JP3024766B2 - トリプトファン生産能を有する乳酸桿菌 - Google Patents
トリプトファン生産能を有する乳酸桿菌Info
- Publication number
- JP3024766B2 JP3024766B2 JP21598889A JP21598889A JP3024766B2 JP 3024766 B2 JP3024766 B2 JP 3024766B2 JP 21598889 A JP21598889 A JP 21598889A JP 21598889 A JP21598889 A JP 21598889A JP 3024766 B2 JP3024766 B2 JP 3024766B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- dna
- lactobacillus
- plasmid
- minutes
- derived
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、ラクトバチルス・カゼイ（Lactobacillus
casel;以下、「乳酸桿菌」とも呼ぶ）におけるトリプト
ファン生合成に関与する遺伝子、乳酸桿菌に外来遺伝子
を導入する際に使用されるシャトルベクター及び、かか
るシャトルベクター系を用いてトリプトファン合成系遺
伝子を導入することにより形質転換された乳酸桿菌株に
関する。
casel;以下、「乳酸桿菌」とも呼ぶ）におけるトリプト
ファン生合成に関与する遺伝子、乳酸桿菌に外来遺伝子
を導入する際に使用されるシャトルベクター及び、かか
るシャトルベクター系を用いてトリプトファン合成系遺
伝子を導入することにより形質転換された乳酸桿菌株に
関する。
更に詳しくは、乳酸桿菌由来のトリプトファン合成系
遺伝子を含有するDNA、ストレプトコッカス・フィーカ
リス（Streptococcus faecalis）DS5株由来のプラスミ
ドpAMβ１の一部が欠落したプラスミドpAMβ１−１、ま
たはpAMα１の少なくとも一部と大腸菌由来のプラスミ
ドとを結合して構成される、シャトルベクター、該シャ
トルベクターに、さらに、トリプトファン合成系遺伝子
を含有するDNAを結合したプラスミド、そして、かかる
プラスミドを用いて導入されたトリプトファン合成系遺
伝子を保有することによりトリプトファン生産能を獲得
した乳酸桿菌株に関する。
遺伝子を含有するDNA、ストレプトコッカス・フィーカ
リス（Streptococcus faecalis）DS5株由来のプラスミ
ドpAMβ１の一部が欠落したプラスミドpAMβ１−１、ま
たはpAMα１の少なくとも一部と大腸菌由来のプラスミ
ドとを結合して構成される、シャトルベクター、該シャ
トルベクターに、さらに、トリプトファン合成系遺伝子
を含有するDNAを結合したプラスミド、そして、かかる
プラスミドを用いて導入されたトリプトファン合成系遺
伝子を保有することによりトリプトファン生産能を獲得
した乳酸桿菌株に関する。
［従来の技術及び発明が解決しようとする問題点］ 乳酸桿菌はヨーグルト、乳酸菌飲料、チーズなどの乳
製品製造、飼料の製造、醗酵法による乳酸の製造などの
産業分野において広く用いられている重要な菌であり、
この菌を所望の性質を発現するように人為的に改変して
育種することができれば産業上のメリットも極めて大と
なり、従ってこの育種の手段としての遺伝子工学的手法
はかかる観点からしても非常に重要な手段となるはずで
ある。
製品製造、飼料の製造、醗酵法による乳酸の製造などの
産業分野において広く用いられている重要な菌であり、
この菌を所望の性質を発現するように人為的に改変して
育種することができれば産業上のメリットも極めて大と
なり、従ってこの育種の手段としての遺伝子工学的手法
はかかる観点からしても非常に重要な手段となるはずで
ある。
また、トリプトファンは動物の必須アミノ酸のひとつ
であり、その工業的生産方法に関しては多くの研究がな
されている。そこでラクトバチルス属細菌によりトリプ
トファンの生産が可能となれば産業上の利益は極めて大
きく、また、このトリプトファン生産能を有する生菌
を、乳製品として、或いは菌製剤として動物や人が飲用
することにより生体内でトリプトファンを生産させるこ
とができれば体外からのトリプトファンの補給が不必要
であるばかりでなく、腸内で産生する有害物質であるイ
ンドールを有用なトリプトファンに変換可能となり、家
畜や人の健康の上でも、その利益は大きいと考えられ
る。
であり、その工業的生産方法に関しては多くの研究がな
されている。そこでラクトバチルス属細菌によりトリプ
トファンの生産が可能となれば産業上の利益は極めて大
きく、また、このトリプトファン生産能を有する生菌
を、乳製品として、或いは菌製剤として動物や人が飲用
することにより生体内でトリプトファンを生産させるこ
とができれば体外からのトリプトファンの補給が不必要
であるばかりでなく、腸内で産生する有害物質であるイ
ンドールを有用なトリプトファンに変換可能となり、家
畜や人の健康の上でも、その利益は大きいと考えられ
る。
従って、かかる有用な形質を付与した乳酸桿菌の開発
が望まれていた。一方、これまでに、乳酸桿菌に外来遺
伝子を導入する安定な方法が確立されていなかったため
に、この乳酸即金を遺伝子工学的手法を用いて、人為的
に改変することを目的とする技術的な種々の試みには、
殆んど見るべき成果はなかった。しかるに、最近になっ
て本発明者らは、乳酸桿菌に安定に外来DNAを導入する
方法を開発した（特願昭62−294199号及びFumio Imamot
o（Kyoto Pharmaceutical University）eta1.,Techno J
apan,vol.22,No.3,pp,8−18参照。）。この方法を用い
ることにより、外来DNAを乳酸桿菌に導入することが可
能となったことから、その際使用されるベクターに関し
て、有用なベクターの開発、殊に遺伝子工学的手法を用
いて、新たに有用な形質の付与された乳酸桿菌を作成す
るための良好なベクターの開発が求められるようになっ
た。
が望まれていた。一方、これまでに、乳酸桿菌に外来遺
伝子を導入する安定な方法が確立されていなかったため
に、この乳酸即金を遺伝子工学的手法を用いて、人為的
に改変することを目的とする技術的な種々の試みには、
殆んど見るべき成果はなかった。しかるに、最近になっ
て本発明者らは、乳酸桿菌に安定に外来DNAを導入する
方法を開発した（特願昭62−294199号及びFumio Imamot
o（Kyoto Pharmaceutical University）eta1.,Techno J
apan,vol.22,No.3,pp,8−18参照。）。この方法を用い
ることにより、外来DNAを乳酸桿菌に導入することが可
能となったことから、その際使用されるベクターに関し
て、有用なベクターの開発、殊に遺伝子工学的手法を用
いて、新たに有用な形質の付与された乳酸桿菌を作成す
るための良好なベクターの開発が求められるようになっ
た。
［問題点を解決するための手段］ かかる現状に鑑みて本発明者らは、乳酸桿菌にトリプ
トファン合成系遺伝子を導入して、トリプトファン生産
能を付与した菌株を得るべく、また、その際使用するシ
ャトルベクターに関して良好で有用なものを得るべく研
究を重ねた。
トファン合成系遺伝子を導入して、トリプトファン生産
能を付与した菌株を得るべく、また、その際使用するシ
ャトルベクターに関して良好で有用なものを得るべく研
究を重ねた。
本発明者らは、ラクトバチルス・カゼイRNL7株の染色
体DNAより、トリプトファン生合成に関与する遺伝子の
存在するDNA断片を得、その塩基配列を明らかにするこ
とに成功した。そして、このようなトリプトファン合成
系遺伝子及び他の有用な遺伝子を乳酸桿菌に導入する際
に、必要とされる良好なシャトルベクター構築し、次い
で、これらのシャトルベクターにトリプトファン合成系
遺伝子を結合し、最近、本発明者らが開発した上記の遺
伝子導入法を用いて、トリプトファン合成系遺伝子をト
リプトファン要求性のラクトバチルス・カゼイに導入
し、トリプトファン生産能を有する菌株を作成すること
に成功し、本発明を完成させた。
体DNAより、トリプトファン生合成に関与する遺伝子の
存在するDNA断片を得、その塩基配列を明らかにするこ
とに成功した。そして、このようなトリプトファン合成
系遺伝子及び他の有用な遺伝子を乳酸桿菌に導入する際
に、必要とされる良好なシャトルベクター構築し、次い
で、これらのシャトルベクターにトリプトファン合成系
遺伝子を結合し、最近、本発明者らが開発した上記の遺
伝子導入法を用いて、トリプトファン合成系遺伝子をト
リプトファン要求性のラクトバチルス・カゼイに導入
し、トリプトファン生産能を有する菌株を作成すること
に成功し、本発明を完成させた。
本発明のシャトルベクターとしては、ストレプトコッ
カス・フィーカリス（Streptococcus faecalis）DS5株
由来のプラスミドpAMβ１及びその一部が欠落したpAMβ
１−１と大腸菌由来のプラスミドベクターを、例えばpB
R322やpUC19などとを結合させて得られるプラスミドで
あるpBLβ15,PBLβ21,pBLβ22,PBLβ23,pBLβ24,PBLβ2
5などが挙げられる。またストレプトコッカス・フィー
カリスDS5株由来のプラスミドpAMα１と大腸菌由来のプ
ラスミドベクター、例えばpACYC177とを結合させて得ら
れるプラスミドであるpHY300PLK（特開昭60−248184を
参照。）なども挙げられる。
カス・フィーカリス（Streptococcus faecalis）DS5株
由来のプラスミドpAMβ１及びその一部が欠落したpAMβ
１−１と大腸菌由来のプラスミドベクターを、例えばpB
R322やpUC19などとを結合させて得られるプラスミドで
あるpBLβ15,PBLβ21,pBLβ22,PBLβ23,pBLβ24,PBLβ2
5などが挙げられる。またストレプトコッカス・フィー
カリスDS5株由来のプラスミドpAMα１と大腸菌由来のプ
ラスミドベクター、例えばpACYC177とを結合させて得ら
れるプラスミドであるpHY300PLK（特開昭60−248184を
参照。）なども挙げられる。
本発明の乳酸桿菌由来のトリプトファン合成系遺伝子
の存在するDNA断片は、乳酸桿菌を培養し、得られた菌
体からDNAを取り出し、このDNAを制限酵素のHind IIIで
切断し、この切断されたDNAとHind IIIで切断された大
腸菌由来のプラスミドベクターpBR322とを適当なリガー
ゼを用いてライゲーションし、このようにして得られた
プラスミドを適当な手段、例えばCaCl2溶液中に懸濁さ
せた大腸菌のtrp遺伝子変異体株、例えばE.coli mH3trp
C9830株と接触させ、このようにして大腸菌の形質転換
体を得、そしてこの大腸菌の形質転換体のアンピシリン
耐性及びトリプトファン生産能を指標として選択的に所
