JP3069298B2 - Polyamine analysis method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ポリアミン分析方
法に関する。[0001] The present invention relates to a method for analyzing polyamines.

【０００２】[0002]

【従来の技術】生体ポリアミン（プトレシン、カダベリ
ン、スペルミジン、スペルミン）は、種々のガン患者の
尿中高値を示すことが知られている。この場合に要求さ
れる測定感度は高くpmol程度である。従来一般に用いら
れている分析方法は蛍光色素によるラベル化と、ＨＰＬ
Ｃによる分離を組合せた方法である。2. Description of the Related Art Biological polyamines (putrescine, cadaverine, spermidine, spermine) are known to exhibit high urine levels in various cancer patients. The measurement sensitivity required in this case is as high as about pmol. Conventionally used analysis methods include labeling with a fluorescent dye and HPL
This is a method combining separation by C.

【０００３】ラベル化試薬としてはアミノ基に反応する
ものが多く使用される。この際、ポリアミンと混在する
アミノ基含有の他の成分、例えばアミノ酸、オリゴペプ
チド等が同様にラベル化される。従って、蛍光ラベル化
されたポリアミンを他の成分と分離しなければならない
という問題点があった。[0003] As a labeling reagent, those reacting with an amino group are often used. At this time, other amino group-containing components mixed with the polyamine, such as amino acids and oligopeptides, are similarly labeled. Accordingly, there is a problem that the fluorescent-labeled polyamine must be separated from other components.

【０００４】[0004]

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記問題に鑑
み、たとえモノアミノ基含有成分を多量に混在する場合
でも、該モノアミノ基含有成分を分離することなく、簡
便に高感度で選択的にポリアミン及びその混合物を分析
する方法を見出し本発明を完成するに至った。SUMMARY OF THE INVENTION In view of the above-mentioned problems, the present invention provides a method for easily and selectively preparing polyamines without separating the monoamino group-containing components even if the monoamino group-containing components are present in a large amount. And a method for analyzing the mixture thereof, thereby completing the present invention.

【０００５】[0005]

【課題を解決するための手段】本発明者は、上記の問題
を解決するべく鋭意研究し、ポリアミンの２以上のアミ
ノ基にピレン蛍光分子でラベル化すると、該ピレン蛍光
分子を光励起した際に効率的にエキシマー蛍光を生じる
ことを見出し本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventor has made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and when two or more amino groups of a polyamine are labeled with a pyrene fluorescent molecule, when the pyrene fluorescent molecule is photoexcited. The inventors have found that excimer fluorescence is efficiently generated, and have completed the present invention.

【０００６】すなわち、本発明は、２以上のアミノ基を
有するポリアミン（又は混合物）を、ピレン基を有する
ラベル化試薬でラベル化し、ピレン基に基づくモノマー
蛍光よりも長波長領域（４５０〜５２０ｎｍ）に生じる
蛍光の蛍光強度及び／又は蛍光強度減衰曲線の測定に基
づき前記ポリアミン（またはその混合物）量を分析する
方法を提供するものである。That is, the present invention labels a polyamine (or mixture) having two or more amino groups with a labeling reagent having a pyrene group, and has a longer wavelength region (450 to 520 nm) than monomer fluorescence based on the pyrene group. A method for analyzing the amount of the polyamine (or a mixture thereof) based on the measurement of the fluorescence intensity and / or the fluorescence intensity decay curve of the fluorescence generated in the step (a).

【０００７】また、本発明は、前記ピレン基に基づく蛍
光よりも長波長領域に生じる蛍光が、前記ポリアミンの
２以上のアミノ基が前記試薬でラベル化され、前記ピレ
ン基の光励起に基づき前記ポリアミンの分子内で形成さ
れるエキシマー蛍光であることを特徴とする、前記ポリ
アミンを分析する方法を提供するものである。[0007] The present invention also relates to a method for producing a polyamine, wherein the fluorescence generated in a longer wavelength region than the fluorescence based on the pyrene group is obtained by labeling at least two amino groups of the polyamine with the reagent, A method for analyzing the polyamine, characterized in that it is excimer fluorescence formed in the molecule of the polyamine.

【０００８】さらに、本発明は、前記ポリアミン混合物
が、少なくとも、リシン、オルニチン、プトレシン、カ
ダベリン、スペルミジン、スペルミンからなる群のいず
れか１つを含むものであることを特徴とする前記ポリア
ミンを分析する方法を提供するものである。Further, the present invention provides a method for analyzing a polyamine, wherein the polyamine mixture contains at least one member selected from the group consisting of lysine, ornithine, putrescine, cadaverine, spermidine and spermine. To provide.

【０００９】以下本発明を実施の形態に即して詳しく説
明する。Hereinafter, the present invention will be described in detail with reference to embodiments.

【００１０】[0010]

【発明の実施の形態】BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION

（ポリアミン、及びポリアミンを含む試料）本発明の方
法で分析可能なポリアミン、ポリアミン混合物、又はそ
れらを含む試料は特に限定されない。溶液状態の試料で
も、半固体状態の試料でも、さらには固体状態の試料で
もよく、適当な溶媒により、以下で説明するラベル化反
応を行える濃度に希釈されるものであればよい。(Polyamine and Sample Containing Polyamine) The polyamine, the polyamine mixture, and the sample containing them that can be analyzed by the method of the present invention are not particularly limited. A sample in a solution state, a sample in a semi-solid state, or a sample in a solid state may be used, as long as it is diluted with an appropriate solvent to a concentration at which a labeling reaction described below can be performed.

