JP3022983B2 - 新規エステラーゼ、生産菌及び利用 - Google Patents
新規エステラーゼ、生産菌及び利用Info
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- JP3022983B2 JP3022983B2 JP23897490A JP23897490A JP3022983B2 JP 3022983 B2 JP3022983 B2 JP 3022983B2 JP 23897490 A JP23897490 A JP 23897490A JP 23897490 A JP23897490 A JP 23897490A JP 3022983 B2 JP3022983 B2 JP 3022983B2
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- Japan
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- esterase
- bread
- flour
- tween80
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- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、新規エステラーゼ、生産菌及びその利用に
関するものである。
関するものである。
更に詳細には、本発明は、パンの老化を防止する作用
を有する新規エステラーゼとその生産菌及びこれらを用
いたパンもしくは菓子パンに関するものである。
を有する新規エステラーゼとその生産菌及びこれらを用
いたパンもしくは菓子パンに関するものである。
本発明の新規エステラーゼ、その生産菌もしくはその
培養物を、パンもしくは菓子パンの製造に際して用いれ
ば、製造されたパンもしくは菓子パンはかなり老化がお
くれ、食パンであれば３日〜２週間固くなるのが防止さ
れるのである。
培養物を、パンもしくは菓子パンの製造に際して用いれ
ば、製造されたパンもしくは菓子パンはかなり老化がお
くれ、食パンであれば３日〜２週間固くなるのが防止さ
れるのである。
従って、本発明はパン業界や菓子パン業界に大いに貢
献するものである （従来技術及び問題点） 一般的に、パンもしくは菓子類等は老化しやすい食品
の一つである。しかしながら、近年のパンもしくは菓子
の消費者指向としては、いつまでも柔らかくて新鮮な要
素が求められている。この老化抑制に対し、いままでモ
ノグリセライド等の食品添加物で対応していたが、最近
の天然物志向に合致していないという問題点がある。
献するものである （従来技術及び問題点） 一般的に、パンもしくは菓子類等は老化しやすい食品
の一つである。しかしながら、近年のパンもしくは菓子
の消費者指向としては、いつまでも柔らかくて新鮮な要
素が求められている。この老化抑制に対し、いままでモ
ノグリセライド等の食品添加物で対応していたが、最近
の天然物志向に合致していないという問題点がある。
一方、伝統的な製パン法において、パン種として使わ
れているサンフランシスコサワーやパネトーネサワーを
用いれば、常法でも長時間柔らかなパンができることは
知られており、それらサワードウ中の乳酸菌がその効果
に関与しているといわれている。このことは最近の研究
で明かにされている。
れているサンフランシスコサワーやパネトーネサワーを
用いれば、常法でも長時間柔らかなパンができることは
知られており、それらサワードウ中の乳酸菌がその効果
に関与しているといわれている。このことは最近の研究
で明かにされている。
しかしながら、サンフランシスコサワーやパネトーネ
サワーのパン種菌の系統的管理は難しく、また原料や製
パン工程の管理、例えば温度、醗酵時間により大きく影
響をうけ、長時間柔らかなパン、そして品質の安定した
パンが得られにくいという欠点があった。
サワーのパン種菌の系統的管理は難しく、また原料や製
パン工程の管理、例えば温度、醗酵時間により大きく影
響をうけ、長時間柔らかなパン、そして品質の安定した
パンが得られにくいという欠点があった。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、パンを長時間柔らかく保つ技術を、サ
ンフランシスコやパネトーネなどの地域に限定されるこ
となく、どこでも利用できるように鋭意研究したとこ
ろ、本発明においてパンを長時間柔らかく保つことので
きる酵素を明らかにし、パンを長時間柔らかく保つパン
製造技術を確立することに成功したのである。
ンフランシスコやパネトーネなどの地域に限定されるこ
となく、どこでも利用できるように鋭意研究したとこ
ろ、本発明においてパンを長時間柔らかく保つことので
きる酵素を明らかにし、パンを長時間柔らかく保つパン
製造技術を確立することに成功したのである。
即ち、本発明は下記の理化学的性質を有する新規エス
テラーゼに関する。
テラーゼに関する。
1. 小麦粉のphospholipids、Tween80及び１−monooleo
yl−rac−glycerolに作用する。
yl−rac−glycerolに作用する。
2. 小麦粉のphospholipids、Tween80及び１−monooleo
yl−rac−glycerolに作用し、triolein、１−３−diole
in及び小麦粉のnonpolar lipidsに作用しない基質特異
性を有する。
yl−rac−glycerolに作用し、triolein、１−３−diole