要の形質転換体のみを取り出し、これを更に培養し、培
養した菌体からプラスミドを取り出して得ることができ
る。
の存在するDNA断片は、乳酸桿菌を培養し、得られた菌
体からDNAを取り出し、このDNAを制限酵素のHind IIIで
切断し、この切断されたDNAとHind IIIで切断された大
腸菌由来のプラスミドベクターpBR322とを適当なリガー
ゼを用いてライゲーションし、このようにして得られた
プラスミドを適当な手段、例えばCaCl2溶液中に懸濁さ
せた大腸菌のtrp遺伝子変異体株、例えばE.coli mH3trp
C9830株と接触させ、このようにして大腸菌の形質転換
体を得、そしてこの大腸菌の形質転換体のアンピシリン
耐性及びトリプトファン生産能を指標として選択的に所
要の形質転換体のみを取り出し、これを更に培養し、培
養した菌体からプラスミドを取り出して得ることができ
る。
本発明のシャトルベクターは、ストレプトコッカス・
フィーカリスDS5株由来のプラスミドpAMβ１−１と、大
腸菌由来のプラスミドベクター例えばpBR322やpUC19な
どとを、またはストレプトコッカス・フィーカリスDS5
株由来のプラスミドpAMα１と、大腸菌由来のプラスミ
ドベクター例えばpACYC177とをライゲーションし、この
ようにして得られたプラスミドを適当な手段で大腸菌に
導入し、このようにして得られた大腸菌の形質転換体を
得、これを更に培養し、培養した菌体からプラスミドを
取り出して得ることができる。
フィーカリスDS5株由来のプラスミドpAMβ１−１と、大
腸菌由来のプラスミドベクター例えばpBR322やpUC19な
どとを、またはストレプトコッカス・フィーカリスDS5
株由来のプラスミドpAMα１と、大腸菌由来のプラスミ
ドベクター例えばpACYC177とをライゲーションし、この
ようにして得られたプラスミドを適当な手段で大腸菌に
導入し、このようにして得られた大腸菌の形質転換体を
得、これを更に培養し、培養した菌体からプラスミドを
取り出して得ることができる。
また本発明のトリプトファン合成系遺伝子を有する形
質転換された乳酸桿菌は、上記したトリプトファン合成
遺伝子を含むDNA断片を上記したシャトルベクターに適
当なリガーゼを用いて結合させ、得られたトリプトファ
ン合成遺伝子を含むプラスミドを、例えば特願昭62−29
4199号に記載の方法、すなわちエレクトロポレーション
によって乳酸桿菌中に導入することによって得られる。
質転換された乳酸桿菌は、上記したトリプトファン合成
遺伝子を含むDNA断片を上記したシャトルベクターに適
当なリガーゼを用いて結合させ、得られたトリプトファ
ン合成遺伝子を含むプラスミドを、例えば特願昭62−29
4199号に記載の方法、すなわちエレクトロポレーション
によって乳酸桿菌中に導入することによって得られる。
すなわち、乳酸桿菌を緩衝液に懸濁させ、これに上記
のプラスミドを添加混合し、この懸濁液にパルス電流を
通電することによって乳酸桿菌中に上記のプラスミドを
導入するのである。
のプラスミドを添加混合し、この懸濁液にパルス電流を
通電することによって乳酸桿菌中に上記のプラスミドを
導入するのである。
このようにエレクトロポレーションに付した乳酸桿菌
を次いで公知の選別過程に付して、得られた形質転換体
を選別する。形質転換体は、例えば各種の抗生物質に対
する耐性などにより選別される。
を次いで公知の選別過程に付して、得られた形質転換体
を選別する。形質転換体は、例えば各種の抗生物質に対
する耐性などにより選別される。
次に実施例によってこの発明を更に具体的に説明する
ことにする。なお、これらの実施例は本発明を説明する
ためのものとして開示するものであって、この記載によ
って本発明が限定されるものではない。
ことにする。なお、これらの実施例は本発明を説明する
ためのものとして開示するものであって、この記載によ
って本発明が限定されるものではない。
実施例 １ ラクトバチルス・カゼイのトリプトファン合成系遺伝子
のクローニング （１） ラクトバチルス・カゼイのDNAの抽出及び精製 次の培地組成： トマトジュース抽出物＊ 400ml グルコース 20g 溶性デンプン 0.5g 酵母エキス（イーストエキストラクト）（Difco） 6g ポリペプトン（大五栄養） 15g グルタミン酸ナトリウム 2g Tween80 1g CH3COONa・3H2O 10g KH2PO4 4g NaCl 5g DL−スレオニン 2g 蒸留水 600ml ＊トマトジュース抽出物は、市販トマトジュース〔デル
モンテ（Del Monte）社製〕に等量の蒸留水を加え、約6
0℃で１時間加熱し、更に100℃で５分間加熱した後、冷
却して、水不溶物を別して調整した。
のクローニング （１） ラクトバチルス・カゼイのDNAの抽出及び精製 次の培地組成： トマトジュース抽出物＊ 400ml グルコース 20g 溶性デンプン 0.5g 酵母エキス（イーストエキストラクト）（Difco） 6g ポリペプトン（大五栄養） 15g グルタミン酸ナトリウム 2g Tween80 1g CH3COONa・3H2O 10g KH2PO4 4g NaCl 5g DL−スレオニン 2g 蒸留水 600ml ＊トマトジュース抽出物は、市販トマトジュース〔デル
モンテ（Del Monte）社製〕に等量の蒸留水を加え、約6
0℃で１時間加熱し、更に100℃で５分間加熱した後、冷
却して、水不溶物を別して調整した。
より成る培地をNaOHでpH6.8に調整した後オートクレー
ブを用いて、120℃で15分間滅菌処理した。
ブを用いて、120℃で15分間滅菌処理した。
この培地は使用時にアスコルビン酸ナトリウム3.4gと
Ｌ−システイン200mgを蒸留水に溶かして10mlとし、無
菌過した溶液10mlを加えた。
Ｌ−システイン200mgを蒸留水に溶かして10mlとし、無
菌過した溶液10mlを加えた。
得られた培地500mlに別にこの培地中37℃で終夜静置
培養したラクトバチルス・カゼイRNL7株の培養液5mlを
接種し、37℃で静置培養した。A600＝0.3となった時点
で菌体を遠心分離により捕集した。菌体を1mM EDTAを
含む10mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0以下TEと略称）で２
回洗浄し、次いで25％（w/v）蔗糖を含むTE3mlに懸濁し
た。これにリゾチーム溶液（20mg/ml−0.25M Tris−C
l,pH8.0）0.2mlを加え、37℃で60分間保温した。これに
120mM EDTAを含む100mM Tris−HCl緩衝液（pH9.0）3m
l,10％ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）1.5ml及びProtei
nase K（4mg/ml−蒸留水）0.2mlを加え更に37℃で60分
間保温した後100mM Tris−HCl（pH9.0）を4ml加えた。
この溶液にTE飽和フェノールを加えてゆるく振盪した。
混液を遠心分離して上清画分を分取した。これに100mM
Tris−HCl（pH9.0）を4ml加え、TEに対し透析した。
透析後RNaseAを10μg/mlとなるよう加え37℃で30分保温
し、次いでProteinase Kを50μg/mlとなるよう加えて更
に37℃で30分間保温した。この溶液にSDSを0.5％となる
量で加えてTE飽和フェノール−クロロホルム−イソアミ
ルアルコール25:24:1混液で３回洗浄した。更にクロロ
ホルム−イソアミルアルコール24:1混液で１回洗浄した
後セシウムクロライド−エチジウムブロマイド濃度勾配
超遠心分離をおこない、精製DNAを得た。
培養したラクトバチルス・カゼイRNL7株の培養液5mlを
接種し、37℃で静置培養した。A600＝0.3となった時点
で菌体を遠心分離により捕集した。菌体を1mM EDTAを
含む10mM Tris−HCl緩衝液（pH8.0以下TEと略称）で２
回洗浄し、次いで25％（w/v）蔗糖を含むTE3mlに懸濁し
た。これにリゾチーム溶液（20mg/ml−0.25M Tris−C
l,pH8.0）0.2mlを加え、37℃で60分間保温した。これに
120mM EDTAを含む100mM Tris−HCl緩衝液（pH9.0）3m
l,10％ラウリル硫酸ナトリウム（SDS）1.5ml及びProtei
nase K（4mg/ml−蒸留水）0.2mlを加え更に37℃で60分
間保温した後100mM Tris−HCl（pH9.0）を4ml加えた。
この溶液にTE飽和フェノールを加えてゆるく振盪した。
混液を遠心分離して上清画分を分取した。これに100mM
Tris−HCl（pH9.0）を4ml加え、TEに対し透析した。
透析後RNaseAを10μg/mlとなるよう加え37℃で30分保温
し、次いでProteinase Kを50μg/mlとなるよう加えて更
に37℃で30分間保温した。この溶液にSDSを0.5％となる
量で加えてTE飽和フェノール−クロロホルム−イソアミ
ルアルコール25:24:1混液で３回洗浄した。更にクロロ
ホルム−イソアミルアルコール24:1混液で１回洗浄した
後セシウムクロライド−エチジウムブロマイド濃度勾配
超遠心分離をおこない、精製DNAを得た。
（２） ライゲーション （１）で得られたDNA1μｇを50mM NaCl,10mM Tris
−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノール
を含む溶液20μに溶解し、Hind III1μを加え37℃
で２時間インキュベートした。0.5M EDTA1μｇを加え
た後TE飽和フェノール−クロロホルム−イソアミルアル
コール25:24:1混液で３回洗浄し、次いでクロロホルム
−イソアミルアルコール24:1で１回洗浄した。得られた
DNAを含む溶液に1/10倍量の3M CH3COONa水溶液及び2.2
倍量のエタノールを加え、−80℃で10分間静置した後15
000rpmで５分間遠心分離して、DNAの沈澱を得た。このD
NA沈澱を70％エタノールで洗浄し、真空下で乾燥した後
滅菌蒸留水に溶解した。
−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノール
を含む溶液20μに溶解し、Hind III1μを加え37℃
で２時間インキュベートした。0.5M EDTA1μｇを加え
た後TE飽和フェノール−クロロホルム−イソアミルアル
コール25:24:1混液で３回洗浄し、次いでクロロホルム
−イソアミルアルコール24:1で１回洗浄した。得られた
DNAを含む溶液に1/10倍量の3M CH3COONa水溶液及び2.2
倍量のエタノールを加え、−80℃で10分間静置した後15
000rpmで５分間遠心分離して、DNAの沈澱を得た。このD
NA沈澱を70％エタノールで洗浄し、真空下で乾燥した後
滅菌蒸留水に溶解した。
pBR322 １μｇを50mM NaCl,10mM Tris−HCl（pH7.