【００１１】具体的には、生体からの試料としては、尿
サンプル、血液サンプル等に含まれるポリアミン類であ
る。また、本発明に係る方法を用いる際の上記試料の前
処理についても特に制限はないが、以下に説明するよう
に、本発明に係る方法は、ポリアミンのアミノ基にラベ
ル化するものであり、しかも蛍光測定による検出方法を
用いるものであるため、共存する種々の成分をあらかじ
め除去することは好ましいことである。具体的な前処理
としては、混在する酸性の成分を除去、又は混在する蛋
白質成分の除去が挙げられる。混在する酸性の成分を除
去するためには通常のイオン交換カラムクロマト法によ
り容易に可能であり、また、混在する蛋白質成分を除去
するためには、通常の酸、有機溶媒、又は加熱による方
法等を容易に行うことができる。特に蛋白質成分中には
強い蛍光を示すものがあり、本発明に係る方法において
バックグラウンド蛍光の原因となることから、本発明に
係る方法を高感度分析に使用するためには好ましい処理
である。[0011] Specifically, samples from living bodies include polyamines contained in urine samples, blood samples and the like. Further, there is no particular limitation on the pretreatment of the sample when using the method according to the present invention, but as described below, the method according to the present invention labels an amino group of a polyamine, In addition, since a detection method based on fluorescence measurement is used, it is preferable to remove various coexisting components in advance. Specific pretreatment includes removal of mixed acidic components or removal of mixed protein components. A common ion-exchange column chromatography can easily remove mixed acidic components, and a normal acid, organic solvent, or a method of heating can be used to remove mixed protein components. Can be easily performed. In particular, some protein components exhibit strong fluorescence, which causes background fluorescence in the method of the present invention. Therefore, this is a preferable treatment for using the method of the present invention for high-sensitivity analysis.

【００１２】さらに、本発明に係る方法は、ポリアミン
に多量のモノアミン成分が混在していてもよい。ここで
モノアミン成分としては、具体的には、上記の生体試料
中の種々のアミノ酸成分が挙げられる。本発明に係る方
法においては、ピレン基を有するラベル化試薬によるラ
ベル化反応によりこれらのモノアミン成分もまた非選択
的にラベル化される。一方これらラベル化されたモノア
ミン成分は光励起によりピレン基自体の蛍光を発生する
が、本発明に係るピレン基自体の蛍光よりも長波長領域
の蛍光、又はエキシマー形成によるエキシマー蛍光は全
く発生させない。従って、本発明に係る方法は、これら
混在するモノアミン成分の存在には影響されるものでな
い。Further, in the method according to the present invention, a large amount of a monoamine component may be mixed in the polyamine. Here, specific examples of the monoamine component include various amino acid components in the biological sample described above. In the method according to the present invention, these monoamine components are also non-selectively labeled by a labeling reaction with a labeling reagent having a pyrene group. On the other hand, these labeled monoamine components generate fluorescence of the pyrene group itself upon photoexcitation, but do not generate fluorescence in a longer wavelength region than the fluorescence of the pyrene group itself according to the present invention, or excimer fluorescence due to excimer formation. Therefore, the method according to the present invention is not affected by the presence of these mixed monoamine components.

【００１３】さらに、ポリアミン成分が試料中で特別の
構造を有し、遊離の形では存在しない場合には、その特
別な構造を種々の化学反応を含む処理により分解し、ポ
リアミンを遊離させることも好ましい前処理である。具
体的には、ポリアミンが抱合型で存在する場合、ポリア
ミンを含む試料をあらかじめ加水分解してポリアミンを
遊離の形にすることは好ましい処理である。Further, when the polyamine component has a special structure in the sample and does not exist in a free form, the polyamine may be decomposed by a treatment including various chemical reactions to release the polyamine. This is a preferred pretreatment. Specifically, when the polyamine is present in a conjugated form, it is preferable to hydrolyze the sample containing the polyamine in advance to make the polyamine in a free form.

【００１４】（分析可能なポリアミン）本発明に係る方
法により分析されるポリアミンについては特に制限はな
く、分子中に２個以上のアミノ基がある成分であればよ
い。ここでアミノ基は１級アミノ基、２級アミノ基、又
は３級アミノ基を意味するが、本発明においては、１級
アミノ基、又は２級アミノ基が好ましく、特に１級アミ
ノ基を２以上有する成分が好ましい。(Analyzable Polyamine) The polyamine to be analyzed by the method of the present invention is not particularly limited, and may be any component having two or more amino groups in the molecule. Here, the amino group means a primary amino group, a secondary amino group, or a tertiary amino group. In the present invention, a primary amino group or a secondary amino group is preferable. Components having the above are preferred.

【００１５】また、本発明に係る方法により分析される
ポリアミンは、分子中にさらに種々の他の置換基がある
構造を有していてもよい。具体的には、他の置換基があ
る構造としては、アミノ酸構造、核酸構造、糖構造、蛋
白構造、脂質構造が挙げられる。蛋白構造としては、よ
り具体的には２個以上のアミノ基を有するアミノ酸、又
はそのアミノ酸を含むオリゴペプチド（蛋白質を含む）
が挙げられる。２個以上のアミノ基を有するアミノ酸の
例としてリシン、オルニチンが挙げられる。さらには、
アルキル骨格、または環状アルキル骨格を有するポリア
ミン、芳香族環を含むポリアミン、その他のポリアミン
化合物が本発明の分析の対象となる。このうち、本発明
に係る方法は特に生体ポリアミンとして知られている、
プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン等
のポリアミン、またはそれらの混合物を分析するために
好ましいものである。The polyamine analyzed by the method according to the present invention may have a structure in which various other substituents are present in the molecule. Specifically, examples of the structure having another substituent include an amino acid structure, a nucleic acid structure, a sugar structure, a protein structure, and a lipid structure. As the protein structure, more specifically, an amino acid having two or more amino groups, or an oligopeptide containing the amino acid (including a protein)
Is mentioned. Examples of amino acids having two or more amino groups include lysine and ornithine. Furthermore,
Polyamines having an alkyl skeleton or cyclic alkyl skeleton, polyamines containing an aromatic ring, and other polyamine compounds are to be analyzed in the present invention. Among them, the method according to the present invention is particularly known as a biological polyamine,
It is preferred to analyze polyamines such as putrescine, cadaverine, spermidine, spermine, or mixtures thereof.

