JP3064325B2 - Enzyme inhibitors - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、オキサゾピロロキノリンおよびその塩を有
効成分とするアルド−ス還元酵素に対する阻害剤に関す
るものである。The present invention relates to an aldose reductase inhibitor comprising oxazopyrroloquinoline and a salt thereof as an active ingredient.

〔従来の技術，発明が解決しようとする問題点〕[Prior art and problems to be solved by the invention]

一般に、アルド−ス還元酵素は、グルコ−スをNADPH
の存在下でソルビト−ルに還元する酵素である。このソ
ルビト−ルは、NADの存在下でソルビト−ル脱水素酵素
によりフラクト−スに変換される。このグルコ−スがソ
ルビト−ルを介してフラクト−スに変換される経路は、
ポリオ−ル代謝と呼ばれている。Generally, aldose reductase converts glucose into NADPH
Is an enzyme that reduces to sorbitol in the presence of This sorbitol is converted to fructose by sorbitol dehydrogenase in the presence of NAD. The pathway by which this glucose is converted to fructose via sorbitol is
It is called Polyol metabolism.

グルコ−スは、エネルギ−源として重要な物質であ
り、正常時では、細胞内に取り込まれた後に大部分がヘ
キソキナ−ゼの作用でグルコ−ス−６−リン酸になって
解糖系で代謝され、ポリオ−ル経路を解して代謝される
のはわずか数％である。しかし、糖尿病で高血糖状態に
なると末梢神経，網膜，水晶体，角膜，血管，腎糸球
体，赤血球などのインスリン非依存性組織の細胞内グル
コ−ス濃度が上昇し、ポリオ−ル経路を介したグルコ−
ス代謝が亢進され、ソルビト−ルの過剰産生が認められ
る。このソルビト−ルは、極性が高いので細胞外への拡
散が悪く、このために、糖尿病性神経症，糖尿病性網膜
症，糖尿病性白内障，糖尿病性角膜症，糖尿病性腎疾患
などの糖尿病性合併症が発症すると考えられている。Glucose is an important substance as an energy source. Under normal conditions, after being taken up into cells, most of it becomes glucose-6-phosphate by the action of hexokinase and becomes glycosylated. Only a few percent are metabolized and metabolized via the polyol pathway. However, when diabetes becomes hyperglycemic, the intracellular glucose concentration of non-insulin-dependent tissues such as peripheral nerves, retina, lens, cornea, blood vessels, renal glomeruli, erythrocytes, etc. increases, via the polyol pathway. Gluco-
Metabolism is enhanced, and excessive production of sorbitol is observed. This sorbitol has a high polarity and is poorly diffused out of the cell. Therefore, diabetic complications such as diabetic neuropathy, diabetic retinopathy, diabetic cataract, diabetic keratopathy, and diabetic nephropathy are caused. It is believed that the disease develops.

そこでアルド−ス還元酵素を阻害することにより、糖
尿病性合併症の予防および治療が可能であり、種々のア
ルド−ス還元酵素阻害剤が研究開発されているが、いま
だ実用に供されているものはない。Therefore, diabetic complications can be prevented and treated by inhibiting aldose reductase, and various aldose reductase inhibitors have been researched and developed, but those which are still in practical use There is no.

また近年、酸化還元酵素の新しい補酵素として見出さ
れたピロロキノリンキノン（PQQ）あるいはピロロキノ
リンキノン塩（これらを総称して以下PQQ類と記す。）
が、アルドース還元酵素を阻害することが報告されてい
る（特開昭63−41421号公報、特開昭63−48215号公
報）。しかしながらその活性は、まだ十分なものではな
い。さらにPQQは腎毒性を有することが近年明らかにさ
れた〔渡辺ら,Hiroshima J.Med.Sci.,第38巻，第１号，
第49〜51頁（1987年）〕。In addition, pyrroloquinoline quinone (PQQ) or pyrroloquinoline quinone salt, which has recently been discovered as a new coenzyme for oxidoreductase (these are generally referred to as PQQs hereinafter).
Have been reported to inhibit aldose reductase (JP-A-63-41421, JP-A-63-48215). However, its activity is not yet sufficient. Furthermore, it has recently been shown that PQQ has renal toxicity [Watanabe et al., Hiroshima J. Med. Sci., Vol. 38, No. 1,
49-51 (1987)].

