JP3040161B2 - 急性乳酸アシドーシスを予防するためのルーメン内細菌 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は新規な微生物に関する。さらに詳しくは、特
に、茎葉飼料から濃厚飼料（高穀物飼料）に突然切り換
えられたウシにおいて、急性乳酸アシドーシスを予防す
ることができる乳酸消費（lactic acid consuming）ル
ーメン内細菌（ruminal bacterium）に関する。

発明の背景 牛肉集約生産はウシにエネルギー密な高濃厚飼料を給
餌することを意味する。これらの濃厚飼料はコーン、小
麦、マイロまたは他の澱粉含有成分を高い割合で含む。
成長促進滋養食ウシ（starter cattle）が茎葉飼料から
濃厚飼料に切り換えられると、急性消化不良を生じるこ
ともある［エラム，シー・ジェイ（Elam,C.J.）、ジャ
ーナル・オブ・アニマル・サイエンス（J.Anim.Sc
i.）、43、第898頁〜第901頁（1976）；ヒューバー，テ
ィー・エル（Huber,T.L.）、ジャーナル・オブ・アニマ
ル・サイエンス（J.Anim.Sci.）、43、第902頁〜第909
頁（1976）；アート，ビー・エイ（Uhart,B.A.）および
エフ・ディー・キャロル（F.D.Carroll）、ジャーナル
・オブ・アニマル・サイエンス（J.Anim.Sci.）、26、
第1195頁〜第1198頁（1976）］。この消化不良は、乳酸
を含む多量の有機酸の生産を生じるルーメン内微生物群
棲による澱粉粒の急速かつ広範囲の発酵が原因である。
この有機酸の生産はルーメン酸の生産および利用とルー
メン緩衝能との間のバランスを崩すほどに大きくなり得
る。この状態をアシドーシスと称する。急性アシドーシ
スはルーメン中および血液中のpHの急速な低下および乳
酸のレベルの急激な増大によって特徴付けられる［エラ
ム，シー・ジェイ、上記文献；スライター，エル・エル
（Slyter,L.L.）、ジャーナル・オブ・アニマル・サイ
エンス（J.Anim.Sci.）、43、第910頁〜第929頁（197
6）；アート，ビー・エイおよびエフ・ディー・キャロ
ル、上記文献］。かなり重症である場合、乳酸および他
の酸の過剰生産はルーメンpHの低下に寄与し得、その結
果、常在細菌叢が不調になる。しばしば、この結果、酸
性条件に耐性のある少数の細菌種のみ生き残る［クロ
フ，エヌ（Krogh,N.）、アクタ・ベテリナリア・スキャ
ンディナビカ（Acta Vet.Scand.）、２、第102頁〜第11
9頁（1961）；マッキィ，アール・アイ（Mackie,R.I.）
およびエフ・エム・シー・ギルクリスト（F.M.C.Gilchr
ist）、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・
マイクロバイオロジー（Appl.Environ.Microbiol.）、3
8、第422頁〜第430頁（1979）；マン，エス・オー（Man
n,S.O.）、ジャーナル・オブ・アプライド・バクテリオ
ロジー（J.Appl.Bacteriol.）、33、第403頁〜第409頁
（1970）］。

情報開示ステートメント 急性乳酸アシドーシスの問題を制御するために、幾人
かの研究者は、低濃厚飼料から高濃厚飼料に突然切り換
えられたウシのルーメンに、高穀物食料に適した動物由
来の生存可能なラクテート消費細菌またはルーメン内細
菌を投与することを研究した［アリソン，エム・ジェイ
（Allison,M.J.）ら、ジャーナル・オブ・アニマル・サ
イエンス（J.Anim.Sci.）、23、第1164頁〜第1171頁（1
964）；チャンドラー，ピー・ティー（Chandler,P.T.）
ら、ジャーナル・オブ・デーリー・サイエンス（J.Dair
y Sci.）、38、第1660頁〜第1665頁（1975）；クック，
エム・ケイ（Cook,M.K.）ら、アメリカン・ジャーナル
・オブ・ベタリナリィ・リサーチ（Am.J.Vet.Res.）、3
8、第1015頁〜第1017頁（1977）；ヒューバー，ティー
・エル（Huber,T.L.）、アメリカン・ジャーナル・オブ
・ベタリナリィ・リサーチ（Am.J.Vet.Res.）、35、第6
39頁〜第641頁（1974）］。彼らは、投与した細菌が生
産されたラクテートをより高レベルで消費し、生産と消
費との間のバランスを維持し、その結果、アシドーシス
の問題を減少または除去するであろうと予想した。アリ
ソンらおよびヒューバー（上記文献）は、粗飼料給餌動
物のルーメンに高濃厚飼料適応動物由来のルーメン液を
接種すると、突然の飼料変更が行われた場合に急性アシ
ドーシスの問題が緩和されることを見出した。米国特許
第4,138,498号は、高濃厚飼料に適応した動物由来のル
ーメン内細菌培養を粗飼料適応動物に与え、次いで、濃
厚飼料を与えることに関するものであり、乳酸アシドー
シスの症状の緩和または除去をクレームしている。対照
ウシと比較して、これらの培養株を摂取しているウシに
おける増体量の増加および飼料要求率の増加も主張され
ている。米国特許第3,857,791号は、反芻胃動物の高穀
物飼料への適応の間、乳酸アシドーシスの症状を緩和ま
たは除去するために、「適合したルーメン微生物」また
はメガスフェラー・エルスデニィイ（Megasphaera elsd
enii）とセレノモナス・ルミナンチウム（Selenomonas
ruminantium）との混合物をルーメンに接種することに
関する。さらに、ある適応したルーメン生細菌を乳牛に
ルーメン内（intraruminal）接種することによって牛乳
生産が増加したことが報告されている［チャンドラー
（Chandler）ら、上記文献；米国特許第3,956,482
号］。

これらの文献がアシドーシスを予防するかまたは高濃
厚飼料へのウシの適応を促進する方法を開示していると
いう事実にもかかわらず、現在までのところ関連製品は
市場に出ていない。上記に関連した問題を克服するた
め、本発明者らは、我々は、高茎葉飼料から高濃厚飼料
に突然切り換えられたウシのアシドーシスを予防するた
めのルーメン接種物として使用するために濃厚飼料給餌
ウシから特定の乳酸消費ルーメン内細菌を単離した。

発明の概要 本発明は、細菌培養、NRRL B−18624に関する。該細
菌は乳酸を消費し、モネンシン、ラサロシド、２−クレ
オキシ−グルコースおよび低pH（5.3）に耐性であり、
他の糖類の存在下でラクテートを使用し、ブチレートを
生産することを特徴とする。培養NRRL B−18624は単離
体407Aおよび培養UC−12497とも称する。

本発明は、実質的に細菌培養NRRL B−18624からな
る、粗飼料または通常の牧草飼料から高エネルギー澱粉
飼料への反芻胃動物の適応を促進するための組成物にも
関する。

適応の間、ある量の細菌培養、NRRL B−18624を反芻
胃動物に投与することからなる粗飼料または通常の牧草
飼料から高エネルギー飼料への反芻胃動物の適応を促進
する方法も記載する。

このようなアシドーシスを予防するのに充分なある量
の細菌培養NRRL B−18624を反芻胃動物に投与すること
からなる反芻胃動物の急性乳酸アシドーシスを予防する
方法も記載する。

発明の詳細な説明 実施例１ 乳酸消費ルーメン内細菌の単離および増殖 動物および飼料：ヒアフォード（Hereford）Ｘアング
ス（Angus）雑種去勢ウシを使用した。４頭の動物に、
ひき割りコーン60％、サイレージ30％およびB282補足物
10％を含有する飼料（第１表）を、毎日１回、維持レベ
ルで給餌した。３頭のルーメン瘻管形成雑種ウシにＢ−
376を90％および干し草細切を10％含有する飼料（第２
表）を、毎日１回、維持量で給餌した。動物は常時自由
に飲水させた。

培地：ブライアント，エム・ピー（Bryant,M.P.）お
よびエル・エイ・バーキィー（L.A.Burkey）、ジャーナ
ル・オブ・デーリー・サイエンス（J.Dairy Sci.）、3
6、第205頁〜第212頁（1953）の方法に従って、嫌気性
希釈溶液（ADS）を調製した。細菌の接種および移動は
嫌気性グローブボックス［コイ・ラブ・プロダクツ（Co
y Lab.Products）、ミズーリ州アン・アーバー；雰囲
気:85％N₂、10％H₂および５％CO₂、室温］中で行った。
すべての培地は既に開示されている方法［ブライアン
ト，エム・ピー（Bryant,M.P.）、アメリカン・ジャー
ナル・オブ・クリニカル・ニュートリション（Am.J.Cli
n.Nutr.）、25、第1324頁〜第1328頁（1972）；ハンゲ
ート，アール・イー（Hungate,R.E.）、アカデミック・
プレス、ニューヨーク（1966）］によって100％CO₂下で
調製した。実験用培地を第３表に示す。Ｌ培地として、
テクテートを含まないが、以下の化合物：グルコース、
マルトース、マンニトールまたは可溶性澱粉［ディフコ
（Difco）］を0.2〜0.5％含む種々の炭水化物培地プレ
ートを調製した。Ｌ培地に２−デオキシ−Ｄ−グルコー
ス［２−DG、グレードII、シグマ（Sigma）］を0.5％に
て添加し、Ｌ培地にモネンシンまたはラサロシドを添加
して、終濃度を6ppmとした。ルーメン液を用いず、pH値
を変化させ、かつ溶液を還元する一連の培地（Ｂと称す
る）を調製した（培地B1、B2、B3およびB14）。他の試
験については、超清澄化ルーメン液をＢ培地に逆に添加
し、B11−Ｒ、B12−ＲおよびR13−Ｒと称した（第３
表）。

