JP3038151B2 - Fusion method of fermentation and microbial conversion reaction - Google Patents
Fusion method of fermentation and microbial conversion reactionInfo
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Description
【０００１】[0001]
【発明の属する技術】本発明は、グルコース等の糖類か
らの発酵生産物である水溶性有機酸類またはアルコール
類を、微生物的にエステル化反応に組み込む発酵と微生
物変換反応との融合方法に関する。[0001] The present invention relates to a method of integrating a fermentation and a microbial conversion reaction by microbiologically incorporating a water-soluble organic acid or alcohol, which is a fermentation product from a saccharide such as glucose, into an esterification reaction.
【０００２】[0002]
【従来技術およびその課題】近年、微生物変換法による
物質生産が世界中で試みられており、この微生物変換法
の１つの応用例として、リパーゼやエステラーゼのよう
な加水分解酵素の逆反応によってエステルを合成する方
法が、特に光学分割を目的として数多く提案されている
［T．Sugai and H．Ohta，Agric．Biol．Chem.，５５，
２９３（１９９１）；H．Kakeya，et al.，Agric．Bio
l．Chem.，５５，１８７７（１９９１）；T．Sugai and
H．Ohta，Agric．Biol．Chem.，５４，３３３７（１９
９０）］。この酵素によるエステル化反応を効率的に進
めるためには、反応系に存在する水分量を減少させるこ
とが必要であり、そのために酵素反応は一般には有機溶
媒中で行われる。2. Description of the Related Art In recent years, attempts have been made to produce substances by a microbial conversion method all over the world. As one application example of this microbial conversion method, an ester is produced by a reverse reaction of a hydrolase such as lipase or esterase. Many synthesis methods have been proposed, particularly for the purpose of optical resolution [T. Sugai and H. Ohta, Agric. Biol. Chem., 55,
293 (1991); Kakeya, et al., Agric. Bio
l. Chem., 55, 1877 (1991); Sugai and
H. Ohta, Agric. Biol. Chem., 54, 3337 (19
90)]. In order to efficiently carry out the esterification reaction by the enzyme, it is necessary to reduce the amount of water present in the reaction system, and therefore, the enzyme reaction is generally performed in an organic solvent.
【０００３】一方、市販されているリパーゼおよびエス
テラーゼは、コスト上の問題の他に、三級水酸基のエス
テル化が不可能である、立体障害の大きいカルボン酸の
エステル化が困難である。α，β−不飽和カルボン酸の
エステル化が困難である、芳香環に置換したカルボン酸
のエステル化が困難である、比較的対称性のよい一級水
酸基のエステル化では光学分割が困難である、等の多く
の問題を有している。さらに、エステル化に供する低分
子量の有機酸またはアルコールを高濃度で反応系に投入
すると、反応系のｐＨ低下やリパーゼまたはエステラー
ゼの失活が生ずるため、高濃度のエステル合成は非常に
困難である［B．Cambou and A．M．Klibanov，Biotechn
ol．Bioeng.，２６，１４４９（１９８４）］。On the other hand, commercially available lipases and esterases are difficult to esterify a carboxylic acid having a large steric hindrance, in which esterification of a tertiary hydroxyl group is impossible, in addition to cost problems. It is difficult to esterify an α, β-unsaturated carboxylic acid, it is difficult to esterify a carboxylic acid substituted with an aromatic ring, and it is difficult to optically resolve the esterification of a primary hydroxyl group having relatively good symmetry. And so on. Furthermore, when a low-molecular-weight organic acid or alcohol to be subjected to esterification is charged into the reaction system at a high concentration, the pH of the reaction system decreases and lipase or esterase is deactivated, so that high-concentration ester synthesis is very difficult. [B. Cambou and A. M. Klibanov, Biotechn
ol. Bioeng., 26, 1449 (1984)].
【０００４】このような市販のリパーゼまたはエステラ
ーゼがもつ上記の如き欠陥を克服するために、新規なリ
パーゼまたはエステラーゼを生産し得る微生物のスクリ
ーニングおよび該微生物をそのまま生体触媒として利用
する微生物変換法が広く試みられているが、微生物は一
般に有機溶媒中では死滅するかもしくは増殖不能であ
り、エステル化反応を安定的に進行せしめることは困難
である。In order to overcome the above-mentioned deficiencies of such commercially available lipases or esterases, screening of microorganisms capable of producing novel lipases or esterases and microbial conversion methods using the microorganisms as they are as biocatalysts are widely used. Although attempts have been made, microorganisms generally die or cannot grow in organic solvents, and it is difficult to allow the esterification reaction to proceed stably.
【０００５】また、アルコールアセチルトランスフエラ
ーゼによるエステル生成が知られているが、清酒香気エ
ステルの生成のみに関心がもたれており、有用なエステ
ルの合成を目的とする報告は皆無である。[0005] Further, although ester formation by alcohol acetyltransferase is known, there is no interest in only the production of sake flavored esters, and there is no report aimed at synthesizing useful esters.
【０００６】一方、栄養源および水を含む親水性担体に
付着させた、微生物に対して実質的に毒性を示さない疎
水性有機溶媒界面で増殖する微生物を生体触媒として利
用する界面バイオリアクターは、ほとんど全ての微生物
および微生物反応に適用することができ、エステル化反
応も非常に効率的に進行させることができる［S．Odaan
d H．Ohta，Biosci．Biotech．Biochem.，５６，２０４
１（１９９２）；S．Oda，et al.，J．Ferment．Bioen
g.，７８，１４９（１９９４），特開平５−３４４８９
６号公報］。しかしながら、界面バイオリアクターで
は、親水性の毒物に対する毒性回避は不可能であり、低
分子の有機酸類またはアルコール類を高濃度で反応系に
添加することは困難である［S．Oda and H．Ohta，Bios
ci．Biotech．Biochem.，５６，１５１５（１９９
２）］。On the other hand, an interfacial bioreactor utilizing a microorganism, which is attached to a hydrophilic carrier containing a nutrient source and water and grows on a hydrophobic organic solvent interface which is substantially non-toxic to microorganisms, as a biocatalyst, It can be applied to almost all microorganisms and microbial reactions, and the esterification reaction can also proceed very efficiently [S. Odaan
d H. Ohta, Biosci. Biotech. Biochem., 56, 204
1 (1992); Oda, et al. Ferment. Bioen
g., 78, 149 (1994), JP-A-5-34489.