in及び小麦粉のnonpolar lipidsに作用しない基質特異
性を有する。
3. pH5〜８の至適pHを有する。
4. 30〜45℃の至適温度を有する。
本発明の新規エステラーゼはエステラーゼTNと命名さ
れているが、この酵素をパン生地調製時に使用すれば、
この酵素が脂質に作用して生成した分解物がパンの長時
間にわたる柔軟性保持に役立つものと考えられるに至っ
ている。
れているが、この酵素をパン生地調製時に使用すれば、
この酵素が脂質に作用して生成した分解物がパンの長時
間にわたる柔軟性保持に役立つものと考えられるに至っ
ている。
本発明のエステラーゼTNの理化学的性質の詳細は次の
通りである。
通りである。
1. 小麦粉のphospholipids、Tween80及び１−monooleo
yl−rac−glycerolに作用する。
yl−rac−glycerolに作用する。
2. 小麦粉のphospholipids、Tween80及び１−monooleo
yl−rac−glycerolに作用し、triolein、１−３−diole
in及び小麦粉のnonpolar lipidsに作用しない基質特異
性を有する。
yl−rac−glycerolに作用し、triolein、１−３−diole
in及び小麦粉のnonpolar lipidsに作用しない基質特異
性を有する。
種々の基質に対するエステラーゼ活性の比較は次の表
１に示される。
１に示される。
3. pH5〜８の至適pHを有する。
エステラーゼ活性に及ぼすpHの影響は、広域バッファ
ーであるBrittonとRobinsonのバッファーを用いて4.0か
ら10.0までの間で測定した。基質には各pHのバッファー
に溶解した0.1mg/mlのBSAを含む1.5％Tween80を使用
し、37℃で30分間反応させた。
ーであるBrittonとRobinsonのバッファーを用いて4.0か
ら10.0までの間で測定した。基質には各pHのバッファー
に溶解した0.1mg/mlのBSAを含む1.5％Tween80を使用
し、37℃で30分間反応させた。
その結果は第１図に示す通りである。
4. 30〜45℃の至適温度を有する。
20℃から55℃の間で酵素活性を測定した。その他の条
件は至適pHの測定と同じように行なった。
件は至適pHの測定と同じように行なった。
その結果は第２図に示す通りである。
5. エステラーゼTNの製造 ラクトバチルス クルバタス（Lactobacillus curvat
us）TN−8 NRIC 1716（FERM P−11682）をGYP培地（500
ppmのTween80と１％の酢酸ソーダを含む）で30℃、24時
間培養した。
us）TN−8 NRIC 1716（FERM P−11682）をGYP培地（500
ppmのTween80と１％の酢酸ソーダを含む）で30℃、24時
間培養した。
培養液を6000rpmで15分遠心分離し、菌体を得、これ
を2mM CaCl2を含むpH7.0の5mM β−glycerophosphate
bufferで２回洗浄し、6000rpmで15分間遠心分離し、得
られた菌体をpH7.8の50mM Tris−HCl bufferの200ml中
に懸濁させ、30℃で２時間インキュベートし、1800rpm
で30分遠心分離し、沈澱物を除去し、エステラーゼTN抽
出液を得た。
を2mM CaCl2を含むpH7.0の5mM β−glycerophosphate
bufferで２回洗浄し、6000rpmで15分間遠心分離し、得
られた菌体をpH7.8の50mM Tris−HCl bufferの200ml中
に懸濁させ、30℃で２時間インキュベートし、1800rpm
で30分遠心分離し、沈澱物を除去し、エステラーゼTN抽
出液を得た。
6. 酵素活性の測定 菌体懸濁液と精製酵素:0.1mg/mlのBSAを含む1.5％のT
ween80（50mMリン酸バッファー、pH7.0）溶液を基質と
して37℃で30分間反応させた。懸濁液の場合は反応液を
遠心分離（15000rpm×3min.）し、上清液のオレイン酸
量を遊離脂肪酸測定キット（和光純薬）で測定した（10
％懸濁液50μ−基質2ml）。CWEと分画チューブ:0.2mg
/mlのBSAを含む3.0％のTween80溶液を基質として37℃で
４時間反応後、同様に測定した（試料1ml−基質1ml）。
ween80（50mMリン酸バッファー、pH7.0）溶液を基質と
して37℃で30分間反応させた。懸濁液の場合は反応液を
遠心分離（15000rpm×3min.）し、上清液のオレイン酸
量を遊離脂肪酸測定キット（和光純薬）で測定した（10
％懸濁液50μ−基質2ml）。CWEと分画チューブ:0.2mg
/mlのBSAを含む3.0％のTween80溶液を基質として37℃で
４時間反応後、同様に測定した（試料1ml−基質1ml）。
L.curvatus TN−８株のインタクトセルによるTween80
の分解曲線は第３図に示される。
の分解曲線は第３図に示される。
本酵素ではTween80を分解し、１分間に１μmolのオレ
イン酸を生成する酵素量を１単位とした。
イン酸を生成する酵素量を１単位とした。
7. 酵素の精製 イオン交換クロマトグラフィー:pH7.8の50mMトリス塩
酸バッファーで平衡化したDEAE−Sephacelカラム（2.5
×20cm）にCWEを2ml/minの流速でアプライした。CWEを
アプライ後、トリス塩酸バッファーで洗浄した。非吸着
の吸光度が低下したのちに2ml/minの流速で6mlずつ分画
し０から0.3MNaCl（50mMのトリス塩酸バッファー、pH7.