ルーメン液の収集:in vitro増殖用に、B282補足物を
常食とする４頭の動物から給餌２〜５時間後にルーメン
液を収集した。直接平板培養試験用に、Ｂ−376補足物
を常食とする３頭の動物から給餌５時間後にルーメン液
を収集した。CO₂流下、ルーメン内容物全試料をフラス
コ内に収集し、研究室に運搬するまで氷上に保持した。
各動物は有効な細菌単離のための別々の源として表示し
た。

増殖および平板培養:in vitro増殖において、CO₂下、
同重量のルーメン液およびADS中２％（w/w）アミロペク
チン［シグマ（Sigma）Ａ−7780］を混合し、４の調製
したルーメン液:1％アミロペクチン混合物の各10ml試料
を50ml血清ビン中にピペットで移し、溝付きゴム栓で密
閉した。該栓を通してブンゼン弁を挿入して、過剰圧を
開放した。38℃で時間インキュベートした後、ビン内容
物0.55mlをB2培地5mlに添加し、18時間インキュベート
した。連続３日間、毎日、新しいB2に移した４の各増殖
から10倍希釈液を調製した。その後、B3培地中、各供給
源からの一連の10倍希釈液を10^-9まで調製した。10^-5〜
10^-9希釈液をB2寒天培地上に平板培養した（0.1ml/プレ
ート）。5p.s.i.CO₂下、38℃で５日間、プレートをイン
キュベートした。

直接平板培養実験については、Ｂ−376補足物を常食
とする３頭の各動物から収集したルーメン液の10倍希釈
液（10^-9まで）をB14培地中で調製した。一連の各希釈
液（10^-5〜10^-9）0.1ml試料をB14寒天上に平板培養し、
上記のようにインキュベートした。

単離手順：ウエルを単離し、代表的なコロニーを選択
し、ステンレス製レプリケーター上のグリッドと一致す
る配列でＬ寒天プレート上にスポットした。上記のよう
に、プレートを48時間インキュベートした。Ｌ寒天プレ
ート上での増殖は「マスター」プレートとして供し、レ
プリケーターで種々のプレートに接種するのに使用し
た。

単離体の特徴付け：乳酸消費単離体の選択法をチャー
ト１に示す。まず、炭水化物利用および対6ppmモネンシ
ンまたはラサロシド耐性について単離体を試験した。２
種の抗生物質いずれかの存在下でＬ培地上で増殖しなか
ったこれらの単離体を除く。モネンシンまたはラサロシ
ドの存在下で増殖したものを、B2ブロス中、pH5.3でラ
クテート上で増殖させて低pH耐性について試験した。増
殖しなかったものを除去した。pH5.3のB2培地において
増殖した単離体をB2ブロスにおけるそれらの発酵酸プロ
フィールについて評価した。単離体の増殖速度をＬブロ
ス中で測定した。最後に、0.2％グルコースまたはマル
トースの存在および非存在下、低レベルのラクテートを
有する培地（0.55mM;B11−Ｒ、B12−ＲおよびB13−Ｒ）
を接種して、ラクテートがこれら２種の糖類の存在下で
利用されるか否かを測定した。

分析：揮発性脂肪酸（VFA）分析は標準的な方法に従
った。乳酸濃度はバーカー，エス・ビー（Barker,S.
B.）およびダブリュ・エイチ・サマーソン（W.H.Summer
son）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミスト
リー（J.Biol.Chem.）、138、第535頁〜第554頁（194
1）の方法によって測定した。

増殖および直接平板培養法によって乳酸消費ルーメン
内細菌単離体を得た。増殖工程から、pH5.3のラクテー
ト上で急速に増殖し得たこれらの単離体についてB2培地
を選択した。４時間のインキュベーション後（ビン培養
からB2中に一部を移した時点）、in vitro増殖ビン中の
液体のpHは5.1〜5.4であった。

直接平板培養実験については、モネンシンおよび２−
DGの存在下で低pH培地（B14）上で単離体を増殖させ
た。この培地は、6ppmモネンシンに対して耐性であり、
かつpH5.3で２−DGの存在下で増殖し得たこれらのラク
テート利用体について選択した。２−DG、はグルコース
またはマルトースならびに乳酸を運搬するこれらの微生
物を抑制し得るので選択的薬物として選択した［ロマ
ノ，エイ・エイチ（Romano,A.H.）ら、ジャーナル・オ
ブ・バクテリオロジー（J.Bacteriol.）、139、第93頁
〜第97頁（1979）；トンプソン（Thompson）、ジャーナ
ル・オブ・ビオシミィ（J.Biochimie）、70、第325頁〜
第336頁（1988）］。

増殖および直接平板培養単離法の双方から合計142個
のコロニーを選び出し、種々の炭水化物プレート上で評
価した。これらから、一連の増殖からの代表的単離体14
個および一連の直接平板培養からの代表的単離体８個
を、チャート１で略記したように試験した。単離体22個
のうち10個をさらに試験するために保持した。これらの
10個の基質利用プロフィールを第４表に示す。＃252な
いし320の単離体は可溶性澱粉上で増殖不良であった。
比較的少ないルーメン内細菌しかマンニトールを代謝し
得ないため、マンニトールを含めた。マンニトールは、
２種の重要なルーメン内ラクテート利用種、メガスフェ
ラー・エルスデニィイ（Megasphaera elsdenii）および
セレノモナス・ルミナンチウム（Selenomonas ruminant
ium）とそれを使用しないラクテート利用細菌とを区別
する。

試験した単離体６個のうち、＃298以外は全てマンニ
トール上で十分に増殖した。10個の単離体は全て、他の
細菌を抑制する化合物（モネンシン、ラサロシド、およ
び２−DG）の存在下、ラクテート培地上で十分に増殖し
た。モネンシンおよびラサロシドは、これらイオノフォ
ア抗生物質がフィードロット（feedlot）ウシに一般に
給餌されるので、選択的規準として含めた。ほとんどの
ルーメン内ラクテート利用細菌は少なくとも48ppmのこ
れらの抗生物質に耐性である（デニス，エス・エム（De
nnis,S.M.）ら、ジャーナル・オブ・アニマル・サイエ
ンス（J.Anim.Sci.）、52、第418頁〜第426頁（198
1））。

Ｌ培地中の典型的な単離体の増殖曲線を測定した。比
増殖速度および世代時間は、各々、単離体＃394につい
ての0.187および3.71時間から単離体＃382についての0.
644および1.08時間の範囲であった（第５表）。

単離体をB2ラクテート培地上で増殖させた場合、生産
された主要なVFAは、酪酸およびプロピオン酸であり、
少量の吉草酸およびイソ吉草酸を伴っていた（第６
表）。アセテートおよびイソブチレートについての負の
値は、それらの利用を示している。＃394以外の全単離
体によって多量のブチレートが生産された。該単離体の
ほとんどによって少量のカプロン酸が生産された。

マルトースまたはグルコースの存在および非存在下で
低ラクテート培地（初期濃度0.55mM）中でのラクテート
消費を測定した。２種の糖類いずれの存在下であって
も、該単離体によってラクテートは利用された。炭水化
物を含有する培養物中のDL−乳酸の初期濃度における見
掛けの差は、糖類がラクテートアッセイに干渉するため
であった。試験した単離体５個全てにおいて、乳酸の初
期濃度（35μg/ml）は、24時間後、約15μg/mlまで60％
減少した。該単離体は、バックグラウンド吸光度値が経
時的に減少したので、添加されたグルコースまたはマル
トースをも発酵させた。

形態的には、全ての単離体は単一体もしくは対として
生じる大きい球菌（1.2μｍ）または球杆菌（1.0×3.0
μｍ）いずれかであった。6ppmでのラサロシドおよびモ
ネンシンに対する耐性と共にこの情報は該単離体がメガ
スフェラー・エルスデニィイ（M.elsdenii）に似ている
ことを示唆する［ホールドマン，エル・ブイ（Holdema
n,L.V.）ら、アンエアロウブ・ラボラトリー・マニュア
ル（Anaerobe Laboratory Manual）、第４版、バージニ
ア・ポリテクニク・インスティテュート・アンド・ステ
ート・ユニバーシティ（Virginia Polytechnic Institu
te and State University）、ブラックスバーグ（Black
sburg）（1977）；クリーグ，エヌ・アール（Krieg,N.
R.）およびジェイ・ジー・ホルト（J.G.Holt）、バーゲ
イズ・マニュアル・オブ・システマティック・バクテリ
オロジー（Bergey's manual of systematic bacteriolo
gy）、第１巻、ウィリアムズ（Williams）およびウィル
キンズ（Wilkins）、バルチモア（Baltimore）、（198
4）］。