5）,10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノールを含む溶液2
0μ中で、Hind III1μを加え37℃で２時間インキュ
ベートした。0.5M EDTA1μｇを加えた後、TE飽和和フ
ェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール25:24:
1混液で３回洗浄し、次いでクロロホルム−イソアミル
アルコール24:1で１回洗浄した。得られたDNAを含む溶
液に1/10倍量の3M CH3COONa水溶液及び2.2倍量のエタ
ノールを加え、−80℃で10分静置した後15,000rpmで５
分間遠心分離してDNAの沈澱を得た。DNA沈澱を70％エタ
ノールで洗浄し、真空下で乾燥した後、滅菌蒸留水25μ
に溶解した。これにTE25μ,1M Tris−HCl（pH8.
8）２μを加え更にE.coli alkaline phosphataseを加
えて65℃,30分間インキュベートした。TE飽和フェノー
ル−クロロホルム−イソアミルアルコール25:24:1混液
で３回洗浄し、更に、クロロホルム−イソアミルアルコ
ール24:1で１回洗浄した。得られた水層に1/10倍量の3M
CH3COONa及び2.2倍量のエタノールを加え−80℃で10分
間静置してDNAを不溶化させ、15000rpmで５分間遠心分
離してDNAの沈澱を得た。この沈澱を70％エタノールで
洗い、真空下乾燥した後滅菌蒸留水に溶解した。
5）,10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノールを含む溶液2
0μ中で、Hind III1μを加え37℃で２時間インキュ
ベートした。0.5M EDTA1μｇを加えた後、TE飽和和フ
ェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール25:24:
1混液で３回洗浄し、次いでクロロホルム−イソアミル
アルコール24:1で１回洗浄した。得られたDNAを含む溶
液に1/10倍量の3M CH3COONa水溶液及び2.2倍量のエタ
ノールを加え、−80℃で10分静置した後15,000rpmで５
分間遠心分離してDNAの沈澱を得た。DNA沈澱を70％エタ
ノールで洗浄し、真空下で乾燥した後、滅菌蒸留水25μ
に溶解した。これにTE25μ,1M Tris−HCl（pH8.
8）２μを加え更にE.coli alkaline phosphataseを加
えて65℃,30分間インキュベートした。TE飽和フェノー
ル−クロロホルム−イソアミルアルコール25:24:1混液
で３回洗浄し、更に、クロロホルム−イソアミルアルコ
ール24:1で１回洗浄した。得られた水層に1/10倍量の3M
CH3COONa及び2.2倍量のエタノールを加え−80℃で10分
間静置してDNAを不溶化させ、15000rpmで５分間遠心分
離してDNAの沈澱を得た。この沈澱を70％エタノールで
洗い、真空下乾燥した後滅菌蒸留水に溶解した。
Hind IIIで切断したラクトバチルス・カゼイのDNA50
〜500ng及びHind IIIで切断したpBR322 50〜500ngを含
む、ライゲーションバッファー（50mM Tris−HCl,pH7.
4,10mM MgCl2,10mM ジチオトレイトール、1mM スペ
ルミジン、2mM ATP,0.1mg/ml牛血清アルブミン）10μ
にT4DNAリガーゼ１μを加え12℃で12〜16時間イン
キュベートした。TE飽和フェノール−クロロホルム−イ
ソアミルアルコール25:24:1で３回洗浄し、次いでクロ
ロホルム−イソアミルアルコール24:1で１回洗浄した後
1/10倍量の3M CH3COONa水溶液及び2.2倍量のエタノー
ルを加えDNAを不溶化し、−80℃で10分間 静置した後15000rpm,5分間遠心分離して、DNAの沈澱を
得た。この沈澱を70％エタノールで洗い、真空下乾燥し
た後滅菌蒸留水10μに溶解した。
〜500ng及びHind IIIで切断したpBR322 50〜500ngを含
む、ライゲーションバッファー（50mM Tris−HCl,pH7.
4,10mM MgCl2,10mM ジチオトレイトール、1mM スペ
ルミジン、2mM ATP,0.1mg/ml牛血清アルブミン）10μ
にT4DNAリガーゼ１μを加え12℃で12〜16時間イン
キュベートした。TE飽和フェノール−クロロホルム−イ
ソアミルアルコール25:24:1で３回洗浄し、次いでクロ
ロホルム−イソアミルアルコール24:1で１回洗浄した後
1/10倍量の3M CH3COONa水溶液及び2.2倍量のエタノー
ルを加えDNAを不溶化し、−80℃で10分間 静置した後15000rpm,5分間遠心分離して、DNAの沈澱を
得た。この沈澱を70％エタノールで洗い、真空下乾燥し
た後滅菌蒸留水10μに溶解した。
（３） 大腸菌の形質転換 E.coli mH3trpC9830株を試験管中のＬ−ブロス（バク
トトリプトン１％，酵母エキス0.5％,NaCl0.5％，グル
コース0.1％より成る）5mlに接種し37℃でA550＝0.3と
なるまで振盪培養した。菌体を４℃,3000rpm,10分間遠
心分離して捕集した。菌体を0.1M MgCl22.5mlに懸濁し
た後４℃,3000rpm,10分間遠心分離して菌体を捕集し
た。菌体を0.1M CaCl2に懸濁し、氷中に20分間静置し
た。再び４℃,3000rpm,10分間遠心分離して菌体を捕集
し、菌体を0.1M CaCl20.5mlに懸濁してコンピテント菌
体を調製した。
トトリプトン１％，酵母エキス0.5％,NaCl0.5％，グル
コース0.1％より成る）5mlに接種し37℃でA550＝0.3と
なるまで振盪培養した。菌体を４℃,3000rpm,10分間遠
心分離して捕集した。菌体を0.1M MgCl22.5mlに懸濁し
た後４℃,3000rpm,10分間遠心分離して菌体を捕集し
た。菌体を0.1M CaCl2に懸濁し、氷中に20分間静置し
た。再び４℃,3000rpm,10分間遠心分離して菌体を捕集
し、菌体を0.1M CaCl20.5mlに懸濁してコンピテント菌
体を調製した。
（２）で得られたDNA10μに100μのコンピテント
菌体を加え０℃で１時間放置した後42℃で10分間保温し
た。これを室温に放置し、液温を室温にもどした後、Ｌ
−ブロス1mlを加え37℃で１時間培養した。次いで、室
温で3000rpm,10分間遠心分離して菌体を捕集した。菌体
を更に２回滅菌食塩水で洗浄した後、生理食塩水1mlに
懸濁した。この菌懸濁液を、25μg/mlアンピシリンを添
加したVogel−Bonner寒天培地（MgSO4・7H2O0.02％，ク
エン酸−水和物0.2％,KH2PO41％,NaNH4HPO4・4H2O0.35
％，グルコース0.5％，カザミノ酸0.2％）の表面に塗布
して、37℃にて一昼夜培養した。この寒天培地上にコロ
ニーを形成した形質転換体につき、保有プラスミドを調
べた。本プラスミドはpTLC100と命名した。
菌体を加え０℃で１時間放置した後42℃で10分間保温し
た。これを室温に放置し、液温を室温にもどした後、Ｌ
−ブロス1mlを加え37℃で１時間培養した。次いで、室
温で3000rpm,10分間遠心分離して菌体を捕集した。菌体
を更に２回滅菌食塩水で洗浄した後、生理食塩水1mlに
懸濁した。この菌懸濁液を、25μg/mlアンピシリンを添
加したVogel−Bonner寒天培地（MgSO4・7H2O0.02％，ク
エン酸−水和物0.2％,KH2PO41％,NaNH4HPO4・4H2O0.35
％，グルコース0.5％，カザミノ酸0.2％）の表面に塗布
して、37℃にて一昼夜培養した。この寒天培地上にコロ
ニーを形成した形質転換体につき、保有プラスミドを調
べた。本プラスミドはpTLC100と命名した。
このプラスミドpTLC100の構築過程は第１図で示され
る。
る。
（４） クローニングされたラクトバチルス・カゼイDN
Aの性質 （ａ） 得られたプラスミドを用いて（３）に示された
のと同一の方法で調製したE.coli W3110のtrp変異株コ
ンピテント菌体の形質転換を（３）に示すのと同一の方
法でおこない、（３）で示したアンピシリン25μg/ml含
有Vogel−Bonner寒天培地上でのコロニーの形質を調べ
た。その結果を下の表に示す。
Aの性質 （ａ） 得られたプラスミドを用いて（３）に示された
のと同一の方法で調製したE.coli W3110のtrp変異株コ
ンピテント菌体の形質転換を（３）に示すのと同一の方
法でおこない、（３）で示したアンピシリン25μg/ml含
有Vogel−Bonner寒天培地上でのコロニーの形質を調べ
た。その結果を下の表に示す。
以上の結果及び（３）の結果より、クローニングされ
たラクトバチルス・カゼイDNAは、E.coliのtrpC,trpF,t
rpB及びtrpAの変異に対し、相補性を示す。
たラクトバチルス・カゼイDNAは、E.coliのtrpC,trpF,t
rpB及びtrpAの変異に対し、相補性を示す。
（ｂ） 次に得られたプラスミドを各種の制限酵素で切
り、電気泳動上の挙動を調べる事により、制限酵素地図
を作成した。
り、電気泳動上の挙動を調べる事により、制限酵素地図
を作成した。
pTLC100 0.1〜0.3μｇを含む、緩衝液20μに一種
以上の制限酵素を加え、37℃,2時間インキュベートする
かまたは必要に応じ、一種の制限酵素を用いてインキュ
ベートした後更に緩衝液を変えて別の制限酵素を加えて
インキュベートをおこなった。インキュベート終了後0.