No. 6]. However, in the interfacial bioreactor, it is impossible to avoid toxicity to hydrophilic poisons, and it is difficult to add low-molecular organic acids or alcohols to the reaction system at a high concentration [S. Oda and H. Ohta, Bios
ci. Biotech. Biochem., 56, 1515 (199
2)].
【０００７】[0007]
【問題を解決するための手段】そこで本発明者は、上記
の如き従来技術の様々な問題点を解決するために鋭意検
討を重ねた結果、界面バイオリアクターの大きな長所で
ある有機溶媒中での微生物の増殖能と該微生物の発酵能
を効果的に活用し、水溶性の有機酸類、アルコール類ま
たはそれらの前駆体であるアセチルコエンザイムＡを発
酵生産させつつ、これら水溶性有機酸類、アルコール類
またはアセチルコエンザイムＡを逐次微生物エステル化
反応に組み込み、発酵と微生物的エステル化反応を融合
させることによって解決できることを見出し本発明を完
成するに至った。The present inventors have conducted intensive studies to solve the various problems of the prior art as described above. As a result, the present inventor has found that an interfacial bioreactor has a great advantage in an organic solvent. While effectively utilizing the growth ability of microorganisms and the fermentation ability of the microorganisms, while fermentatively producing acetyl coenzyme A, which is a water-soluble organic acid, alcohol or a precursor thereof, these water-soluble organic acids, alcohols or The present inventors have found that the problem can be solved by incorporating acetyl coenzyme A into the successive microbial esterification reaction and fusing the fermentation with the microbial esterification reaction, thereby completing the present invention.
【０００８】かくして、本発明に従えば、親水性固定化
担体に有機酸発酵能、アルコール発酵能またはアセチル
コエンザイムＡ発酵能を有し且つリパーゼ、エステラー
ゼまたはアルコールアセチルトランスフエラーゼを生産
する能力を有する微生物を付着させ、該微生物の栄養源
である発酵原料である糖類を含む水性媒体の存在下に、
水に不溶性もしくは難溶性（以下、まとめて「水難溶
性」という）のアルコールまたは有機酸を含有する疎水
性有機溶媒を該担体上の該微生物に接触させて接触界面
で該微生物を増殖させ、該増殖微生物の作用によって、
該発酵原料から水溶性有機酸、アルコールまたはアセチ
ルコエンザイムＡ（以下、「アセチル−ＣｏＡ」と略
す）を発酵生産させながら、該微生物と上記疎水性有機
溶媒中の水難溶性のアルコールまたは有機酸類との間で
微生物的エステル化反応を行うことを特徴とする発酵と
微生物変換との融合方法が提供される。Thus, according to the present invention, the hydrophilic immobilized carrier has an organic acid fermentation ability, an alcohol fermentation ability, or an acetyl coenzyme A fermentation ability, and has the ability to produce lipase, esterase or alcohol acetyltransferase. In the presence of an aqueous medium containing a saccharide that is a fermentation raw material that is a nutrient source of the microorganism,
A hydrophobic organic solvent containing an alcohol or an organic acid that is insoluble or hardly soluble in water (hereinafter collectively referred to as “poorly water-soluble”) is brought into contact with the microorganism on the carrier, and the microorganism is grown at the contact interface. By the action of growing microorganisms,
While fermentatively producing a water-soluble organic acid, alcohol or acetyl coenzyme A (hereinafter abbreviated as “acetyl-CoA”) from the fermentation raw material, the microorganism and the poorly water-soluble alcohol or organic acid in the hydrophobic organic solvent are mixed with each other. A method for the fusion of fermentation and microbial conversion is provided, wherein a microbial esterification reaction is performed between the fermentation and the microbial conversion.
【０００９】本発明によれば、界面バイオリアクターに
おける担体／疎水性有機溶媒からなる固／液界面に増殖
する微生物は、担体中のグルコース、デンプン、ショ糖
などの糖類からなる発酵原料を利用して低分子量の水溶
性有機酸類、アルコール類またはアセチル−ＣｏＡを発
酵生産する。これらの発酵生産物は、該微生物の有する
リパーゼ、エステラーゼまたはアルコールアセチルトラ
ンスフエラーゼの酵素作用によって、疎水性有機溶媒中
の水難溶性アルコール類あるいは有機酸類でエステル化
されて、疎水性有機溶媒中にエステル化物が大量に蓄積
してくる。この場合、有機酸発酵、アルコール発酵また
はアセチル−ＣｏＡ発酵によって生成してくる低分子量
の水溶性有機酸類、アルコール類またはアセチル−Ｃｏ
Ａは、担体中で毒性を発現する濃度に達する前に逐次エ
ステル化反応に供されるため、微生物に対して毒性を発
現することはない。また、疎水性有機溶媒中の水難溶性
アルコール類または有機酸類は、界面バイオリアクター
の大きな長所である固／液界面における毒性緩和現象に
基づき、その添加濃度および蓄積濃度を従来技術よりも
格段に引き上げることが可能である。さらに、エステル
化によって生ずるエステル類もまた、該毒性緩和現象に
基づき、従来技術をはるかに凌ぐ高濃度レベルで蓄積可
能である。According to the present invention, microorganisms growing on a solid / liquid interface comprising a carrier / a hydrophobic organic solvent in an interface bioreactor utilize a fermentation raw material comprising a saccharide such as glucose, starch, and sucrose in the carrier. Fermentatively produce low molecular weight water-soluble organic acids, alcohols or acetyl-CoA. These fermentation products are esterified with poorly water-soluble alcohols or organic acids in a hydrophobic organic solvent by the enzymatic action of lipase, esterase or alcohol acetyltransferase possessed by the microorganism, and are converted into a hydrophobic organic solvent. Large amounts of esterified compounds accumulate. In this case, low molecular weight water-soluble organic acids, alcohols or acetyl-Co produced by organic acid fermentation, alcohol fermentation or acetyl-CoA fermentation.