【００１６】本発明に係る方法は、各ポリアミン成分が
単独で存在する状態でも好ましく使用可能であり、この
場合には当該ポリアミンの存在量が分析可能となる。The method according to the present invention can be preferably used even in a state where each polyamine component is present alone. In this case, the amount of the polyamine can be analyzed.

【００１７】さらには本発明に係る方法は、複数のポリ
アミン成分が混合した状態でも好ましく使用可能であ
る。この場合には、存在するポリアミンの全量が分析可
能である。この際、以下説明するように、上記複数のポ
リアミン成分を分離することなく存在するポリアミンの
総量が分析可能とするものである。上記混合物の各成分
毎の量については、ＨＰＬＣ等の手段により混合物を分
離して分析することも可能である。Further, the method according to the present invention can be preferably used even in a state where a plurality of polyamine components are mixed. In this case, the total amount of polyamine present can be analyzed. At this time, as described below, the total amount of the polyamines present can be analyzed without separating the plurality of polyamine components. The amount of each component of the mixture can be analyzed by separating the mixture by means such as HPLC.

【００１８】（ラベル化試薬）本発明に係る方法に使用
可能なラベル化試薬はピレン基を有するものである。こ
こでピレン基は無置換ピレン環、及び置換ピレン環を含
むものである。置換ピレン環の置換基は特に制限はない
が、エキシマー形成を阻害しない置換基またはエキシマ
ー形成を促進する置換基が好ましく使用可能である。本
発明に係る方法においては、特に無置換ピレン環を有す
るラベル化試薬が好ましい。(Labeling Reagent) The labeling reagent usable in the method of the present invention has a pyrene group. Here, the pyrene group includes an unsubstituted pyrene ring and a substituted pyrene ring. The substituent on the substituted pyrene ring is not particularly limited, but a substituent that does not inhibit excimer formation or a substituent that promotes excimer formation can be preferably used. In the method according to the present invention, a labeling reagent having an unsubstituted pyrene ring is particularly preferable.

【００１９】また本発明に係る方法に使用可能なラベル
化試薬はピレン基が含まれていればその他の構造には特
に制限されない。従って、通常公知の又は市販のアミノ
基ラベル化用の種々のピレン含有ラベル化試薬が好まし
く使用可能である。本発明においては特にスクシンイミ
ジルピレンブチレートが好ましく使用可能である。The labeling reagent usable in the method of the present invention is not particularly limited to other structures as long as it contains a pyrene group. Accordingly, various commonly known or commercially available pyrene-containing labeling reagents for amino group labeling can be preferably used. In the present invention, succinimidyl pyrene butyrate is particularly preferably used.

【００２０】本発明においては、ラベル化試薬の反応選
択性は、１級アミノ基に優先的に反応する試薬に限定さ
れることはなく、２級アミノ基に反応するものでもよ
い。また、１級および２級のアミノ基のラベル化反応が
混在してもよい。従って、ポリアミンの構造により３以
上のピレン基でラベル化される場合もあり得る。この場
合であっても、以下説明するように、分子内の２つのピ
レン基によるエキシマーが形成され、エキシマー蛍光が
観測可能となり、従って、本発明に係る方法を用いてポ
リアミン分析が可能となる。In the present invention, the reaction selectivity of the labeling reagent is not limited to a reagent that preferentially reacts with a primary amino group, but may be one that reacts with a secondary amino group. Also, primary and secondary amino group labeling reactions may coexist. Therefore, the polyamine may be labeled with three or more pyrene groups. Even in this case, as described below, an excimer is formed by two pyrene groups in the molecule, and excimer fluorescence can be observed. Therefore, polyamine analysis can be performed using the method according to the present invention.

【００２１】本発明に係る方法においては、上記のピレ
ン基を含むラベル化試薬により、試料中に混在するモノ
アミノ基を有する成分中のアミノ基も非選択的にラベル
化するものであるが、この場合、分子内でエキシマー形
成が不可能でありエキシマー蛍光は発生しない。In the method according to the present invention, the amino group in the component having a monoamino group mixed in the sample is also non-selectively labeled by the labeling reagent containing a pyrene group. In such a case, excimer formation in the molecule is impossible, and no excimer fluorescence is generated.

【００２２】さらに、過剰のラベル化試薬が未反応又は
加水分解を受けて後溶液中に混在していても上記と同様
にエキシマー蛍光は生じないので分離する必要はない。Further, even if an excess of the labeling reagent is unreacted or undergoes hydrolysis and is mixed in the post-solution, excimer fluorescence does not occur similarly to the above, so that there is no need for separation.

【００２３】（エキシマー蛍光）一般に知られているよ
うに、１分子内にピレンなどの芳香族分子を２個持つ場
合（例えば１，３−ビス−（１−ピレニル）−プロパ
ン）、光励起された励起状態においてピレンが会合し、
分子内エキシマー蛍光を発する。ここでエキシマー蛍光
は励起分子の２分子会合により生じるものであり、この
会合が１分子内で生じる場合は、該蛍光強度は、分子の
濃度には依存しない。さらに従来の知見によれば、上記
のエキシマーが生じるためには、２つのピレン基がエキ
シマー形成のためには、好ましい空間位置をとることが
必要であり、そのため２つのピレン基間の特定構造によ
り上記の好ましい空間位置を保持することが必要とされ
ている。(Excimer Fluorescence) As is generally known, when one molecule has two aromatic molecules such as pyrene (eg, 1,3-bis- (1-pyrenyl) -propane), it is photoexcited. Pyrene associates in the excited state,
Emit intramolecular excimer fluorescence. Here, the excimer fluorescence is generated by the association of two molecules of the excited molecule, and when this association occurs within one molecule, the fluorescence intensity does not depend on the concentration of the molecule. Furthermore, according to conventional knowledge, in order for the above-mentioned excimer to occur, it is necessary that two pyrene groups take a preferable spatial position for excimer formation, and therefore, due to a specific structure between the two pyrene groups, There is a need to maintain the preferred spatial position described above.