5M EDTA1μを加え、0.8％アガロースゲル、1.2％ア
ガロースゲルの電気泳動をおこない、DNAのバンドの
数、移動度を調べた。用いた制限酵素と緩衝液を下に示
す。
以上の制限酵素を加え、37℃,2時間インキュベートする
かまたは必要に応じ、一種の制限酵素を用いてインキュ
ベートした後更に緩衝液を変えて別の制限酵素を加えて
インキュベートをおこなった。インキュベート終了後0.
5M EDTA1μを加え、0.8％アガロースゲル、1.2％ア
ガロースゲルの電気泳動をおこない、DNAのバンドの
数、移動度を調べた。用いた制限酵素と緩衝液を下に示
す。
この結果、第２図に示される制限酵素地図を作成し
た。
た。
（ｃ） 得られたラクトバチルス・カゼイDNAを各種制
限酵素で切断し、これをpUC9又はpUC19にサブクローニ
ングした。サブクローニングしたDNA断片を用い、宝酒
造（株）製のDNAシークエンシングキットを使ったダイ
デオキシ法によりDNAの全塩基配列の決定をおこなっ
た。決定された全塩基配列を第３図に示す。ここで決定
されたDNAはシーケンスサイズが塩基6468個から成り、D
NA上の各遺伝子の位置は、trpD506→1531,trpC1528→23
10,trpF2462→3061,trpB3045→4265,trpA4252→5052,未
知遺伝子X6325→5666,未知遺伝子Y402→509の各塩基
（数字は各塩基の番号）に対応するものであることが分
った。
限酵素で切断し、これをpUC9又はpUC19にサブクローニ
ングした。サブクローニングしたDNA断片を用い、宝酒
造（株）製のDNAシークエンシングキットを使ったダイ
デオキシ法によりDNAの全塩基配列の決定をおこなっ
た。決定された全塩基配列を第３図に示す。ここで決定
されたDNAはシーケンスサイズが塩基6468個から成り、D
NA上の各遺伝子の位置は、trpD506→1531,trpC1528→23
10,trpF2462→3061,trpB3045→4265,trpA4252→5052,未
知遺伝子X6325→5666,未知遺伝子Y402→509の各塩基
（数字は各塩基の番号）に対応するものであることが分
った。
このDNAの各遺伝子の位置関係と遺伝子の方向は第４
図に示される。
図に示される。
実施例 ２ シャトルベクターpBLβ15の作成 （１） pAMβ１のtra領域が欠落したプラスミドpAMβ
１−１ 0.3μｇを含む緩衝液（100mM NaCl,50mM Tri
s−HCl,pH7.5,10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノール）
20μにEcoR I0.125ユニットを加え37℃で１時間イン
キュベートした。0.5M EDTAを１μｇ加えてインキュベ
ートを停止し、処理液をTE−飽和フェノール−クロロホ
ルム−イソアミルアルコール混液で３回、更にクロロホ
ルム−イソアミルアルコール24:1混液で１回洗浄した。
得られた水層に1/10倍量の3M CH3COONa及び2.2倍量の
エタノールを加え、DNAを不溶化し、−80℃で10分間静
置した後15000rpm,5分間遠心分離してDNA沈澱を得た。
この沈澱を70％エタノールで洗い、真空下で乾燥した
後、滅菌蒸留水に溶解した。
１−１ 0.3μｇを含む緩衝液（100mM NaCl,50mM Tri
s−HCl,pH7.5,10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノール）
20μにEcoR I0.125ユニットを加え37℃で１時間イン
キュベートした。0.5M EDTAを１μｇ加えてインキュベ
ートを停止し、処理液をTE−飽和フェノール−クロロホ
ルム−イソアミルアルコール混液で３回、更にクロロホ
ルム−イソアミルアルコール24:1混液で１回洗浄した。
得られた水層に1/10倍量の3M CH3COONa及び2.2倍量の
エタノールを加え、DNAを不溶化し、−80℃で10分間静
置した後15000rpm,5分間遠心分離してDNA沈澱を得た。
この沈澱を70％エタノールで洗い、真空下で乾燥した
後、滅菌蒸留水に溶解した。
緩衝液の組成が100mM NaCl,50mM Tris−HCl（pH7.
5）,10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノールであり、制
限酵素がEcoR Iである点を除いては実施例１−（２）に
示したのと同じ条件で、pBR322のEcoR I切断物を得た。
5）,10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノールであり、制
限酵素がEcoR Iである点を除いては実施例１−（２）に
示したのと同じ条件で、pBR322のEcoR I切断物を得た。
次いで、宝酒造（株）製のライゲーションキットを用
いて、pAMβ１−１とpBR322とのライゲーションをおこ
なった。EcoR I切断pAMβ１−１ 0.05〜0.2μｇ、pBR3
22 0.05〜0.2μｇを含む、緩衝液（100mM Tris−HCl,
pH7.6,5mM MgCl2）５μに、プロトコールに従い、Ａ
液30μ,B液５μを加え、16℃で30分〜１時間ライゲ
ーション反応をおこなった。次いで使用菌株がE.coli H
B101である事を除いては実施例１−（３）と同一の条件
下でコンピテント菌体を調製した。ライゲーション反応
液20μにコンピテント菌体100μを加え、０℃で１
時間静置した後42℃で10分間保温した。これを室温に放
置し、液温を室温にもどした後Ｌ−ブロス1mlを加え37
℃で１時間培養した。この培養液をＬ−ブロスに25μg/
mlのアンピシリンを加え1.5％アガロースを添加して調
製した寒天培地の表面に塗布して37℃で一夜培養し、コ
ロニーを得た。
いて、pAMβ１−１とpBR322とのライゲーションをおこ
なった。EcoR I切断pAMβ１−１ 0.05〜0.2μｇ、pBR3
22 0.05〜0.2μｇを含む、緩衝液（100mM Tris−HCl,
pH7.6,5mM MgCl2）５μに、プロトコールに従い、Ａ
液30μ,B液５μを加え、16℃で30分〜１時間ライゲ
ーション反応をおこなった。次いで使用菌株がE.coli H
B101である事を除いては実施例１−（３）と同一の条件
下でコンピテント菌体を調製した。ライゲーション反応
液20μにコンピテント菌体100μを加え、０℃で１
時間静置した後42℃で10分間保温した。これを室温に放
置し、液温を室温にもどした後Ｌ−ブロス1mlを加え37
℃で１時間培養した。この培養液をＬ−ブロスに25μg/
mlのアンピシリンを加え1.5％アガロースを添加して調
製した寒天培地の表面に塗布して37℃で一夜培養し、コ
ロニーを得た。
（２） 上記得られた各コロニーをアンピシリン50μg/
mlを含むＬ−ブロスに接種し37℃で一夜振盪培養した。
培養液1.5mlを取り、15000rpm,1分間遠心分離して菌体
を捕集した。菌体を5mg/mlのリゾチームを含む緩衝液
（50mMグルコース,25mM Tris−HCl pH8.0,10mM EDT
A）100μに懸濁し、室温に５分間放置し、次いで、１
％ラウリル硫酸ナトリウムを含む0.2N NaOHを250μ
加えゆるやかに振盪し、室温に５分間放置した。3M CH
3COOK（pH4.8）を150μ加えゆるやかに振盪し、室温
に５分間放置した。15000rpmで５分間遠心して、上清画
分を得た。上清液に0.6倍量のイソプロピルアルコール
を加えDNAを不溶化し室温で15分間静置した後15000rpm
で５分間遠心分離してDNAの沈澱を得た。この沈澱を70
％エタノールで洗い、真空乾燥した後滅菌蒸留水に溶解
した。
mlを含むＬ−ブロスに接種し37℃で一夜振盪培養した。
培養液1.5mlを取り、15000rpm,1分間遠心分離して菌体
を捕集した。菌体を5mg/mlのリゾチームを含む緩衝液
（50mMグルコース,25mM Tris−HCl pH8.0,10mM EDT
A）100μに懸濁し、室温に５分間放置し、次いで、１
％ラウリル硫酸ナトリウムを含む0.2N NaOHを250μ
加えゆるやかに振盪し、室温に５分間放置した。3M CH
3COOK（pH4.8）を150μ加えゆるやかに振盪し、室温
に５分間放置した。15000rpmで５分間遠心して、上清画
分を得た。上清液に0.6倍量のイソプロピルアルコール
を加えDNAを不溶化し室温で15分間静置した後15000rpm
で５分間遠心分離してDNAの沈澱を得た。この沈澱を70
％エタノールで洗い、真空乾燥した後滅菌蒸留水に溶解
した。
（３） 上記得られたプラスミドを0.8アガロースゲル
で電気泳動をおこないサイズ約22.5kbのプラスミドを選
択し、それらを更に、EcoR Iで切断し、0.8％アガロー
スゲルの電気泳動をおこない、pBR322由来の4.4kbのバ
ンド及びpAMβ１−１由来の２本のバンド（複製開始領
域を含む5kbとエリスロマイシン耐性領域を含む13kbの
バンド）（合計３本のバンド）が認められるプラスミド
を選びpBLβ15と命名した。
で電気泳動をおこないサイズ約22.5kbのプラスミドを選
択し、それらを更に、EcoR Iで切断し、0.8％アガロー
スゲルの電気泳動をおこない、pBR322由来の4.4kbのバ
ンド及びpAMβ１−１由来の２本のバンド（複製開始領
域を含む5kbとエリスロマイシン耐性領域を含む13kbの
バンド）（合計３本のバンド）が認められるプラスミド
を選びpBLβ15と命名した。
このプラスミドpBLβ15の構築過程は第５図で示され
る。
る。
実施例 ３ シャトルベクターpBLβ21の調製 （１） pAMβ１−１より、エリスロマイシン耐性遺伝
子を含むDNA断片及び複製開始領域を含むDNA断片の調製 pBLβ15 50μｇを含む緩衝液（100mM NaCl,50mM T
ris−HCl,pH7.5,10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノー
ル）100μに、Ava I75ユニット、EcoR I75ユニットを
加え、37℃で１時間インキュベートした。更に同量の酵
素を加え更に１時間インキュベートを続けた。0.5M ED
TA20μを加え、インキュベートを停止した後0.8％ア
ガロースゲル電気泳動をおこなった。pAMβ１−１の複
製開始領域を含む5kbのEcoR I−EcoR I断片（以下断片
−１と称す）のバンドを含むゲル及びpAMβ１−１のエ
リスロマイシン耐性遺伝子を含む4kbのAva I−EcoR I断
片のバンドを含むゲルをそれぞれ切り出し、透析バック
に入れ更に電気泳動をおこなって、ゲル内のそれぞれの
DNA断片を溶出した。それぞれのDNA断片を含む溶液（約
3ml）を、TE飽和フェノールで４回洗い、次いで２−ブ
タノールと共に振盪してDNAを含む溶液を約400μまで
濃縮した。この溶液をエーテルで３回洗浄した後1/10倍