要約すれば、栄養培地および直接平板培養法を用い
て、本発明らは10種の乳酸消費ルーメン内細菌を単離し
た。これらの単離体はモネンシン、ラサロシド、２−デ
オキシ−グルコースおよび低pH（5.3）に耐性であっ
た。ラクテート上と同様にグルコース、マルトースおよ
びマンニトール上でほとんどが増殖するが、これらの糖
類の存在下でさえラクテートを利用し続ける。該単離体
の全ては形態的にはプロピオネートを生産するメガスフ
ェラー・エルスデニィイ（M.elsdenii）と似ているので
ブチレートを生産するのは予期しない結果である。

^１乾燥物質ベース^２ 以下の成分を含有： 重量％ 大豆油カス、49％ 57.145 アルファルファミール、脱水化、17％ 17.000 糖ミツ、乾燥 17.000 黄色獣脂、安定化 2.000 脱フツホスフェート（CDP）、18％Ｐ 1.500 石灰石、粉砕化 1.900 塩 2.000 微量ミネラル混合物（CCC、10％Zn） 0.250 ビタミンＡ、30,000IU/g 0.100 ビタミンＤ、15,000IU/g 0.005 ビタミンＥ、20,000IU/lb 0.050 亜セレン酸ナトリウム、0.2mg/g 0.050 ^１以下の成分を含有： 重量％ ロールコーン（8.5そのままで） 89.639 大豆カス（48.5％そのままで） 6.758 脂肪（動物性） 0.973 ジカル（Dical）（18.5％） 0.200 石灰 1.298 塩 0.291 ダイナ（Dyna）Ｋ（塩化カリウム） 0.600 セレン・プレミックス（0.2％） 0.048 微量ミネラルプレミックス 0.096 ビタミンＡ（30,000IU/g） 0.007 ビタミンＤ（15,000IU/g） 0.002 ビタミンＥ（20,000IU/lb） 0.088 ^１全ての培地は100％CO₂下で調製した。固形培地に対し
て1.75〜2.0％w/vの寒天を添加した。² DL−乳酸ナトリウム60％シロップ（ベイカー）:83.3
g、蒸留水で500mlに調製して、10％w/v溶液とした。培
地中の終濃度は0.5％w/vであった。^３ 還元剤：培地を沸騰させた後であって、オートクレー
ブ処理する前に、各々2.5％のシステインHCl・H₂Oおよ
びNa₂S・9H₂Oを添加した。⁴ DL−乳酸ナトリウム60％シロップ（ベイカー）：蒸留
水332.3ml中に1.0mlを混合して1.8mg/mlとした。培地B1
1−Ｒ、B12−ＲおよびB13−Ｒ中の終濃度は、200μＭ
（0.0018％）であった。^５ 濃厚飼料を与えた去勢ウシから、給餌５時間後にルー
メン液を収集し、オートクレーブ処理し、遠心し、0.2
μＭフィルターを通した。^６ モネンシン溶液：培地中の終濃度は6ppmであった。

^１寒天プレート上の増殖度：−−−＝測定されず、＋＝
非常に僅かに増殖、＋＋＝良好に増殖、＋＋＋＝多量に
増殖、＋＋＋＋＝盛んに増殖^２ 無ラクテートＬ培地³ 6ppmのモネンシンおよびラサロシド;0.5％の２−DG、p
H5.8に調節 ¹L培地中で増殖した単離体 ^１酸の正味の生産、接種していないB2培地との比較 実施例２ ラクテート消費ルーメン内細菌による乳酸消
費を評価するためのin vitroアシドーシス試験システム 本実施例は、ルーメンにおけるアシドーシス工程によ
く似せ、かつin vivoでアシドーシスを防止するために
ルーメン接種物として使用するための乳酸消費ルーメン
内細菌の菌株を選択するためにそれを使用するin vitro
試験システムの展開を示す。

このin vitro試験システムの概要は以下の通りであ
る：茎葉飼料を給餌した動物から収集したルーメン液
を、嫌気性希釈溶液中２％（wt/vol）アミロペクチンと
混合し（50:50）、38℃で12時間振盪しながらインキュ
ベートする。応答変数、pHおよび乳酸濃度は、１時間間
隔で測定する。インキュベーション中、ルーメン液混合
物のpHは＜6.0に低下し、乳酸は６時間以内に＞35mMま
で蓄積する。これらの応答は、茎葉ベース飼料から穀物
ベース飼料に切り換えられたウシのルーメン中で観察さ
れたものと類似している。本発明者らは、このin vitro
システムを使用して、pH低下および（または）乳酸増加
の防止能について、乳酸消費ルーメン内細菌の選択菌株
を試験した（実施例１）。成功についての標準は、6.0
を超えるpHの維持および未接種対照に対する生産乳酸量
の少なくとも80％の減少であった。実施例１からの穀物
給餌ウシのルーメンから予め単離した６種類の嫌気性乳
酸消費細菌を試験した。４種類の菌株が成功の標準に適
合した。これら４種類の菌株を、乳酸上での増殖速度、
糖類の存在下での乳酸消費、および牧畜場で常用されて
いる抗生物質に対する感受性につきさらに比較した。こ
の試験法を通じ、２種類の菌株＃320および＃407を選択
した。

動物および飼料：高茎葉飼料（＞70％ムラサキウマゴ
ヤシの干し草またはコーンサイレージ、乾燥物質基礎）
を任意に与えたヒアフォード（Hereford）Ｘアンガス
（Angus）雑種去勢ウシを使用した。胃管（瘻管非形成
動物）またはルーメン瘻管によってルーメン内容物を収
集した。動物は、常時自由に飲水させた。各実験につい
て、ルーメン液は３頭の動物から収集した。

培地：嫌気性希釈溶液（ADS、５）中２％（wt/vol）
懸濁液としてアミロペクチン［シグマ（Sigma）］を調
整した。乳酸消費細菌の菌株を、0.5％（wt/vol）（DL
−）乳酸ナトリウムを含有するB1培地上に維持した。細
菌の接種および移動は、嫌気性グローブボックス［ミズ
ーリ州アン・アーバーのコイ・ラブ・プロダクツ（Coy
Lab.Products）；環境:85％N₂、10％H₂および５％CO₂、
室温］中で行った。前記した方法（実施例１）によって
100％CO₂下で全培地を調製した。

in vitroアシドーシス試験法:O₂流下、給餌1.5時間後
にルーメン内容物試料をフラスコに収集し、研究室に運
ぶまで氷上に保持した。2mmナイロンメッシュを介し
て、ルーメン試料を濾過し、等重量ごとにプールし、20
分間、氷上で冷却した。添加後、乳酸消費細菌の試験菌
株のB1ブロス培養物400mlを中間対数増殖期まで増殖さ
せ、嫌気性遠心によって収穫し、接種物として使用する
ためにADS 14mlに再懸濁した。CO₂流下、プールしたル
ーメン液10mlおよび細菌接種物0.5ml（またはADS 0.5m
l）を60ml血清ビンに入れ、灰色の栓で密閉し、氷上で
冷却した。試験する各菌株（対照または処理）を22本の
ビンに充填した。最後のビンに充填したら、全てのビン
にブンゼン弁を装着し、38℃の回転振盪器−インキュベ
ーター（ニュー・ブランスヴィック、160rpm）に入れ
た。該ビンを20分間平衡化させ、次いで、各処理の２本
のビンを０、２時間目、その後１時間間隔で12時間にわ
たって収集した。

増殖測定：選択菌株の増殖速度はB15ブロス培地上で
比較した。B15は前記（実施例１）基礎（Ｂ）培地を修
飾したものであり、さらに乳酸ナトリウム（99.5＋％Ｌ
−ラクテート、ベイカー（Baker）、0.18％）、グルコ
ース（0.2％）およびマルトース（0.2％）（最終培地中
の割合）を含有させた。光路長18mmのパーキン−エルマ
ー（Perkin−Elmer）分光光度計、モデル55で、650nmで
光学密度を測定した。

分析：プラスチック遠心管にビン内容物を移し、標準
pH電極対を浸漬した後にpHを記録した。次いで、後の発
酵酸の分析のために該試料を−20℃で冷凍した。乳酸濃
度は、バーカー，エス・ビーにおけるダブリュ・エイチ
・サマーソン［Barker,S.B.and W.H.Summerson、前記文
献］の方法またはその修飾法によって測定した。特記し
ない限り、Ｄ（−）およびＬ（＋）両形の乳酸が測定さ
れた。本明細書における乳酸への言及は、Ｄ（−）およ
びＬ（＋）形の合計に対し行う。実施例１で既に述べた
ように揮発性脂肪酸を分析した。