8）のリニアーグラジェント（500ml）で溶出した、酵素
活性の画分は集めた後、0.6Mの硫安濃度に調製した。ピ
ークは280nmの吸光度で検出した。
酸バッファーで平衡化したDEAE−Sephacelカラム（2.5
×20cm）にCWEを2ml/minの流速でアプライした。CWEを
アプライ後、トリス塩酸バッファーで洗浄した。非吸着
の吸光度が低下したのちに2ml/minの流速で6mlずつ分画
し０から0.3MNaCl（50mMのトリス塩酸バッファー、pH7.
8）のリニアーグラジェント（500ml）で溶出した、酵素
活性の画分は集めた後、0.6Mの硫安濃度に調製した。ピ
ークは280nmの吸光度で検出した。
DEAE−SephacelによるCWEのイオン交換クロマトグラ
フィーは第４図に示される。
フィーは第４図に示される。
疎水クロマトグラフィー:0.5Mの硫安（50mMトリス塩
酸バッファー、pH7.8）で平衡化したブチルトヨパール6
50Mのカラム（1.5×15cm）に0.5M硫安濃度のイオン交換
クロマトグラフィー活性画分を1ml/minの流速でアプラ
イした。280nmの吸光度が0.05以下になるまで0.5Mの硫
安で洗浄したのち、0.5Mから0M硫安のリニアーグラジェ
ント（400ml）で溶出した。
酸バッファー、pH7.8）で平衡化したブチルトヨパール6
50Mのカラム（1.5×15cm）に0.5M硫安濃度のイオン交換
クロマトグラフィー活性画分を1ml/minの流速でアプラ
イした。280nmの吸光度が0.05以下になるまで0.5Mの硫
安で洗浄したのち、0.5Mから0M硫安のリニアーグラジェ
ント（400ml）で溶出した。
ブチルトヨパールを用いた疎水クロマトグラフィーに
よるエステラーゼTNの精製は第５図に示される。
よるエステラーゼTNの精製は第５図に示される。
8. 分子量 SDS−PAGE:疎水クロマトグラフィーより得られた活性
画分をpH7.0の50mMリン酸バッファーと遠心限外濾過チ
ューブ（ザルトリウス社製）で脱塩、濃縮したものを泳
動用試料とした。7.5％ポリアクリルアミドゲルのミニ
スラブ電気泳動装置（アトー社製）を使用し、Laemmli
の方法（５）に準拠して行なった。分子量マーカーはベ
ーリンガー社製を用いた。タンパクはクマシーブリリア
ントブルーG250で染色した。
画分をpH7.0の50mMリン酸バッファーと遠心限外濾過チ
ューブ（ザルトリウス社製）で脱塩、濃縮したものを泳
動用試料とした。7.5％ポリアクリルアミドゲルのミニ
スラブ電気泳動装置（アトー社製）を使用し、Laemmli
の方法（５）に準拠して行なった。分子量マーカーはベ
ーリンガー社製を用いた。タンパクはクマシーブリリア
ントブルーG250で染色した。
精製されたエステラーゼTNのSDS−PAGEは第６図に示
される。
される。
エステラーゼTNの分子量は8400であった。
本発明は、ラクトバチルス属に属し、請求項第１項の
エステラーゼTNを生産する菌を包含している。
エステラーゼTNを生産する菌を包含している。
エステラーゼTN生産菌の具体例としては、サワー種か
ら分離されたラクトバチルス クルバタス（Lactobacil
lus curvatus）TN−8 NRIC 1716（FERM P−11682）があ
げられる。
ら分離されたラクトバチルス クルバタス（Lactobacil
lus curvatus）TN−8 NRIC 1716（FERM P−11682）があ
げられる。
ラクトバチルス クルバタスTN−８の菌学的性質は次
の通りである。 性 質 形態 rods グラム染色 ＋ カタラーゼ − 15℃の生育 ＋ 45℃の生育 − 最適pH 6.0〜7.5 発酵のタイプ homo 乳酸の光学形態 DL 糖の発酵性 Ｌ−arabinose − Ｄ−ribose − Ｄ−xylose − glucose ＋ fructose ＋ galactose ＋ mannose ＋ rhamnose − maltose ＋ cellobiose − lactose ＋ melibiose − sucrose − trehalose ＋ salicin ＋ raffinose − sorbitol − mannitol − gluconate − starch − melezitose − ビタミンと塩基の要求性 thiamine − riboflavin ＋ biotin − niacin ＋ PABA − Ca−pantothenate ＋ folic acid ＋ pyridoxal − pyridoxine − adenine − guanine − uracil − xanthine − ラクトバチルス クルバタスTN−８はGYP培地（500pp
mのTween80と１％の酢酸ソーダを含む）で30℃、24時間
程度培養することによって単一菌の培養物を得ることが
できる。