量の3M CH3COONa及び2.2倍量のエタノールを加え、DNA
を不溶化し、−80℃で10分間静置した後15000rpmで５分
間遠心分離してDNA沈澱を得た。70％エタノールで洗浄
した後真空下乾燥して、滅菌蒸留水20μに溶解した。
子を含むDNA断片及び複製開始領域を含むDNA断片の調製 pBLβ15 50μｇを含む緩衝液（100mM NaCl,50mM T
ris−HCl,pH7.5,10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノー
ル）100μに、Ava I75ユニット、EcoR I75ユニットを
加え、37℃で１時間インキュベートした。更に同量の酵
素を加え更に１時間インキュベートを続けた。0.5M ED
TA20μを加え、インキュベートを停止した後0.8％ア
ガロースゲル電気泳動をおこなった。pAMβ１−１の複
製開始領域を含む5kbのEcoR I−EcoR I断片（以下断片
−１と称す）のバンドを含むゲル及びpAMβ１−１のエ
リスロマイシン耐性遺伝子を含む4kbのAva I−EcoR I断
片のバンドを含むゲルをそれぞれ切り出し、透析バック
に入れ更に電気泳動をおこなって、ゲル内のそれぞれの
DNA断片を溶出した。それぞれのDNA断片を含む溶液（約
3ml）を、TE飽和フェノールで４回洗い、次いで２−ブ
タノールと共に振盪してDNAを含む溶液を約400μまで
濃縮した。この溶液をエーテルで３回洗浄した後1/10倍
量の3M CH3COONa及び2.2倍量のエタノールを加え、DNA
を不溶化し、−80℃で10分間静置した後15000rpmで５分
間遠心分離してDNA沈澱を得た。70％エタノールで洗浄
した後真空下乾燥して、滅菌蒸留水20μに溶解した。
上記のAva I−EcoR I断片約0.5μg,dATP,dCTP,dGTP,d
TTP各0.1mMを含む緩衝液（7mM Tris−HCl,pH7.5,0.1mM
EDTA,20mM NaCl,7mM MgCl2）50μにKlenow酵素１
μ（２ユニット）を加え37℃で１時間インキュベート
し、末端の平滑化をおこなった（この断片を以下断片−
２と称す）。TE飽和フェノール−クロロホルム−イソア
ミルアルコール25:24:1混液で３回洗い、次いでクロロ
ホルム−イソアミルアルコール24:1で１回洗った後1/10
倍量の3M CH3COONa及び2.2倍量のエタノールを加えDNA
を不溶化し、−80℃で10分間置いた後、15000rpm,5分間
遠心してDNAを沈澱した。沈澱を70％エタノールで洗浄
し、真空下で乾燥して滅菌蒸留水に溶解した。
TTP各0.1mMを含む緩衝液（7mM Tris−HCl,pH7.5,0.1mM
EDTA,20mM NaCl,7mM MgCl2）50μにKlenow酵素１
μ（２ユニット）を加え37℃で１時間インキュベート
し、末端の平滑化をおこなった（この断片を以下断片−
２と称す）。TE飽和フェノール−クロロホルム−イソア
ミルアルコール25:24:1混液で３回洗い、次いでクロロ
ホルム−イソアミルアルコール24:1で１回洗った後1/10
倍量の3M CH3COONa及び2.2倍量のエタノールを加えDNA
を不溶化し、−80℃で10分間置いた後、15000rpm,5分間
遠心してDNAを沈澱した。沈澱を70％エタノールで洗浄
し、真空下で乾燥して滅菌蒸留水に溶解した。
プラスミドpBLβ15と断片１及び断片２との関係を第
６図に示す。
６図に示す。
（２） 制限酵素が、Nru Iである点を除いては実施例
１−（２）で示したのと同一の方法でpBR322のNru I切
断物を得た。次いで用いるDNAが断片−２及びpBR322のN
ru I切断物である点を除いては実施例２−（１）に示し
たのと同一の方法でアンピシリン耐性コロニーを得、次
いで実施例２−（２）と同一の方法で各コロニーからプ
ラスミドを精製した。
１−（２）で示したのと同一の方法でpBR322のNru I切
断物を得た。次いで用いるDNAが断片−２及びpBR322のN
ru I切断物である点を除いては実施例２−（１）に示し
たのと同一の方法でアンピシリン耐性コロニーを得、次
いで実施例２−（２）と同一の方法で各コロニーからプ
ラスミドを精製した。
（３） 上記得られたプラスミドを0.8％アガロースゲ
ル電気泳動をおこないサイズ約8.4kbのプラスミドを選
択し、更にHind IIIで切断してアガロースゲル電気泳動
をおこなってpBR322に断片−２がクローニングされてい
る事を確認した。本プラスミドをpBLβ18と命名した。
ル電気泳動をおこないサイズ約8.4kbのプラスミドを選
択し、更にHind IIIで切断してアガロースゲル電気泳動
をおこなってpBR322に断片−２がクローニングされてい
る事を確認した。本プラスミドをpBLβ18と命名した。
（４） 制限酵素がEcoR Iであり、緩衝液が100mM NaC
l,50mM Tris−Cl（pH7.5）,10mM MgCl2,1mMメルカプ
トエタノールより成る点を除いては実施例１−（２）で
示したのと同一の方法でpBLβ18のEcoR I切断物を得
た。次いで、用いるDNAが断片−１及びpBLβ18のEcoR I
切断物である点を除いては実施例２−（１）に示したの
と同一の方法でアンピシリン耐性コロニーを得、次いで
実施例２−（２）と同一の方法で各コロニーからプラス
ミドを精製した。
l,50mM Tris−Cl（pH7.5）,10mM MgCl2,1mMメルカプ
トエタノールより成る点を除いては実施例１−（２）で
示したのと同一の方法でpBLβ18のEcoR I切断物を得
た。次いで、用いるDNAが断片−１及びpBLβ18のEcoR I
切断物である点を除いては実施例２−（１）に示したの
と同一の方法でアンピシリン耐性コロニーを得、次いで
実施例２−（２）と同一の方法で各コロニーからプラス
ミドを精製した。
（５） 上記で得られたプラスミドを0.8％アガロース
ゲル電気泳動をおこないサイズ約12.4kbのプラスミドを
選択した。このプラスミドをHind III,Kpn I,Pvu II等
で切断し、アガロースゲル電気泳動上のバンドの挙動よ
り断片−１がクローニングされている事を確認した。本
プラスミドをpBLβ21と命名した。
ゲル電気泳動をおこないサイズ約12.4kbのプラスミドを
選択した。このプラスミドをHind III,Kpn I,Pvu II等
で切断し、アガロースゲル電気泳動上のバンドの挙動よ
り断片−１がクローニングされている事を確認した。本
プラスミドをpBLβ21と命名した。
プラスミドpBLβ18及びプラスミドpBLβ21の構築過程
並びにそれらの制限酵素地図は第７図に示される。
並びにそれらの制限酵素地図は第７図に示される。
実施例 ４ シャトルベクターpBLβ22,pBLβ23の調製 （１） 制限酵素がHinc IIである点を除いては実施例
１−（２）で示したのと同一の方法でpUC19のHinc II切
断物を得た。次いで用いる菌株がE.coli JM105で、用い
るDNAが断片−２及び、pUC19のHinc II切断物であり、
寒天培地の組成がXgal（５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）20μg/ml,
アンピシリン25μg/ml,及び寒天1.5％を添加したＬ−ブ
ロスの寒天培地である点を除いては実施例２−（１）に
示したのと同一の方法で、アンピシリン耐性の白色コロ
ニーを得た。次いで実施例２−（２）と同一の方法で各
コロニーのプラスミドを精製した。
１−（２）で示したのと同一の方法でpUC19のHinc II切
断物を得た。次いで用いる菌株がE.coli JM105で、用い
るDNAが断片−２及び、pUC19のHinc II切断物であり、
寒天培地の組成がXgal（５−ブロモ−４−クロロ−３−
インドリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド）20μg/ml,
アンピシリン25μg/ml,及び寒天1.5％を添加したＬ−ブ
ロスの寒天培地である点を除いては実施例２−（１）に
示したのと同一の方法で、アンピシリン耐性の白色コロ
ニーを得た。次いで実施例２−（２）と同一の方法で各
コロニーのプラスミドを精製した。
（２） 上記で得られたプラスミドを0.8％アガロース
ゲル電気泳動をおこない、サイズ約6.7kbのプラスミド
を選択した。次いでこれらのプラスミドをHind III,Eco
R I,Pst I及びそれらの組み合わせで切断し、クローニ
ングされたDNAの検討をおこない、断片−２の挿入の方
向が異る２種類のプラスミドを得た。これらのプラスミ
ドをpBLβ19及びpBLβ20と命名した。
ゲル電気泳動をおこない、サイズ約6.7kbのプラスミド
を選択した。次いでこれらのプラスミドをHind III,Eco
R I,Pst I及びそれらの組み合わせで切断し、クローニ
ングされたDNAの検討をおこない、断片−２の挿入の方
向が異る２種類のプラスミドを得た。これらのプラスミ
ドをpBLβ19及びpBLβ20と命名した。
プラスミドpBLβ19及びプラスミドpBLβ20の構築過程
並びにそれらの制限酵素地図は第８図に示される。
並びにそれらの制限酵素地図は第８図に示される。
（３） 用いるプラスミドがpBLβ19である点を除いて
は実施例３−（３）と同一の方法でpBLβ19のEcoR I切
断物を得た。次いで用いるDNAが断片−１及びpBLβ19の
EcoR I切断物である点を除き実施例２−（１）で示した
のと同一の方法でアンピシリン耐性コロニーを得た。次
いで実施例２−（２）と同一の方法で各コロニーのプラ
スミドを精製した。
は実施例３−（３）と同一の方法でpBLβ19のEcoR I切
断物を得た。次いで用いるDNAが断片−１及びpBLβ19の
EcoR I切断物である点を除き実施例２−（１）で示した
のと同一の方法でアンピシリン耐性コロニーを得た。次
いで実施例２−（２）と同一の方法で各コロニーのプラ
スミドを精製した。
（４） 上記で得られたプラスミドを0.8％アガロース
ゲル電気泳動をおこない、サイズ約11.7kbのプラスミド
を選択した。次いでこれらのプラスミドをKpn I,Hind I
II,EcoR I及びこれらの組み合わせで切断し、0.8％アガ
ロースゲル電気泳動をおこない、その挙動を調べて断片
−１の方向が異る２種類のプラスミドを得た。これらの
プラスミドをpBLβ22及びpBLβ23と命名した。
ゲル電気泳動をおこない、サイズ約11.7kbのプラスミド
を選択した。次いでこれらのプラスミドをKpn I,Hind I
II,EcoR I及びこれらの組み合わせで切断し、0.8％アガ
ロースゲル電気泳動をおこない、その挙動を調べて断片
−１の方向が異る２種類のプラスミドを得た。これらの
プラスミドをpBLβ22及びpBLβ23と命名した。
プラスミドpBLβ22及びプラスミドpBLβ23の構築過
程、並びにそれらの制限酵素地図は第８図及び第９図