Since A is subjected to successive esterification reactions before reaching a concentration at which toxicity is exhibited in the carrier, it does not exhibit toxicity to microorganisms. In addition, poorly water-soluble alcohols or organic acids in a hydrophobic organic solvent significantly increase the added concentration and accumulated concentration thereof compared to the prior art, based on the toxicity reduction phenomenon at the solid / liquid interface, which is a great advantage of an interfacial bioreactor. It is possible. In addition, esters resulting from esterification can also accumulate at high concentration levels, far exceeding the prior art, based on the mitigation phenomenon.
【００１０】上記した微生物的エステル化反応におい
て、発酵によって水溶性有機酸類が生産される場合に
は、当然このものは疎水性溶媒中のアルコール類との間
で、そして発酵によって水溶性アルコール類が生産され
る場合にはこのものは疎水性溶媒中の有機酸類との間で
エステル化が行われる。In the above-mentioned microbial esterification reaction, when a water-soluble organic acid is produced by fermentation, it is naturally exchanged with an alcohol in a hydrophobic solvent, and the water-soluble alcohol is produced by fermentation. If produced, it is esterified with organic acids in a hydrophobic solvent.
【００１１】一方、アセチル−ＣｏＡが発酵生産される
場合には、該アセチル−ＣｏＡはアセチルドナーとして
有機溶媒中のアルコール類とエステル化される。On the other hand, when acetyl-CoA is produced by fermentation, the acetyl-CoA is esterified with an alcohol in an organic solvent as an acetyl donor.
【００１２】しかして、本発明の第一の特徴は、界面バ
イオリアクターの長所である有機溶媒中での微生物の増
殖現象を活用し、該微生物に発酵によって水溶性有機
酸、アルコールまたはアセチル−ＣｏＡを産出させつ
つ、これを逐次該微生物によるエステル化反応に組み込
むことにある。従来のバイオテクノロジーの領域では、
発酵法と微生物変換法とは全く異種の研究あるいは応用
分野であり、したがって、各分野の研究あるいは応用は
全く独立に展開されてきたため、発酵と微生物変換法を
融合させる試みは皆無であった。しかるに本発明では、
発酵によって水溶性有機酸類、アルコール類またはアセ
チル−ＣｏＡを生産させつつ、これらを逐次エステル化
反応に組み込むため、微生物にとって好ましい状態で発
酵と微生物的エステル化反応の融合を図ることができ
る。Thus, a first feature of the present invention is to utilize a growth phenomenon of a microorganism in an organic solvent, which is an advantage of an interfacial bioreactor, and to ferment the microorganism with a water-soluble organic acid, alcohol or acetyl-CoA. And successively incorporating it into an esterification reaction by the microorganism. In traditional biotechnology,
The fermentation method and the microbial conversion method are completely different research or application fields, and therefore, the research or application in each field has been developed completely independently. Therefore, no attempt has been made to integrate the fermentation method and the microbial conversion method. However, in the present invention,
Since the water-soluble organic acids, alcohols, or acetyl-CoA are produced by fermentation and successively incorporated into the esterification reaction, the fermentation and the microbial esterification reaction can be fused in a preferable state for the microorganism.
【００１３】本発明の第二の特徴は、エステル化に供さ
れる水溶性の有機酸類、アルコール類またはアセチル−
ＣｏＡの微生物に対する毒性発現を抑えることができる
ことである。水溶性の有機酸類、アルコール類またはア
セチル−ＣｏＡは、微生物に対して強毒性もしくはフィ
ードバック阻害を発現するため、これらを従来技術に従
って微生物反応系に添加する場合、その添加濃度は低く
設定せざるを得ず、その結果、低反応速度、低収量を余
儀なくされる。また、市販のアセチル−ＣｏＡ塩は極め
て高価であるため、これをアセチルドナーとして用いる
ことは実用上不可能である。しかるに、本発明において
は、発酵によって生ずる水溶性有機酸類、アルコール類
またはアセチル−ＣｏＡは、微生物に対して毒性あるい
はフィードバック阻害を発現する濃度に達する前に逐次
エステル化反応に供されるため、該水溶性有機酸類、ア
ルコール類またはアセチル−ＣｏＡの毒性もしくはフィ
ードバック阻害発現の問題は生じず、安定的に発酵およ
びエステル化反応を継続せしめることができる。[0013] A second feature of the present invention is that water-soluble organic acids, alcohols or acetyl-esters to be subjected to esterification are used.
That is, the expression of the toxicity of CoA to microorganisms can be suppressed. Since water-soluble organic acids, alcohols or acetyl-CoA exhibit strong toxicity or feedback inhibition to microorganisms, when they are added to a microbial reaction system according to the prior art, the addition concentration must be set low. As a result, a low reaction rate and a low yield are forced. In addition, commercially available acetyl-CoA salts are extremely expensive, and it is practically impossible to use them as acetyl donors. However, in the present invention, the water-soluble organic acids, alcohols or acetyl-CoA produced by fermentation are subjected to a sequential esterification reaction before reaching a concentration that exhibits toxicity or feedback inhibition to microorganisms. The problem of toxicity or feedback inhibition of water-soluble organic acids, alcohols or acetyl-CoA does not occur, and the fermentation and esterification reactions can be stably continued.
【００１４】また、本発明の第三の特徴は、エステル化
に供される水難溶性アルコール類あるいは有機酸類は、
界面バイオリアクターにおける毒性緩和現象によって、
その添加濃度を高く設定できる点にある。原料の添加濃
度は、生産性や収率の向上、さらには生成物の分離精製
上非常に重要な因子であり、製造コスト低減に大きく寄
与する。A third feature of the present invention is that a poorly water-soluble alcohol or organic acid used for esterification is
Due to the mitigation phenomenon in the interface bioreactor,
The point is that the addition concentration can be set high. The added concentration of the raw material is a very important factor in improving the productivity and yield, and further in separating and purifying the product, and greatly contributes to the reduction of the production cost.