そこで、毒性および腎毒性が低く、かつこのアルド−
ス還元酵素を阻害する薬剤を見出すことが出来れば、糖
尿病性合併症の予防および治療薬として開発できるもの
と期待される。Therefore, the toxicity and nephrotoxicity are low, and
If a drug that inhibits S-reductase can be found, it is expected that it can be developed as a drug for preventing and treating diabetic complications.

［問題を解決するための手段，作用］ 本発明者は、前記した理由により、毒性が低く、かつ
アルド−ス還元酵素を強力に阻害する薬剤について鋭意
研究を進めたところ、オキサゾピロロキノリン類および
その塩が毒性が低くかつ当該酵素活性を著るしく阻害す
ることを見出した。[Means for Solving the Problem and Action] For the reasons described above, the present inventors have conducted intensive studies on drugs having low toxicity and potently inhibiting aldose reductase. And its salts have low toxicity and markedly inhibit the enzyme activity.

すなわち、本発明は、オキサゾピロロキノリン類およ
びその塩を有効成分とするアルドース還元酵素の阻害剤
である。That is, the present invention is an aldose reductase inhibitor comprising oxazopyrroloquinolines and salts thereof as active ingredients.

オキサゾピロロキノリン類とは、別名2,8,10−トリカ
ルボキシ−1H−オキサゾ［5,4−ｈ］−ピロロ［2,3−
ｆ］キノリンであり、一般式は以下のごとくである。Oxazopyrroloquinolines are also known as 2,8,10-tricarboxy-1H-oxazo [5,4-h] -pyrrolo [2,3-
f] quinoline, and the general formula is as follows:

〔Ｒは一般式Ｒ′−CH（NH2）−COOHで示されるαーア
ミノ酸のＲ′と同じ。〕 本発明において使用されるオキサゾピロロキノリン類
およびその塩のＲ（〔Ｉ〕式参照）は、一般式Ｒ′−CH
2（NH2）−COOHで示されるαーアミノ酸のＲ′と同じで
あればよいが、好ましくは天然のαーアミノ酸のＲ′、
更に好ましくは天然の蛋白質を構成するαーアミノ酸の
Ｒ′と同一のものが好適である。以下オキサゾピロロキ
ノリン類およびその塩を総称してOPQ類と称す。 [R is the same as R 'of the α-amino acid represented by the general formula R'-CH (NH2) -COOH. R of the oxazopyrroloquinolines and salts thereof (see formula [I]) used in the present invention is represented by the general formula R'-CH
It may be the same as the R 'of the α-amino acid represented by 2 (NH2) -COOH, but is preferably R' of the natural α-amino acid,
More preferably, the same as R 'of the α-amino acid constituting the natural protein is preferable. Hereinafter, oxazopyrroloquinolines and salts thereof are collectively referred to as OPQs.

本発明において使用されるOPQ類は、PQQ類と各種のα
ーアミノ酸，メチルアミンなどとを酸素存在下で反応さ
せることにより、容易に製造することが可能である。OPQs used in the present invention include PQQs and various α
-It can be easily produced by reacting with amino acids, methylamines and the like in the presence of oxygen.