（Ａ），（Ｂ）に示される。
程、並びにそれらの制限酵素地図は第８図及び第９図
（Ａ），（Ｂ）に示される。
実施例 ５ シャトルベクターpBLβ24,pBLβ25の調製 用いるプラスミドがpBLβ20である点を除き、実施例
４−（３）,4−（４）と同一の方法でpBLβ20に断片−
１の挿入方向が異る２種類のプラスミドを得た。これら
のプラスミドをpBLβ24及びpBLβ25と命名した。
４−（３）,4−（４）と同一の方法でpBLβ20に断片−
１の挿入方向が異る２種類のプラスミドを得た。これら
のプラスミドをpBLβ24及びpBLβ25と命名した。
プラスミドpBLβ24及びプラスミドpBL25の構築過程、
並びにそれらの制限酵素地図は第８図及び第９図
（Ｃ），（Ｄ）に示される。
並びにそれらの制限酵素地図は第８図及び第９図
（Ｃ），（Ｄ）に示される。
実施例 ６ pHY300PLKによるラクトバチルス・カゼイの形質転換 実施例１に示したラクトバチルス・カゼイの培地より
Tween80及びDL−スレオニンを除いた培地を菌の培養に
用いた。なおこのプラスミドpHY300PLKは特開昭60−248
184号に開示されている。
Tween80及びDL−スレオニンを除いた培地を菌の培養に
用いた。なおこのプラスミドpHY300PLKは特開昭60−248
184号に開示されている。
ラクトバチルス・カゼイJCM1053株の終夜培養液0.2ml
を試験管中の上記培地10mlに接種し、A600＝0.2となる
まで静置培養した。４℃で3000rpm,10分間遠心分離して
菌体を捕集した。菌体を0.4Mスクロースを含む8mMリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で２回洗浄し、次いで、
0.1mlの上記緩衝液に懸濁した。菌体懸濁液100μにpH
Y300PLK1μｇを含む水溶液50μ,40％ポリエチレング
リコール2000水溶液250μを加え撹拌して０℃に10分
間放置した。次いでバイオラッド社製ジーンパルサーを
用い、2kV,1μＦの条件下で通電し、再び０℃で10分間
静置した。４℃で15000rpm,2分間遠心して菌体を捕集
し、上記培地1mlに懸濁し37℃で３時間培養した。この
培養液0.3mlを上記培地にテトラサイクリン10μg/ml及
び寒天1.5％を添加した寒天培地に塗布し、37℃で３日
間嫌気的に培養したところ、寒天培地１枚当り560個の
テトラサイクリン耐性コロニーを得た。pHY300PLKを添
加せずに同一の実験をおこなったところテトラサイクリ
ン耐性のコロニーは得られなかった。
を試験管中の上記培地10mlに接種し、A600＝0.2となる
まで静置培養した。４℃で3000rpm,10分間遠心分離して
菌体を捕集した。菌体を0.4Mスクロースを含む8mMリン
酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）で２回洗浄し、次いで、
0.1mlの上記緩衝液に懸濁した。菌体懸濁液100μにpH
Y300PLK1μｇを含む水溶液50μ,40％ポリエチレング
リコール2000水溶液250μを加え撹拌して０℃に10分
間放置した。次いでバイオラッド社製ジーンパルサーを
用い、2kV,1μＦの条件下で通電し、再び０℃で10分間
静置した。４℃で15000rpm,2分間遠心して菌体を捕集
し、上記培地1mlに懸濁し37℃で３時間培養した。この
培養液0.3mlを上記培地にテトラサイクリン10μg/ml及
び寒天1.5％を添加した寒天培地に塗布し、37℃で３日
間嫌気的に培養したところ、寒天培地１枚当り560個の
テトラサイクリン耐性コロニーを得た。pHY300PLKを添
加せずに同一の実験をおこなったところテトラサイクリ
ン耐性のコロニーは得られなかった。
実施例 ７ シャトルベクターpBLβ21によるラクトバチルス・カゼ
イの形質転換 実施例６のプラスミドをpBLβ21に変え、寒天培地の
テトラサイクリンをエリスロマイシンに変えた他は同一
の条件でラクトバチルス・カゼイIAM1045株の形質転換
をおこない寒天培地１枚当り673個のエリスロマイシン
耐性コロニーを得た。pBLβ21を添加せずに同一の実験
をおこなったところエリスロマイシン耐性コロニーは得
られなかった。
イの形質転換 実施例６のプラスミドをpBLβ21に変え、寒天培地の
テトラサイクリンをエリスロマイシンに変えた他は同一
の条件でラクトバチルス・カゼイIAM1045株の形質転換
をおこない寒天培地１枚当り673個のエリスロマイシン
耐性コロニーを得た。pBLβ21を添加せずに同一の実験
をおこなったところエリスロマイシン耐性コロニーは得
られなかった。
実施例 ８ シャトルベクターpBLβ25によるラクトバチルス・カゼ
イの形質転換 実施例７のプラスミドをpBLβ25に変えた他は実施例
７と同一の条件で形質転換をおこない、1120個のエリス
ロマイシン耐性コロニーを得た。pBLβ25を添加しない
で同一の実験をおこなった場合はエリスロマイシン耐性
コロニーは得られなかった。
イの形質転換 実施例７のプラスミドをpBLβ25に変えた他は実施例
７と同一の条件で形質転換をおこない、1120個のエリス
ロマイシン耐性コロニーを得た。pBLβ25を添加しない
で同一の実験をおこなった場合はエリスロマイシン耐性
コロニーは得られなかった。
実施例 ９ ラクトバチルス・カゼイtrp遺伝子のpBL25へのクローニ
ング （１） pTLC100 20μｇを含む緩衝液（50mM NaCl,10m
M Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,1mMメルカプトエ
タノール）400μにHind III30ユニットを加え37℃で
１時間インキュベートした。更に30ユニットの酵素を加
え37℃で１時間インキュベートを続けた。0.5M EDTA20
μを加えインキュベーションを停止後0.8％アガロー
スゲル電気泳動をおこなった。ラクトバチルス・カゼイ
trp遺伝子を含む6.47kbのDNA断片のバンドを含むゲルを
切り出し、透析バックに入れ、更に電気泳動をおこなっ
てDNA断片を溶出した。DNA断片を含む溶液（約3ml）をT
E飽和フェノールで４回洗い、次いで２−ブタノールと
共に、振盪してDNAを含む溶液を約400μまで濃縮し
た。この溶液をエーテルで３回洗浄した後1/10倍量の3M
CH3COONa及び2.2倍量のエタノールを加えDNAを不溶化
し、−80℃で10分間静置した後15000rpmで５分間遠心分
離してDNA沈澱を得た。70％エタノールで洗浄した後真
空下で乾燥して滅菌蒸留水20μに溶解した（得られた
DNA断片を断片−３と称す。）。
ング （１） pTLC100 20μｇを含む緩衝液（50mM NaCl,10m
M Tris−HCl（pH7.5）,10mM MgCl2,1mMメルカプトエ
タノール）400μにHind III30ユニットを加え37℃で
１時間インキュベートした。更に30ユニットの酵素を加
え37℃で１時間インキュベートを続けた。0.5M EDTA20
μを加えインキュベーションを停止後0.8％アガロー
スゲル電気泳動をおこなった。ラクトバチルス・カゼイ
trp遺伝子を含む6.47kbのDNA断片のバンドを含むゲルを
切り出し、透析バックに入れ、更に電気泳動をおこなっ
てDNA断片を溶出した。DNA断片を含む溶液（約3ml）をT
E飽和フェノールで４回洗い、次いで２−ブタノールと
共に、振盪してDNAを含む溶液を約400μまで濃縮し
た。この溶液をエーテルで３回洗浄した後1/10倍量の3M
CH3COONa及び2.2倍量のエタノールを加えDNAを不溶化
し、−80℃で10分間静置した後15000rpmで５分間遠心分
離してDNA沈澱を得た。70％エタノールで洗浄した後真
空下で乾燥して滅菌蒸留水20μに溶解した（得られた
DNA断片を断片−３と称す。）。
このDNA断片約0.5μg,dATP,dCTP,dGTP,dTTP各0.1mMを
含む緩衝液（7mM Tris−HCl,pH7.5,0.1mM EDTA,20mM
NaCl,7mM MgCl2）30μにKlenow酵素２μ（４ユ
ニット）を加え37℃で１時間インキュベートしDNA末端
を平滑にした。TE飽和フェノール−クロロホルム−イソ
アミルアルコール25:24:1混液で３回洗い、次いでクロ
ロホルム−イソアミルアルコール24:1で１回洗った後 の3M CH3COONa及び2.2倍量のエタノールを加えてDNAを
不溶化し、−80℃で10分間静置した後、15000rpm,5分間
遠心分離してDNAを沈澱させた。沈澱を70％エタノール
で洗浄し、真空下で乾燥して滅菌蒸留水に溶解した。
含む緩衝液（7mM Tris−HCl,pH7.5,0.1mM EDTA,20mM
NaCl,7mM MgCl2）30μにKlenow酵素２μ（４ユ
ニット）を加え37℃で１時間インキュベートしDNA末端
を平滑にした。TE飽和フェノール−クロロホルム−イソ
アミルアルコール25:24:1混液で３回洗い、次いでクロ
ロホルム−イソアミルアルコール24:1で１回洗った後 の3M CH3COONa及び2.2倍量のエタノールを加えてDNAを
不溶化し、−80℃で10分間静置した後、15000rpm,5分間
遠心分離してDNAを沈澱させた。沈澱を70％エタノール
で洗浄し、真空下で乾燥して滅菌蒸留水に溶解した。
（２） 使用するプラスミドがpBLβ25であり、制限酵
素がSma Iであり、緩衝液組成が20mM KCl,10mM Tris
−HCl（pH8.0）10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノール
である点を除いては実施例１−（２）で示したのと同一
の方法でpBLβ25のSma I切断物を得た。次いで、用いる
DNAがpTLC100より上記（１）によりHind IIIで切り出し
末端を平滑にしたラクトバチルス・カゼイtrp遺伝子を
含むDNA、及び、pBLβ25のSma I切断物である点を除い
ては実施例２−（１）に示したのと同一の方法でアンピ
シリン耐性コロニーを得、次いで実施例２−（２）と同
一の方法で各コロニーからプラスミドを精製した。
素がSma Iであり、緩衝液組成が20mM KCl,10mM Tris
−HCl（pH8.0）10mM MgCl2,1mMメルカプトエタノール
である点を除いては実施例１−（２）で示したのと同一
の方法でpBLβ25のSma I切断物を得た。次いで、用いる
DNAがpTLC100より上記（１）によりHind IIIで切り出し
末端を平滑にしたラクトバチルス・カゼイtrp遺伝子を
含むDNA、及び、pBLβ25のSma I切断物である点を除い
ては実施例２−（１）に示したのと同一の方法でアンピ
シリン耐性コロニーを得、次いで実施例２−（２）と同
一の方法で各コロニーからプラスミドを精製した。
（３） 上記得られたプラスミドを0.8％アガロースゲ
ル電気泳動をおこない、サイズ約18kbのプラスミドを得
