JP3067403B2 - Novel transglutaminase and method for producing protein gelation product using the same - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は新規なトランスグルタミ
ナーゼと該酵素を用いるタンパクゲル化物の製造法に関
する。The present invention relates to a novel transglutaminase and a method for producing a protein gel using the enzyme.

【０００２】[0002]

【従来の技術】トランスグルタミナーゼは、ペプチド鎖
内にあるグルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のア
シル転移反応を触媒する酵素である。2. Description of the Related Art Transglutaminase is an enzyme that catalyzes an acyl transfer reaction of a γ-carboxamide group of a glutamine residue in a peptide chain.

【０００３】このトランスグルタミナーゼは、アシル受
容体としてタンパク質中のリジン残基のε−アミノ基が
作用すると分子内及び分子間にε−（γ−Ｇｌｕ）−Ｌ
ｙｓ架橋結合を形成させる。また、水がアシル受容体と
して機能するときは、グルタミン残基が脱アミド化され
グルタミン酸残基になる反応を進行させる。[0003] This transglutaminase is intracellularly and intermolecularly ε- (γ-Glu) -L when an ε-amino group of a lysine residue in a protein acts as an acyl receptor.
ys crosslinks are formed. In addition, when water functions as an acyl acceptor, a reaction in which a glutamine residue is deamidated into a glutamic acid residue proceeds.

【０００４】この新規トランスグルタミナーゼを利用し
て製造される本発明のゲル化物は、従来のゲル状食品、
ゲル状化粧料をはじめとしてヨーグルト、ゼリー、チー
ズ、ゲル状化粧料などとして用いられる（特公平1ー5038
2）。[0004] The gelled product of the present invention produced by using the novel transglutaminase is a conventional gelled food,
Used as gel cosmetics, yogurt, jelly, cheese, gel cosmetics, etc.
2).

【０００５】また、本発明に係わるゲル化物は、未加熱
で製造でき、熱に安定なゲルであるため、マイクロカプ
セルの素材、固定化酵素等の担体などとしても広範囲に
用いることができるものである。The gelled product according to the present invention can be produced without heating and is a heat-stable gel, so that it can be widely used as a material for microcapsules, a carrier for immobilized enzymes and the like. is there.

【０００６】トランスグルタミナーゼはこれまで動物由
来、植物由来、微生物由来のものが知られている。例え
ば動物由来のものではモルモットの肝臓［Connellan,et
al.，ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリ
ー(Journal of Biological Chemistry)２４６巻、４
号、１０９３〜１０９８頁］及び哺乳類の臓器、血液に
広く分布し、［Folk et al.,アドバンセス・イン・エン
ザイモロジー(Advancesin Enzymology)３８巻、１０９
〜１９１頁(1973)］、［Folk et al.,アドバンセス・イ
ン・プロテイン・ケミストリー(Advances in Protein C
hemistry)３１巻、１〜１３３頁(1977)］、その酵素の
特徴も研究されている。また本酵素を用いたタンパクゲ
ル化物の製造法についても報告がなされている［特公平
1ー50382］。[0006] Transglutaminase has been known to be derived from animals, plants and microorganisms. For example, animal-derived guinea pig liver [Connellan, et.
al., Journal of Biological Chemistry, 246, 4
Pp. 1093-1098] and widely distributed in mammalian organs and blood [Folk et al., Advances in Enzymology 38, 109.
191 (1973)], [Folk et al., Advances in Protein Chemistry (Advances in Protein C).
hemistry) 31, 31-133 (1977)], and the characteristics of the enzyme have been studied. A method for producing a gelled protein using this enzyme has also been reported.
1-50382].

【０００７】植物由来のトランスグルタミナーゼはえん
どう豆の茎頂***部位から精製された例が一つ報告され
ている［Isaac Icekson et al.,プラント・フィジオロ
ジー(Plant Physiology)８４巻、９７２〜９７４頁(198
7)］。[0007] One example of a plant-derived transglutaminase purified from a pea shoot division site has been reported [Isaac Icekson et al., Plant Physiology 84, 972-974. Page (198
7)].

【０００８】しかしこれら動植物由来のトランスグルタ
ミナーゼが安価にまた大量に調製または入手するのが困
難であることから、これら動植物由来のトランスグルタ
ミナーゼの産業への利用は、事実上不可能であった。However, since it is difficult to prepare or obtain these transglutaminases derived from animals and plants inexpensively and in large quantities, it is practically impossible to use these transglutaminases derived from animals and plants in industry.