本発明におけるOPQ類としては、PQQ類とグリシン，ス
レオニン，プロリン，トリプトファンおよびモノメチル
アミンのいずれか１種とから得られるOPQ（Ｒ＝Ｈ）
（特願平１−292459号）、PQQ類とセリンから得られる
ヒドロキシメチルOPQ（Ｒ＝CH2 OH）（特願平１−25879
1号）、PQQ類とバリンから得られる１−メチルエチルOP
Q（Ｒ＝CH（CH3）２）（特願平１−309479号）、PQQ類
とイソロイシンから得られる１−メチルプロピルOPQ
（Ｒ＝CH（CH3）CH2 CH3）（特願平１−309480号）、PQ
Q類とロイシンから得られる２−メチルプロピルOPQ（Ｒ
＝CH2 CH（CH3）２）（特願平１−309481号）、PQQ類と
アラニンから得られるメチルOPQ（Ｒ＝CH3）（特願平１
−327347号）、PQQ類とグルタミン酸から得られる２−
カルボキシエチルOPQ（Ｒ＝CH2 CH2 CO2 H）（特願平１
−327351号）、PQQ類とグルタミンから得られる２−カ
ルバモイルエチルOPQ,（Ｒ＝CH2 CH2 CONH2）（特願平
１−327348号）、PQQ類とメチオニンから得られる２−
メチルチオエチルOPQ（Ｒ＝CH2 CH2 SCH3）（特願平１
−327349号）、PQQ類とフェニルアラニンから得られる
ベンジルOPQ （特願平１−327350号）、PQQ類とチロシンから得られ
る４−ヒドロキシフェニルOPQ PQQ類とアスパラギン酸から得られる１−カルボキシメ
チルOPQ（Ｒ＝CH2 CO2 H）、PQQ類とアスパラギンから
得られる１−カルバモイルメチルOPQ（Ｒ＝CH2 CONH2）
およびPQQ類とヒスチジンから得られる１−（４−イミ
ダリ−ル）メチルOPQ などがある。また、それぞれのOPQの塩、すなわちアル
カリ金属塩，アルカリ土類金属塩，アンモニウム塩およ
び置換アンモニウム塩なども有効であり、その代表例と
しては、ナトリウム塩，カリウム塩，マグネシウム塩，
カルシウム塩，アンモニウム塩，トリメチルアンモニウ
ム塩，トリエチルアンモニウム塩，トリエタノ−ルアン
モニウム塩などがある。As OPQs in the present invention, OPQs obtained from PQQs and any one of glycine, threonine, proline, tryptophan and monomethylamine (R = H)
(Japanese Patent Application No. 1-292459), hydroxymethyl OPQ (R = CH2 OH) obtained from PQQs and serine (Japanese Patent Application No. 1-2879)
1), 1-methylethyl OP obtained from PQQs and valine
Q (R = CH (CH3) 2) (Japanese Patent Application No. 1-309479), 1-methylpropyl OPQ obtained from PQQs and isoleucine
(R = CH (CH3) CH2 CH3) (Japanese Patent Application No. 1-309480), PQ
2-methylpropyl OPQ (R
= CH2CH (CH3) 2) (Japanese Patent Application No. 1-309481), methyl OPQ obtained from PQQs and alanine (R = CH3) (Japanese Patent Application No. 1-309481)
No. 327347), 2- which is obtained from PQQs and glutamic acid.
Carboxyethyl OPQ (R = CH2 CH2 CO2 H) (Japanese Patent Application No. 1)
2-327351), 2-carbamoylethyl OPQ obtained from PQQs and glutamine, (R = CH2 CH2 CONH2) (Japanese Patent Application No. 1-327348), 2-carbamoylethyl OPQ obtained from PQQs and methionine.
Methylthioethyl OPQ (R = CH2 CH2 SCH3)
-327349), benzyl OPQ obtained from PQQs and phenylalanine (Japanese Patent Application No. 1-232750), 4-hydroxyphenyl OPQ obtained from PQQs and tyrosine 1-carboxymethyl OPQ obtained from PQQs and aspartic acid (R = CH2 CO2 H), 1-carbamoylmethyl OPQ obtained from PQQs and asparagine (R = CH2 CONH2)
And 1- (4-imidaryl) methyl OPQ obtained from PQQs and histidine and so on. Also effective are the respective OPQ salts, that is, alkali metal salts, alkaline earth metal salts, ammonium salts and substituted ammonium salts, and typical examples thereof include sodium salts, potassium salts, magnesium salts, and the like.
Calcium salts, ammonium salts, trimethyl ammonium salts, triethyl ammonium salts, triethanol ammonium salts and the like.

