℃で増殖せし
めた。この培養物5mlを例１に於ける如く100mlの培地に
接種し、次いでこの新たな培養株を軌道振とう器上で25
0rpmで30℃で165時間増殖せしめた。165時間後のpHは8.
5であった。この培養物の濾液は3820CIU/mlのカタラー
ゼ力価を有していた。
例４ 本発明のカタラーゼを、60℃,pH10で過酸化水素の除
去に於て２種の従来技術の酵素と比較した。
去に於て２種の従来技術の酵素と比較した。
例２の培養物の濾液を、特開平２−76579に従って得
られたA.ニガー由来のカタラーゼおよび商業上のカタラ
ーゼ製品ASK TM25（三菱ガス化学社製品）と共に試験し
た。
られたA.ニガー由来のカタラーゼおよび商業上のカタラ
ーゼ製品ASK TM25（三菱ガス化学社製品）と共に試験し
た。
反応条件は60℃,pH10（１当たり0.4gのNaHCO3＋0.6
gのNa2CO3）,25〜1500rpmのH2O2（以下に示す如し）お
よび酵素濃度2000〜30000CIU/（以下に示す如し）で
あった。
gのNa2CO3）,25〜1500rpmのH2O2（以下に示す如し）お
よび酵素濃度2000〜30000CIU/（以下に示す如し）で
あった。
残留H2O2をメルクペルオキシド試験紙により検出し
た。これは、H2O2濃度に酵素添加後10分、15分および20
分に行った。
た。これは、H2O2濃度に酵素添加後10分、15分および20
分に行った。
結果を以下の表に示すが、表中次の記号を用いる： ◎ 過酸化水素は10分以内に除去 ○ 過酸化水素は15分以内に除去 △ 過酸化水素は20分以内に除去 − 過酸化水素は20分以内に除去されず Ａ カタラーゼ用量（CIU/） Ｂ H2O2（ppm） 結果は、明らかに本発明のカタラーゼが高温度および
高pHでの過酸化水素の除去に対し従来技術の酵素よりも
秀れている。かくして、本発明のカタラーゼの6000CIU/
は10分以内に25〜100ppmの過酸化水素を除去できた。
高pHでの過酸化水素の除去に対し従来技術の酵素よりも
秀れている。かくして、本発明のカタラーゼの6000CIU/
は10分以内に25〜100ppmの過酸化水素を除去できた。
例５ 60℃で過酸化水素の除去 1000ppmのH2O2を含有する（以下に示す如き）pH9又は
10の0.05Mのホスフェート緩衝液中、60℃で実験を行っ
た。本発明のカタラーゼ10CIU/ml（例２の培養物の濾
液）を加え、次いでH2O2の量を、20分、40分および60分
後に測定した。結果（ppm H2O2）： pH9 pH10 20分 ８ 11 40分 ５ 7 60分 ５ 6 ブランク（酵素なし）： 60分 ＞900 850 これらの結果は、これらの条件でH2O2の極めて低レベ
ルへの減少を示し、一方例４はpH10で20分以内で不完全
な除去を示した。
10の0.05Mのホスフェート緩衝液中、60℃で実験を行っ
た。本発明のカタラーゼ10CIU/ml（例２の培養物の濾
液）を加え、次いでH2O2の量を、20分、40分および60分
後に測定した。結果（ppm H2O2）： pH9 pH10 20分 ８ 11 40分 ５ 7 60分 ５ 6 ブランク（酵素なし）： 60分 ＞900 850 これらの結果は、これらの条件でH2O2の極めて低レベ
ルへの減少を示し、一方例４はpH10で20分以内で不完全
な除去を示した。
例６ カタラーゼの精製 42％w/wエタノールを例１に於けると同様に得られた
培養物の濾液に添加しカタラーゼを沈殿せしめた。遠心
分離後、沈殿物を元の容量までイオン交換された水に再
溶解した。
培養物の濾液に添加しカタラーゼを沈殿せしめた。遠心
分離後、沈殿物を元の容量までイオン交換された水に再
溶解した。
pHを4.5に調節し次いで再溶解したカタラーゼを３％w
/wのベントナイト（Clarite BW）および３％w/wの活性
炭（Pricatif FGV）で処理した（室温、１時間撹拌）。
ベントナイトおよび活性炭を遠心分離により除去し、次
いで滅菌濾過した。
/wのベントナイト（Clarite BW）および３％w/wの活性
炭（Pricatif FGV）で処理した（室温、１時間撹拌）。
ベントナイトおよび活性炭を遠心分離により除去し、次
いで滅菌濾過した。
pHを5.0に調節し次いで濾液をバッチプロセスに於てC
M−セファロース（ファルマシア）を用い４℃で一夜処
理した（200,000CIU当たり1mlのCM−セファロース）。
イオン交換樹脂を、pH5.0で0.025Mのホスフェート緩衝
液および0.09MのNaClの10容量を用いて洗浄した。
M−セファロース（ファルマシア）を用い４℃で一夜処
理した（200,000CIU当たり1mlのCM−セファロース）。
イオン交換樹脂を、pH5.0で0.025Mのホスフェート緩衝
液および0.09MのNaClの10容量を用いて洗浄した。
最終精製工程は、ファルマシア製のクママトフォーカ
シング樹脂PBE94を用いて行った：緩衝液を、透析によ
りpH5.5で0.025ピペラジン/HCl緩衝液に交換し、次いで
カタラーゼをPBE94カラムに吸着させ、更にpH4.0でポリ
バッファー（Polybuffer）74で溶出し、引き続き1MのNa
Cl溶液で溶出した。カタラーゼは1MのNaCl溶液中に見出
された。
シング樹脂PBE94を用いて行った：緩衝液を、透析によ
りpH5.5で0.025ピペラジン/HCl緩衝液に交換し、次いで
カタラーゼをPBE94カラムに吸着させ、更にpH4.0でポリ