【００１５】本発明の第四の特徴は、生成してくる水不
溶性エステル類が界面バイオリアクターの反応溶媒層に
自動的に移行するため、該エステル類の毒性回避や反応
平衡のエステル化へのシフト、反応速度の向上等を達成
することができる点にある。さらに、基質の水難溶性ア
ルコール類もしくは有機酸類が強毒性である場合、これ
らの基質を流加法によって逐次低濃度で添加することが
できる。生成物であるエステル類の反応溶媒中への高濃
度の蓄積は、第三の特徴とともに、製造コスト低減に大
きく寄与するものである。A fourth feature of the present invention is that the formed water-insoluble esters are automatically transferred to the reaction solvent layer of the interfacial bioreactor, thereby avoiding toxicity of the esters and reducing esterification in the reaction equilibrium. Shift, improvement of reaction speed, and the like can be achieved. Further, when the poorly water-soluble alcohols or organic acids of the substrate are highly toxic, these substrates can be successively added at a low concentration by a fed-batch method. The accumulation of a high concentration of the product esters in the reaction solvent, together with the third feature, greatly contributes to a reduction in production cost.
【００１６】さらに本発明の第五の特徴は、発酵生産を
効率化させるために担体中の糖類濃度を引き上げる場
合、エステル化反応と並行して生ずる、増殖微生物によ
ってもたらされる副反応、例えば、微生物的酸化反応を
効果的に抑止することができる点にある。微生物酸化反
応を触媒するアルコール脱水素酵素は一般に高濃度の糖
類、例えばグルコースによって活性抑止されることが知
られている［U．Lutstrof and R．Megnet，Arch．Bioch
em．Biophys.，１２６，９３３（１９６８）；B．S．Ya
dav，et al.，J．Ferment．Technol.，５７，２４４
（１９７９）］。従って、本発明によって高濃度の糖類
で発酵能を向上させる場合には、同時に副反応である微
生物的酸化反応が抑止され、結果として生成するエステ
ルの収率および収量は大幅に向上する。A fifth feature of the present invention is that when the concentration of saccharides in a carrier is increased in order to increase the efficiency of fermentation production, side reactions caused by growing microorganisms, such as microorganisms, occur in parallel with the esterification reaction. In that the effective oxidation reaction can be effectively suppressed. It is known that alcohol dehydrogenase, which catalyzes a microbial oxidation reaction, is generally inhibited by high concentrations of sugars such as glucose [U. Lutstrof and R. Megnet, Arch. Bioch
em. Biophys., 126, 933 (1968); S. Ya
dav, et al. Ferment. Technol., 57, 244
(1979)]. Therefore, when the fermentation ability is improved with a high concentration of saccharides according to the present invention, the microbial oxidation reaction which is a side reaction is suppressed at the same time, and the yield and yield of the resulting ester are greatly improved.
【００１７】本発明の融合方法で使用し得る界面バイオ
リアクターは、それ自体既知のものであることができ、
使用される親水性固定化担体の素材、大きさおよび形
態、使用可能な反応溶媒等としては、例えば、特開平５
−９１８７８号公報に記載されたものを使用することが
できる。The interfacial bioreactors that can be used in the fusion method of the present invention can be known per se,
Examples of the material, size and form of the hydrophilic immobilization carrier to be used, usable reaction solvents and the like include, for example,
No. 91878 can be used.
【００１８】親水性固定化担体としては、例えば、アル
ギン酸、カラギーナン、デンプンマトリクス、寒天、濾
過板のようなセルロース材などの天然高分子；ポリビニ
ルアルコール、ウレタンポリマー、ポリアクリルアミ
ド、ポリアクリル酸などの合成高分子；泡ガラス板のよ
うな無機多孔質材料の板状化物などを挙げることができ
る。担体を繰り返し再生使用する場合には、ゲル状合成
高分子や無機多孔質材料の板状化物などを用いるのが好
ましく、また、強度を付与するために、強固なろ過板や
泡ガラス板のような多孔質の板やステンレス等の板状ま
たは棒状物などを担体の骨格として用いるのが好まし
い。Examples of the hydrophilic immobilization carrier include natural polymers such as alginic acid, carrageenan, starch matrix, agar, and cellulose materials such as filter plates; synthetic polymers such as polyvinyl alcohol, urethane polymer, polyacrylamide, and polyacrylic acid. Polymers: plate-like products of inorganic porous materials such as foam glass plates and the like can be mentioned. When the carrier is repeatedly used and reused, it is preferable to use a gel-like synthetic polymer or a plate-like material of an inorganic porous material, and to impart strength, such as a strong filter plate or a foam glass plate. It is preferable to use a simple porous plate or a plate-like or rod-like material such as stainless steel as the skeleton of the carrier.
【００１９】また、反応溶媒である疎水性有機溶媒とし
ては、固定化された微生物菌体に対して実質的に毒性を
示さないものが好ましく、具体的には例えば、ヘキサ
ン、ヘプタン、オクタン、ノナン、デカン等の炭素数６
〜２０のメタン系炭化水素に代表されるノルマルパラフ
ィン類または流動パラフィン類；イソオクタン等のイソ
パラフィン類；ペンチルベンゼン、ヘキシルベンゼン、
ヘプチルベンゼン、オクチルベンゼン等の脂肪族鎖の炭
素数が５〜１５のノルマルアルキルベンゼン類；キュメ
ン等のイソアルキルベンゼン類；シクロヘキサン等の脂
環式炭化水素類；ジヘキシルエーテル等の脂肪族エーテ
ル類；ジブチルフタレート等の芳香族エステル類；デカ
ン酸エチル等の脂肪族エステル類；ポリジメチルシロキ
サン等のシリコンオイル等を例示することができる。As the hydrophobic organic solvent which is a reaction solvent, those which do not substantially exhibit toxicity to the immobilized microbial cells are preferable, and specific examples thereof include hexane, heptane, octane and nonane. , Decane, etc. with 6 carbon atoms
Normal paraffins or liquid paraffins represented by methane hydrocarbons of from 20 to 20; isoparaffins such as isooctane; pentylbenzene, hexylbenzene,
Normal alkylbenzenes having 5 to 15 carbon atoms in the aliphatic chain such as heptylbenzene and octylbenzene; isoalkylbenzenes such as cumene; alicyclic hydrocarbons such as cyclohexane; aliphatic ethers such as dihexyl ether; dibutylphthalate And the like; aliphatic esters such as ethyl decanoate; silicone oils such as polydimethylsiloxane;
【００２０】しかして、界面バイオリアクターの具体例
としては、例えば、反応溶媒としてパラフィン類を用
い、固定化担体としてポリビニルアルコール被覆のろ過
板を使用して、これを反応溶媒中に横配列もしくは縦配
列に充填したものを挙げることができる。Thus, as a specific example of the interfacial bioreactor, for example, a paraffin is used as a reaction solvent, and a filter plate coated with polyvinyl alcohol is used as an immobilization carrier, and these are arranged horizontally or vertically in the reaction solvent. An array can be mentioned.