【０００９】微生物由来のトランスグルタミナーゼは放
線菌のストレプトベルチシリウム属から発見されており
［Ando et al.,アグリカルチュラル・アンド・バイオロ
ジカル・ケミストリー(Agricultural and Biological C
hemistry)５３巻、１０号、２６１３〜２６１７頁(198
9)］、酵素の精製、特徴について研究されている。また
本酵素を用いたタンパクゲル化物の製造法についても報
告がなされている［特開昭６４−２７４７１］。A transglutaminase derived from a microorganism has been discovered from the genus Streptoverticillium of actinomycetes [Ando et al., Agricultural and Biological Chemistry.
hemistry) 53, 10, 2613-2617 (198
9)], research on the purification and characteristics of enzymes. A method for producing a gelled protein using the present enzyme has also been reported [JP-A-64-27471].

【００１０】微生物のトランスグルタミナーゼの発見に
より大量に酵素を供給する事は可能になったが、微生物
が生産するものであるため、利用する酵素は必ず培養液
から一度抽出、分離精製しなければならない問題点があ
り、さらにポリペプトン、ラスターゲンのような高価な
培地成分存在下でないと酵素が安定に供給されない等の
問題点も存在する。[0010] The discovery of microbial transglutaminase has made it possible to supply enzymes in large quantities, but since they are produced by microorganisms, the enzymes to be used must be once extracted, separated and purified from the culture solution. There is a problem that the enzyme is not supplied stably unless expensive medium components such as polypeptone and rastergen are present.

【００１１】[0011]

【発明が解決しようとする課題】従って本発明の課題は
安価かつ大量供給できる、食品その他タンパク質のゲル
化高分子化が行なえる新規トランスグルタミナーゼを探
索することにある。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to search for a novel transglutaminase which can be supplied at a low cost and in large quantities and which can carry out gelation and polymerization of foods and other proteins.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】本発明者等は大量供給で
きるトランスグルタミナーゼの給源を求め、広く検索を
行った結果、食品海産物のほや（マボヤ 学名 Halocyn
thia roretzi）の筋膜体に、ペプチド鎖内のグルタミン
残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を触媒
する新規トランスグルタミナーゼ活性があること見いだ
し、またこの酵素を用いることにより、タンパク質濃度
１．０％以上のタンパク含有溶液又はスラリーをゲル化
させてタンパクゲル化物を製造できることを見いだし、
本発明を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have searched for a source of transglutaminase that can be supplied in large quantities and conducted extensive searches.
thia roretzi) has a novel transglutaminase activity that catalyzes the acyl transfer reaction of the γ-carboxamide group of the glutamine residue in the peptide chain. 0% or more of the protein-containing solution or slurry is gelled to produce a protein gelled product,
The present invention has been completed.

【００１３】すなわち、本発明はペプチド鎖内のグルタ
ミン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反応を
触媒する マボヤ（Halocynthia roretzi）由来の新規ト
ランスグルタミナーゼ、並びにこの新規トランスグルタ
ミナーゼの作用により、タンパク質濃度１．０重量％以
上のタンパク含有溶液又はスラリーをゲル化させること
を特徴とするタンパクゲル化物の製造法である。That is, the present invention provides a novel transglutaminase derived from Mavoya (Halocynthia roretzi) which catalyzes an acyl transfer reaction of the γ-carboxamide group of a glutamine residue in a peptide chain, and a protein concentration by the action of the novel transglutaminase. A method for producing a gelled protein, comprising gelling a protein-containing solution or slurry of 1.0% by weight or more.

【００１４】マボヤ（Halocynthia roretzi）は原索動
物尾索類の一種で 三陸海岸、男鹿半島以北の東北地方
で多く養殖されている海産物であり、外鞘をはがして筋
膜体を食用とするものである。[0014] Maboya (Halocynthia roretzi) is a species of protochordate marine chordae and is a marine product that is widely cultivated on the Sanriku coast and the Tohoku region north of the Oga Peninsula. Things.