た。これを更に数種の制限酵素で切断し、アガロースゲ
ル電気泳動をおこない、ラクトバチルス・カゼイtrp遺
伝子がクローニングされている事を確認し、更に遺伝子
の挿入されている方向を確認した。得られたプラスミド
をpTLC150と命名した。
ル電気泳動をおこない、サイズ約18kbのプラスミドを得
た。これを更に数種の制限酵素で切断し、アガロースゲ
ル電気泳動をおこない、ラクトバチルス・カゼイtrp遺
伝子がクローニングされている事を確認し、更に遺伝子
の挿入されている方向を確認した。得られたプラスミド
をpTLC150と命名した。
プラスミドpTLC150の構築過程は第10図に示される。
実施例 10 trp+のラクトバチルス・カゼイJCM1053株の取得 （１） 実施例６のプラスミドをpTLC150に変え、寒天
培地のテトラサイクリンをエリスロマイシンに変えた他
は同一の条件でラクトバチルス・カゼイの形質転換をお
こない寒天培地１枚当り155個のエリスロマイシン耐性
コロニーを得た。実施例１の培地よりTween80及びDL−
スレオニンを除き、エリスロマイシンを３μg/mlとなる
よう加えた培地に、得られたコロニーを接種し、一夜37
℃で静置培養した。培養液3mlを15000rpmで１分間遠心
分離して菌体を捕集し、50mM NaCl及び5mM EDTAを含
む30mM Tris−HCl（pH3.0）800μで１回洗い、リゾ
チーム溶液（10mg/ml−50mMグルコース、10mM EDTA,25
mM Tris−HCl pH8.0）100μに菌株を懸濁させた。3
7℃で45分間保温した後、0.2M NaCl及び１％SDSより成
る溶液250μを加え室温で10分間静置した。次いで0.3
MCH3COOK（pH4.8）を加え氷中で５分間静置し、15000rp
mで５分間遠心分離して上清を得た。RNase（400μ/m
l）２μを加え37℃で10分間保温し、次いでプロテイ
ネイスＫ（3mg/ml）を２μ加え、更に20分間保温し
た。TE飽和フェノール−クロロホルム−イソアミルアル
コール混液25:24:1で２回洗い、クロロホルム−イソア
ミルアルコール24:1で１回洗った後、水層の２倍量のエ
タノールを加えDNAを不溶化し、−80℃で１時間静置し
た後15000rpmで５分間遠心分離し、DNAの沈殿を得た。
沈殿を70％エタノールで洗った後、真空下で乾燥し、滅
菌蒸留水に溶解した。これを0.8％アガロースゲル電気
泳動にかけたところ、pTLC150と同一の移動度を示すプ
ラスミドのバンドが検出された。又、得られたコロニー
をエリスロマイシンを10μg/ml及びアントラニル酸を10
μg/ml含む、次の表の培地に塗布したところ、生育が認
められた。比較の為、ベクターであるpBLβ25を保有す
るラクトバチルス・カゼイJCM1053は同じ培地に生育不
能であった。即ち、ラクトバチルス・カゼイJCM1053株
はラクトバチルス・カゼイRNL7株由来のトリプトファン
遺伝子を保有する事によりトリプトファン非要求性とな
った。トリプトファン非要求性となったラクトバチルス
・カゼイJCM1053株をラクトバチルス・カゼイRNL398
（微工研菌寄第10725号）と命名した。
培地のテトラサイクリンをエリスロマイシンに変えた他
は同一の条件でラクトバチルス・カゼイの形質転換をお
こない寒天培地１枚当り155個のエリスロマイシン耐性
コロニーを得た。実施例１の培地よりTween80及びDL−
スレオニンを除き、エリスロマイシンを３μg/mlとなる
よう加えた培地に、得られたコロニーを接種し、一夜37
℃で静置培養した。培養液3mlを15000rpmで１分間遠心
分離して菌体を捕集し、50mM NaCl及び5mM EDTAを含
む30mM Tris−HCl（pH3.0）800μで１回洗い、リゾ
チーム溶液（10mg/ml−50mMグルコース、10mM EDTA,25
mM Tris−HCl pH8.0）100μに菌株を懸濁させた。3
7℃で45分間保温した後、0.2M NaCl及び１％SDSより成
る溶液250μを加え室温で10分間静置した。次いで0.3
MCH3COOK（pH4.8）を加え氷中で５分間静置し、15000rp
mで５分間遠心分離して上清を得た。RNase（400μ/m
l）２μを加え37℃で10分間保温し、次いでプロテイ
ネイスＫ（3mg/ml）を２μ加え、更に20分間保温し
た。TE飽和フェノール−クロロホルム−イソアミルアル
コール混液25:24:1で２回洗い、クロロホルム−イソア
ミルアルコール24:1で１回洗った後、水層の２倍量のエ
タノールを加えDNAを不溶化し、−80℃で１時間静置し
た後15000rpmで５分間遠心分離し、DNAの沈殿を得た。
沈殿を70％エタノールで洗った後、真空下で乾燥し、滅
菌蒸留水に溶解した。これを0.8％アガロースゲル電気
泳動にかけたところ、pTLC150と同一の移動度を示すプ
ラスミドのバンドが検出された。又、得られたコロニー
をエリスロマイシンを10μg/ml及びアントラニル酸を10
μg/ml含む、次の表の培地に塗布したところ、生育が認
められた。比較の為、ベクターであるpBLβ25を保有す
るラクトバチルス・カゼイJCM1053は同じ培地に生育不
能であった。即ち、ラクトバチルス・カゼイJCM1053株
はラクトバチルス・カゼイRNL7株由来のトリプトファン
遺伝子を保有する事によりトリプトファン非要求性とな
った。トリプトファン非要求性となったラクトバチルス
・カゼイJCM1053株をラクトバチルス・カゼイRNL398
（微工研菌寄第10725号）と命名した。
実施例 11 ラクトバチルス・カゼイtrp遺伝子のpHY300PLKへのクロ
ーニング 使用するプラスミドがpHY300PLKである他は実施例１
−（２）に示したのと同一の方法でpHY300PLKのHind II
Iの切断物を得た。次いで用いるDNAが、実施例９で示し
た断片−３とpHY300PLKのHind III切断物であり、使用
菌株がE.coli mH3trpAE1である点を除いては実施例２
−（１）に示したのと同一の方法でアンピシリン耐性コ
ロニーを得た。得られたコロニーを更に、実施例１−
（３）に示したVogel−Bonner寒天培地にアンピシリン2
5μg/ml及びテトラサイクリン10μg/ml、インドール10
μg/mlとなるよう加えて作成した寒天培地に接種し、ア
ンピシリン及びテトラサイクリンに耐性であり、trp+で
あるコロニーを選択した。これらのコロニーより、実施
例２−（２）と同一の方法でプラスミドを精製し、実施
例９−（３）に示したのと同一の方法でプラスミドの確
認をおこなった。得られたプラスミドをpTLC156と命名
した。
ーニング 使用するプラスミドがpHY300PLKである他は実施例１
−（２）に示したのと同一の方法でpHY300PLKのHind II
Iの切断物を得た。次いで用いるDNAが、実施例９で示し
た断片−３とpHY300PLKのHind III切断物であり、使用
菌株がE.coli mH3trpAE1である点を除いては実施例２
−（１）に示したのと同一の方法でアンピシリン耐性コ
ロニーを得た。得られたコロニーを更に、実施例１−
（３）に示したVogel−Bonner寒天培地にアンピシリン2
5μg/ml及びテトラサイクリン10μg/ml、インドール10
μg/mlとなるよう加えて作成した寒天培地に接種し、ア
ンピシリン及びテトラサイクリンに耐性であり、trp+で
あるコロニーを選択した。これらのコロニーより、実施
例２−（２）と同一の方法でプラスミドを精製し、実施
例９−（３）に示したのと同一の方法でプラスミドの確
認をおこなった。得られたプラスミドをpTLC156と命名
した。
プラスミドpTCL156の構築過程は第11図に示される。
実施例 12 trp+のラクトバチルス・カゼイJCM1053株の取得 実施例６のプラスミドをpTLC156に変えた他は同一条
件で本株にpTLC156を導入する操作をおこなった。導入
操作後の培養液を15000rpmで１分間遠心分離して菌体を
捕集し、菌体を生理食塩水で２回洗浄した。菌体を生理
食塩水300μに懸濁し、その100μをインドール10μ
g/ml及びテトラサイクリン10μg/mlを含む実施例10に示
した寒天培地に塗布し、37℃で３日間嫌気的に培養した
ところ寒天培地１枚当り2600個のテトラサイクリン耐性
でtrp+のコロニーを得た。更に実施例10と同一の方法で
プラスミドの確認をおこない、pTLC156と同一のサイズ
のプラスミドを検出した。トリプトファン非要求性とな
ったラクトバチルス・カゼイJCM1053株をラクトバチル
ス・カゼイRNL420（微工研菌寄第10724号）と命名し
た。
件で本株にpTLC156を導入する操作をおこなった。導入
操作後の培養液を15000rpmで１分間遠心分離して菌体を
捕集し、菌体を生理食塩水で２回洗浄した。菌体を生理
食塩水300μに懸濁し、その100μをインドール10μ
g/ml及びテトラサイクリン10μg/mlを含む実施例10に示
した寒天培地に塗布し、37℃で３日間嫌気的に培養した
ところ寒天培地１枚当り2600個のテトラサイクリン耐性
でtrp+のコロニーを得た。更に実施例10と同一の方法で
プラスミドの確認をおこない、pTLC156と同一のサイズ
のプラスミドを検出した。トリプトファン非要求性とな
ったラクトバチルス・カゼイJCM1053株をラクトバチル
ス・カゼイRNL420（微工研菌寄第10724号）と命名し
た。
実施例 13 実施例10に示した培地にトリプトファン生合成前駆体
であるアントラニル酸又はインドールを加えた培地にRN
L398株及びRNL420株を塗布し、37℃で２日間嫌気的に培
養したところ、生育の状況は次の表に示す結果だった。
であるアントラニル酸又はインドールを加えた培地にRN
L398株及びRNL420株を塗布し、37℃で２日間嫌気的に培
養したところ、生育の状況は次の表に示す結果だった。
一方、pBLβ25又はpHY300PLKを保有するL.casei JCM
1053株は上記培地上では生育不可能であり、実施例10に
示した培地にトリプトファンを添加した培地のみで生育
可能であった。
1053株は上記培地上では生育不可能であり、実施例10に
示した培地にトリプトファンを添加した培地のみで生育
可能であった。
第１図は、プラスミドpTLC100の構築過程と同プラスミ
ドの制限酵素地図を示す。 第２図は、ラクトバチルス・カゼイDNAの簡単な制限酵
素地図を示す。 第３−（１）〜（５）図は、クラトバチルス・カゼイDN
Aの全塩基配列を示す。 第４図は、ラクトバチルス・カゼイDNA上のtrpA,B,C,F
及びＤ遺伝子、並びに未知遺伝子X,Yの位置関係を示
す。 第５図はプラスミドpBLβ15の構築過程を示す。 第６図はプラスミドpBLβ15と断片１及び断片２との関
係を示す。 第７図はプラスミドpBLβ18及びpBLβ21の構築過程を示
す。 第８図はプラスミドpBLβ19、pBLβ20、pBLβ22、pBLβ