【００２１】一方、界面バイオリアクターの親水性固定
化担体の代わりに、液体培地を用いる水／有機溶媒二相
系反応法［M．D．Hocknull and M．D．Lilly，Appl．Mi
crobiol．Biotechnol.，３３，１４８（１９９０）］に
よっても、本発明における発酵と微生物変換反応との融
合は可能であるが、その際には、有機溶媒やエステル化
に供する水難溶性アルコール類または有機酸類の毒性発
現が生じるため、界面バイオリアクターで得られる成績
を凌駕することはできない。On the other hand, a water / organic solvent two-phase reaction method using a liquid medium instead of the hydrophilic immobilized carrier of the interface bioreactor [M. D. Hocknull and M. D. Lilly, Appl. Mi
crobiol. Biotechnol., 33, 148 (1990)], it is possible to fuse the fermentation and the microbial conversion reaction in the present invention. In this case, however, the organic solvent or the poorly water-soluble alcohol or organic acid used for esterification can be used. Due to the onset of toxicity, the results obtained with interfacial bioreactors cannot be surpassed.
【００２２】微生物増殖のための酸素の供給について
は、有機酸発酵またはアルコール発酵を微生物に行わせ
る場合には、むしろ酸素供給をせずに嫌気条件下で増
殖、反応させる方がよいが、一般に微生物は増殖の過程
で反応溶媒中の酸素を消費してしまうため、必ずしも反
応溶媒の脱気あるいは窒素置換等の操作を行う必要はな
い。一方、アセチル−ＣｏＡを生産させる場合には、好
気条件下で発酵生産させるほうが好ましいため、特に界
面バイオリアクターは有効である。With respect to the supply of oxygen for the growth of microorganisms, when the microorganisms are to be subjected to organic acid fermentation or alcoholic fermentation, it is better to grow and react under anaerobic conditions without supplying oxygen. Since microorganisms consume oxygen in the reaction solvent during the growth process, it is not always necessary to perform operations such as degassing the reaction solvent or replacing with nitrogen. On the other hand, in the case of producing acetyl-CoA, it is more preferable to produce by fermentation under aerobic conditions, so that an interfacial bioreactor is particularly effective.
【００２３】微生物の増殖に必要な栄養源としては、水
溶性の有機酸類、アルコール類またはアセチル−ＣｏＡ
を発酵によって生じさせることが必要であるため、該水
溶性有機酸類、アルコール類またはアセチル−ＣｏＡの
発酵生産のための原料を含んでいることが必須であり、
その発酵原料としては、例えば、グルコース、デンプ
ン、ショ糖等の糖類が挙げられる。該栄養源は、これら
の水溶性有機酸、アルコール類またはアセチル−ＣｏＡ
を発酵生産する基質以外に、例えば特開平５−９１８７
８号公報に記載されている一般的な培地成分を含むこと
ができる。Nutrient sources necessary for the growth of microorganisms include water-soluble organic acids, alcohols and acetyl-CoA.
It is necessary to include a raw material for fermentative production of the water-soluble organic acids, alcohols or acetyl-CoA,
Examples of the fermentation material include sugars such as glucose, starch, and sucrose. The nutrient sources are water-soluble organic acids, alcohols or acetyl-CoA.
Other than the substrate for fermentative production of
No. 8 publication can contain general medium components.
【００２４】発酵原料としてのグルコース等の糖類の水
性媒体中における濃度は、高過ぎると、微生物の増殖阻
害や酵素活性、発酵能を阻害するので、一般には３〜５
重量％程度の濃度が適当であるが、糖類の濃度を約３重
量％以上に引き上げることによって、好ましくない副反
応、例えば反応溶媒中の水難溶性アルコール類や有機酸
類の酸化分解反応等が有意に抑制され、結果としてエス
テルの収率が著しく向上する場合も多くみられるので、
糖類の最適添加濃度は個々に実験的に決定することが望
ましい。If the concentration of a saccharide such as glucose as a fermentation raw material in an aqueous medium is too high, it inhibits the growth of microorganisms, enzyme activity and fermentation ability.
A concentration of about 3% by weight or more is suitable, but by increasing the concentration of the saccharide to about 3% by weight or more, undesirable side reactions, such as oxidative decomposition of poorly water-soluble alcohols and organic acids in the reaction solvent, are significantly reduced. In many cases, the yield of the ester is significantly improved as a result,
It is desirable that the optimum concentration of saccharide added be determined experimentally individually.
【００２５】本発明において上記糖類の有機酸発酵によ
って生産される有機酸類としては、例えば、ギ酸、酢
酸、プロピオン酸、乳酸、酪酸、アミノ酸等が挙げら
れ、また、上記糖類のアルコール発酵によって生産され
るアルコール類には、例えば、エタノール、プロパノー
ル、ブタノールのような低級アルコール類；ブタンジオ
ールのようなジオール類等が包含される。これらの発酵
生産物およびアセチル−ＣｏＡは、本発明に従い、以下
に述べる如き水難溶性アルコール類または有機酸類との
間での微生物的エステル化反応に供される。In the present invention, the organic acids produced by the organic acid fermentation of the above-mentioned saccharides include, for example, formic acid, acetic acid, propionic acid, lactic acid, butyric acid, amino acids and the like. Examples of the alcohols include lower alcohols such as ethanol, propanol, and butanol; and diols such as butanediol. According to the invention, these fermentation products and acetyl-CoA are subjected to a microbial esterification reaction with poorly water-soluble alcohols or organic acids as described below.