の通りである。 性 質 形態 rods グラム染色 ＋ カタラーゼ − 15℃の生育 ＋ 45℃の生育 − 最適pH 6.0〜7.5 発酵のタイプ homo 乳酸の光学形態 DL 糖の発酵性 Ｌ−arabinose − Ｄ−ribose − Ｄ−xylose − glucose ＋ fructose ＋ galactose ＋ mannose ＋ rhamnose − maltose ＋ cellobiose − lactose ＋ melibiose − sucrose − trehalose ＋ salicin ＋ raffinose − sorbitol − mannitol − gluconate − starch − melezitose − ビタミンと塩基の要求性 thiamine − riboflavin ＋ biotin − niacin ＋ PABA − Ca−pantothenate ＋ folic acid ＋ pyridoxal − pyridoxine − adenine − guanine − uracil − xanthine − ラクトバチルス クルバタスTN−８はGYP培地（500pp
mのTween80と１％の酢酸ソーダを含む）で30℃、24時間
程度培養することによって単一菌の培養物を得ることが
できる。
GYP培地組成は次の通りである。
glucose 20g yeast extract 10g peptone 10g Na−acetate・3H2O 10g MgSO4・7H2O 200mg MgSO4・4H2O 10mg FeSO4・7H2O 10mg NaCl 10mg water 1000ml pH6.5 本発明においては、エステラーゼTN、エステラーゼTN
生産菌もしくはその培養物を用いてパンもしくは菓子パ
ンを製造し、長時間柔軟性を保持するパンもしくは菓子
パンを得ることができるものである。
生産菌もしくはその培養物を用いてパンもしくは菓子パ
ンを製造し、長時間柔軟性を保持するパンもしくは菓子
パンを得ることができるものである。
エステラーゼTN、エステラーゼTN生産菌もしくはその
培養物を用いて中種を製造し、得られた中種を各種原料
と混合して生地を製造し、得られた生地を発酵し、焼成
することによってパンもしくは菓子パンを製造すること
ができる。
培養物を用いて中種を製造し、得られた中種を各種原料
と混合して生地を製造し、得られた生地を発酵し、焼成
することによってパンもしくは菓子パンを製造すること
ができる。
次に本発明の実施例を示す。
実施例１ ラクトバチルス クルバタス（Lactobacillus curvat
us）TN−8 NRIC 1716（FERM P−11682）をGYP培地（500
ppmのTween80と１％の酢酸ソーダを含む）で30℃、24時
間培養した。
us）TN−8 NRIC 1716（FERM P−11682）をGYP培地（500
ppmのTween80と１％の酢酸ソーダを含む）で30℃、24時
間培養した。
培養液を6000rpmで15分遠心分離し、ラクトバチルス
クルバタスTN−８の培養物を得た。
クルバタスTN−８の培養物を得た。
実施例２ 大豆レシチン10gとサラダ油10gを混合、加熱溶解し、
水80gを加えてホモミキサーで混合し、乳化液とした。
水80gを加えてホモミキサーで混合し、乳化液とした。
この乳化液100mlに実施例１で得た培養物の10％懸濁
液10mlに添加し、30℃で３日間攪拌インキュベートし、
インキュベート処理物を得た。
液10mlに添加し、30℃で３日間攪拌インキュベートし、
インキュベート処理物を得た。
このインキュベート処理物は、そのまま生菌体を含ん
でいてもよく、また、殺菌してもいずれでもパンもしく
は菓子パンの製造に使用することができる。
でいてもよく、また、殺菌してもいずれでもパンもしく
は菓子パンの製造に使用することができる。
実施例３ 実施例２で得たインキュベート処理物（生菌体含有）
5g、小麦粉100g、水38.5g、フード0.1g、パン酵母2gを
よく混合し、28℃で４時間置き、中種とした。
5g、小麦粉100g、水38.5g、フード0.1g、パン酵母2gを
よく混合し、28℃で４時間置き、中種とした。
この中種にショートニング4g、食塩2g、砂糖4g、小麦
粉70g、水65gを加え、よく混合し、ドウとした。
粉70g、水65gを加え、よく混合し、ドウとした。
このドウはフロアタイム15分とり、分割し、ベンチタ
イム17分とり、成型し、ケースに入れて、ホイロで37℃
で55分置き、次いで220℃で40分焼成し、食パン得た。
イム17分とり、成型し、ケースに入れて、ホイロで37℃
で55分置き、次いで220℃で40分焼成し、食パン得た。
通常食パンは冷蔵庫に入れても２〜３日で固くなるが
この食パンは５日間は柔軟性を保持していた。
この食パンは５日間は柔軟性を保持していた。
第１図はエステラーゼTNの至適pHを示す図で、第２図は
その至適温度を示す図で、第３図はインタクトセルによ
るTween80の分解を示す図で、第４図はDEAE−Sephacel
によるCWEのイオン交換クロマトグラフィーを示す図
で、第５図はブチルトヨパールを用いた疎水クロマトグ