本発明のOPQ類は、経口および非経口投与のいずれの
投与形態も可能である。経口投与の場合は、カプセル
剤，錠剤，粉剤などの通常の方法で投与することができ
る。また非経口投与の場合には、注射剤，液剤などで投
与される。さらに徐放剤も効果的である。The OPQs of the present invention can be in any of oral and parenteral administration forms. In the case of oral administration, it can be administered by usual methods such as capsules, tablets, powders and the like. In the case of parenteral administration, it is administered as an injection, liquid or the like. In addition, sustained release agents are also effective.

本発明の有効成分を製剤化するには、界面活性剤，賦
形剤，着色料，保存料，コ−ティング助剤などが適宜使
用される。また、他の薬剤との併用も行うことが出来
る。To formulate the active ingredient of the present invention, surfactants, excipients, coloring agents, preservatives, coating aids and the like are appropriately used. It can also be used in combination with other drugs.

〔PQQ類およびOPQ類の急性毒性および腎毒性試験〕(Acute toxicity and nephrotoxicity test of PQQs and OPQs)

（１）急性毒性試験 SPF−ICR 雄 ５週齢（チャールズ リバー製）に、
PQQ・2NaおよびOPQ類をマウス1Kg当たり20、40、80、16
0および200mgのそれぞれを腹腔投与し、14日間、25℃で
飼育した。OPQ類としては、OPQ、１−メチルプロピルOP
Q、２−メチルチオエチルOPQおよびベンジルOPQを用い
た。なお、一群は８匹とした。(1) Acute toxicity test SPF-ICR male 5 weeks old (manufactured by Charles River)
PQQ ・ 2Na and OPQs were added at 20, 40, 80, 16 / Kg / mouse
Each of 0 and 200 mg was intraperitoneally administered and kept at 25 ° C. for 14 days. OPQs include OPQ, 1-methylpropyl OP
Q, 2-methylthioethyl OPQ and benzyl OPQ were used. In addition, one group consisted of 8 animals.

その結果、PQQ・2Na20mg/kg投与および40mg/kg投与で
はマウスは死亡しなっかったが、80mg投与では５匹、16
0mg投与および200mg投与で８匹全部死亡した。一方OPQ
類では全てのマウスが死亡しなかった。これにより、OP
QはPQQに比べて毒性が著しく低下していることが判る。As a result, mice did not die when PQQ · 2Na was administered at 20 mg / kg and 40 mg / kg, but 5 mice and 16 mice at 80 mg.
All 8 animals died at 0 mg and 200 mg. OPQ on the other hand
Not all mice died in this class. This allows the OP
It can be seen that Q has significantly lower toxicity than PQQ.

（２）尿検査による腎毒性 急性毒性試験と同様にして、PQQ・2NaおよびOPQ類を
投与し、マウスを飼育した。毎日、マウスの尿を採取
し、ウリステックスII（マイルス・三共製）を用いてグ
ルコース濃度を調べた。(2) Nephrotoxicity by urinalysis In the same manner as in the acute toxicity test, PQQ.2Na and OPQs were administered, and mice were bred. Every day, the urine of the mouse was collected, and the glucose concentration was examined using Uristex II (manufactured by Miles Sankyo).

第１表に示すように、PQQ・2Naを投与したマウスの尿
からは糖が検出されたが、OPQ類を投与したマウスの尿
からは糖が検出されなかった。すなわち、PQQ類は腎毒
性が認められたが、OPQ類では腎毒性が認められなかっ
た。As shown in Table 1, sugar was detected in urine of mice to which PQQ · 2Na was administered, but no sugar was detected in urine of mice to which OPQs were administered. That is, nephrotoxicity was observed for PQQs, but not for OPQs.