【００２６】このエステル化反応に供される反応溶媒中
の水難溶性アルコール類または有機酸類としては、反応
溶媒である疎水性有機溶媒に溶解し得るものであれば特
に制約はなく、例えば、１−オクタノールや１−デカノ
ール等の中鎖アルカノール類；１−オクタデカノール等
の長鎖アルカノール類；シトロネロールやメントール、
ゲラニオールのようなテルペンアルコール類；フェニル
プロパノールやフェニルブタノールのような芳香族アル
コール類；オクタン酸やデカン酸等のアルカン酸類；２
−ヒドロキシ−４−フェニルブタン酸のような芳香族酸
類；シトロネル酸やゲラニル酸のようなテルペン酸類；
等を挙げることができる。これらの水難溶性アルコール
類または有機酸類の添加量は、一般に界面バイオリアク
ターにおける毒性緩和現象に基づき高い濃度に設定可能
であるが、微生物種や原料の極性によっても左右され
る。例えば、シトロネロールのようなテルペンアルコー
ルや１−オクタノールのような中鎖アルカノールは、特
に水溶性アルコール、有機酸、アセチル−ＣｏＡ生産経
路にダメージを与えるため、界面バイオリアクターによ
ってもその毒性を大きく回避することはできず、微生物
種によってはわずか１〜５％の濃度しか添加できない場
合もあるが、そのような場合には、原料であるテルペル
アルコールやアルカノール類を逐次添加法（流加法）に
よって添加することにより解決することができる。The hardly water-soluble alcohol or organic acid in the reaction solvent used in the esterification reaction is not particularly limited as long as it can be dissolved in a hydrophobic organic solvent as a reaction solvent. Medium-chain alkanols such as octanol and 1-decanol; long-chain alkanols such as 1-octadecanol; citronellol and menthol;
Terpene alcohols such as geraniol; aromatic alcohols such as phenylpropanol and phenylbutanol; alkanoic acids such as octanoic acid and decanoic acid;
Aromatic acids such as -hydroxy-4-phenylbutanoic acid; terpene acids such as citronellic acid and geranilic acid;
And the like. The amount of these poorly water-soluble alcohols or organic acids to be added can be generally set to a high concentration based on the toxicity mitigation phenomenon in the interfacial bioreactor, but also depends on the microorganism species and the polarity of the raw material. For example, terpene alcohols such as citronellol and medium-chain alkanols such as 1-octanol particularly damage water-soluble alcohols, organic acids, and acetyl-CoA production pathways, so that their toxicity is also largely avoided by interfacial bioreactors. In some cases, only 1% to 5% can be added depending on the type of microorganism, but in such a case, the terper alcohol or alkanol as a raw material is added by a sequential addition method (fed-batch method). Can solve the problem.
【００２７】また、水溶性の比較的高い有機酸類または
アルコール類であっても、反応溶媒中への添加量を低く
抑え、段階的にこれを添加する流加法を適用すれば、本
発明のエステル化用の基質として用いることができる。In addition, even if organic acids or alcohols having relatively high water solubility are added to the reaction solvent in a low amount and the fed-batch method of adding these in a stepwise manner is applied, the ester of the present invention can be obtained. It can be used as a substrate for conversion.
【００２８】本発明で使用可能な微生物種としては、糖
類の発酵による水溶性有機酸類、アルコール類またはア
セチル−ＣｏＡの生産能（有機酸発酵能、アルコール発
酵能またはアセチル−ＣｏＡ発酵能）を有し、且つリパ
ーゼ、エステラーゼまたはアルコールアセチルトランス
フエラーゼを生産する能力を有するものであれば特に制
約はなく、例えば、プロピオニバクテリウム属（Propio
nibacterium）、アセトバクター属（Acetobacter）、ラ
クトバチルス属（Lactobacillus）、シュードモナス属
（Pseudomonas）、バチルス属（Bacillus）等の細菌
類；イサチェンキア属（Issatchenkia）、ハンゼヌラ属
（Hansenula）、カンジダ属（Candida）、サッカロマイ
セス属（Saccharomyces）、クルイベロマイセス属（Klu
yberomyces）、ピシア属(Pichia)等の酵母類；リゾープ
ス属（Rhizopus）、アスペルギルス属（Aspergillu
s）、ペニシリウム属（Penicillium）等糸状菌類が挙げ
られ、さらに具体的には、例えば、プロピオニバクテリ
ウム・シャーマニィ（P．shemanii）、アセトバクター
・アセティ（A．aceti）、ラクトバチルス・ブレビス
（L．brevis）、シュードモナス・フルオレッセンス
（P．fluorescens）、ハンゼヌラ・サチュールナス
（H．saturnus）、ハンゼヌラ・アノマラ（H．anomal
a）、カンジダ・ユーティリス（C．utilis）、イサチエ
ンキア・テリコア（I．terricola）、バチルス・サブチ
リス・サブスピーシス・ニガー（B．subtili subsp．ni
ger）、サッカロマイセス・セレビシエ（S．cerevisia
e）、ピシア・ヒーディ(P.heedii)、 ピシア・クエルキ
ューム(P. quercuum)、リゾープス・デレマー（R．dele
mar）、アスペルギルス・テレウス（A．terreus）、ペ
ニシリウム・ノタウム（P．notaum）等が挙げられる。
特に、立体選択性に優れるリパーゼやエステラーゼを生
産し得る微生物、例えば、シュードモナス属、カンジダ
属、アスペルギルス属等の微生物を使用した場合には、
反応溶媒中のアルコール類または有機酸類の種類によっ
ては、微生物的エステル化反応が立体選択的に進行する
ため、光学分割法としても活用することができる。The microorganism species that can be used in the present invention have the ability to produce water-soluble organic acids, alcohols or acetyl-CoA by fermentation of saccharides (organic acid fermentation ability, alcohol fermentation ability or acetyl-CoA fermentation ability). Is not particularly limited as long as it has the ability to produce lipase, esterase or alcohol acetyltransferase. For example, Propionobacterium (Propiobacterium)
nibacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Pseudomonas, Bacillus, and the like; bacteria of the genera Issatchenkia, Hansenula, and Candida. , Saccharomyces, Kluyveromyces (Klu
yeasts such as Yberomyces and Pichia; Rhizopus and Aspergillus
s) and Penicillium spp., and more specifically, for example, propionibacterium shamanii (P. shemanii), Acetobacter aceti (A. aceti), Lactobacillus brevis ( L. brevis), P. fluorescens, H. saturnus, H. anomala
a), C. utilis, C. utilis, I. terricola, B. subtili subsp. niger (B. subtili subsp. ni)
ger), Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisia)
e), P. heedii, P. quercuum, R. delemar (R. dele)
mar), Aspergillus terreus (A. terreus), penicillium notaum (P. notaum) and the like.