バッファー（Polybuffer）74で溶出し、引き続き1MのNa
Cl溶液で溶出した。カタラーゼは1MのNaCl溶液中に見出
された。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 ダイモン コウサク 千葉県船橋市東船橋２−９−９ コーポ 海老原▲ＩＩ▼−205 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 D06L 3/00 D06L 3/14 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (7)
- 【請求項１】６〜８の至適pH値を有し並びにシタリジウ
ム・サーモフィラムATCC 28085,ATCC 48409、及びCBS 6
71.88、H.インソレンスUAMH 2025,IMI 158747及びATCC
34627から成る群から選ばれたカタラーゼ産生株からの
由来物であるカタラーゼ。 - 【請求項２】分子量約92,000および株ATCC 28085の由来
物である請求の範囲第１項記載のカタラーゼ。 - 【請求項３】シタリジウム又はフミコラの株から由来
し、更に40ppmのポリビニルピロリドンの存在下、70
℃、pH9〜10.5で20分後に少なくとも75％の残留活性を
有することを特徴とする、カタラーゼ調製品。 - 【請求項４】S.サーモフィラム又はH.インソレンスの株
から由来する請求の範囲第３項記載のカタラーゼ調製
品。 - 【請求項５】フミコラ属又はシタリジウム属のカタラー
ゼ産生株を栄養培地中で培養し、引き続き培養培地から
カタラーゼを回収することを含むカタラーゼの製造方
法。 - 【請求項６】株がS.サーモフィラム又はH.インソレンス
に属する請求の範囲第５項記載の方法。 - 【請求項７】過酸化水素の除去において、請求の範囲第
１若しくは２項記載のカタラーゼ、又は請求の範囲第３
若しくは４項記載のカタラーゼ調製品のいづれか１つを
使用する方法。
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| EP91610050 | 1991-06-04 | ||
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| JP3070768B2 true JP3070768B2 (ja) | 2000-07-31 |
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|---|---|---|---|
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| Country | Link |
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| EP (1) | EP0580662B1 (ja) |
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| DE19642325A1 (de) * | 1996-10-14 | 1998-04-16 | Bayer Ag | Entfernung von Wasserstoffperoxid aus Bleichflotten |
| US6022721A (en) * | 1997-01-03 | 2000-02-08 | Development Center For Biotechnology | Catalase, the gene thereof and composition comprising the same, and process for preparing catalase using genetic engineering technology |
| KR20040037009A (ko) * | 2002-10-25 | 2004-05-04 | (주) 피엘바이오 | 과산화수소수 분해 능력과 저항성이 이 뛰어난 신규미생물과 이들이 생산하는 카타라아제 |
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| US9052529B2 (en) | 2006-02-10 | 2015-06-09 | Johnson & Johnson Vision Care, Inc. | Comfortable ophthalmic device and methods of its production |
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| WO2023225459A2 (en) | 2022-05-14 | 2023-11-23 | Novozymes A/S | Compositions and methods for preventing, treating, supressing and/or eliminating phytopathogenic infestations and infections |
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-
1993
- 1993-09-27 FI FI934240A patent/FI106803B/fi active
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