【００１５】マボヤ トランスグルタミナーゼ（以下TGa
seと略す）は、マボヤ筋膜体より抽出される。またその
際ホモジナイザー、ミキサーにより筋膜体を破砕するこ
とによってTGaseの抽出効率を上げることができる。Mavoya transglutaminase (TGa)
abbreviated as se) is extracted from the maboya fascia. At this time, the TGase extraction efficiency can be increased by crushing the fascial body with a homogenizer or a mixer.

【００１６】酵素抽出液からTGaseを精製するには通常
酵素精製に用いられるあらゆる方法が使用できる。例え
ばエタノール、アセトン、イソプロピルアルコール等の
有機溶媒による処理、硫安、食塩等による塩析、透析、
限外ろ過法、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロ
マトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、
ゲルろ過、吸着剤、等電点分画等の方法が使用できる。
またこれらの方法を適当に組み合わせることにより、 T
Gaseの精製度を上げることができる。これらの方法によ
って得られる酵素は安定化剤として各種の塩類、糖類、
タンパク質、脂質、界面活性剤等を加え、或いは加える
ことなく、限外ろ過濃縮、逆浸透濃縮、減圧乾燥、凍結
乾燥、噴霧乾燥の方法により液体又は個体の TGaseを得
ることができる。[0016] To purify TGase from the enzyme extract, any method usually used for enzyme purification can be used. For example, treatment with an organic solvent such as ethanol, acetone, isopropyl alcohol, ammonium sulfate, salting out with sodium chloride, dialysis,
Ultrafiltration, ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, affinity chromatography,
Methods such as gel filtration, adsorbents, and isoelectric focusing can be used.
In addition, by appropriately combining these methods, T
Gase purification can be increased. Enzymes obtained by these methods are used as stabilizers for various salts, sugars,
Liquid or solid TGase can be obtained by ultrafiltration concentration, reverse osmosis concentration, drying under reduced pressure, freeze-drying, or spray-drying, with or without the addition of proteins, lipids, and surfactants.

【００１７】TGaseの活性測定はベンジルオキシカルボ
ニル−Ｌ−グルタミニルグリシンとヒドロキシルアミン
を基質として反応を行い、生成したヒドロキサム酸をト
リクロロ酢酸存在下で鉄錯体を形成させ、525nmの吸光
を測定し、ヒドロキサム酸の量を検量線より求め活性を
算出する。TGase活性は特に記載しない限り以下に記載
する方法により測定した。 ＜活性測定法＞ 試薬Ａ 0.2M トリス塩酸緩衝液（pH7.0） 0.1M ヒドロキシルアミン 0.01M 還元型グルタチオン 0.03M ベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニル
グリシン 0.005M 塩化カルシウム 試薬Ｂ 3N 塩酸 12％ トリクロロ酢酸 5％FeCl₃・6H₂O(0.1N HClに溶解) 上記溶液の1:1:1の混合液を試薬Ｂとする。The activity of TGase was measured by reacting benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine with hydroxylamine as a substrate. The resulting hydroxamic acid was allowed to form an iron complex in the presence of trichloroacetic acid, and the absorbance at 525 nm was measured. The amount of hydroxamic acid is determined from a calibration curve to calculate the activity. TGase activity was measured by the method described below unless otherwise specified. <Activity measurement method> Reagent A 0.2M Tris-HCl buffer (pH 7.0) 0.1M hydroxylamine 0.01M Reduced glutathione 0.03M Benzyloxycarbonyl-L-glutaminylglycine 0.005M Calcium chloride Reagent B 3N Hydrochloric acid 12% Trichloroacetic acid 5% FeCl ₃ .6H ₂ O (dissolved in 0.1N HCl) A 1: 1: 1 mixture of the above solutions is used as reagent B.

【００１８】酵素液の0.05mlに試薬Ａ0.5mlを加えて混
合し25℃で10分間反応後、試薬Ｂを加えて反応停止とＦ
ｅ錯体の形成を行った後525nmの吸光度を測定する。対
照としてあらかじめ熱失活させた酵素液を用いて同様に
反応させたものの吸光度を測定し、酵素液との吸光度差
を求める。別に酵素液の代わりにＬ−グルタミン酸γ−
モノヒドロキサム酸を用いて検量線を作成し、前記吸光
度差より生成されたヒドロキサム酸の量を求め1分間に1
μモルのヒドロキサム酸を生成する酵素活性を1単位と
した。After adding 0.5 ml of reagent A to 0.05 ml of the enzyme solution, mixing and reacting at 25 ° C. for 10 minutes, the reaction is stopped by adding reagent B, and F is added.
After the formation of the e complex, the absorbance at 525 nm is measured. As a control, the absorbance of an enzyme solution that has been reacted in the same manner using a heat-inactivated enzyme solution in advance is measured, and the absorbance difference from the enzyme solution is determined. Separately, L-glutamic acid γ-
A calibration curve was prepared using monohydroxamic acid, and the amount of hydroxamic acid generated from the absorbance difference was determined to be 1 minute per minute.
The enzymatic activity producing μmol hydroxamic acid was defined as 1 unit.