抗生物質感受性:1％（vol/vol）還元剤（2.5％Ｌ−シ
ステイン・塩酸塩/2.5％亜硫酸ナトリウム、wt/vol）を
含有するウィルキンズ−チャルグレン（Wilkins−Chalg
ren）寒天培地［ディフコ（Difco）］を用いて、NCCLS
ガイドライン［ナショナル・コミティ・フォー・クリニ
カル・ラボラトリー・スタンダーズ，アプルーブド・ス
タンダーズ（National Committee for Clinical Labora
tory Standards,Approved standards）M11−A:嫌気性細
菌の抗菌性感受性試験のための基準寒天希釈法（refere
nce agar dilution production for antimicrobial sus
ceptibility testing of anaerobic bacteia）、ペンシ
ルベニア州ビラノバのナショナル・コミッティ・フォー
・クリニカル・ラボラトリー・スタンダーズ（National
Committee for Clinical Laboratory Standards）（19
85）］に従って、選択した抗生物質の最小阻止濃度（MI
Cs）を測定した。以下の抗生物質を試験した：ナクセル
＼（Naxcel＼）［ジ・アップジョン・カンパニー（The
Upjohn Co.）］、オキシテトラサイクリン［ピー−エル
・バイオケミカルズ（Ｐ−L Biochemicals）］、エリス
ロマイシン［シグマ］、ペニシリンＧ［シグマ］、リン
コマイシン［塩酸塩、ジ・アップジョン・カンパニ
ー］、チロシン［酒石酸塩、シグマ］、リファンピン
［シグマ］、チオペプチン［フギサワ（Fugisawa）］、
チオストレプトン［シグマ］、およびクロルテトラサイ
クリン［ICNニュートリショナル・バイオケミカルズ（I
CN Nutritional Biochemicals）］。ナクセル＼、ペニ
シリンＧ、リンコマイシンおよびチロシンを水に溶解し
た。他の全てはDMSOに溶解した。抗生物質濃度は、各薬
物の特異的純度について補正した0.25から128μg/ml
（または単位/ml）まで調製したか、または情報が入手
不可能である場合には、純度は100％であると仮定し
た。３種類の嫌気性細菌の菌株は正の対照（使用する抗
生物質についてMICsが知られている）としてMIC測定で
含ませた。これらの細菌はバクテロイデス・フラギリス
（Bacteroides fragilis）ATCC 25285、バクテロイデス
・シータイオタオミクロン（Bacteroides thetaiotaomi
cron）ATCC 29741、およびクロストリジウム・パーフリ
ンジェンス（Clostridium perfringens）ATCC 13124で
あった。

6.0未満へのpHの低下および35mMを超えての乳酸濃度
の増加は、複連ビンの間かつ実験の間で再現性があっ
た。ルーメン内乳酸消費細菌の候補菌株の予備評価を、
実施例１における本発明者らの選択法を介して同定した
「最良の」６種類の乳酸消費細菌の菌株について行っ
た。

牧草を給餌した全動物から実験＃８のためのルーメン
液を収集した。試験菌株番号＃310、＃320および＃382
をADS−接種対照ビンに対して比較した。インキュベー
トしているルーメン液−アミロペクチン混合物を含有す
る対照ビンのpHは、３時間後に初期値6.7から６時間目
の5.8まで低下した。その後、pHは6.0以下に維持され
た。一方、対照ビン中の乳酸の濃度は、検出レベル（約
0.5mM）から６時間目の39mMまで増加した。乳酸の濃度
は６時間後に、12時間目における24mMまで減少した。３
種類の試験菌株いずれかを接種したビンにおいて、イン
キュベートしている混合物のpHは6.0を超えて維持さ
れ、かつ乳酸の濃度は7mMを超えては上昇しなかった
（４〜５時間目）。生産されたすべての乳酸は３時間以
内に単離体によって消費された。

インキュベーション期間中に生産された発酵酸も測定
した。６時間後に発酵酸蓄積はプラトーに達したが、比
較は12時間目に行った。12時間目の全酸濃度は、対照ビ
ン中で468mMであり、菌株＃310、＃320および＃382につ
いては、各々542、511および526mMであった。非接種対
照ビンにおいて、アセテート、プロピオネート、ブチレ
ートおよびバレレートは、各々、59、24、15および２モ
ル％存在した。試験菌株を添加したものについては、こ
れらのモル％は、各々、（平均）50、17、26および７％
に変化した。全ての試験菌株から、同様の発酵酸プロフ
ィールを得た。平均して、試験菌株を添加したビンは、
対照ビンと比較して58mM多く全酸を生産した。対照ビン
中の発酵は６時間後に低pHにより程度が制限されたよう
だが、対照ビン中の乳酸は、この差異の一部分（12時間
目）をなしていた。

全牧草給餌動物から、次の実験のためのルーメン液を
収集した。ADS接種対照ビンに対して、試験菌株＃394、
＃407および＃414を比較した。対照ビンのpHは４時間後
に初期値6.8から６時間目における5.7まで低下した。予
備実験におけるごとく、その後、pHを6.0未満に維持し
た。この実験において、試験菌株＃407および＃414はpH
を6.0を超えて維持したが、他方、菌株＃394は維持しな
かった。乳酸は、インキュベーションの４時間後にビン
中で蓄積し始めた。対照ビン中の乳酸の濃度は、検出レ
ベルから６時間目における45mMまで増加した。６時間
後、乳酸の対照ビン濃度は、該濃度が66mMまで増加する
12時間目まで45mM付近のままであった。菌株＃407およ
び＃414を添加した場合、乳酸は６時間までには15mMま
で蓄積するが、１時間以内に検出レベルまで消費され
た。しかしながら、菌株＃394については、乳酸は６時
間目で36mMまで蓄積し、12時間目に12mMまで徐々に減少
したにすぎなかった。

この第２の実験において、発酵酸はより多く変化す
る；個々の酸濃度は、それらが第１の実験においてプラ
トーに達した６時間目でプラトーに達しなかった。12時
間目の全酸濃度は、対照ビン中で476mM、菌株＃394、＃
407および＃414について、各々513、561および579mMで
あった。対照ビン中で、アセテート、プロピオネート、
ブチレートおよびバレレートは、各々、63、26、９およ
び１モル％存在した。試験菌株＃394を添加した場合
は、これらのモル％は、各々、62、17、11および10％で
あった。菌株＃407および＃414を添加した場合は、これ
らのモル％は、各々、45、15、30および10％であった。
平均して、試験菌株を添加したビンは、対照ビンと比較
して75mM多く全酸を生産した。菌株＃394を省略する場
合、菌株＃407および＃414は、各々、対照ビン発酵より
も平均94mM多く全酸を生産した。前記のように、対照ビ
ン発酵は低pHによって制限されたようだが、対照ビン中
の乳酸の濃度はこの差異の一部をなしていた。

このin vitroインキュベーションシステムにおいて試
験した６種類の菌株のうち１つも、有力な発酵酸とし
て、（改良された動物行動との正の相関関係に基づい
て）好ましい発酵生成物であるプロピオネートを生産し
なかった。アセテートおよびプロピオネートのモル％を
30％減少させた全てがブチレートを多量に生産するらし
かった。同様に、添加された試験菌株の存在は、ブチレ
ートおよびバレレートのモル％を、各々、２〜３倍およ
び３〜10倍増加させた。これらのデータは純粋培養（実
施例１）におけるこれらの試験菌株によって生産された
発酵酸と一致する。

６種類の試験菌株のうち５種類は、ビン内容物のpHを
6.0を超えて維持し、これはバランスのとれたルーメン
発酵の継続のために優れている。これらの条件下での発
酵の継続は、対照ビン（乳酸を含有）と比較して、試験
菌株を含有するビンにおけるより高い全酸濃度によって
支持された。

しかしながら、より重要なことに、添加されたアミロ
ペクチン（澱粉基質）上で在来ルーメン内細菌によって
生産された乳酸が、添加された６種類の乳酸消費細菌の
試験菌株のうち５種類によって消費された。本発明者ら
は、さらに評価するために、この２つの実験から最良の
菌株を選択した。これらは菌株＃320、＃382、＃407お
よび＃414であった。

これら４種類を、グルコースおよびマルトース（培地
B15）の存在下における乳酸消費能について評価した。
それらの増殖曲線およびラクテートおよびグルコースの
消費速度の比較は、全ての菌株が他のルーメン内細菌と
同程度に速くまたはそれよりも速く増殖したことを示し
た。B15培地における世代（倍加）時間は、菌株＃320、
＃382、＃407および＃414について、各々、0.93、1.2
1、0.87および1.56時間であった。＃320および＃407は
より速い速度で両基質を使用したが、４種類の全菌株が
ラクテートおよびグルコースを共代謝することができた
（培地中のマルトース濃度は非常に低くて判断できなか
った）。かくして１時間またはそれ未満の倍加時間を有
する菌株＃320および＃407は、＃382および＃414よりも
「より良好」であった。それらのより速い増殖速度は、
ルーメン中においてそれらをより良好に競争させること
ができるようだ。