（３）血液検査による腎毒性 急性毒性試験と同様にして、PQQ・2NaおよびOPQ類を
投与し、マウスを飼育した。投与１日後絶食（水は与え
る）し、さらに18時間後に採血し、血清を得た。血清中
のグルコース、尿素態窒素およびクレアチニン（Creati
nine）を富士ドライケムスライド（富士写真フィルム
製）を用いて調べた。なお、各々の値は８匹の平均値で
示した。 (3) Nephrotoxicity by blood test In the same manner as in the acute toxicity test, PQQ · 2Na and OPQs were administered, and mice were bred. One day after administration, the animals were fasted (water was given), and blood was collected 18 hours later to obtain serum. Serum glucose, urea nitrogen and creatinine
nine) were examined using Fuji Dry Chem Slide (Fuji Photo Film). In addition, each value was shown by the average value of eight animals.

結果を第２表に示す。PQQ・2Na投与では、グルコース
の大幅な減少、尿素およびクレアチニンの大幅な増加が
みられ、腎毒性が認められた。これに対してOPQ類投与
では、グルコース、尿素およびクレアチニンのそれぞれ
の含有量は、「無投与」の場合と大差はなく、腎毒性は
認められなかった。The results are shown in Table 2. PQQ · 2Na administration resulted in a significant decrease in glucose and a large increase in urea and creatinine, and nephrotoxicity was observed. On the other hand, in the administration of OPQs, the contents of glucose, urea and creatinine were not much different from those in the case of “no administration”, and no nephrotoxicity was observed.

以下に、本発明に係わるOPQ類のアルドース還元酵素
に対する阻害効果を示した実施例を示すが、本発明はこ
れらの実施例に限定されるものではない。 Hereinafter, Examples showing the inhibitory effect of OPQs on aldose reductase according to the present invention will be shown, but the present invention is not limited to these Examples.

［実施例１］ 犬の腎臓の髄質を４倍容量の2mMジチオスレイト−ル
を含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）でホモジナイズし、
遠心して得た上清をアフィニティ−クロマト，ゲル濾
過，クロマトフォ−カシングで精製し、電気泳動的に均
一なアルド−ス還元酵素を得た。[Example 1] The medulla of the dog kidney was homogenized with 4 volumes of 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 2 mM dithiothreitol,
The supernatant obtained by centrifugation was purified by affinity chromatography, gel filtration, and chromatofocusing to obtain an electrophoretically uniform aldose reductase.

0.1Mリン酸緩衝液（pH6.2）0.8mlに、3mM NADPH 0.
05ml,DL−グリセルアルデヒド0.1mlおよび蒸留水0.04ml
を加え、25℃に３分間放置した後アルド−ス還元酵素液
0.01mlを加えて反応を開始し、25℃で340nmの吸光度の
減少を経時的に測定した。なお、１分間に１μmoleのNA
DPHを消費する酵素量を１単位とした。0.8 mM 0.1 M phosphate buffer (pH 6.2) contains 3 mM NADPH
05 ml, DL-glyceraldehyde 0.1 ml and distilled water 0.04 ml
And left at 25 ° C for 3 minutes, followed by aldose reductase solution.
The reaction was started by adding 0.01 ml, and the decrease in absorbance at 340 nm at 25 ° C. was measured over time. In addition, 1 μmole of NA per minute
The amount of the enzyme consuming DPH was defined as one unit.