【００１９】次に、TGaseを用いて、タンパクゲル化物
の製法について述べる。基質となるタンパク質は、リジ
ン残基及びグルタミン残基を有し、上述の酵素の触媒を
うけるものであれば、その起源性状に制約されるもので
はなく、植物性タンパク質、動物性タンパク質などいか
なるものでも使用できる。具体的には大豆タンパク、乳
タンパク、ゼラチン等を例示することができる。Next, a method for producing a protein gel using TGase will be described. The protein serving as a substrate has a lysine residue and a glutamine residue, and is not limited by its origin, as long as it is catalyzed by the above-mentioned enzyme. But can be used. Specific examples include soy protein, milk protein, gelatin and the like.

【００２０】これらタンパク質の1.0重量％以上、好ま
しくは3.0％以上の液体またはスラリー状に調製された
ものであれば、TGaseの添加により高粘性物、あるいは
ゲル状物質が形成され、1.0重量％以下であれば溶液状
または沈澱状の架橋高分子化合物が得られる。If these proteins are prepared in a liquid or slurry form of 1.0% by weight or more, preferably 3.0% or more of these proteins, a highly viscous substance or a gel substance is formed by the addition of TGase, and 1.0% by weight or less. In this case, a solution or precipitated crosslinked polymer compound is obtained.

【００２１】またゲル化に用いるTGaseは、マボヤより
抽出したままのものでもよいし、また適宜精製したもの
を用いてもよい。 かくしてTGaseを タンパク1gに対し
て0.01〜2000ユニット添加、好ましくは0.1〜200ユニッ
ト以上添加、反応溶液のpHは4〜10、好ましくは5〜8に
調製し、2〜50℃、好ましくは10〜35℃で1分〜24時間、
好ましくは10分〜2時間インキュベートすると架橋高分
子化物ないしゲル状物を得ることができる。これらの条
件は特公平1ー50382に記載される方法を参考にして適宜
選択可能である。The TGase used for gelation may be the one extracted from maboya or the one purified appropriately. Thus, TGase is added in an amount of 0.01 to 2000 units, preferably 0.1 to 200 units or more per 1 g of the protein, and the pH of the reaction solution is adjusted to 4 to 10, preferably 5 to 8, and 2 to 50 ° C, preferably 10 to 10 ° C. 1 minute to 24 hours at 35 ° C,
Incubation is preferably performed for 10 minutes to 2 hours to obtain a crosslinked polymerized substance or gel. These conditions can be appropriately selected with reference to the method described in JP-B-1-50382.

【００２２】[0022]

【実施例】以下、本発明を実施例にてさらに詳細に説明
する。The present invention will be described in more detail with reference to the following examples.

【００２３】＜実施例１ マボヤTGaseの抽出と調製＞ マボヤの外鞘を取り去った筋膜体500gに2mMのEDTAを含
む20mMMOPS緩衝液(pH7.0)1,000mlを添加し、ホモジナイ
ザーで筋膜体を破砕した。次にこの破砕溶液を10,000rp
m 15分の条件で遠心分離を行なわせて遠心上清よりTGas
e素抽出液（タンパク質総量6,480mg）を得た。<Example 1 Extraction and preparation of maboya TGase> 1,000 ml of a 20 mM MOPPS buffer (pH 7.0) containing 2 mM EDTA was added to 500 g of the fascia body from which the outer sheath of the maboya was removed, and the fascia body was homogenized. Was crushed. Next, 10,000 rp
centrifuge at 15 min.
An e-element extract (total protein amount 6,480 mg) was obtained.