【００２４】一方、本発明に係る方法においては、ラベ
ル化されたポリアミンを光励起する際に生じる蛍光を測
定するものであるが、本発明に係る方法は特に、ピレン
基自体からの蛍光ではなく、当該蛍光よりも長波長領域
に現われる新たな蛍光を観測するものである。この新た
な蛍光は、上記説明したエキシマー蛍光と同様に、ポリ
アミン分子内でピレン基を光励起することにより形成さ
れるエキシマーに基づく蛍光（エキシマー蛍光）と考え
られる。すなわち、本発明者は、生体内で見出される種
々のポリアミンの２以上のアミノ基にピレン基を有する
ラベル化試薬でラベル化することにより、ピレン基自体
からの蛍光のみならず、エキシマー蛍光と考えられる当
該蛍光よりも長波長領域に新たな蛍光が観測されるこ
と、さらにその蛍光強度はポリアミンの種類（化学構
造）にはほとんど依存しないことを見出した。また、種
々のポリアミンの混合物の場合には、得られる当該蛍光
の強度は、存在するポリアミンの総量に比例することを
見出した。また、上記の結果は、ポリアミン混合物とし
て、生体内ポリアミンであるプトレシン、カダベリン、
スペルミジン、スペルミン又は、ジアミノアミノ酸であ
るリシン、オルニチン、又はこれらの混合物でも適用さ
れることを見出した。図１には、スペルミジンをピレン
基ラベル化試薬でラベル化したときの蛍光スペクトルを
示すものである。ラベル化試薬のみの場合には、ピレン
自体の蛍光スペクトルのみが観測される（励起波長３４
５ｎｍで３７５ｎｍ及び３９５ｎｍに発光極大）が、ス
ペリミジンとの反応の結果、ピレン基自体の発光は減少
し、新たに４７５ｎｍを極大とする発光が観測される。
この蛍光は上記説明したエキシマー蛍光と考えられ、水
を含む極性溶媒中では特に強く観測されるものであり、
含水極性溶媒中では、例えば疎水的相互作用によるピレ
ン芳香環同士が近接して位置しているものと考えられ
る。当該エキシマー蛍光強度は溶媒の組成（含水率、極
性溶媒の種類、及びそれらの存在比）に依存する。On the other hand, in the method according to the present invention, the fluorescence generated when the labeled polyamine is photoexcited is measured. However, the method according to the present invention is not limited to the fluorescence from the pyrene group itself. This is to observe new fluorescence appearing in a longer wavelength region than the fluorescence. This new fluorescence is considered to be an excimer-based fluorescence (excimer fluorescence) formed by photoexcitation of a pyrene group in a polyamine molecule, similarly to the above-described excimer fluorescence. That is, the present inventor considers not only fluorescence from the pyrene group itself but also excimer fluorescence by labeling with a labeling reagent having a pyrene group at two or more amino groups of various polyamines found in the living body. It was found that new fluorescence was observed in a longer wavelength region than the obtained fluorescence, and that the fluorescence intensity hardly depended on the type (chemical structure) of the polyamine. Further, in the case of a mixture of various polyamines, it was found that the intensity of the obtained fluorescence was proportional to the total amount of the polyamines present. In addition, the above results show that as a polyamine mixture, in vivo polyamines putrescine, cadaverine,
It has been found that spermidine, spermine or the diamino amino acids lysine, ornithine or mixtures thereof are also applicable. FIG. 1 shows a fluorescence spectrum when spermidine is labeled with a pyrene group labeling reagent. In the case of using only the labeling reagent, only the fluorescence spectrum of pyrene itself is observed (excitation wavelength 34
At 5 nm, the emission maximum at 375 nm and 395 nm), and as a result of the reaction with sperimidine, the emission of the pyrene group itself decreases, and emission with a maximum at 475 nm is newly observed.
This fluorescence is considered to be the excimer fluorescence described above, and is particularly strongly observed in a polar solvent containing water.
In a water-containing polar solvent, for example, it is considered that pyrene aromatic rings due to hydrophobic interaction are located close to each other. The excimer fluorescence intensity depends on the composition of the solvent (water content, type of polar solvent, and their abundance).

【００２５】これらポリアミンはそれぞれ以下の化学構
造を有するアミンである。これらの１級アミノ基間の空
間距離は、Ｃ−Ｃ（及びＣ−Ｎ）結合の数で評価して、
５（プトレシン）〜１３個（スペルミン）の範囲であ
り、１級アミノ基と２級アミノ基間の空間距離は、４〜
５個の範囲である。These polyamines are amines having the following chemical structures. The spatial distance between these primary amino groups is evaluated by the number of CC (and CN) bonds,
5 (putrescine) to 13 (spermine), and the spatial distance between the primary amino group and the secondary amino group is 4 to
There are five ranges.