４種類の選択菌株についての最小阻止濃度は、抗生物
質の羅列によって決定した（第７表）。MIC結果は、プ
ラスまたはマイナスの２つの２倍希釈液範囲内で同一の
ものと解釈できる。対照微生物についてのデータはそれ
らの公知のMICと一致した。本発明者らはナクセル＼（N
axcel＼）、エリスロマイシン、ペニシリンＧ、リンコ
マイシンおよびチロシンについての菌株差異を発見し
た。４種類の試験菌株は、全て、リファンピンに対して
同等に感受性であり、オキシテトラサイクリン、チオペ
プチンおよびチオストレプトンに対して耐性があった
（第７表）。菌株＃320はリンコマイシン、一般的なブ
タ飼料添加物に対して最も感受性であったが、菌株＃41
4はチロシン、一般的なウシ飼料添加物に対して最も耐
性があった。

本発明者らは、in vitro乳酸アシドーシス試験の結
果、菌株増殖速度およびMICデータに基づいて、有効な
急性アシドーシス予防剤としてさらに評価するために菌
株＃320および＃407を選択した。

動物に微生物培養を投与する方法は当業者によく知ら
れている［例えば、本明細書中に引用記載している米国
特許第4,138,498号参照］。

^１（17）におけるような方法。ペニシリン（単位/ml） 実施例３ ルーメン内ラクテート利用細菌407Aの特徴付
けおよび推定に基づく同定 ルーメン内ラクテート利用細菌単離体407A（NRRL B−
18624;UC−12497）およびメガスフェラー・エルスデニ
ィイ（Megasphaera elsdenii）の２種類の菌株（菌株B1
59およびATCC 25940）を発行されたガイドラインに従っ
て特徴付けた。単離体407Aは、イソ酪酸、酪酸、イソ吉
草酸、吉草酸およびカプロン酸を生産する大きくて非運
動型のグラム陰性球菌である点メガスフェラー・エルス
デニィイ（M.elsdenii）菌株B159およびATCC 25940の標
準菌株と類似していた。ラクテートの代謝によって３種
の全細菌により水素が生産された。ラクテート上で、pH
5.4で全てが増殖したが、6ppmモネンシンの存在下、pH
5.0にてラクテート上では単離体407Aだけが増殖した。
全てがトレオニンをプロピオネートに転換させ、インド
ールに対しては陰性であり、ニトレートを還元しないか
または澱粉を加水分解しなかった。単位体407Aは胆液に
よって抑制されたが、他方、25940およびB159は抑制さ
れなかった。菌株B159はグルコース、マルトースまたは
マンニトールを含有する培地中で酸を生産するが、407A
は生産せず、25940の標準菌株は、マルトースおよびマ
ンニトールから弱酸だけを生産した。単離体407Aについ
て得られた結果は、メガスフェラー・エルスデニィイ
（M.elsdenii）の記載と類似していることが分かる。し
かしながら、モネンシンの存在下、pH5.0でのラクテー
ト含有培地中の407Aの増殖によると、この細菌は、メガ
スフェラー・エルスデニィイ（M.elsdenii）以外の分類
群中に置かれてもよい。

細菌およびそれらの培養：実施例１および２に従っ
て、菌株407A（UC−12497）を単離し、液体窒素下で貯
蔵した。メガスフェラー・エルスデニィイ（Megasphaer
a elsdenii）の標準菌株、菌株番号25940は、メリーラ
ンド州ロックヴィルのアメリカン・タイプ・カルチャー
・コレクション（American Type Culture Collection）
から入手したものであり、元々はヒツジのルーメンから
単離されたものであった。菌株B159はユニバーシティ・
オブ・イリノイ（Univ.of Illinois）のエム・ピー・ブ
ライアント博士（Dr.M.P.Bryant）の培養コレクション
から入手したものであり、元々はヒツジのルーメンから
単離されたものであった。全ての菌株は、CO₂上部空間
下、38℃にてB18c培地（第８表）上でルーメン的に培養
した。

試験培地：バージニア・ポリテクニック・インスティ
テュート・アンエアローブ・ラボラトリー・マニュアル
（Virginia Polytechnic Institute（V.P.I.）Anaerobe
Laboratory manual）［ホールドマン，エル・ブイ（Ho
ldeman,L.V.）、イー・ピー・ケイトウ（E.P.Cato）お
よびダブリュ・イー・シー・ムーア（W.E.C.Moore）
編、アンエアローブ・ラボラトリー・マニュアル（Anae
robe Laboratory manual）、第４版、バージニア・ポリ
テクニック・インスティテュート・アンド・ステート・
ユニバーシティ（Virginia Polytechnic Institute and
State University）、ブラックスバーグ］の系統的表
示および方法に適合する嫌気性ペプトン酵母エキス発酵
培地の商業的調製物は、カール−スケアボロウ・マイク
ロバイオロジカルズ・インコーポレイテッド（Carr−Sc
arborough Micro−biologicals,Inc.）（ジョージア州
ストーン・マウンテン）から購入した。0.5％２−デオ
キシ−Ｄ−グルコースまたは6ppmモネンシンを含むまた
は含まない低pHラクテート含有培地を調製し、各々、B2
0、B21およびB22と称した（第８表）。B20、B21およびB
22培地の最終pH値は、各々、5.43、5.65および5.04であ
った。

方法:B18c中で増殖させた若い（７時間）培養を使用
して、グラム菌株を決定し、肉細切炭水化物（CMC）培
地［カール−スケアボロウ・マイクロバイオロジカルズ
・インコーポレイテッド（Carr−Scarborough Microbio
logicals,Inc.）］に接種した。CMC培養物を一晩インキ
ュベートし（17時間）、次いで、それを使用して試験培
地管（４滴／管）およびB18c寒天プレートに接種した。
CO₂下で該管に接種し、V.P.I.法［ホールドマン，エル
・ブイ（Holdeman,L.V.）ら、上記文献］に従った。嫌
気性グレードCO₂流下で栓を外し、該管に接種し、次い
で再度密封した。該管を、38℃で46〜47時間、静かに、
真っすぐに立ててインキュベートした後、それらを開
け、内容物のpHを測定し、適切な生化学的試験を行った
（第９表）。

分析：コーニング・セミ−マイクロ・コンビネーショ
ン・エレクトロード（Corning semi−micro combinatio
n electrode）、モデル476541を装着したコーニング・
モデル（Corning Model）12pHメーターを用いてpHの測
定を行った。Ｄ（−）およびＬ（＋）乳酸について、PY
ラクテート培養物をアッセイした。水素炎イオン化ガス
クロマトグラフィーによって揮発性脂肪酸について、PY
基礎、ラクテート、グルコースおよびトレオニン培養物
を分析した。水素は、ネルソン，ディー・アール（Nels
on,D.R.）およびジェイ・ジー・ゼイクス（J.G.Zeiku
s）、アプライド・アンド・エンバイロンメンタル・マ
イクロバイオロジー（Appl.Environ.Micro.）、28、第2
58頁〜第261頁（1974）によって教示されたものと同様
の条件を用いて、熱伝導検出器を装着したガスクロマト
グラフを用いて測定した。

407A同定に選択した生化学試験は、V.P.I.マニュアル
［ホールドマン，エル・ブイ（Holdeman,L.V.）ら、上
記文献］に教示された嫌気性細菌属についての分類検索
表に基づいた。該マニュアルにおける分類検索表は、菌
株407Aが、イソ酪酸、酪酸、イソ吉草酸、吉草酸および
カプロン酸を生産する大きいグラム陰性球菌であるの
で、メガスフェラー属に由来するらしいことを示す。こ
の結果、メガスフェラーと他の特徴付けられた全嫌気性
球菌とを有意に区別するであろう試験を行った。さら
に、本発明者らは、単離体407Aが低pHのラクテート含有
培地（B20、B21およびB22）中で増殖するだろうことを
知った。本発明者らは、これらの培地がメガスフェラー
・エルスデニィイ菌株25940およびB159を抑制するか否
かを知るためにこれらの培地を試験した。

細菌を特徴付けるのに使用する生化学試験およびVFA
分析の結果を第９表に示す。位相差顕微鏡検査による３
種類の菌株の実験は、単一、対または短鎖を生じた大き
い（直径約2.3μｍ）細胞を示した。古い培養物におい
て、鎖はより一般に見られた。３種類の全細菌がグラム
陰性的に染色された。３種類の菌株についてのインキュ
ベーション２日後の表面コロニー形態は類似していた。
それらは、直径２〜3mm、円形および全縁、淡黄色であ
り、バター様コンシステンシーを有していた。