【００２４】次に、TGase抽出液を同緩衝液で透析後、
同緩衝液で平衡化したDEAE-トヨパール（東洋ソーダ
製）充填カラム（φ5.0×30cm）に通液させたところTGa
seは吸着された。さらに同緩衝液で不純タンパク質を洗
い流した後、0〜500mMのKClの濃度勾配溶液でTGaseを溶
出させた（図１に示される）。TGaseはKCl150〜300mMの
濃度で溶出された。このTGase活性画分を20mMMOPS緩衝
液で透析後、再びDEAE-トヨパール充填カラム（φ2.5×
50cm）に通液、吸着させた後、0〜500mMのKClの濃度勾
配溶液でTGaseを溶出させたところ、TGaseはKCl200〜30
0mMの濃度で溶出された （図２に示される）。Next, the TGase extract was dialyzed against the same buffer,
After passing through a DEAE-Toyopearl (Toyo Soda) packed column (φ5.0 × 30cm) equilibrated with the same buffer, TGa was obtained.
se was adsorbed. After washing away the impure proteins with the same buffer, TGase was eluted with a 0 to 500 mM KCl concentration gradient solution (shown in FIG. 1). TGase was eluted at a concentration of 150-300 mM KCl. This TGase-active fraction was dialyzed against a 20 mM MOPPS buffer, and then again packed with a DEAE-Toyopearl packed column (φ2.5 ×
TGase was eluted with a concentration gradient solution of 0 to 500 mM KCl.
Eluted at a concentration of 0 mM (shown in FIG. 2).

【００２５】その後TGase活性画分222mlに硫安を40g添
加溶解させた後、この溶液を35％硫安飽和20mMMOPS緩衝
液にて平衡化したブチル−トヨパール（東洋ソーダ製）
充填カラム（φ2.5×30cm）に通液させたところTGaseは
吸着された。続いて35％硫安飽和20mMMOPS緩衝液を流し
不純タンパク質を洗い流した後、飽和度35〜0％の硫安
の濃度勾配溶液でTGaseを溶出させたところ硫安飽和度2
0〜10％でTGaseは溶出された （図３に示される）。活
性画分を20mMMOPS緩衝液で透析した。Then, after adding and dissolving 40 g of ammonium sulfate to 222 ml of the TGase active fraction, the solution was equilibrated with a 35% ammonium sulfate saturated 20 mM MOPPS buffer, butyl-toyopearl (manufactured by Toyo Soda).
When the solution was passed through a packed column (φ2.5 × 30 cm), TGase was adsorbed. Subsequently, a 35% ammonium sulfate saturated 20 mM MOPPS buffer was poured to wash away impure proteins, and then TGase was eluted with a 35 to 0% ammonium sulfate concentration gradient solution.
TGase was eluted at 0-10% (shown in FIG. 3). The active fraction was dialyzed against 20 mM MOPPS buffer.

【００２６】ここで精製されたTGase活性画分324mlをさ
らに20mMMOPS緩衝液で平衡化させたカダベリンをリガン
ドとするアフィニティークロマトカラム（東洋ソーダ製
エポキシトヨパール30gを2Nの200mlKOHに懸濁後、5gの
塩酸カダベリンを加え、6NKOHでpHを11に調製後45℃で2
0時間振とう攪拌し調製したもの。φ2.5×20cm）に吸着
させた後、0〜300mMのKClの濃度勾配溶液でTGaseを溶
出、KCl120mM〜180mMの濃度のところを分画した（図４
に示される）。この結果活性画分は単一のピークとして
溶出され、酵素精製溶液212ml（タンパク質総量12.6m
g）を得た。このものの比活性はTGase素抽出液に対し16
2倍であり、回収率は32％であった。TGaseの精製結果を
表１に示した。次に得られたTGaseの酵素的性質につい
て検討した。324 ml of the purified TGase-active fraction was further equilibrated with 20 mM MOPPS buffer, and affinity chromatography column using cadaverine as a ligand (30 g of epoxy toyopearl manufactured by Toyo Soda, suspended in 200 ml of 2N KOH, and 5 g of Add cadaverine hydrochloride, adjust pH to 11 with 6NKOH, and add
Prepared by shaking for 0 hours. After adsorbing on 2.52.5 × 20 cm), TGase was eluted with a concentration gradient solution of 0 to 300 mM KCl, and fractionated at a concentration of 120 mM to 180 mM KCl (FIG. 4).
Shown). As a result, the active fraction was eluted as a single peak, and 212 ml of the enzyme purification solution (total protein amount of 12.6 m
g) was obtained. The specific activity of this product is 16
Double, with a recovery of 32%. Table 1 shows the results of TGase purification. Next, the enzymatic properties of the obtained TGase were examined.