In particular, when a microorganism capable of producing a lipase or an esterase having excellent stereoselectivity, for example, a microorganism of the genus Pseudomonas, Candida, or Aspergillus is used,
Depending on the type of alcohols or organic acids in the reaction solvent, the microbial esterification reaction proceeds stereoselectively, and thus can also be used as an optical resolution method.
【００２９】これら微生物の前述した親水性固定化担体
への付着は、例えば、親水性固定化担体に、前述した糖
類を必須成分とする栄養源を含む水性媒体（培地）を含
浸保持させ、それに所期の微生物を植菌し、その微生物
の至適条件下で０〜５日間程度培養することにより行な
うことができる。The adhesion of these microorganisms to the above-mentioned hydrophilic immobilization carrier is carried out, for example, by impregnating and holding the hydrophilic immobilization carrier with the above-mentioned aqueous medium (medium) containing a nutrient containing saccharides as an essential component. It can be carried out by inoculating a desired microorganism and culturing it under the optimum conditions of the microorganism for about 0 to 5 days.
【００３０】このようにして微生物を付着させた親水性
固定化担体に、必要により栄養源を含む水性媒体を補充
し、該微生物の性質に応じて水難溶性アルコール類また
は有機酸類を溶解した疎水性有機溶媒を加えて、エステ
ルが十分に蓄積するまで培養を続ける。その際の培養温
度は使用する微生物に好ましい温度、例えば約２０〜約
４０℃間の至適温度とすることができる。An aqueous medium containing a nutrient is replenished to the hydrophilic immobilized carrier to which the microorganisms have been attached as described above, and if necessary, depending on the properties of the microorganisms, a hydrophobic solvent in which poorly water-soluble alcohols or organic acids are dissolved. Add the organic solvent and continue the culture until the ester has accumulated sufficiently. The culture temperature at that time can be a temperature preferable for the microorganism used, for example, an optimum temperature between about 20 to about 40 ° C.
【００３１】反応溶媒中に高濃度で蓄積したエステル類
の回収は、一般的な分離精製法に従い、例えば、蒸留に
よる反応溶媒の留去による濃縮を経る工程やシリカゲル
やアルミナ等の吸着剤に生成エステル類を吸着分離する
方法等により行なうことができる。The ester accumulated at a high concentration in the reaction solvent is recovered according to a general separation and purification method, for example, a step of concentration by distilling off the reaction solvent by distillation, or formation of an adsorbent such as silica gel or alumina. It can be carried out by a method of adsorbing and separating esters.
【００３２】[0032]
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに具体的に
説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるもので
はない。EXAMPLES The present invention will be described in more detail with reference to the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
【００３３】実施例１ 直径２１ｃｍのガラス製シャーレに、ペプトン５ｇ、酵
母エキス３ｇ、麦芽エキス３ｇ、硫酸マグネシウム１
ｇ、グルコース４０ｇ、寒天２０ｇおよび蒸留水１ lit
er よりなる寒天平板培地（ｐＨ６．０）を２００ｍｌ
分注し、これにハンゼヌラ・サチュールナス（H．satur
nus）ＩＦＯ ０８０９の１日培養液２ｍｌをコンラー
ジ棒を用いて植菌した。１夜静置培養の後、２％シトロ
ネロール／デカン溶液７０ｍｌを重層して５日間発酵−
変換試験を行った。デカン層のガスクロマトグラフィー
による分析の結果、デカン層中への酢酸シトロネリルの
蓄積が反応開始後１日目より確認され、５日目にはその
蓄積濃度は１８ｇ／ｌに達した。 Example 1 Peptone 5 g, yeast extract 3 g, malt extract 3 g, magnesium sulfate 1
g, glucose 40 g, agar 20 g and distilled water 1 lit
agar plate medium (pH 6.0) consisting of 200 ml
Dispense and add Hansenula Saturnas (H. satur
nus) 2 ml of a daily culture of IFO 0809 was inoculated using a contra rod. After overnight culturing, 70 ml of a 2% citronellol / decane solution is overlaid and fermented for 5 days.
A conversion test was performed. As a result of gas chromatography analysis of the decane layer, accumulation of citronellyl acetate in the decane layer was confirmed from the first day after the start of the reaction, and the accumulated concentration reached 18 g / l on the fifth day.
【００３４】実施例２ １０％ポリビニルアルコールのゲル（ＥＮＴＶ−５０
０，関西ペイント製）で被覆したろ過板（６×１３ｃ
ｍ）の内部空子ｂを実施例１と同様の組成の液体培地で
置換し、これにピシア・ヒーディ(Pichia heedii)ＩＦ
Ｏ １００１９の１日培養液を上記板状担体１３枚に植
菌して１日培養後、内容量３ liter のステンレスタン
クにステンレス製フレームを用いて縦配列にて充填し
た。 Example 2 Gel of 10% polyvinyl alcohol (ENTV-50)
0, Kansai Paint) coated filter plate (6 × 13c)
m) was replaced with a liquid medium having the same composition as in Example 1, and this was replaced with Pichia heedii IF
A 100-day culture solution of O10019 was inoculated on the 13 plate-shaped carriers described above and cultured for 1 day, and then filled in a 3-liter stainless steel tank in a vertical arrangement using a stainless steel frame.
【００３５】これに３％ゲラニオール／ウンデカン溶液
１ liter を分注し、反応器底部に設置したマグネット
の撹拌下で５日間反応させた。ウンデカン層のガスクロ
マトグラフィーによる分析の結果、ウンデカン層中への
酢酸ゲラニルの著量蓄積が反応開始後１日目より確認さ
れ、５日目にはその蓄積濃度は２６ｇ／ｌに達した。 実施例３ 直径２１ｃｍのガラス製シャーレに実施例１と同様の組
成の寒天平板培地を分注した。これにイサチェンキア・
テリコラ（Issatchnkia terricola）ＩＦＯ０９３３の
１日培養液２ｍｌをコンラージ棒を用いて植菌した。１
夜静置培養の後、２％デカン酸／デカン溶液７０ｍｌを
重層して５日間発酵−変換試験を行った。デカン層のガ
スクロマトグラフィーによる分析の結果、デカン層中へ
のデカン酸エチルの蓄積が反応開始後１日目より確認さ
れ、５日目にはその蓄積濃度は９ｇ／ｌに達した。A 3% geraniol / undecane solution
Dispense 1 liter and place the magnet at the bottom of the reactor
The reaction was carried out for 5 days under stirring. Undecane gas chromatography
As a result of analysis by
Significant accumulation of geranyl acetate was confirmed on day 1 after the start of the reaction.