【００２６】[0026]

【化１】 Embedded image

【００２７】これらの種々のポリアミンの標準品混合物
をラベル化反応して後、そのまま蛍光測定してエキシマ
ー蛍光（４７５〜５５０ｎｍ）強度を測定して得られた
蛍光強度と、さらにこの混合物をＨＰＬＣで分離し、そ
れぞれのラベル化されたポリアミンのピークに基づくエ
キシマー蛍光強度（グラジエント溶媒によるエキシマー
蛍光強度を補正した後）を測定し各成分の蛍光強度積分
値の和とは同じ値（変動係数５％）を示した（図１）。After labeling a mixture of these various polyamine standards, the fluorescence intensity obtained by directly measuring the fluorescence and measuring the excimer fluorescence (475 to 550 nm) intensity, and further, this mixture is analyzed by HPLC. Separate and measure the excimer fluorescence intensity (after correcting the excimer fluorescence intensity with the gradient solvent) based on the peak of each labeled polyamine, and measure the same value (variation coefficient 5%) as the sum of the integrated fluorescence intensity values of each component. ) (FIG. 1).

【００２８】この結果は、本発明に係る分析方法におい
ては、これらの広範囲に異なる構造を有するポリアミン
化合物のピレン基に基づくエキシマー蛍光強度は実質的
に同じであることを意味するものである。These results indicate that, in the analysis method according to the present invention, the excimer fluorescence intensities based on the pyrene groups of these polyamine compounds having widely different structures are substantially the same.

【００２９】従って、本発明に係る方法を使用すること
により、混在するモノアミン成分による阻害を受けない
で、ポリアミンの種類に拘らず、試料中に存在する全ポ
リアミン量を簡便に分析することが可能であることを示
すものである。Therefore, by using the method according to the present invention, the total amount of polyamine present in the sample can be easily analyzed regardless of the kind of polyamine without being inhibited by the mixed monoamine component. It is shown that it is.

【００３０】（蛍光測定）本発明に係る方法において使
用可能な蛍光測定装置については特に制限はない。ピレ
ン基を励起する励起光（波長３４５ｎｍが好ましい）、
及びエキシマー蛍光を観測する検出器（波長４７５ｎｍ
が好ましい）があればよい。また、測定に適した試料濃
度、測定セル、測定条件についても特に制限はなく、通
常公知の条件、器具等を好ましく使用できる。必要なら
ば、測定条件の最適化についても通常公知の方法で可能
である。(Fluorescence Measurement) There is no particular limitation on the fluorescence measurement device that can be used in the method according to the present invention. Excitation light (preferably at a wavelength of 345 nm) for exciting a pyrene group,
And a detector that observes excimer fluorescence (wavelength 475 nm)
Is preferable). The sample concentration, measurement cell, and measurement conditions suitable for the measurement are not particularly limited, and generally known conditions and instruments can be preferably used. If necessary, measurement conditions can be optimized by a generally known method.

【００３１】具体的な測定手段の一例としては、ポリア
ミン混合物（プトレシン、カダベリン、スペルミジン、
スペルミンの等量混合物）を溶媒テトラヒドロフラン−
ＤＭＳＯ−水（1:2:1体積／体積）を用いてスクシンイ
ミジルピレンブチレートによりラベル化した試料濃度
（ポリアミンに換算して）1×10^-5〜10^-8Ｍの溶液を１
〜４ｍｌの石英セルにて測定する。この際励起波長は３
４５ｎｍであり、測定波長は４７５ｎｍである。得られ
るエキシマー蛍光強度については、波長４７５ｎｍから
５５０ｎｍまでの範囲の強度を積分する。ポリアミンを
加えない条件、又はラベル化しない試料をバックグラウ
ンド（又はコントロールとして）同条件で測定する。As an example of a specific measuring means, a polyamine mixture (putrescine, cadaverine, spermidine,
Equivalent mixture of spermine) in the solvent tetrahydrofuran-
A solution having a sample concentration of 1 × 10 ⁻⁵ to 10 ⁻⁸ M (in terms of polyamine) labeled with succinimidylpyrene butyrate using DMSO-water (1: 2: 1 volume / volume) was added to 1 solution.
Measure in a ~ 4 ml quartz cell. In this case, the excitation wavelength is 3
45 nm and the measurement wavelength is 475 nm. Regarding the obtained excimer fluorescence intensity, the intensity in the range of a wavelength of 475 nm to 550 nm is integrated. A sample without a polyamine or a sample without labeling is measured under the same background (or as a control).

【００３２】（全ポリアミン量算出方法）得られるエキ
シマー蛍光強度に基づいて試料中の全ポリアミンを算出
（定量）する方法においても特に限定はされない。例え
ば、既知濃度の単一のポリアミンの標準品（（株）和光
純薬から入手可能）を用いて、本発明に係るラベル化反
応を行い、蛍光測定により得られるエキシマー蛍光強度
から検量線を作成することにより好ましくポリアミンの
量を算出することが可能である。(Method of calculating total polyamine amount) The method of calculating (quantifying) total polyamine in a sample based on the obtained excimer fluorescence intensity is not particularly limited. For example, a standard curve of a single polyamine of a known concentration (available from Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) is used to perform the labeling reaction according to the present invention, and a calibration curve is created from excimer fluorescence intensity obtained by fluorescence measurement. By doing so, it is possible to preferably calculate the amount of the polyamine.

【００３３】または、濃度既知のポリアミンの標準品を
添加する標準添加法も好ましく使用可能である。この場
合、上で説明したように試料中に含まれていると推定さ
れるポリアミンの１種を用いることが好ましく。具体的
には、例えば、既知濃度のリシン又はスペルミジンを試
料に添加した後にラベル化試薬で処理して得られるエキ
シマー蛍光強度を測定し、この測定値と上記の標準品を
添加せずに得られるエキシマー蛍光強度の測定値を比較
することにより試料中のポリアミンの量を分析すること
が可能となる。Alternatively, a standard addition method in which a standard polyamine having a known concentration is added can be preferably used. In this case, it is preferable to use one of the polyamines presumed to be contained in the sample as described above. Specifically, for example, the excimer fluorescence intensity obtained by adding a known concentration of lysine or spermidine to a sample and then treating with a labeling reagent is measured, and the measured value and the excimer fluorescence intensity obtained without adding the above-mentioned standard product By comparing the measured values of the excimer fluorescence intensity, it is possible to analyze the amount of polyamine in the sample.