【００２７】[0027]

【表１】 [Table 1]

【００２８】ａ）電気泳動分析 精製酵素溶液 20μlとり、5％メルカプトエタノール、2
％SDSを含む0.0625Mトリス−塩酸緩衝液(pH6.8)中、沸
騰湯浴中で3分加熱したものを泳動用試料とした。試料
は第一化学薬品（株）社製SDS-PAGプレート10/20に10ul
アプライし、0.1％SDSを含む0.025mMトリス−0.192mMグ
リシン緩衝液を用い、60mAで約1時間泳動を行った。泳
動後プレートからゲルを剥し、コマジーブリリアントブ
ルーを含む染色液で一晩染色後、酢酸を含む脱色液にて
脱色を行い、吸引乾燥した。その結果、分子量約90,000
のところに単一のバンドを生じた。A) Electrophoretic analysis Take 20 μl of the purified enzyme solution and add 5% mercaptoethanol,
A sample for electrophoresis was heated in a boiling water bath for 3 minutes in a 0.0625 M Tris-HCl buffer (pH 6.8) containing% SDS. Sample is 10ul on SDS-PAG plate 10/20 manufactured by Daiichi Kagaku Co., Ltd.
The mixture was applied, and electrophoresed at 60 mA for about 1 hour using 0.025 mM Tris-0.192 mM glycine buffer containing 0.1% SDS. After the electrophoresis, the gel was peeled off the plate, stained overnight with a staining solution containing Coomassie brilliant blue, decolorized with a destaining solution containing acetic acid, and suction-dried. As a result, the molecular weight is about 90,000
Yielded a single band at

【００２９】ｂ）ゲル濾過分析 精製酵素溶液100μlをファルマシア製液体クロマト用カ
ラムSuperlose 6にアプライし、300mMのNaClを含む100m
Mトリス−塩酸緩衝液を用いて0.5ml/分の流速で溶出し
た。その結果、TGaseの保持時間は10.9分であり、TGase
分子量は約360,000であった。B) Gel Filtration Analysis 100 μl of the purified enzyme solution was applied to Supercia 6 liquid chromatography column manufactured by Pharmacia, and 100 μl of 300 mM NaCl was added.
Elution was carried out at a flow rate of 0.5 ml / min using M Tris-HCl buffer. As a result, the retention time of TGase was 10.9 minutes,
The molecular weight was about 360,000.

【００３０】ｃ）至適ｐＨ 基質としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニ
ルグリシンとヒドロキシルアミンを使用した場合、25
℃、10分反応で反応の至適pH は6.5〜7.5であった（図
５に示される）。[0030] c) when using a benzyloxy Cal Boniru -L- glutaminyl glycine and hydroxylamine as optimum pH substrate 25
The optimal pH of the reaction was 6.5 to 7.5 at 10 ° C. for 10 minutes (shown in FIG. 5).

【００３１】ｄ）至適温度 基質としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタミニ
ルグリシンとヒドロキシルアミンを使用した場合、pH7.
0、10分反応で反応の至適温度は20℃〜28℃であった
（図６に示される）。[0031] d) when using benzyloxy Cal Boniru -L- glutaminyl glycine and hydroxylamine as optimum temperature substrate, pH 7.
The optimum temperature of the reaction was 20 ° C. to 28 ° C. in the reaction for 0 and 10 minutes (shown in FIG. 6).

【００３２】ｅ）ｐＨ安定性 精製酵素溶液を各pHで25℃、2時間前処理を行なった
後、基質としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタ
ミニルグリシンとヒドロキシルアミンを使用し、25℃、
pH7.0、10分間反応を行なった。その結果酵素は前処理p
H5.5〜8.5で安定であった（図７に示される）。[0032] 25 ° C. at each pH the e) pH Stability The purified enzyme solution, after performing 2 hour pretreatment, using benzyloxy Cal Boniru -L- glutaminyl-glycine and hydroxylamine as substrates, 25 ° C.,
The reaction was performed at pH 7.0 for 10 minutes. As a result, the enzyme
It was stable from H5.5 to 8.5 (shown in FIG. 7).