On the fifth day, its accumulated concentration reached 26 g / l. Example 3 The same set as in Example 1 on a glass petri dish with a diameter of 21 cm
The adult agar plate medium was dispensed. This is Isachenkia
Tericola (Issatchnkia terricola) of IFO0933
2 ml of the culture solution per day was inoculated with a large rod. 1
After standing still culture at night, 70 ml of a 2% decanoic acid / decane solution was added.
The fermentation-conversion test was performed for 5 days by overlaying. Deccan layer moth
Into the decane layer as a result of chromatographic analysis
Ethyl decanoate accumulation was confirmed from day 1 after the start of the reaction.
On the fifth day, its accumulated concentration reached 9 g / l.
【００３６】実施例４ 直径２１ｃｍのガラス製シャーレに実施例１と同様の組
成の寒天平板培地を分注した。これにバチルス・サブチ
リス・サブスピーシス・ニガー（Bacillus subtilis su
bsp．niger）ＩＦＯ ３１０８の１日培養液２ｍｌをコ
ンラージ棒を用いて植菌した。１夜静置培養の後、１％
メントール・デカン溶液７０ｍｌを重層して５日間発酵
−変換試験を行った。デカン層のガスクロマトグラフィ
ーによる分析の結果、デカン層中へのデカン酸エチルの
蓄積が反応開始１日目から確認され、５日目にはその蓄
積濃度は６ｇ／ｌに達した。 Example 4 An agar plate medium having the same composition as in Example 1 was dispensed into a glass petri dish having a diameter of 21 cm. This is followed by Bacillus subtilis sugar (Bacillus subtilis sugar).
bsp. niger) 2 ml of a daily culture of IFO 3108 was inoculated using a contra rod. After overnight culture, 1%
A 70-ml menthol-decane solution was overlaid and a fermentation-conversion test was performed for 5 days. As a result of gas chromatography analysis of the decane layer, accumulation of ethyl decanoate in the decane layer was confirmed from the first day of the reaction, and the accumulated concentration reached 6 g / l on the fifth day.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｐ 7/62 Ｃ１２Ｒ 1:125） ──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. 7 Identification symbol FI C12R 1:84) (C12P 7/62 C12R 1: 645) (C12P 7/62 C12R 1: 125)
Claims (6)
コール発酵能またはアセチルコエンザイムＡ発酵能を有
し且つリパーゼ、エステラーゼまたはアルコールアセチ
ルトランスフエラーゼを生産する能力を有する微生物を
付着させ、該微生物の栄養源であり且つ発酵原料である
糖類を含む水性媒体の存在下に、水に不溶性もしくは難
溶性のアルコールまたは有機酸を含有する疎水性有機溶
媒を該担体上の該微生物と接触させて接触界面で該微生
物を増殖させ、該増殖微生物の作用によって、該発酵原
料から水溶性有機酸、アルコールまたはアセチルコエン
ザイムＡを発酵生産させながら、該発酵生産物と上記疎
水性有機溶媒中の水に不溶性もしくは難溶性のアルコー
ルまたは有機酸との間で微生物的エステル化反応を行わ
せることを特徴とする発酵と微生物変換との融合方法。A microorganism having an organic acid fermentation ability, an alcohol fermentation ability or an acetylcoenzyme A fermentation ability and capable of producing lipase, esterase or alcohol acetyltransferase is attached to the hydrophilic immobilized carrier. A hydrophobic organic solvent containing an alcohol or organic acid insoluble or hardly soluble in water is brought into contact with the microorganism on the carrier in the presence of an aqueous medium containing saccharides that are a nutrient source of the microorganism and a fermentation raw material. The microorganism is grown at the contact interface, and the fermentation product and water in the hydrophobic organic solvent are added to the fermentation product while fermentatively producing a water-soluble organic acid, alcohol or acetyl coenzyme A from the fermentation raw material by the action of the microorganism. Microbial esterification reaction with insoluble or hardly soluble alcohols or organic acids Of fermentation and microbial conversion.
（Hansenula saturnus）、ピシア・ヒーディ(Pichia he
edii)、イサチエンキア・テリコア（Issatchenkia terr
icola）及びバチルス・サブチリス・サブスピーシス・
ニガー（Bacillus subtilis subsp．niger）から選ばれ
る請求項１記載の融合方法。2. The microorganism is Hansenula saturnus, Pichia hedi (Pichia hedi).
edii), Issatchenkia terr
icola) and Bacillus subtilis subsp.
The fusion method according to claim 1, which is selected from niger (Bacillus subtilis subsp. Niger).
プン及びショ糖から選ばれる請求項１記載の融合方法。3. The fusion method according to claim 1, wherein the saccharide used as a fermentation raw material is selected from glucose, starch, and sucrose.
流動パラフィン、イソパラフィン、ノルマルアルキルベ
ンゼン、イソアルキルベンゼン脂環式炭化水素、及び脂
肪族エーテル類から選ばれる請求項１記載の融合方法。4. The method according to claim 1, wherein the hydrophobic organic solvent is normal paraffin,
The fusion method according to claim 1, wherein the fusion method is selected from liquid paraffin, isoparaffin, normal alkylbenzene, isoalkylbenzene alicyclic hydrocarbon, and aliphatic ethers.
が中鎖もしくは長鎖アルカノール類、テルペンアルコー
ル類及び芳香族アルコール類から選ばれる請求項１記載
の融合方法。5. The fusion method according to claim 1, wherein the alcohol insoluble or hardly soluble in water is selected from medium-chain or long-chain alkanols, terpene alcohols, and aromatic alcohols.
ルカン酸類、芳香族酸類及びテルペン酸類から選ばれる
請求項１記載の融合方法。6. The fusion method according to claim 1, wherein the organic acid insoluble or hardly soluble in water is selected from alkanoic acids, aromatic acids and terpene acids.
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
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1996
- 1996-07-05 JP JP8194109A patent/JP3038151B2/en not_active Expired - Fee Related
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