【００３４】（エキシマー蛍光の蛍光減衰曲線）本発明
においては、該エキシマー蛍光の蛍光減衰曲線に基づき
ポリアミンの量を分析することも可能である。この場
合、エキシマー蛍光に基づく蛍光のみを選択的に測定す
ることが可能となり、より高感度の測定が可能となる。(Fluorescence Decay Curve of Excimer Fluorescence) In the present invention, the amount of polyamine can be analyzed based on the fluorescence decay curve of the excimer fluorescence. In this case, it is possible to selectively measure only the fluorescence based on the excimer fluorescence, and it is possible to perform measurement with higher sensitivity.

【００３５】この際時間分解蛍光スペクトル測定装置は
特に限定されず、ピレン基の励起手段と、得られるエキ
シマー蛍光を時間分解して測定する手段を有していれば
よい。At this time, the time-resolved fluorescence spectrum measuring apparatus is not particularly limited, and it is only necessary to have a means for exciting the pyrene group and a means for time-resolved measurement of the obtained excimer fluorescence.

【００３６】[0036]

【実施例】以下実施例に基づき本発明を具体的に説明す
るが、本発明はその要旨を超えない限り以下の実施例に
限定されるものではない。EXAMPLES The present invention will be specifically described below with reference to examples, but the present invention is not limited to the following examples unless it exceeds the gist.

【００３７】（実施例１）ポリアミンとして、オルニチ
ン、リシン、プトレシン、カダベリン、スペルミジン、
及びスペルミンそれぞれの単一物、及びこれらの等量混
合物（各100nmol）を、それぞれスクシンイミジルピレ
ンブチレート（１nmol、molecular Probes社製）、と室
温で200μｌのテトラヒドロフラン−ＤＭＳＯ−水（1:
2:1体積／体積）中で混合し、約１５時間反応させてラ
ベル化を行った。Example 1 As polyamines, ornithine, lysine, putrescine, cadaverine, spermidine,
And spermine, respectively, and an equal mixture thereof (100 nmol each) were combined with succinimidylpyrene butyrate (1 nmol, manufactured by Molecular Probes) and 200 μl of tetrahydrofuran-DMSO-water (1:
(2: 1 volume / volume) and allowed to react for about 15 hours to perform labeling.

【００３８】ラベル化ポリアミン混合物の分離は、高速
液体クロマトグラフ（以下ＨＰＬＣという）（条件：カ
ラム；TSKgel SuperOctyl（4.6mm×5cm、東ソー）、移
動相；水−アセトニトリルのグラジエント溶離（アセト
ニトリル濃度50-80％/20分、直線）を行った。分離され
た各ピークは、通常のピレン基の蛍光波長（励起波長３
４５nm、観測波長３７５nm）及び、ピレンエキシマー蛍
光波長（励起波長３４５nm、観測波長４７５nm）で検出
した（図２）。The separation of the labeled polyamine mixture is performed by high performance liquid chromatography (hereinafter referred to as HPLC) (conditions: column; TSKgel SuperOctyl (4.6 mm × 5 cm, Tosoh), mobile phase), gradient elution of water-acetonitrile (acetonitrile concentration 50- 80% / 20 min, linear) The separated peaks are the normal fluorescence wavelength of pyrene group (excitation wavelength 3).
45 nm, observation wavelength 375 nm) and pyrene excimer fluorescence wavelength (excitation wavelength 345 nm, observation wavelength 475 nm) (FIG. 2).

【００３９】さらに、ＨＰＬＣで分離した上記のそれぞ
れのラベル化ポリアミンの質量分析（ＴＯＦ−ＭＳ、島
津製作所（株）製ＭＡＬＤＩ ＩＶ）の結果は、これら
のすべてのポリアミンの２箇所でラベル化されているこ
とが示された。この結果は、スクシンイミジルピレンブ
チレートにより主に１級アミノ基にラベル化されている
ことを示すものである。Further, the results of mass spectrometry (TOF-MS, MALDI IV, manufactured by Shimadzu Corporation) of each of the above labeled polyamines separated by HPLC show that all of these polyamines are labeled at two places. Was shown. This result indicates that the primary amino group is mainly labeled by succinimidyl pyrene butyrate.

【００４０】図３には、同様にスクシンイミジルピレン
ブチレートでラベル化したリシン、オルニチン、アラニ
ン、グリシン及びブランク試料の反応混合物の蛍光スペ
クトルを示したものである。この場合測定溶液中には、
未反応の試薬及びその加水分解物（それぞれスクシンイ
ミジルピレンブチレート及びピレン酪酸）も同時に過剰
に存在し、全ての試料でこれらに由来する蛍光が強く観
測される（蛍光ピーク３７５ｎｍ）。FIG. 3 shows the fluorescence spectra of the reaction mixture of lysine, ornithine, alanine, glycine and a blank sample similarly labeled with succinimidylpyrene butyrate. In this case, in the measurement solution,
An unreacted reagent and its hydrolyzate (succinimidylpyrene butyrate and pyrene butyrate, respectively) are also present in excess at the same time, and the fluorescence derived from these is strongly observed in all samples (fluorescence peak: 375 nm).