【００３３】ｆ）温度安定性 精製酵素溶液をpH7.0、各温度で2時間前処理を行なった
後、基質としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グルタ
ミニルグリシンとヒドロキシルアミンを使用し、25℃、
pH7.0、10分間反応を行なった。その結果酵素は前処理
温度4〜40℃で安定であった（図８に示される）。[0033] After the f) Temperature stability purified enzyme solution pH 7.0, was carried out for 2 hours pretreatment at each temperature, using a benzyloxy Cal Boniru -L- glutaminyl-glycine and hydroxylamine as substrates, 25 ° C.,
The reaction was performed at pH 7.0 for 10 minutes. As a result, the enzyme was stable at a pretreatment temperature of 4 to 40 ° C. (shown in FIG. 8).

【００３４】ｇ）阻害剤、金属イオンの活性に及ぼす影
響 酵素阻害剤、並びに各金属イオンを精製酵素溶液にそれ
ぞれ1mMの濃度で添加し、25℃で10分間前処理を行なっ
た後、基質としてベンジルオキシカルボニル−Ｌ−グル
タミニルグリシンとヒドロキシルアミンを使用し、25
℃、pH7.0、10分間反応を行なった。その結果を表２に
示した。G) Influence on the activity of the inhibitor and metal ion The enzyme inhibitor and each metal ion were added to the purified enzyme solution at a concentration of 1 mM, respectively, and pretreated at 25 ° C for 10 minutes. use benzyloxy Cal Boniru -L- glutaminyl-glycine and hydroxylamine, 25
The reaction was carried out at a temperature of 7.0 ° C. and a pH of 7.0 for 10 minutes. The results are shown in Table 2.

【００３５】[0035]

【表２】 [Table 2]

【００３６】＜実施例２ タンパクのゲル化方法＞ (1)分離状大豆タンパク「アジプロンS-2」（味の素製）
を５重量％(2)フィブリノーゲン（シグマ製）を１．０
重量％の溶液となるように5mM 塩化カルシウムを含む
0.1Mトリス−ＨＣｌ緩衝液（pH7）を加え、各タンパク
を完全に溶解または懸濁した後、TGase酵素液をタンパ
ク1mgあたり0.2ユニット加え良く攪はんし、25℃、10時
間反応させた後、タンパク溶液のゲル化状態を観察し
た。<Example 2 Method for gelling protein> (1) Separate soy protein "Adipron S-2" (manufactured by Ajinomoto)
5% by weight (2) 1.0% fibrinogen (manufactured by Sigma)
Contains 5 mM calcium chloride to give a weight percent solution
After adding 0.1 M Tris-HCl buffer (pH 7) to completely dissolve or suspend each protein, add 0.2 units of TGase enzyme solution per 1 mg of protein, stir well, and react at 25 ° C for 10 hours. Then, the gelation state of the protein solution was observed.

【００３７】尚、TGaseを添加しない以外は全く同一の
処理をしたものを対照とした。結果は図９に示したが、
TGaseを添加したもののみがゲル化し、試験管を逆さま
にしてもゲルが落ちなかった。The control was the same as above except that TGase was not added. The results are shown in FIG.
Only the TGase-added gelled, and the gel did not fall even if the test tube was inverted.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 1回目DEAEートヨハ゜ールカラムでのTGaseの精製 ○-○,TGase 活性; ●ー●, 280nmにおける吸光度・・・・,
KCl 濃度; I-I,分画範囲.[Figure 1] Purification of TGase on the first DEAE-Toyohar column ○-○, TGase activity; ● ー ●, absorbance at 280nm ・ ・ ・ ・,
KCl concentration; II, fractionation range.

【図２】 2回目DEAEートヨハ゜ールカラムでのTGaseの精製 ○-○,TGase 活性; ●ー●, 280nmにおける吸光度・・・・,
KCl 濃度; I-I,分画範囲.[Figure 2] Purification of TGase on DEAE Toyohar column for the second time ○-○, TGase activity; ● ー ●, absorbance at 280nm ・ ・ ・ ・,
KCl concentration; II, fractionation range.

【図３】 フ゛チルトヨハ゜ールでのTGaseの精製 ○-○,TGase 活性; ●ー●, 280nmにおける吸光度・・・・,
硫安濃度; I-I,分画範囲.[Fig. 3] Purification of TGase in Filtration Yohar ○-○, TGase activity; ● ー ●, Absorbance at 280nm ・ ・ ・ ・,
Ammonium sulfate concentration; II, fractionation range.