セロビオース、エスクリン、ラクトース、澱粉、ショ
糖およびキシロースが試験培地における炭素供給源であ
る場合、全細菌が酸を生産できなかった。カタラーゼは
検出されず、エスクリンは加水分解されず、全てが絶対
的に嫌気性であった。どの細菌も肉を消化しなかった
か、ニトレートを還元しなかったか、澱粉を加水分解し
なかったか、インドールを生産しなかったか、または運
動型でなかった。B159は、407Aおよび25940よりも、グ
ルコース、マルトースおよびマンニトール中においてよ
り多くの酸を生産した。胆液は407Aの増殖を抑制した
が、他の２種類の菌株を抑制しなかった。２−デオキシ
−Ｄ−グルコースの存在または非存在下、pH5.3−5.7の
ラクテート上で全てが十分増殖したが、6ppmモネンシン
の存在下、pH5.0では407Aのみ増殖した。トレオニン
は、３種類の全細菌によってプロピオネートに転換され
た。水素は、407A、25940およびB159について、各々6.
2、12.9および26.7％のレベルで３種類全てによって生
産された。VFAプロフィールは、基礎、ラクテート、グ
ルコースおよびトレオニン培地上で増殖した各微生物に
ついては類似していた。ブチレートは試験した３種類の
細菌における主要発酵最終生産物であった。これは、メ
ガロスフェラー・エルスデニィイ（M.elsdenii）に関し
て他の人によって報告されたデータと一致する。

菌株407Aに対して固有の試験は、１）グルコース、マ
ルトースおよびマンニトールからの酸生産の欠如、２）
胆液の存在下でのより乏しい増殖および３）6ppmモネン
シンの存在下でpH5.0でのラクテート含有培地における
増殖であった（第９表）。細菌による炭水化物からの酸
生産（またはその欠如）は、その同定のための分類検索
表特徴の１つである。B159について行われた試験だけ
は、V.P.I.マニュアルにおける結果に充分に一致してい
た。標準菌体25940は、グルコースが陰性であり、かつ
マルトースおよびマンニトールが中間量の酸性度（「弱
酸性度」、第９表）だけを生産したので、充分に一致し
ていなかった。

他の２種類の嫌気性球菌の属、ベーヨネラ（Veillone
lla）およびアシダミノコッカス（Acidaminococcus）だ
けはグラム陰性であった。単離体407Aは、非常に大き
く、イソ酪酸、酪酸、イソ吉草酸およびカプロン酸を生
産し、トレオニンをプロピオネートに転換するので、ベ
ーヨネラ（veillonella）とは異なる。アシダミノコッ
カス（Acidaminococcus）はより小さく、カプロエート
を生産せず、ラクテートを利用しないので、単離体407A
はアシダミノコッカス（Acidaminococcus）とは異な
る。かくして、単離体407Aの特徴は、メガスフェラー・
エルスデニィイ（M.elsdenii）の分類とより一致してい
るが、モネンシンの存在下でpH5.0でよく増殖し得るの
で、407Aはメガスフェラー属の新しい種または亜種であ
り得る。

メガスフェラーと他の嫌気性球菌との系統発生的関係
は、あまり知られていない［ヒル，ジー・ビー（Hill,
G.B.）、（1981）嫌気性球菌（The anaerobic cocc
i）、第1631〜1650頁、エム・ピー・スター（M.P.Star
r）、エイチ・ストルプ（H.Stolp）、エイチ・ジー・ト
ゥルパー（H.G.Truper）、エイ・バロウズ（A.Balows）
およびエイチ・ジー・シュレゲル（H.G.Schlegel）編、
原核生物：細菌の生息場所、単離、および同定について
のハンドブック（The prokaryotes:a handbook on habi
tats,isolation,and identification of bacteria）、
ニューヨーク州スプリンガー−バーラグ；ロゴサ，エム
（Rogosa M.）、嫌気性グラム陰性球菌（Anaerobic gra
m−negative cocci）、第680〜685頁、エヌ・アール・
クレイグ（N.R.Kreig）およびジェイ・ジー・ホルト
（J.G.Holt）編、系統細菌学のバーゲイのマニュアル
（Bergey's manual of systematic bacteriology）、第
１巻、ザ・ウイリアムズ・アンド・ウイルキンズ・カン
パニー（The Williams ＆ Wilkins Co.）、バルチモア
（1984）］。今日までに、ある種のメガスフェラー、メ
ガスフェラー・エルスデニィイ（M.elsdenii）だけが知
られている。本発明者らの試験の結果とV.P.I.マニュア
ルのものとの間にいくつかの矛盾があるが、407Aがメガ
スフェラー・エルスデニィイの新しい菌株以外のもので
あることを支持するためにこの時点で充分な証拠はない
と思われる。しかしながら、この研究で行われた生化学
試験に基づく単離体407Aの同定は、推定の根拠となると
みなされるべきである。

^ａ乳酸ナトリウム：シグマ（Sigma）No.L−1375 ほぼ同量のＤ（−）およびＬ（＋）異性体を含有^ｂ ミネラル1:蒸留水１当たりK₂HPO₄ 6g^ｃ ミネラル2:蒸留水１当たりK₂HPO₄ 6g、（NH₄）SO₄
6g、NaCl 12g、MgSO₄・7H₂O 2.45gおよびCaC_２・2H₂O
1.59g^ｄ オートクレーブ処理する前に培地のpHを5.2に調整^ｅ 嫌気性グローブボックス中で脱酸素化水を用いて調製
し、次いで、濾過を用い、無菌であるが冷却した培地に
無菌的に添加^ｆ モネンシンナトリウム（シグマＭ−2513）32.4mgを20
0プルーフエタノール50mlに添加した。混合し、次い
で、濾過滅菌溶液を無菌媒質に添加した。モネンシンの
終濃度は6ppmであった。

^aV.P.I.嫌気性研究室マニュアル（５）に記載されてい
るほとんどの試験および方法。^ｂ 予備還元し、嫌気的に滅菌した培地−系統的表示のた
めのアペンディックスを参照。

^aV.P.I.嫌気性研究室マニュアル（５）に記載されてい
るほとんどの試験および方法。^ｂ 予備還元し、嫌気的に滅菌した培地−系統的表示のた
めのアペンディックスを参照。

^aV.P.I.嫌気性研究室マニュアル（５）に記載されてい
るほとんどの試験および方法。^ｂ 予備還元し、嫌気的に滅菌した培地−系統的表示のた
めのアペンディックスを参照。

^ａ第２表および解説および分類検索表についてのテキス
トを参照。

V.P.I.マニュアル（５）の方法に基づいた方法。^ｂ 上部空間におけるH₂パーセント。^ｃ 未接種培地と比較。

実施例４ 本実施例は、菌株407Aをルーメンにより接種した３組
の動物からのデータを略記する。各組はアシドーシス誘
発間の別時点で接種し、それらのコンテンポラリー（ブ
ロック）対照と比較した。

実験設計：急性乳酸アシドーシスのin vivoモデルに
基づいて親実験を設計した。各々４頭の動物からなる４
つのブロックを使用した。各ブロックは２〜４週ごとに
分けた。ブロック２、３および４の各々においては、２
頭のさらにルーメンに瘻管形成した去勢ウシを加えて１
グループを６頭とした。去勢ウシを任意に対照または接
種（407A−投与）処理グループのいずれかに割り当て
た。ブロック１は、407A細胞が利用不可能であるので含
めなかった。ブロック２、３および４において、去勢ウ
シから以下に略記するデータを得た。

動物およびそれらの管理：ヒアフォード（Hereford）
ｘアングス（Angus）雑種去勢ウシを使用した。これら
のウシ（体重約300〜380kg）はルーメンに瘻管形成され
たものであり、モーテルに収容し、最低３週間、低品質
ムラサキウマゴヤシ干し草−麦稈飼料（5:2;1日当たり
0.1〜0.2kgの最小増加）を任意に与えた。使用直前に、
各動物の体重を測定した（第11表）。その後の干し草細
切またはアシドーシス誘発穀物ミールの供給は、この体
重（BW）に基づいた。

給餌計画およびルーメン試料採取：ウシを、実験期間
前の午後に測定室中に移し、翌日まで給餌しなかった。
水は給餌および断食の間、利用可能とした。１日目の午
前７時および午後３時および２日目の午前７時に動物に
ムラサキウマゴヤシ細切からなる0.5％BWミールを給餌
した。残った飼料を瘻管を介してルーメン内に送り込ん
だ。３日目には餌を与えなかった。午前６時に開始する
４日目に急性アシドーシスが始まった。瘻管を開け、ル
ーメン内容物の5ml試料を２つ収集し、ドライアイス−
エタノール中に浸漬したプラスチック管中で直ちに冷凍
させ、ラクテートおよび揮発性脂肪酸（VFA）分析のた
めに−20℃で貯蔵した。浸漬可能な平面電極［センソレ
ックス（Sensorex）450C、ストラントン、カリフォルニ
ア州］およびルーメンのほぼ中心に保持されたプローブ
を有するMP−815pHメーター［フィッシャー・サイエン
ティフィック（Fisher Scientific）］でルーメンpHを
測定した。直後に、90％ひき割りコーンおよび10％糖蜜
を同量の水と手動で混合してなる４の0.5％BWミールの
うち最初のものを、瘻管を介して各ルーメン中にボーラ
ス用量として導入した。残りのミールを午前７、８およ
び９時に同様に送り込んだ。午前６時に収集したルーメ
ン試料に加え、ボーラス投与後にときどき瘻管を介し
て、その後のルーメン試料を得た。かかる場合、pHを測
定した後に動物当り1250ml以下のルーメン液を収集し
た。