23、pBLβ24及びpBL25の構築過程を示す。 第９図（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）の夫々は、
プラスミドpBLβ22、pBLβ23、pBLβ24及びpBLβ25の制
限酵素地図を示す。 第10図は、プラスミドpTLC150の構築過程とその制限酵
素地図を示す。 第11図は、プラスミドpTLC156の構築過程とその制限酵
素地図を示す。
ドの制限酵素地図を示す。 第２図は、ラクトバチルス・カゼイDNAの簡単な制限酵
素地図を示す。 第３−（１）〜（５）図は、クラトバチルス・カゼイDN
Aの全塩基配列を示す。 第４図は、ラクトバチルス・カゼイDNA上のtrpA,B,C,F
及びＤ遺伝子、並びに未知遺伝子X,Yの位置関係を示
す。 第５図はプラスミドpBLβ15の構築過程を示す。 第６図はプラスミドpBLβ15と断片１及び断片２との関
係を示す。 第７図はプラスミドpBLβ18及びpBLβ21の構築過程を示
す。 第８図はプラスミドpBLβ19、pBLβ20、pBLβ22、pBLβ
23、pBLβ24及びpBL25の構築過程を示す。 第９図（Ａ），（Ｂ），（Ｃ）および（Ｄ）の夫々は、
プラスミドpBLβ22、pBLβ23、pBLβ24及びpBLβ25の制
限酵素地図を示す。 第10図は、プラスミドpTLC150の構築過程とその制限酵
素地図を示す。 第11図は、プラスミドpTLC156の構築過程とその制限酵
素地図を示す。
フロントページの続き (56)参考文献 特開 平１−171487（ＪＰ，Ａ) Ｇｅｎｅ，27（1984）ｐ．55−65 Ｎａｃ．Ａｃｉ．Ｒｅｓ．９［24 ］（1981）ｐ．6647−6668 Ｊ．Ｎｏｌ．Ｂｉｏｌ．156［２ ］（1982）ｐ．245−256 Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．159［３ ］（1984）ｐ．905−912 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) Ｇｅｎｂａｎｋ／ＥＭＢＬ／ＤＤＢＪ／Ｇ ｅｎｅｓｅｑ ＪＩＳＣＴファイル（ＪＯＩＳ)
Claims (4)
- 【請求項１】乳酸桿菌由来のトリプトファン合成系遺伝
子を含むDNAであって、下記の塩基配列： における ｉ）506〜1531位（trpD）の塩基配列を有するDNA、また
はこのDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダイ
ズし、且つ機能的な乳酸桿菌由来のtrpDタンパク質をコ
ードするもの； ii）1528〜2310位（trpC）の塩基配列を有するDNA、ま
たはこのDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、且つ機能的な乳酸桿菌由来のtrpCタンパク質を
コードするもの； iii）2462〜3061位（trpF）の塩基配列を有するDNA、ま
たはこのDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、且つ機能的な乳酸桿菌由来のtrpFタンパク質を
コードするもの； iv）3045〜4265位（trpB）の塩基配列を有するDNA、ま
たはこのDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、且つ機能的な乳酸桿菌由来のtrpBタンパク質を
コードするもの；および ｖ）4252〜5052位（trpA）の塩基配列を有するDNA、ま
たはこのDNAにストリンジェントな条件下でハイブリダ
イズし、且つ機能的な乳酸桿菌由来のtrpAタンパク質を
コードするもの； の少なくとも１つからなるDNA。 - 【請求項２】請求項１に示される塩基配列からなるDN
A。 - 【請求項３】ストレプトコッカス・フィーカリスDS5株
由来のプラスミドpAMβ１−１のエリスロマイシン耐性
遺伝子をコードする領域および複製開始領域と大腸菌由
来のプラスミドとを結合させて得られる大腸菌−乳酸桿
菌シャトルベクターであって、更に請求項１または２記
載のDNAを含有することを特徴とする大腸菌−乳酸桿菌
シャトルベクター。 - 【請求項４】請求項３に記載のシャトルベクターを用い
て形質転換された乳酸桿菌。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21598889A JP3024766B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | トリプトファン生産能を有する乳酸桿菌 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21598889A JP3024766B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | トリプトファン生産能を有する乳酸桿菌 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0380084A JPH0380084A (ja) | 1991-04-04 |
| JP3024766B2 true JP3024766B2 (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=16681550
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21598889A Expired - Fee Related JP3024766B2 (ja) | 1989-08-24 | 1989-08-24 | トリプトファン生産能を有する乳酸桿菌 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3024766B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP7135411B2 (ja) * | 2018-05-02 | 2022-09-13 | 村田機械株式会社 | 搬送システム |
-
1989
- 1989-08-24 JP JP21598889A patent/JP3024766B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Ｇｅｎｅ，２７（１９８４）ｐ．５５−６５ |
| Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１５９［３］（１９８４）ｐ．９０５−９１２ |
| Ｊ．Ｎｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５６［２］（１９８２）ｐ．２４５−２５６ |
| Ｎａｃ．Ａｃｉ．Ｒｅｓ．９［２４］（１９８１）ｐ．６６４７−６６６８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0380084A (ja) | 1991-04-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3485916B2 (ja) | 組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用 | |
| Alley et al. | Genetic analysis of a temporally transcribed chemotaxis gene cluster in Caulobacter crescentus. | |
| Cornet et al. | Characterization of two cel (cellulose degradation) genes of Clostridium thermocellum coding for endoglucanases | |
| US5922583A (en) | Methods for production of recombinant plasmids | |
| GB2147902A (en) | Microbially produced bgh and its use | |
| JPS6371185A (ja) | ヒト・インターロイキン−１αの合成遺伝子 | |
| PT97081B (pt) | Processo para a preparacao de vectores bacterianos | |
| EP0293391A1 (en) | Cloned streptococcal genes encoding protein g and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein g | |
| KR910001807B1 (ko) | 스태필로키나아제를 생산하는 유전자를 함유하는 새로운 대장균 및 스태필로키나아제의 제조법 | |
| JP3024766B2 (ja) | トリプトファン生産能を有する乳酸桿菌 | |
| US6830901B1 (en) | Propionibacteruim vector | |
| KR100457879B1 (ko) | 비피도박테리움 유래 신규 플라스미드, 이를 이용한 재조합 발현 벡터 및 형질전환 방법 | |
| CN110055202A (zh) | 用于高表达外源蛋白的大肠杆菌及其构建方法与应用 | |
| US7026162B2 (en) | Lac shuttle vectors | |
| KR100434108B1 (ko) | L-트립토판의유전공학적제조방법 | |
| JP3302053B2 (ja) | オキセタノシン−ａの産生に関与する遺伝子及びそれを含む組換ｄｎａ | |
| JP3089287B2 (ja) | う蝕ワクチンの製造法 | |
| KR20040072545A (ko) | 비피도박테리움 롱검 ｍｇ1 유래 신규 플라스미드를함유하는 셔틀벡터 | |
| US20030224009A1 (en) | Bacterial expression systems | |
| EP0972835A1 (en) | Propionibacterium vector | |
| JPH02109984A (ja) | 複合プラスミド及びそれを含有する微生物 | |
| JPH02312590A (ja) | プラスミドｐＴＹ１ | |
| JPH0284188A (ja) | シャトルベクターＹＣＵｐ４及び菌体内にＹＣＵｐ４を保持する微生物菌株 | |
| JPH03277289A (ja) | ハイブリッドプロモーター・オペレーター | |
| JPH02261383A (ja) | β―ガラクトシダーゼ産生遺伝子を含むＤＮＡ断片 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |