JP3008208B2

JP3008208B2 - 新規ハイブリドーマ，その製造法および生理活性物質の製造法

Info

Publication number: JP3008208B2
Application number: JP2145180A
Authority: JP
Inventors: 秀和澤田; 圭司岩本; 一昭北野
Original assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Takeda Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1990-06-01
Filing date: 1990-06-01
Publication date: 2000-02-14
Anticipated expiration: 2015-02-14
Also published as: CA2043535A1; EP0459372A2; US5213980A; EP0459372A3; JPH0440892A

Description

【発明の詳細な説明】産業上の利用分野本発明は、リンパ球を片方の親細胞とするハイブリド
ーマにFGF蛋白質遺伝子を導入することによってハイブ
リドーマを育種・改良する方法に係わる。更に詳しく
は、FGF蛋白質遺伝子をハイブリドーマに導入し、培養
物中（細胞内もしくは培地中）に発現させたFGF蛋白質
によりハイブリドーマの増殖能力を向上させることによ
って、無血清培地中でのハイブリドーマのクローニング
や培養を容易ならしめ、またハイブリドーマから目的生
産物を安定的かつ効率的に製造する技術に関する。

従来の技術リンパ球系細胞株を培養することは、インターフェロ
ン、インターロイキンなどのリンフォカイン類やモノク
ローナル抗体（以下、MoAbと略記することがある）など
の有用生理活性物質の生産を行う上で重要である。リン
パ球系細胞株の培養には、他の細胞の場合と同様、血清
を10％程度添加した培地が主として用いられ、とりわけ
牛胎児血清（FCS）含有培地が常用されてきた。無血清
培地も種々考案されているが、血清含有培地に比べて一
般に細胞増殖性が悪く、そのために細胞継代時の播種密
度を高くする必要がある。

一方、無血清培地での増殖を改良する目的で、細胞を
無血清培地に馴化させたり、あるいは突然変異を誘発す
る方法により、増殖能の向上した細胞株の取得が試みら
れている。しかし、遺伝子組み換え技術を用いて、合目
的的にハイブリドーマなどのリンパ球系細胞株の増殖能
を改良した例は全く知られていない。

近年、細胞増殖因子に関する研究が進み、各種の因子
が単離され、またその遺伝子も明らかにされている。該
因子の一つである線維芽細胞成長因子（FGF）は、Gospo
darowiczによりウシの下垂体から見出された細胞成長因
子（ネーチャー,249巻 123頁 1974年）で、等電点が
塩基性のbasic FGF（bFGF）と酸性のacidic FGF（aFG
F）があり、共に全アミノ酸配列が明らかにされてい
る。このFGFは線維芽細胞（ジャーナル・オブ・セル・
バイオロジー,66巻 451頁 1975年）をはじめ、副腎細
胞Y1（エンドクリノロジー,97巻 120頁 1975年）、筋
原細胞（ジャーナル・オブ・セル・バイオロジー,70巻
395頁 1976年）、軟骨細胞（ジャーナル・オブ・セ
ルラー・フィジオロジー,91巻 977頁 1977年）、血管
内皮細胞（プロシーディング・オブ・ナショナル・アカ
デミー・オブ・サイエンス USA,73巻 4120頁 1976
年）など中胚葉由来のほとんどの細胞に対して増殖促進
作用を示す細胞成長因子である。しかし、FGFは上皮細
胞に対して一般に増殖促進作用を示さないことが知られ
ている（細胞成長因子，日本組織培養学会編朝倉書
店,32頁 1984年）。また、FGFを添加した培地でハイブ
リドーマなどのリンパ球系細胞を培養するとリンパ球系
細胞から生理活性物質が効率よく生産できることが本発
明者らによって見い出されている（特願平２−56203号
明細書参照）が、FGF単独によるリンパ球系細胞に対す
る増殖促進作用はこれまでに全く報告されていない。

一方、FGFの遺伝子に関しては、aFGF、bFGFとも既に
その塩基配列が決定されており、両FGFともに最初155個
のアミノ酸を持つペプチドとして合成されること、また
その配列中に分泌のためのシグナルペプチドの配列が認
められないことが分かっている（J.A.Abrahamら、サイ
エンス，233,545−548（1986）;M.Jayeら、サイエン
ス，233,541−545（1986））。

発明が解決しようとする課題動物細胞を培養し有用物質を生産する場合、血清培地
の使用には種々の問題点が指摘されている。すなわち血
清にロット間変動がある、マイコプラズマやウイルスに
よる汚染の危険性がある、精製過程が繁雑となり、生産
物品質への悪影響が懸念される等である。したがって無
血清培地を用いるのが有利であるが、一般に細胞の増殖
性が悪く、そのために有用物質の生産性も劣る場合が多
い。細胞増殖の悪い条件下では、高い播種密度で細胞を
移植する必要がある（例えば、ヒト型モノクローナル抗
体を産生するヒト−ヒトハイブリドーマの無血清培養で
は、約１×10⁵細胞/mの播種密度とすることが必要で
ある）ため、工業的規模の大量培養では細胞の継代回数
が多くなる煩雑さがあり、雑菌汚染の危険性も高くな
る。また無血清培地を用いて制限希釈培養法により細胞
をクローニングする技術は未だ確立されていない。

本発明者らは、無血清培地中でも高い増殖能を示す変
異細胞株が得られれば、このような問題点が解決できる
と考え、変異等の従来法による細胞の改良を種々試みた
が、良好な成果を得るには至らなかった。また、たとえ
目的とする変異細胞株が取れたとしても、時間もかか
り、また確実な方法とは言いがたい。

近年、動物細胞を宿主とする発現ベクターが種々開発
されているが、本発明は遺伝子操作技術を用いてハイブ
リドーマの増殖性を改良することにより、上述のような
課題を解決しようとして行われたものである。

課題を解決するための手段本発明者らは、無血清培地を用いるハイブリドーマの
単個細胞あるいは低播種密度からの細胞培養方法を確立
すべく鋭意努力を重ねてきた結果、FGF遺伝子を細胞に
導入することによって細胞の増殖能が著しく向上するこ
とを見い出し、これに基づいて更に研究を重ね、本発明
を完成するに至った。

すなわち本発明は、（１）線維芽細胞成長因子（FG
F）蛋白質遺伝子発現ベクターを保持するハイブリドー
マ、（２）FGF蛋白質遺伝子発現ベクターによりハイブ
リドーマを形質転換することを特徴とする上記（１）項
のハイブリドーマの製造法、および（３）FGF蛋白質以
外の生理活性物質を生産するハイブリドーマを用いて上
記（２）項の製造法により得られるハイブリドーマを培
地中で培養し、培養物中にFGF蛋白質を生成させるとと
もに該生理活性物質を生成・蓄積させ、該生理活性物質
を採取することを特徴とする生理活性物質の製造法であ
る。

本発明におけるFGF蛋白質としては、FGF活性を有する
ポリペプチドもしくは蛋白質であればいずれでもよく、
また該FGF蛋白質は等電点が塩基性のbFGF蛋白質あるい
は等電点が酸性のaFGF蛋白質のいずれであってもよい。

さらにFGF蛋白質は、組換えDNA技術により得られるこ
とが知られているFGF（PCT国際公開No.WO/87/01728号公
報；フエブス・レターズ，第213巻 189頁 1987年；ヨ
ーロッパ特許出願公開第237,966号公報（特開昭63−226
287号公報））あるいはFGFムテイン（ヨーロツパ特許出
願公開第281,822号公報（特開平２−193号公報）；バイ
オケミカル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ・コ
ミュニケーションズ，第151巻第701頁 1988年；ヨー
ロッパ特許出願公開第326,907号公報）などであっても
よい。

上記FGFムテインは、本来、元のペプチドあるいは蛋
白質のアミノ酸配列が変異したものであり、したがって
該変異としては、アミノ酸の付加，構成アミノ酸の欠
損，他のアミノ酸への置換が挙げられる。

該アミノ酸の付加としては、少なくとも１個のアミノ
酸が付加しているものが挙げられる。

該構成アミノ酸の欠損としては、少なくとも１個のFG
F構成アミノ酸が欠損しているものが挙げられる。

該他のアミノ酸への置換としては、少なくとも１個の
FGF構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているもの
が挙げられる。

FGFに少なくとも１個のアミノ酸が付加しているムテ
インにおける少なくとも１個のアミノ酸としては、ペプ
チドを発現する際に用いられる開始コドンに基因するメ
チオニンや、シグナルペプチドは含まれないものであ
る。

付加されているアミノ酸の数としては、少なくとも１
個であるが、FGFの特徴を失わない限り何個でもよい。
さらに好ましくは、FGFと相同性（ホモロジー）が認め
られており、同様の活性を示すタンパクのアミノ酸配列
の一部あるいはすべてが挙げられる。

FGFの少なくとも１個のFGF構成アミノ酸が欠損してい
るムテインにおける欠損している構成アミノ酸の数とし
ては、FGFの有する特徴を失わない限り何個でもよい。

該欠損している構成アミノ酸の例としては、ヒトbFGF
のアミノ末端側10残基：ヒトbFGFのアミノ末端側14残基：ヒトbFGFのアミノ末端側41残基：ヒトbFGFのカルボキシル末端側61残基：などが挙げられる。さらに、FGFムテインとして、bFGF
の元のペプチドあるいは蛋白質のカルボキシル末端側の
７個〜46個の構成アミノ酸が欠損したものが挙げられ
る。

FGFの少なくとも１個のFGF構成アミノ酸が別のアミノ
酸で置換されているFGFムテインにおける置換される前
の少なくとも１個のFGF構成アミノ酸の数としては、FGF
の特徴を失わない限り何個でもよい。

置換される前の構成アミノ酸の例としては、システイ
ン，シスチンなどが挙げられるが、システインが特に好
ましい。置換される前の構成アミノ酸としてシステイン
以外のものとしては、アスパラギン酸，アルギニン，グ
リシン，セリン，バリンなどが挙げられる。

置換される前の構成アミノ酸がシステインである場合
には、置換されたアミノ酸としては、たとえば中性アミ
ノ酸が好ましい。該中性アミノ酸の具体例としては、た
とえば、グリシン，バリン，アラニン，ロイシン，イソ
ロイシン，チロシン，フェニルアラニン，ヒスチジン，
トリプトファン，セリン，スレオニン，メチオニンなど
が挙げられる。特に、セリン，スレオニンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がシステイン以外のもの
である場合には、置換された別のアミノ酸としては、た
とえば、アミノ酸の親水性，疎水性あるいは電荷の点
で、置換される前のアミノ酸とは異なる性質をもつもの
を選ぶ。具体的には置換される前のアミノ酸がアスパラ
ギン酸の場合には、置換されたあとのアミノとしてアス
パラギン，スレオニン，バリン，フェニルアラニン，ア
ルギニンなどが挙げられるが、特にアスパラギン，アル
ギニンが好ましい。

置換される前のアミノ酸がアルギニンの場合には置換
されたあとのアミノ酸としてグルタミン，スレオニン，
ロイシン，フェニルアラニン，アスパラギン酸が挙げら
れるが、特にグルタミンが好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がグリシンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、スレオニン，
ロイシン，フェニルアラニン，セリン，グルタミン酸，
アルギニンなどが挙げられ、特にスレオニンが好まし
い。

置換される前の構成アミノ酸がセリンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、メチオニン，
アラニン，ロイシン，システイン，グルタミン，アルギ
ニン，アスパラギン酸などが挙げられ、特にメチオニン
が好ましい。

置換される前の構成アミノ酸がバリンである場合に
は、置換されたあとのアミノ酸としては、セリン，ロイ
シン，プロリン，グリシン，リジン，アスパラギン酸な
どが挙げられ、特にセリンが好ましい。

置換されたあとのアミノ酸としては、アスパラギン，
グルタミン，アルギニン，スレオニン，メチオニン，セ
リン，ロイシンが好ましい。

置換されたムテインの最も好ましいものとしては、構
成アミノ酸であるシステインがセリンに置換されたもの
が挙げられる。

上記の置換においては、２以上の置換を同時に行なっ
てもよい。特に、２または３個の構成アミノ酸が置換さ
れるのが好ましい。

該FGFムテインは、上記した付加，欠損，置換の２つ
または３つが組み合わさったものでもよい。

該FGFムテインとしては、少なくとも１個のヒト塩基
性FGF構成アミノ酸が別のアミノ酸で置換されているム
テインが好ましい。

本発明で用いられるFGF蛋白質遺伝子としては、上記
したFGF蛋白質をコードする遺伝子であればいずれでも
よく、例えばヒト，サル，ウサギ，ラット，ヒツジ，ウ
シ，ニワトリ，イヌ，ブタ，マウスなどの哺乳動物の
脳，網膜，腎，前立腺などの細胞、あるいは各種のFGF
蛋白質産生形質転換細胞から得ることができる。FGF蛋
白質遺伝子の取得は公知の常法により、例えば前述の細
胞からメッセンジャーRAN（mRAN）を抽出し、その相補D
AN（cDNA）を酵素的に作製し、適当なベクターを結合せ
しめて大腸菌のような宿主中で増殖せしめ、FGF蛋白質
遺伝子を組み込んだベクターを有する単一コロニーを選
択するクローニングの手法を用いて取得することができ
る。また、市販の各種cDNAライブラリーを使用すること
もできる。さらに、ウシやヒトのbFGF及びaFGFのアミノ
酸配列やそれらの遺伝子の塩基配列は既に発表されてい
るので（T.Kurokawaら，フェブス・レターズ，213,189
−194（1987）;F.Eschら，バイオケミカル・アンド・バ
イオフィジカル・リサーチ・コミュニケーションズ，13
3,554−562（1985）など）、これらに基づいて適当な塩
基配列を有するオリゴヌクレオチドを公知の常法により
有機合成してプローブとし、上記クローニングにおける
コロニー選択に用いることができる。一方、FGF蛋白質
遺伝子が組み込まれたベクター（プラスミドなど）ある
いは該ベクターを保持する形質転換細胞から、FGF蛋白
質遺伝子を調製することが可能であり、更に公知のaFGF
およびbFGFあるいはそれらのムテインのアミノ酸配列や
それらの遺伝子の塩基配列に基づいて化学合成によって
も調製することが可能である。本発明においては、bFGF
あるいはaFGFをコードする遺伝子のみならずそれらの変
異遺伝子（FGFムテインをコードする遺伝子など）もま
た、FGF蛋白質として発現させた時のFGF活性が著しく低
下しないものであればFGF蛋白質遺伝子として使用する
ことができる。

該FGF蛋白質遺伝子は、構成的にまたは誘導的に発現
可能な状態でハイブリドーマに導入されるが、そのため
には、構成的または誘導的に作動可能なプロモーター、
翻訳開始コドン（ATG）及びFGF蛋白質遺伝子をこの順序
で配列したDNAが適当なベクターに組み込まれているFGF
蛋白質遺伝子発現ベクター（以下、発現ベクターと略記
することがある）を当該ハイブリドーマに導入し形質転
換するのがよい。

該発現ベクターに用いるベクターの例としては、たと
えばpSVL［Mol.Cell.Biol.４,817（1984）］,pCH 110
［J.Mol.App.Gen.101（1983）;Cell.39,653（1985）］,
pKSV−10［Cell.23,175（1981）］,pSV2［Proc.Natl.Ac
ad.Sci.,USA 78,2072（1981）］,pBTV_69T［Methods in
Enzymol.101,387（1983）］,pHEBo［Mol.Cell.Biol.５,
410（1985）］,pZIP−NeoSV［Cell.37,1053（1984）］,
pMAM_neo［Nature.294,228（1981）］などが挙げられる
が、これらに限定されるものではない。

上記翻訳開始コドンの上流に組み込まれるプロモータ
ーは、FGF蛋白質遺伝子の発現に用いるハイブリドーマ
に適切なプロモーターであればいかなるものでもよく、
たとえば、メタロチオネイン遺伝子のプロモーター（ハ
メル,D.H.,アニュアル・レビュー・オブ・バイオケミス
トリー,55巻 93頁 1986年）、あるいはSV（シミアン
ウイルス）40のプロモーター領域［岡山ら，モレキュラ
ーアンドセルラーバイオロジー，第３巻,280〜28
9頁（1983）］や種々のレトロウイルスLTR（Long termi
nal repeat）領域に存在するプロモーターなどが挙げら
れる。

レトロウイルスLTR領域由来のプロモーターとして
は、たとえば下記のものが挙げられる。

エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ−MuLV）
［ゴフ,S.P.ら，セル，第22巻,777〜785頁（1980）］，モノニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−MuLV）［丹羽
ら，セル，第32巻,1105〜1113頁（1983）］，成人Ｔ細胞白血病ウイルス（ATLV）［吉田ら，プロシ
ージングオブナショナルアカデミーオブサイ
エンス USA,第79巻,6899〜6902頁（1982）］，トリ肉腫ウイルス（ASV）［北村ら，ネイチャー，第2
97巻,205〜208頁（1982）］。

メタロチオネイン遺伝子のプロモーターは、構成的に
も発現するが、Cd,Zn,Hg,Ag,Cu,Auなどの重金属によっ
て、より強く発現が誘導される。

本発明においては、上記したプロモーターを１個また
は２個以上用いてもよい。

また、上記発現ベクターは、FGF蛋白質遺伝子の５′
末端の上流に、例えば特開昭61−52293号公報の第２図
における−21番目から−１番目のコドンからなるシグナ
ルペプチドをコードする塩基配列を有していてもよい。

また、上記発現ベクターは、FGF蛋白質遺伝子の３′
末端に、翻訳終止コドンとしてのTAA、TGAまたはTAGを
有していてもよく、とりわけTAGが好ましい。

本発明でハイブリドーマの形質転換に用いるFGF蛋白
質遺伝子発現ベクターは、さらにエンハンサーを有して
いてもよい。エンハンサーとしては、ウイルス由来のエ
ンハンサーが挙げられ、例えばSV40プロモーター領域に
存在するエンハンサー［岡山ら，前出］やレトロウイル
スLTR領域に存在するエンハンサーが挙げられ、とりわ
け上記LTR領域の塩基配列繰返し部分のエンハンサーが
好ましい。

レトロウイルス由来のエンハンサーとしては、たとえ
ば下記のものが挙げられる。

Ａ−MuLV［コブ,S.P.ら，前出］，Ｍ−MuLV［丹羽ら，前出］， ATLV ［吉田ら，前出］， ASV ［北村ら，前出］。

本発明においては、上記したエンハンサーを１個また
は２個以上用いてもよい。

FGF蛋白質遺伝子のハイブリドーマへの導入すなわち
ハイブリドーマの形質転換にあたっては、目的とする形
質転換体の選別を容易にするために、FGF蛋白質遺伝子
をネオマイシン耐性などの薬剤耐性遺伝子とともに同一
の発現ベクター上にのせてハイブリドーマに導入するこ
とにより、あるいは共形質転換［セル（Cell），16:777
（1979）］などにより有利に目的を達することができ
る。

共形質転換においては、形質転換体を選択する目印と
なる遺伝子（Ａ）（例えば、アンピシリン耐性、ネオマ
イシン耐性あるいはハイグロマイシン耐性遺伝子等の抗
生物質を不活化する遺伝子）を保持するプラスミドと、
導入したいFGF蛋白質遺伝子（Ｂ）を保持するプラスミ
ドとを、（Ａ）よりも（Ｂ）を多量にして電気穿孔法な
どで同時に細胞に導入する。遺伝子（Ａ）の耐性薬剤存
在下で培養し、増殖するクローン選択すると遺伝子
（Ａ）と遺伝子（Ｂ）を同時に持つ株を得ることができ
る。

本発明に用いられるハイブリドーマ株としては、例え
ばリンパ球系細胞を片方の親細胞とするマウスハイブリ
ドーマ，マウス・ヒト−ヒトヘテロハイブリドーマ，ヒ
ト−ヒトハイブリドーマなどを挙げることが出来る。よ
り具体的には、マウスハイブリドーマE235I63（Hybrido
ma,４,47（1985）），マウス・ヒト−ヒトヘテロハイブ
リドーマI12−22.25（Biochem.Biophys.Res.Commun.,12
9,26（1985）），ヒト−ヒトハイブリドーマW471−7.24
（Biochem.Biophys.Res.Commun.,142,805（1987））,HB
W−4.16,HBW−6.20（Bio/Technology,７,374（1989））
などあるいはそれらから誘導されるハイブリドーマなど
を挙げることが出来、なかでもモノクローナル抗体を産
生するハイブリドーマとりわけヒトモノクローナル抗体
を産生するヒト−ヒトハイブリドーマが好ましく用いら
れる。

本発明の生理活性物質の製造法において用いられるFG
F蛋白質以外の生理活性物質を産生するハイブリドーマ
としては、たとえばマウスモノクローナル抗体を産生す
るE235I63、ヒトモノクローナル抗体を産生するI12−2
2.25,W471−7.24,HBW−4.16,HBW−6.20などあるいはそ
れらから誘導されるハイブリドーマなどが挙げられる。

ハイブリドーマの培養に用いる培地としては、通常用
いられる血清含有培地、血清代替物質含有培地もしくは
無血清培地が利用できる。血清培地としては、10％牛胎
児血清を添加した培地が、また血清代替物質含有培地と
しては、血清由来増殖促進因子画分（GFS）〔第２回次
世代産業基盤技術シンポジウム−バイオテクノロジー予
講集161頁,1984年〕を3mg/m程度添加した培地などが
例示できるが、モノクローナル抗体などの有用生理活性
物質産生用培地としては、精製が容易であること、培地
が安価であること等の理由から無血清培地が望ましい。
無血清培地としては、基本合成培地に、インシュリン，
トランスフェリン，エタノールアミン，セレニウム，ポ
リエチレングリコール等の因子を添加した培地が用いら
れる。基本合成培地としては、イスコフ培地〔Iscove,
N.N.＆ Melchers.F.,J.Exp.Med.147,923（1978）〕ハム
F12培地〔R.G.Ham,Proc.Natl.Acad.Sci.,53,288（196
5）〕,L15培地〔A.Leibovitz,Amer.J.Hyg.,78,173（196
3）〕,T培地〔特開昭60−145088号〕,TL−２培地（イス
コフ培地，ハムF12培地及びL15培地の1:1:2混合物）等
が用いられるが、好ましくはＴ培地もしくはTL−２培地
が用いられる。

ハイブリドーマの培養には通常培養に用いられる容器
または装置が用いられる。たとえば、マルチウエルプレ
ート，培養フラスコ，スピナーフラスコ，ジャーファー
メンター，ファーメンター、さらにホローファイバー培
養装置，セラミックマトリックスを用いた培養装置やマ
イクロカプセル培養法などが適宜採用される。

本発明の培養は、用いられるハイブリドーマの培養に
適した条件が採用される。一般的には、培養温度約37℃
前後で、pH約6.5〜7.5で、数日〜３か月培養される。た
とえば、本発明の培地に通常0.1〜５×10⁵個/mの細胞
を播種し、マルチウエルプレートやフラスコの場合には
約37℃,5％炭酸ガス培養器（炭酸ガス濃度５％の培養
器）中でpH約6.5〜7.5で約１〜20日間培養される。ジャ
ーファーメンターやファーメンターなどでは通気撹拌培
養が行われる。またこれらの培養槽やホローファイバ
ー，セラミックマトリックス，マイクロカプセルなどを
用いた培養においては培地を回分的，または連続的に交
換することにより生理活性物質の生産性を向上させるこ
とができる。連続灌流培養の場合には１ないし数ケ月
（約３か月）も続ける場合がある。また、必要により通
気される。

培養液から細胞を採取するには、培養液を直接遠心分
離機やろ過機にかけて集める。またハイブリドーマの培
養によって生産されるFGF蛋白質以外の生理活性物質
は、その物質が培養液中に蓄積される場合、ろ過または
遠心分離によって上澄液を得、これから採取される。ま
た細胞内に蓄積される物質の場合には、ろ過または遠心
分離によって得た細胞を物理的方法（例、超音波，フレ
ンチプレス，ダイノミルなど）または化学的方法（例、
塩酸グアニジン等）にて処理し、生産物を抽出したの
ち、上澄液を得る。

上記上澄液から生理活性物質を分離，精製するには自
体公知の分離，精製法を適宜組み合わせて行うことがで
きる。たとえば生理活性物質が蛋白質またはペプチドの
場合には、塩析や溶媒沈澱法などの溶解度を利用する方
法，透析法，限外ろ過法，ゲルろ過法,SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法などの主として分子量の差を利
用する方法，イオン交換クロマトグラフィーなどの荷電
の差を利用する方法，アフィニティクロマトグラフィー
などの特異的親和性を利用する方法，逆相高速液体クロ
マトグラフィーなどの疎水性の差を利用する方法，等電
点電気泳動などの等電点の差を利用する方法などが適用
される。

実施例以下の実施例により本発明をより具体的に説明する
が、本発明はこれらに限定されるものではない。なお、
後述の実施例２で得られた形質転換ヒト−ヒトハイブリ
ドーマHPO−75.29−H74は、平成２年５月８日から財団
法人発酵研究所（IFO）に受託番号IFO 50245として寄
託されている。また、該ハイブリドーマ株は、通産省工
業技術院微生物工業技術研究所（FRI）に平成２年６月
１日から受託番号FERM BP−2939としてブダペスト条約
に基づき寄託されている。

実施例１ｉ）ヒト−ヒトハイブリドーマへのbFGF遺伝子の導入 bFGF遺伝子を含有するベクターとしてはpTB732（R.Sa
sadaら,Mol.Cell.Biol.,８,588−594（1988））を使用
した。抗HBsAgヒトMoAb産生ヒト−ヒトハイブリドーマH
BW−4.16（K.Haradaら,Bio/Technology,７,374−377（1
989））から誘導された抗体高産生株HPO−75.29Cを0.3M
ショ糖溶液（無菌）に１×10⁷細胞/mの密度で懸濁
し、その100μにプラスミドpTB732を制限酵素Cla I処
理したもの25μｇとプラスミドpRSVneo［サイエンス（S
cience）,221巻 551頁 1983年］を制限酵素BamH Iで
処理したもの５μｇとを混合した。この混合液をDEP社
製電気穿孔装置の遠心チャンバーに入れ、2000rpm2分間
遠心後、1000V/3mmの電圧を30秒,1回かけ氷水中に10分
間放置した。抗生物質G418（シグマ社製，米国）を1mg/
m）の濃度で添加したIsF培地に１×10⁵細胞/mの割
合でエレクトロポレーション処理した細胞を浮遊させ、
96穴マルチプレートに100μずつ播種し、37℃炭酸ガ
ス培養器中で２週間培養し、増殖するクローン７株を選
択した。

ii）導入遺伝子の検出細胞（１×10⁸個）を10mMトリス−塩酸緩衝液（pH7.
4）200μに懸濁し、等量の0.4Mトリス−塩酸緩衝液
（pH8.0）,100mM EDTA,1％SDS,200μg/mプロテアー
ゼＫ（BRL社，米国）を加え、60℃で１時間処理した。
等量のフェノール・クロロホルムを加えて上清を分取
し、さらに等量のクロロホルムを加え、再び上清を分取
した。得られたDNA溶液に3M NaOHを0.1容加え、60℃で
１時間処理したのち、室温に冷却し、等量の2M−酢酸ア
ンモニウムを加えて中和した。バイオラッド社製ドット
ブロッティング装置を用いてあらかじめ1M酢酸アンモニ
ウムで湿らせたニトロセルロースフィルターに吸着さ
せ、80℃で２時間乾燥させた。

一方、プラスミドpTB732を制限酵素EcoR IとPst Iで
処理したのち、アガロースゲル電気泳動に付し、bFGF遺
伝子を含むバンドを切り出した。ウルトラフリーC3HV
（ミリポア社製，米国）を用いて精製し、オリゴラベリ
ングキット（ファルマシア社製，スエーデン）を用いて
³²P−dCTPでランダムプライミングにより標識した。

プラスチックバッグにニトロセルロースフィルターと
プレハイブリダイゼーション溶液［50％ホルムアミド,5
×SSC,5×デンハート液,50mM リン酸ナトリウム緩衝液
（pH6.5）,250ng/m １本鎖DNA］を入れ、42℃,8時間
インキュベーションした。次に液をハイブリダイゼーシ
ョン溶液［50％ホルムアミド,5×SSC,1×デンハート液,
20mM リン酸ナトリウム緩衝液（pH6.5）,10％デキスト
ラン硫酸,100μg/m １本鎖DNA,熱処理したプロー
ブ］に入替え、42℃で15時間インキュベートした。フィ
ルターを２×SSC,0.1％SDSで10分間２回洗浄後、68℃に
熱した同じ緩衝液でさらに20分間２回洗浄した。フィル
ターを２×SSCで２回洗浄後、紙で水分を取り、オー
トラジオグラフィー（−70℃,2日間）に供した。

注;SSC 0.15M食塩,15mMクエン酸ナトリウム（pH7.0）オートラジオグラフィーの結果、プラスミドを導入し
ていない対照細胞に比べて明らかに強いオートラジオグ
ラムを与えるヒト−ヒトハイブリドーマHPO−75.29−N2
7,HPO−75.29−N58およびHPO−75.29−N73を取得した。

実施例２プラスミドpTB732を制限酵素Cla I処理したもの25μ
ｇとプラスミドp201（J.L.Yatesら,Nature,313,812−81
5（1985））を制限酵素BamH Iで処理したもの５μｇと
を混合し、実施例１のｉ）に示した方法と同じ方法で、
ヒト−ヒトハイブリドーマHPO−75.29C株に共導入し
た。なお遺伝子導入クローンの選択薬剤としては、ハイ
グロマイシン500μg/m（ベーリンガー・マンハイム山
の内（株））を使用した。導入遺伝子の検出は、実施例
１のii）に示した方法と同じ方法により行った。その結
果、bFGF遺伝子の導入が確認された株としてヒト−ヒト
ハイブリドーマHPO−75.29−H54およびHPO−75.29−H74
を取得した。

実施例３実施例１および２で得られたクローンを、それぞれ無
血清培地PEG−86−１（Y.Shintaniら,Appl.Microbiol.B
iotechnol.,27,533−537（1988））に約１×10³細胞/m
の割合で播種し、24穴マルチプレートに1mずつ分注
して、５％炭酸ガス培養器中37℃、７日間および14日間
静置培養した。得られた培養液中の細胞数を測定し、表
１に示す結果を得た。

親株HPO−75.29Cは１×10³細胞/mの播種では増殖量は
低かったが、bFGF遺伝子を導入した株では著しい増殖の
促進が認められた。

実施例４実施例３で最もよく増殖したヒト−ヒトハイブリドー
マHPO−75.29−H74株（IFO 50245,FERM BP−2939）お
よび親株ヒト−ヒトハイブリドーマHPO−75.29Cを無血
清培地PEG−86−１に約１×10³/mの密度でそれぞれ播
種し、125m容テクネ・スピナフラスコを用いて37℃,1
5日間，撹拌培養したところ、第１図に示す結果を得た
（第１図中、−●−は総細胞数を示し、−○−は生細胞
数を示し、−▲−は抗HBsAgヒトMoAbの産生量（μg/m
）を示す）。

第１図から明らかなように、親株に比べてbFGF遺伝子
導入株では、細胞増殖量および抗体産生量が著しく増加
していた。

実施例５ヒト−ヒトハイブリドーマHPO−75.29−H74および親
株ヒト−ヒトハイブリドーマHPO−75.29Cをそれぞれ96
穴プラスチックプレートに１穴あたり0.5個の細胞にな
るよう、100μの無血清培地PEG−86−１中に植え込
み、５％炭酸ガス培養器中で37℃,15日間培養した。親
株のHPO−75.29Cでは96穴プレート４枚すなわち384穴す
べてに細胞増殖が認められなかったが、HPO−75.29−H7
4株では384穴中10個に細胞の増殖が認められた。

発明の効果 FGF蛋白質遺伝子をヒト−ヒトハイブリドーマに導入
し発現せしめることにより、ハイブリドーマを低播種条
件下でも無血清培地で培養できる。さらにFGF蛋白質の
発現により、細胞増殖が促進され、それに伴って生理活
性物質の産生量も増加するので、無血清培地を用いて抗
体等の生理活性物質を効率良く生産採取することがで
き、工業的生産上有利である。

また、FGF蛋白質遺伝子の導入および発現によって無
血清培地でのクローニングが可能となり、このことは無
血清培地で単個細胞を選別できることを意味しており、
ハイブリドーマを育種改良する上で極めて有用である。

【図面の簡単な説明】第１図は、低播種からの撹拌培養におけるbFGF遺伝子非
導入親株（第１図Ａ）およびbFGF遺伝子導入株（第１図
Ｂ）の培養経過を示す（実施例４参照）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12N 5/00 C12N 15/00 C12P 21/00 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】線維芽細胞成長因子（FGF）蛋白質遺伝子
発現ベクターで形質転換されたハイブリドーマ。
【請求項２】ハイブリドーマがヒト−ヒトハイブリドー
マである請求項１記載のハイブリドーマ。
【請求項３】FGF蛋白質遺伝子発現ベクターによりハイ
ブリドーマを形質転換することを特徴とする請求項１記
載のハイブリドーマの製造法。
【請求項４】形質転換されるハイブリドーマがFGF蛋白
質以外の生理活性物質をも生産するハイブリドーマであ
る請求項３記載の製造法。
【請求項５】生理活性物質がモノクローナル抗体である
請求項４記載の製造法。
【請求項６】請求項４記載の製造法により得られるハイ
ブリドーマを培地中で培養し、培養物中にFGF蛋白質を
生成させるとともに該生理活性物質を生成・蓄積させ、
該生理活性物質を採取することを特徴とする生理活性物
質の製造法。
【請求項７】培地が血清を含まない培地である請求項６
記載の製造法。
【請求項８】ハイブリドーマがFGF蛋白質以外の生理活
性物質をも生産するハイブリドーマである請求項１記載
のハイブリドーマ。
【請求項９】生理活性物質がモノクローナル抗体である
請求項８記載のハイブリドーマ。
【請求項１０】ハイブリドーマがヒト−ヒトハイブリド
ーマである請求項３記載の製造法。
【請求項１１】受託番号FERM BP−2939として寄託され
たヒト−ヒトハイブリドーマHPO−75.29−H74である請
求項１記載のハイブリドーマ。