【００４１】ブランク及びモノアミノ化合物について
は、ピレン自体の蛍光よりも長波長の蛍光であるエキシ
マー蛍光（極大波長４７５ｎｍ）はまったく観測されな
い。これに対して、ポリアミンであるリシン、オルニチ
ンにつては470−600nm付近に新たなエキシマー蛍光が明
瞭に観測される。With respect to the blank and the monoamino compound, no excimer fluorescence (maximum wavelength: 475 nm), which is fluorescence having a longer wavelength than that of pyrene itself, is not observed at all. In contrast, new excimer fluorescence is clearly observed around 470-600 nm for the polyamines lysine and ornithine.

【００４２】さらに、この測定試料のエキシマー蛍光領
域でのリシン、オルニチンによるエ蛍光の時間減衰曲線
を図４に示す。励起光に比較して、新たな蛍光の発光の
遅延は、この発光がエキシマー形成に基づくエキシマー
蛍光であることを示すものである。Further, FIG. 4 shows a time decay curve of the e-fluorescence due to lysine and ornithine in the excimer fluorescence region of this measurement sample. The delay in the emission of the new fluorescence compared to the excitation light indicates that this emission is excimer fluorescence based on excimer formation.

【００４３】（実施例２）各アミン成分のラベル化反応
後のエキシマー蛍光領域である470-600nmの蛍光強度を
それぞれの試料で比較した結果を下の表に示す。ポリア
ミンとしてリシンとオルニチンを、またモノアミンとし
てアラニンとグリシンを測定して比較した。(Example 2) The results of comparing the fluorescence intensity of 470-600 nm, which is the excimer fluorescence region after the labeling reaction of each amine component, with each sample are shown in the table below. Lysine and ornithine were measured as polyamines, and alanine and glycine were measured as monoamines.

【００４４】 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ アミン 蛍光強度（ブランク補正後、単位は任意） −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− リシン 0.9 オルニチン 0.8 グリシン 〜0 アラニン 〜0 ＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝＝ ポリアミン（リシン、オルニチン）が顕著な強度の増加
を示し、モノアミン（グリシン、アラニン）には全く強
度の増加はみられない。また、リシンとオルニチンは実
質的に同じ強度を示した。=============================== Amine Fluorescence Intensity (Any unit after blank correction) −−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−−− Lysine 0.9 Ornithine 0.8 Glycine 0 Alanine 00 ================ ================ Polyamines (lysine, ornithine) show a marked increase in strength, monoamines (glycine, alanine) show no increase in strength at all. Lysine and ornithine also showed substantially the same strength.

【００４５】（実施例３）モノアミン類が過剰量共存し
ている条件下での、ポリアミンのエキシマー蛍光への影
響。Example 3 Influence of polyamine on excimer fluorescence under the condition that monoamines coexist in an excessive amount.

【００４６】モノアミン化合物（アラニン及びグリシ
ン）をそれぞれ約１００倍量共存したリシンの混合物
を、実施例１と同様の条件でラベル化し、得られた反応
溶液の蛍光を測定した。この条件下で測定されたエキシ
マー蛍光の強度は相対強度で0.9であった。比較とし
て、モノアミン化合物が共存しない条件下で同様のラベ
ル化した反応溶液の蛍光を測定した。この場合測定され
たエキシマー蛍光の強度は相対強度で0.9であった。す
なわち、これらの蛍光強度には有意の差が見られず、多
量のモノアミン類の共存には全く影響されないことが明
らかである。この結果は、本発明に係るポリアミン分析
方法は、試料中に多量のモノアミン化合物の共存には影
響を受けないことを示している。A mixture of lysine in which monoamine compounds (alanine and glycine) were co-existing in an amount of about 100 times each was labeled under the same conditions as in Example 1, and the fluorescence of the resulting reaction solution was measured. The intensity of excimer fluorescence measured under these conditions was 0.9 in relative intensity. As a comparison, the fluorescence of a similarly labeled reaction solution was measured under the condition that no monoamine compound was present. In this case, the measured intensity of excimer fluorescence was 0.9 in relative intensity. That is, there is no significant difference between these fluorescence intensities, and it is clear that there is no influence from the coexistence of a large amount of monoamines. This result indicates that the polyamine analysis method according to the present invention is not affected by the coexistence of a large amount of a monoamine compound in a sample.

【００４７】（実施例４）ポリアミン分析用検量線作
成。(Example 4) Preparation of a calibration curve for polyamine analysis.

【００４８】種々のポリアミン（リシン、オルニチン、
プトレシン、カダベリン、スペルミジン、スペルミン）
の濃度対エキシマー蛍光強度をプロットしたものを図５
〜１０に示す。これらの検量線は、実質的に同じであ
り、ポリアミンの種類によりほとんど依存しないことが
示される。この結果は、本発明に係るポリアミン分析方
法は、試料中の種々のポリアミンの混合物からなる全ポ
リアミンを簡便に分析することが可能であることを示す
ものである。さらに、ＨＰＬＣ等の分離手段を使用し、
単一成分の検量線を用いてさらに高感度の分析も可能と
するものである。Various polyamines (lysine, ornithine,
Putrescine, cadaverine, spermidine, spermine)
Fig. 5 is a plot of the concentration of
10 to 10. These calibration curves are substantially the same and show little dependence on the type of polyamine. This result indicates that the polyamine analysis method according to the present invention can easily analyze all polyamines comprising a mixture of various polyamines in a sample. Furthermore, using separation means such as HPLC,
The use of a single component calibration curve also enables more sensitive analysis.

【００４９】さらには、これらの検量線に基づき、本発
明に係る方法による検出限界は、約５０ｎＭ程度（ブラ
ンク値の標準偏差値の３倍のシグナルを与える濃度）で
あることが示される。Further, based on these calibration curves, it is shown that the detection limit of the method according to the present invention is about 50 nM (the concentration giving a signal three times the standard deviation of the blank value).