上記のアルド−ス還元酵素活性測定法の条件で蒸留水
0.04mlの代わりに、各種濃度の阻害物質水溶液0.04mlを
加えて酵素活性を測定し、阻害剤非存在下での酵素活性
との比較から阻害度を算出した。なお、阻害物質とし
て、OPQメチルOPQ１−メチルプロピルOPQ２−
メチルプロピルOPQ２−カルバモイルエチルOPQヒド
ロキシメチルOPQ２−メチルチオエチルOPQ２−カル
ボキシエチルOPQ４−ヒドロキシフェニルメチルOPQ
１−メチルエチルOPQベンジルOPQおよび対照として
PQQを用いた。Distilled water under the conditions of the above-mentioned aldose reductase activity measurement method
Instead of 0.04 ml, 0.04 ml of aqueous solutions of various concentrations of inhibitors were added to measure the enzyme activity, and the degree of inhibition was calculated from the comparison with the enzyme activity in the absence of the inhibitor. In addition, as an inhibitor, OPQ methyl OPQ1-methylpropyl OPQ2-
Methylpropyl OPQ2-carbamoylethyl OPQ hydroxymethyl OPQ2-methylthioethyl OPQ2-carboxyethyl OPQ4-hydroxyphenylmethyl OPQ
1-methylethyl OPQ benzyl OPQ and as control
PQQ was used.

これら各物質のアルド−ス還元酵素に対する阻害率を
第３表に示す。Table 3 shows the inhibition rates of these substances against aldose reductase.

表から判るように、OPQ類はPQQに比して、強力なアル
ド−ス還元酵素阻害作用があることが明かとなった。As can be seen from the table, it has been revealed that OPQs have a stronger aldose reductase inhibitory action than PQQ.

〔実施例２〕 ウサギ水晶体を２倍容量の2mMジチオスレイトールを
含む10mMリン酸緩衝液（pH7.0）でホモジナイズし、遠
心分離して得た上清をアフィニティークロマト、ゲル濾
過、クロマトフォーカシングで精製し、電気泳動的に均
一なアルドース還元酵素を得た。阻害物質としてOPQ
１−メチルプロピルOPQ２−メチルプロピルOPQヒ
ドロキシメチルOPQ１−メチルエチルOPQを用い、実施
例１と同様な方法でウサギ水晶体のアルドース還元酵素
に対するこれら物質の阻害度を調べた。これら各物質の
アルドース還元酵素に対する阻害率を第４表に示す。 Example 2 Rabbit lens was homogenized with 10 mM phosphate buffer (pH 7.0) containing 2 volumes of 2 mM dithiothreitol, and the supernatant obtained by centrifugation was subjected to affinity chromatography, gel filtration, and chromatofocusing. Purification yielded an electrophoretically uniform aldose reductase. OPQ as inhibitor
Using 1-methylpropyl OPQ2-methylpropyl OPQ hydroxymethyl OPQ1-methylethyl OPQ, the degree of inhibition of these substances on aldose reductase in the rabbit lens was examined in the same manner as in Example 1. Table 4 shows the inhibition rates of these substances against aldose reductase.

表からわかるように、OPQ類は、強力なアルドース還
元酵素阻害作用があることが明らかとなった。As can be seen from the table, OPQs were found to have a strong aldose reductase inhibitory action.

［発明の効果］ OPQ類がアルド−ス還元酵素を阻害する活性を有する
ことから糖尿病性合併症の予防および治療薬として利用
される。 [Effect of the Invention] Since OPQs have an activity of inhibiting aldose reductase, they are used as preventive and therapeutic agents for diabetic complications.

フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) A61K 31/4745 A61P 3/10 C07D 498/14 ＣＡ（ＳＴＮ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)Continued on the front page (58) Fields surveyed (Int. Cl. ⁷ , DB name) A61K 31/4745 A61P 3/10 C07D 498/14 CA (STN) MEDLINE (STN) REGISTRY (STN)

Claims (1)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】一般式〔Ｉ〕で示されるオキサゾピロロキ
ノリン類およびその塩の少なくとも一種を有効成分とす
るアルドース還元酵素の阻害剤 〔Ｒは一般式Ｒ′−CH（NH2）−COOHで示されるαーア
ミノ酸のＲ′と同じ。）An aldose reductase inhibitor comprising at least one oxazopyrroloquinoline represented by the general formula [I] and a salt thereof as an active ingredient. [R is the same as R 'of the α-amino acid represented by the general formula R'-CH (NH2) -COOH. )