【図４】 アフィニティークロマトカラムでのTGaseの精製 ○-○,TGase 活性; ●ー●, 280nmにおける吸光度・・・・,
KCl濃度; I-I,分画範囲.Fig. 4 Purification of TGase on affinity chromatography column ○-○, TGase activity; ● ー ●, absorbance at 280nm ・ ・ ・ ・,
KCl concentration; II, fractionation range.

【図５】 TGaseの至適ｐＨ ○−○、トリス−酢酸緩衝液で反応 △−△、酢酸−ＮａＯＨ緩衝液で反応Fig. 5 Optimum pH of TGase ○-○, reacted with Tris-acetate buffer △-△, reacted with acetic acid-NaOH buffer

【図６】 TGaseの至適温度Fig. 6 Optimum temperature of TGase

【図７】 TGaseのｐＨ安定性 ○−○、トリス−酢酸緩衝液で前処理 △−△、酢酸−ＮａＯＨ緩衝液で前処理FIG. 7: pH stability of TGase ○-○, pre-treated with Tris-acetate buffer △-△, pre-treated with acetate-NaOH buffer

【図８】 TGaseの温度安定性Fig. 8 Temperature stability of TGase

【図９】 タンパク質のゲル化 A：アジプロン TGase無添加 C：フィフ゛リノーケ゛ン TGas
e無添加 B：アジプロン TGase添加 D：フィフ゛リノーケ゛ン TGas
e添加Fig. 9 Gelation of protein A: Adiprone TGase-free C: Fibrino Kane TGas
e No additive B: Adipron TGase added D: Fibrino cane TGas
e addition

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 7/00 Ａ６１Ｋ 7/00 Ｒ ──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁷ Identification code FI A61K 7/00 A61K 7/00 R

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 下記の性質を有する、ペプチド鎖内のグ
ルタミン残基のγ−カルボキシアミド基のアシル転移反
応を触媒するマボヤ（Halocynthia roretzi）由来のト
ランスグルタミナーゼ。ａ）ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動分析によ
る分子量：約90,000 ｂ）ゲル濾過分析による分子量：約360,000 ｃ）至適ｐＨ：6.5〜7.5 ｄ）至適温度：20℃〜28℃ ｅ）ｐＨ安定性：25℃で2時間処理した場合、pH5.5〜8.
5で安定 ｆ）温度安定性：pH7.0で2時間処理した場合、4〜40℃
で安定 ｇ）阻害剤、金属イオンの活性に及ぼす影響：1mMの濃
度のモノヨード酢酸、Ｎ−メチルマレイミド、パラクロ
ロマーキュリー安息香酸、FeSO _４ ・ 7H _２ O、HgCl _２ を添加
し、25℃で10分間前処理を行なった後の残存活性は、そ
れぞれ0、24、36、35、16％ 1. A transglutaminase derived from Mavoya (Halocynthia roretzi) having the following properties and catalyzing an acyl transfer reaction of a γ-carboxamide group of a glutamine residue in a peptide chain. a) By SDS-polyacrylamide gel electrophoresis analysis
That molecular weight: about 90,000 b) Molecular weight by gel filtration analysis: about 360,000 c) Optimum pH: 6.5 to 7.5 d) Optimum temperature: 20 ℃ ~28 ℃ e) pH stability: When treated for 2 hours at 25 ° C., pH 5.5-8.
5 in a stable f) Temperature stability: When treated for 2 hours at pH 7.0, 4 to 40 ° C.
In stable g) inhibitor, effects on the activity of the metal ion: the 1mM concentrated
Degree of monoiodoacetic acid, N-methylmaleimide, paraclo
B Mercury benzoic acid, FeSO ₄ · 7H ₂ O, added HgCl ₂
However, the residual activity after pretreatment at 25 ° C for 10 minutes
0, 24, 36, 35, 16% respectively 【請求項２】 請求項１記載のトランスグルタミナーゼ
の作用により、タンパク質濃度１．０重量％以上のタン
パク含有溶液又はスラリーをゲル化させることを特徴と
するタンパクゲル化物の製造法。2. A method for producing a gelled protein, which comprises gelling a protein-containing solution or slurry having a protein concentration of 1.0% by weight or more by the action of the transglutaminase according to claim 1 .