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】スクシンイミジルピレンブチレート（２．５ｍ
Ｍ）のみ、及びスペリミジン（１ｍＭ）との反応後の蛍
光スペクトルを示す図である。FIG. 1: Succinimidyl pyrene butyrate (2.5 m
FIG. 4 is a diagram showing fluorescence spectra after reaction with only M) and sperimidine (1 mM).

【図２】ポリアミン化合物の混合物（プトレシン、カダ
ベリン、スペルミジン、スペルミン、各100pmol）を、
ピレン基でラベル化し、ＨＰＬＣで分離し、エキシマー
蛍光測定により検出したクロマトグラムを示す図であ
り、（Ａ）は励起波長３４５ｎｍ、蛍光観測波長４７５
ｎｍでのクロマトグラムであり、（Ｂ）は励起波長３４
５ｎｍ、蛍光観測波長３７５ｎｍでのクロマトグラムで
ある。FIG. 2 shows a mixture of polyamine compounds (putrescine, cadaverine, spermidine, spermine, 100 pmol each)
It is a figure which shows the chromatogram label | marked with the pyrene group, isolate | separated by HPLC, and detected by the excimer fluorescence measurement, (A) excitation wavelength 345nm, fluorescence observation wavelength 475.
(B) is an excitation wavelength of 34 nm.
It is a chromatogram at 5 nm and a fluorescence observation wavelength of 375 nm.

【図３】ピレンでラベル化した各種アミノ酸（オルニチ
ン、リシン、アラニン、グリシン）の蛍光スペクトル
（水−ＤＭＳＯ（1:1体積／体積）中で5×10^-6Ｍのポリ
アミンを、1×10^-4Ｍスクシンイミジルピレンブチレー
ト（ＤＭＳＯ−ＴＨＦ(1:1体積／体積）100μｌでラベ
ル化して得られた溶液をアセトニトリルで１０倍に希釈
して得られた溶液）を示す図である。FIG. 3 shows a fluorescence spectrum (5 × 10 ⁻⁶ M of polyamine in water-DMSO (1: 1 volume / volume)) of various amino acids (ornithine, lysine, alanine, glycine) labeled with pyrene. FIG. 4 is a diagram showing ^-4 M succinimidyl pyrene butyrate (a solution obtained by diluting a solution obtained by labeling with 100 μl of DMSO-THF (1: 1 volume / volume) with acetonitrile 10-fold). .

【図４】ピレンでラベル化したオルニチン及びリシンの
エキシマー蛍光減衰曲線を示す図である。FIG. 4 shows excimer fluorescence decay curves of ornithine and lysine labeled with pyrene.

【図５】リシンの検量線を示す図である。FIG. 5 is a diagram showing a calibration curve of lysine.

【図６】オルニチンの検量線を示す図である。FIG. 6 is a diagram showing a calibration curve of ornithine.

【図７】スペルミンの検量線を示す図である。FIG. 7 is a diagram showing a calibration curve of spermine.

【図８】スペルミジンの検量線を示す図である。FIG. 8 is a diagram showing a calibration curve of spermidine.

【図９】プトレシンの検量線を示す図である。FIG. 9 is a graph showing a calibration curve of putrescine.

【図１０】カダベリンの検量線を示す図である。FIG. 10 is a diagram showing a calibration curve of cadaverine.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 昭60−142250（ＪＰ，Ａ) 特開 昭64−24884（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−131457（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−66542（ＪＰ，Ａ) 特開 昭56−164795（ＪＰ，Ａ) 特開 昭55−141199（ＪＰ，Ａ) 特開 昭60−188096（ＪＰ，Ａ) 特表 平３−502333（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/68 G01N 21/76 ＣＡ（ＳＴＮ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (56) References JP-A-60-142250 (JP, A) JP-A-64-24884 (JP, A) JP-A-60-131457 (JP, A) JP-A 55-142 66542 (JP, A) JP-A-56-164795 (JP, A) JP-A-55-141199 (JP, A) JP-A-60-188096 (JP, A) Japanese Translation of PCT Application No. Hei 3-502333 (JP, A) (58) Field surveyed (Int. Cl. ⁷ , DB name) G01N 33/68 G01N 21/76 CA (STN) JICST file (JOIS)

Claims (3)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 ２以上のアミノ基を有するポリアミン
を、ピレン基を有するラベル化試薬でラベル化し、４５
０〜５２０ｎｍでの波長領域に生じる蛍光の蛍光強度及
び／又は蛍光強度減衰曲線の測定に基づき前記ポリアミ
ン量を分析する方法。1. A polyamine having two or more amino groups is labeled with a labeling reagent having a pyrene group, and
A method for analyzing the amount of the polyamine based on measurement of a fluorescence intensity and / or a fluorescence intensity decay curve of fluorescence generated in a wavelength region of 0 to 520 nm. 【請求項２】 前記波長領域に生じる蛍光が、前記ポリ
アミンの２以上のアミノ基が前記試薬でラベル化され、
前記ピレン基の光励起に基づき前記ポリアミンの分子内
で形成されるエキシマー蛍光であることを特徴とする請
求項１記載の方法。2. The fluorescence generated in the wavelength region, wherein two or more amino groups of the polyamine are labeled with the reagent,
2. The method according to claim 1, wherein the excimer fluorescence is formed in a molecule of the polyamine based on photoexcitation of the pyrene group. 【請求項３】 請求項１〜２のいずれか１項に記載の方
法において、さらに、前記ポリアミン混合物が、少なく
とも、リシン、オルニチン、プトレシン、カダベリン、
スペルミジン、スペルミンからなる群のいずれか１つを
含むものであることを特徴とする方法。3. The method according to claim 1, wherein said polyamine mixture further comprises at least lysine, ornithine, putrescine, cadaverine,
A method comprising any one of the group consisting of spermidine and spermine.