ラフィーによるエステラーゼTNの精製を示す図で、第６
図は精製されたエステラーゼTNのSDS−PAGEを示す図で
ある。
その至適温度を示す図で、第３図はインタクトセルによ
るTween80の分解を示す図で、第４図はDEAE−Sephacel
によるCWEのイオン交換クロマトグラフィーを示す図
で、第５図はブチルトヨパールを用いた疎水クロマトグ
ラフィーによるエステラーゼTNの精製を示す図で、第６
図は精製されたエステラーゼTNのSDS−PAGEを示す図で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 豊田 建吾 東京都北区堀船１―29―６ (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 9/00 - 9/99 A21D 2/00 - 17/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (4)
- 【請求項１】下記の理化学的性質を有するエステラーゼ
TN。 1. 小麦粉のphospholipids、Tween80及び１−monooleo
yl−rac−glycerolに作用する。 2. 小麦粉のphospholipids、Tween80及び１−monooleo
yl−rac−glycerolに作用し、triolein、１−３−diole
in及び小麦粉のnonpolar lipidsに作用しない基質特異
性を有する。 3. pH5〜８の至適pHを有する。 4. 30〜45℃の至適温度を有する。 - 【請求項２】ラクトバチルス属に属する請求項第１項の
エステラーゼTN生産菌を培養し、培養物からエステラー
ゼTNもしくはその含有物を分離することを特徴とするす
る請求項第１項のエステラーゼTNの製造法。 - 【請求項３】請求項第１項のエステラーゼTN、もしくは
その含有物を用いて製造したパンもしくは菓子パン。 - 【請求項４】請求項第１項のエステラーゼTN、もしくは
その含有物を用いて中種を製造し、得られた中種を各種
原料と混合して生地を製造し、得られた生地を発酵し、
焼成することを特徴とするパンもしくは菓子パンの製造
法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23897490A JP3022983B2 (ja) | 1990-09-11 | 1990-09-11 | 新規エステラーゼ、生産菌及び利用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23897490A JP3022983B2 (ja) | 1990-09-11 | 1990-09-11 | 新規エステラーゼ、生産菌及び利用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH04121186A JPH04121186A (ja) | 1992-04-22 |
| JP3022983B2 true JP3022983B2 (ja) | 2000-03-21 |
Family
ID=17038063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23897490A Expired - Fee Related JP3022983B2 (ja) | 1990-09-11 | 1990-09-11 | 新規エステラーゼ、生産菌及び利用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3022983B2 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3202890A4 (en) * | 2015-05-22 | 2018-02-28 | SPC Co., Ltd. | Novel indigenous natural lactobacillus for baking bread isolated from traditional korean malt |
-
1990
- 1990-09-11 JP JP23897490A patent/JP3022983B2/ja not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP3202890A4 (en) * | 2015-05-22 | 2018-02-28 | SPC Co., Ltd. | Novel indigenous natural lactobacillus for baking bread isolated from traditional korean malt |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH04121186A (ja) | 1992-04-22 |
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