アシドーシスの開始後の動物の回収：各動物から最後
の試料を採取した後、該去勢ウシに任意に干し草細切を
与えた。翌日、該動物をモーテルに戻し、そこで長い干
し草および最小補足物を自由に摂食させた。

ルーメン接種のための菌株407Aの調製:37℃で、培地B
18c（第８表）上の静置培養において乳酸消費ルーメン
内細菌菌株407A（UC−12497）を増殖させた。血清管（5
ml培地／管）（クリンプシール）を用いて、ルーチン的
な移動を行った。１％接種物レベルを使用し、一夜培養
を用いて、100mlの血清ビン中のブロス2mlおよび60mlに
接種した。これらのスケールアップ培養を６〜７時間イ
ンキュベートし、次いで、これを用いて、B18c培地12
を含有する20のガラスカーボイに接種した。接種され
たカーボイを37℃で静かに一晩（16〜18時間）インキュ
ベートした。その後、OD測定（650nm、光路長18mm）の
ため、および生存数測定のために試料を無菌的に引き出
した（下記参照）。

生細胞の嫌気的収穫および保存:407A細胞を嫌気的遠
心によって収穫した。嫌気的グローブボックス内の予備
平衡化によって脱酸素化した気密ｏ−リングシール遠心
ビン［デュポン（DuPont）］を使用した。ハウスバキュ
ームを用いてカーボイ培養を分配してグローブボックス
中で該ビンを満たし、はかりで計量し（重さを測り）、
密閉した。次いで、室温で20分間、GS−３ローター［ソ
ルバール（Sorvall）］中、該ビンを6,250×ｇで遠心し
た。グローブボックス中、上澄み液を捨て、ペレット化
細胞を、ラクテートを含まないが20％（v/v）グリセロ
ールを含む少量のB18c培地に再懸濁した。全ペレットを
再懸濁した後、懸濁液をプールし、全容量を測定し、以
下のように生存数測定を行った。12の各カーボイから
の濃縮細胞懸濁液の平均合計容量は123mlであり、約100
倍の濃縮率を示した。B18c−グリセロール細胞懸濁液を
100mlの血清ビンに分配し、−70℃で冷凍した。使用前
の最大冷凍時間は３週間であった。生存試験は、冷凍懸
濁液が少なくとも３カ月間安定であることを示した。融
解直後であってウシに該懸濁液を接種する前に、もう１
回生存数を測定した。

生存数測定:ADS緩衝液［ブライアント，エム・ピー
（Bryant,M.P.）およびエル・エイ・バーキィ（L.A.Bur
key）、ジャーナル・オブ・デーリー・サイエンス（J.D
airy Sci.）、36、第205頁〜第217頁（1953）］中、培
養物または濃縮細胞懸濁液1mlを10倍工程で連続希釈し
た。選択した希釈液50および100μをB18c寒天（1.5％
w/v）プレートに接種した。ステンレスインキュベーシ
ョン容器中、5lbs.CO₂下、38℃で48時間、該プレートを
インキュベートし、次いで、培養あるいは新しいまたは
融解した細胞懸濁液中の生菌の存在についてコロニーを
計数した。

ルーメン投与量の選択：予め、本発明者らは、1ml当
たり２×10⁸生細胞の接種レベルがin vitroで乳酸の蓄
積を減少させ、かつpHの低下を防止するのに効果的な投
与量であることと判断した。かくして、本発明者らは、
我々のin vivo投与レベルについてこの濃度を目標とし
た。実験去勢ウシの実際のルーメン容量は未知であった
ので、本発明者らは、各々が30の暫定的液量を有する
と仮定した。目標は、ルーメン当たり６×10¹²個の407A
生菌またはルーメン液1ml当たり約２×10⁸個の生細胞を
接種することであった。各カーボイが容量および生存数
が異なる407A細胞を得たので、３つのカーボイからの濃
縮細胞懸濁液を各ブロックについて混合した。かくし
て、アシドーシス誘発後の別時点で接種することに加え
て、各ブロックには僅かに異なる投与量を摂取させた
（第12表、参照）。

ルーメン接種法：各実験ブロックについてアシドーシ
ス開始の日に、３つの別々のカーボイ培養からの濃縮細
胞懸濁液を室温で融解し、嫌気性的グローブボックス中
で混合した。合わせた懸濁液の生存数を測定した（第12
表）。その後、懸濁液を２等分し（２頭の被験動物の各
々につき１つ）、エルレンマイヤーフラスコ中に密閉し
た。これらをグローブボックスから取り出し、所定時間
にルーメン内で開き、各動物のルーメン内容物と一緒に
完全に手動で混合した。定刻よりも30分ほどは早くない
時間に、ルーメン投与のために接種物を準備した。ブロ
ック２、３および４において、処置した動物に、各々、
アシドーシス開始（0600時間）後、４、３および２時間
目にルーメン接種物を投与した。

分析方法：前記方法を用いて乳酸濃度を測定した。HP
LC法［ディネックス・コーポレイション（Dinex Corpor
ation）、イオンクロマトグラフィークックブック：イ
オンクロマトグラフィーによる定量分析への実践ガイド
（Ion chromatography cookbook:a practical guide to
quantitative analysis by ion chromatography）、第
II−15−16頁（1987）］によって揮発性脂肪酸濃度を測
定した。

ブロック２では、アシドーシスの開始から４時間後
に、処置したウシに接種した。菌株407Aが、この時点で
乳酸のin vitro蓄積を低下させることは予め判明してい
た。

ブロック２では、ルーメンpHは、急性アシドーシス開
始後６時間以内に、対照動物において平均約8.0〜5.0以
下まで迅速に低下した。菌株407Aを投与された２頭の去
勢ウシにおけるルーメンpHは６時間までには5.0まで低
下するが、残りの時間はpH5.0以上を維持し、他方、対
照動物のpHは減少し続けた。

対照動物におけるルーメン乳酸は、アシドーシス誘発
後４〜８時間に100mM以上にまで蓄積され、乳酸は、残
りの観察時間を通して高いままであった。投与去勢ウシ
において蓄積されたルーメン・ラクテートは、アシドー
シス誘発後４〜６時間に約60mMにまで上昇した。その
後、乳酸濃度は、間断なく20mM未満まで減少した。

VFAのルーメン濃度を、最初の12時間モニターした。
アシドーシス誘発前、実験動物のいずれにも非常に小さ
いルーメン発酵活性が存在した。例えば、アセテート濃
度は約10mMであった。アセテート蓄積を反映するルーメ
ン発酵活性は、各ミールによって間断なく増加した。５
〜12時間で、対照動物のルーメンアセテート濃度は約5m
Mのレベルまで間断なく低下した。この一時的増加は乳
酸生産の大きい増加に一致した。反対に、407A投与去勢
ウシのルーメン・アセテート濃度は、最初の６時間にわ
たって増加し、次いで、モニターした12時間にわたって
28mMを保持すると思われた。

観察期間にわたって対照動物において、プロピオネー
ト、ブチレートおよびバレレートは非常に低レベルで検
出された（各々、５、２および1mMより低い）。しか
し、４時間目に菌株407Aでルーメン接種した後、プロピ
オネートは約８倍増加した。ブチレートおよびバレレー
トについても、共に４時間の時点から間断なく増加し、
12時間までに各々14および4.5mMの平均濃度に達し、８
倍の増加が観察された。対照または投与された動物にお
いて、イソブチレートおよびイソバレレートは1mM未満
の濃度で観察された。

ブロック３では、ルーメン接種時間を１時間繰り上
げ、アシドーシスの開始後３時間目に動物に接種した。

対照動物におけるルーメンpHは、アシドーシス誘発後
９時間以内に平均8.4から5.0未満まで迅速に低下した。
しかし、投与去勢ウシにおけるルーメンpHは、ブロック
２におけるほど迅速には低下せず、約5.5に維持され
た。投与去勢ウシに関しては、16時間目で、5.2の低平
均pH値に達した。対照去勢ウシにおけるルーメン乳酸濃
度は、４〜８時間に100mMを超えて再度上昇し、高いま
まであった。投与動物においては、ラクテート濃度は４
〜６時間に45mMを超えて上昇するが、12時間後には、24
時間までには０近くまで低下する。

対照去勢ウシにおいては、ルーメンアセテート濃度は
ミール給餌期間に上昇するが、ブロック２におけるよう
にその後低下し、他方、投与去勢ウシにおいては、アセ
テート濃度は20mM近傍のままであった。対照動物におけ
るプロピオネート、ブチレートおよびバレレート濃度
は、再度、非常に低下した（各々、５、２および1mM未
満）。投与去勢ウシにおいては、プロピオネートはアシ
ドーシス開始５時間後に５倍に増加し、他方、ブチレー
トおよびバレレートは、ルーメン接種時の各３時間後に
約10倍まで間断なく増加した。対照または投与動物にお
いては、イソブチレートおよびイソバレレートは1mM未
満の濃度が観察された。

最初のブロックから完了した乳酸試料の分析につい
て、407Aは接種に際し直後にラクテートを代謝できたよ
うであり、乳酸のルーメン濃度が低くても被害を受ける
ようではなかった。ブロック３において最初の１時間に
接種することの成功について、ブロック４について、ル
ーメン接種時間を、アシドーシス誘発後２時間目まで、
さらに１時間繰り上げた。

ブロック４において、機械的失敗によって、ルーメン
pHデータを失った。ルーメン乳酸濃度は、急性アシドー
シスの誘発が前のブロックにおけると同様に成功であっ
たことを示した。対照動物は、アシドーシス誘発後４〜
８時間にルーメン乳酸の迅速な蓄積を再度示した。しか
し、アシドーシス誘発後２時間目の407Aの接種は、乳酸
蓄積をほとんど阻止することが明白であった。投与去勢
ウシにおいて検出された最高レベルは、５〜６時間目で
20mM未満であった。その後、乳酸濃度は4mM未満であっ
た。

ブロック４において、対照および投与両去勢ウシにお
けるアセテート濃度のプロフィールは前のブロックのも
のと同様であったが、投与去勢ウシのアセテート濃度は
より高かった。対照動物におけるプロピオネート、ブチ
レートおよびバレレート濃度は、前のブロックのものと
同様であった。前のブロックとは対照的に、投与動物に
おいて、プロピオネートはほとんど生産されなかった。
しかし、投与去勢ウシにおいては、ブチレートおよびバ
レレートは、ルーメン接種の２時間目から、各々、50お
よび10mMまで約40倍、間断なく増加した。対照または投
与動物においては、イソブチレートおよびイソバレレー
トは1mM未満の濃度で観察された。

本実施例で使用したアシドーシス動物モデルを用い
て、乳酸消費細菌407Aを試験した。まず、該動物を非常
に低質の飼料でバックグラウンド化し、次いで、１％BW
の干し草を給餌し、次いで、アシドーシス誘発前24時
間、絶食させた。これにより、これらの去勢ウシは、恐
らくは過剰のビカーボネートによる高ルーメンpH（8.
0）、CO₂の低生産量および低濃度のVFAが典型的な非常
に低レベルの内因性ルーメン発酵活性となった。第２
に、このシステム中への穀物ミール（２％BW全量）の導
入により、最初の４時間にわたる全ての主要なVFAの間
断なき増加によって立証された生存ルーメン内微生物の
代謝が開始された。しかし、４時間後、速く増殖する乳
酸生産微生物がそれらのVFA生産競争者を圧倒し、乳酸
発酵が確立されたは明白であった。第３に、ルーメンpH
を5.0未満に低下させるのに必要な時間および乳酸濃度
を100mMを超えて増加させるのに必要な時間においてい
くらか変化があったが、該モデルは一致した。この（乳
酸）アシドーシスモデルへの乳酸消費細菌407Aの導入
は、その完全性および代謝の厳格な試験であった。

ブロック２においては、アシドーシス誘発後４時間目
に407Aを接種した。この時点は、ルーメンpHの低下およ
びルーメン乳酸の増加の最大割合と一致した。ルーメン
pHが5.0未満に低下しなかったという事実以外に、本発
明者らは、407Aを非常に遅く接種するとpHに有意な影響
を及ぼすと結論した。ブロック３においては、アシドー
シス誘発開始後３時間目にルーメン接種した場合、ルー
メンpHへの影響はより明白であった。ブロック３のデー
タは、407A投与動物において、5.5以上の平均ルーメンp
Hを示した。技術的な困難により、ブロック４のpHデー
タは含ませることができなかった。しかし、これらの投
与動物での乳酸レベルがブロック３におけるものよりも
非常に低いので、対照および407A投与去勢ウシ間のpHの
差異はさらに大きかったであろう。

乳酸蓄積への407Aの影響は、試験した全ブロックにお
いて大きかった。ブロック２においては、その濃度が対
照動物の半分に達するのみならず、乳酸が407A投与動物
では経時的に連続して減少した。これらのデータは、冷
凍および融解された407A細胞がルーメン接種によって直
ちに乳酸代謝できることを示した。ブロック３および４
の早期接種によって、ルーメン乳酸蓄積は407Aによって
効果的に阻止され、かくして、急性アシドーシス症状は
発生しなかった。

上述の通り、アシドーシス誘発前の全動物において
は、VFAは低濃度で存在していた。アシドーシス対照動
物においては、主要VFAの増加は、誘発４時間後には乳
酸によって置き換えられていた。407A投与動物のルーメ
ン接種の時期に関係なく、ラクテート上で増殖させた場
合、407Aの主要発酵産物であるブチレートおよびバレレ
ートは、接種直後に増加した。ブロック２および３にお
いては、１〜２時間後には、プロピオネートの増加が続
いた。

プロピオネートレベルが最低であった場合にブチレー
トレベルは最高であった（ブロック４）。対照的に、プ
ロピオネートレベルが最高であった場合にブチレートレ
ベルは最低であった（ブロック２）。ルーメン液を４時
間目に投与した場合（ブロック２）、可溶性糖濃度（ほ
とんどはグルコースおよびマルトース）は高く、ほぼ50
mMであった。かくして、乳酸と同様に糖類は407Aが利用
可能であった。ブロック４においては、２時間目にルー
メンを接種した場合、対応して少量の糖および多量の乳
酸が発酵に利用可能であった。407Aはいくつかの糖類の
上で増殖することができるので、これらのルーメンの症
状は観察されたVFAプロフィールにおける差異が原因で
あり得る。この現象はメガスフェラー・エルスデニィイ
（Megasphaera elsdenii）につきin vitroで以前観察さ
れていた［マロウネク，エム（Marounek,M.）ら、Appl.
Environ.Microbiol.、55、第1570〜1573頁（1989）］。
メガスフェラー・エルスデニィイ（M.elsdenii）は、同
時にいくつかの基質を利用することができ、プロピオネ
ート、ブチレートおよびバレレートを生産ができる［マ
ロウネク，エム（Marounek,M.）ら、上記文献およびラ
ッセル，ジェイ・ビー（Russell,J.B.）およびアール・
エル・バルドウィン（R.L.Baldwin）、Appl.Environ.Mi
crobiol.、36、第319〜329頁（1978）］。

要約すれば、急性乳酸アシドーシスの予防は、アシド
ーシス誘発後の４、３および２時間目に、ルーメンにル
ーメン液1ml当たり１〜２×10⁸の407A生菌を接種した場
合に、より中性のルーメンpHおよび低乳酸濃度を維持す
ることによって、この順序でより成功した。これらのデ
ータから、乳酸消費細菌407A（UC−12497）はアシドー
シス予防剤または適応助剤として有用であることが明ら
かである。

単離体407Aは、ジ・アップジョン・カルチャー・コレ
クション（The Upjohn Culture Collection）［ジ・ア
ップジョン・カンパニー（The Upjohn Company）、4900
1ミシガン州カラマズー］に寄託し、受託番号UC−12497
が付された。また、単離体407Aは、受託番号NRRL B−18
624の下、1990年２月15日にARSパテント・カルチャー・
コレクション（ARS Patent Culture Collection）［ア
グリカルチュラル・リサーチ・サービス・カルチャー・
コレクション（Agricultural Research Service Cultur
e Collection）、ノーザン・リージョナル・リサーチ・
センター（Northern Regional Research Center）61604
イリノイ州ペオリア、ノース・ユニバーシティ・ストリ
ート1815番］に寄託した。

^ａアシドーシス開始後の時間^b 0.5％BWミールのサイズの計算はこのブロックでは間違
い^ｃ 行わず ^ａ生存数。^ｂ 去勢ウシ当たり^c 6カーボイ^ｄ 測定せず^ｅ このブロックにおけるカーボイは同日に一まとめにし
て実施

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 グリーニング，リチャード・チャールズ アメリカ合衆国ミシガン州49083、リッ チランド、１／２・エム89 11081番 (72)発明者 スモーレンスキー，ウォルター・ヨセフ アメリカ合衆国ミシガン州49083、リッ チランド、イースト・シィディ・アベニ ュー9242番 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 1/20 - 1/21 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】6ppmモネンシンを含有するブロス培地中で
   増殖できるメガスフェラー・エルスデニィイ（Megaspha
   era elsdenii）407A株NRRL B−18624の細菌培養物。
2. 【請求項２】請求項（１）記載の細菌培養物からなるこ
   とを特徴とする粗飼料または通常の牧草飼料から高エネ
   ルギー澱粉飼料への反芻胃動物の適応を促進するための
   組成物。
3. 【請求項３】適応の間に、請求項（１）記載の細菌培養
   物を反芻胃動物に投与することを特徴とする粗飼料また
   は通常の牧草飼料から高エネルギー飼料への反芻胃動物
   の適応を促進する方法。
4. 【請求項４】乳酸アシドーシスを予防するのに充分な量
   の請求項（１）記載の細菌培養物を反芻胃動物に投与す
   ることを特徴とする反芻胃動物における急性乳酸アシド
   ーシスを予防する方法。