JP3007974B2 - てんかん関連物質 - Google Patents
てんかん関連物質Info
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- JP3007974B2 JP3007974B2 JP2050263A JP5026390A JP3007974B2 JP 3007974 B2 JP3007974 B2 JP 3007974B2 JP 2050263 A JP2050263 A JP 2050263A JP 5026390 A JP5026390 A JP 5026390A JP 3007974 B2 JP3007974 B2 JP 3007974B2
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Description
【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はてんかん関連物質に関し、更に詳細にはてん
かん動物の大脳中に存在し、てんかんの発症に重要な役
割を果たす物質及びその物質の製造法に関する。
かん動物の大脳中に存在し、てんかんの発症に重要な役
割を果たす物質及びその物質の製造法に関する。
従来、てんかんの発作の原因として数多くの仮説が提
唱されている。その中で最も支持されているものは以下
の３つである。すなわち、１）シナプス回路網において
興奮性回路が優位性を持つとき、即ち、グルタミン酸の
過剰遊離、あるいはγ−アミノ酪酸の遊離抑制に起因す
るとするシナプス仮説、２）ニューロンの膜を横切って
流入するナトリウムやカルシウムイオンが異常に増加す
るか、あるいはカリウムイオンの流失抑制が原因となる
とする膜コンダクタンスの異常説、及び３）グリア細胞
のカリウムクリアランスの抑制が引金になるとする説で
ある。
唱されている。その中で最も支持されているものは以下
の３つである。すなわち、１）シナプス回路網において
興奮性回路が優位性を持つとき、即ち、グルタミン酸の
過剰遊離、あるいはγ−アミノ酪酸の遊離抑制に起因す
るとするシナプス仮説、２）ニューロンの膜を横切って
流入するナトリウムやカルシウムイオンが異常に増加す
るか、あるいはカリウムイオンの流失抑制が原因となる
とする膜コンダクタンスの異常説、及び３）グリア細胞
のカリウムクリアランスの抑制が引金になるとする説で
ある。
ところで、最近、実験的てんかんモデル動物において
ｃ−fos蛋白質及びそのmRNAが特異的に産生されること
から、てんかんけいれんと蛋白質との関連性が指摘され
ている（Dragunow and Robertson,Nature329:441−442,
1987,Morganet al.,Science237:192−197,1987）。しか
しながら、この蛋白質産生はてんかん発生時に増加した
カルシウムイオンの合成促進による二次的なものであ
り、しかも、てんかんけいれんの引金にならず、てんか
ん発現とは直接的関連性をもたない。
ｃ−fos蛋白質及びそのmRNAが特異的に産生されること
から、てんかんけいれんと蛋白質との関連性が指摘され
ている（Dragunow and Robertson,Nature329:441−442,
1987,Morganet al.,Science237:192−197,1987）。しか
しながら、この蛋白質産生はてんかん発生時に増加した
カルシウムイオンの合成促進による二次的なものであ
り、しかも、てんかんけいれんの引金にならず、てんか
ん発現とは直接的関連性をもたない。
従って、てんかん起因物質の分離及びてんかんの発症
機序の解明が望まれていた。
機序の解明が望まれていた。
そこで本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究
してきたところ、てんかん動物脳内よりｃ−fos蛋白質
とは異なる新規な水溶性糖蛋白質を分離し、これがてん
かん惹起作用を有することを見出し、本発明を完成し
た。
してきたところ、てんかん動物脳内よりｃ−fos蛋白質
とは異なる新規な水溶性糖蛋白質を分離し、これがてん
かん惹起作用を有することを見出し、本発明を完成し
た。
すなわち、本発明はてんかん関連物質及びその製造法
を提供するものである。
を提供するものである。
本発明のてんかん関連物質は、てんかん動物の脳中に
存在する。従って、例えばてんかん動物の大脳より水又
は水性媒体にて抽出し、得られた抽出液より蛋白画分を
分離し、次いで該蛋白画分より採取すれば、本発明てん
かん関連物質が得られる。
存在する。従って、例えばてんかん動物の大脳より水又
は水性媒体にて抽出し、得られた抽出液より蛋白画分を
分離し、次いで該蛋白画分より採取すれば、本発明てん
かん関連物質が得られる。
てんかん動物としては、物理的もしくは化学的に誘発
させたてんかんモデル動物又は遺伝的にてんかんを起こ
す動物が挙げられる。てんかんを誘発させる手段として
は、例えばコバルト、鉄、アルミナクリーム、ペンチレ
ンテトラゾール、ペニシリン等の投与；定期的な電気刺
激によるキンドリング；遺伝的欠陥動物系の利用等が挙
げられる。用いられる動物種としては、例えばマウス、
ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イ
ヌ、サル等が挙げられる。
させたてんかんモデル動物又は遺伝的にてんかんを起こ
す動物が挙げられる。てんかんを誘発させる手段として
は、例えばコバルト、鉄、アルミナクリーム、ペンチレ
ンテトラゾール、ペニシリン等の投与；定期的な電気刺
激によるキンドリング；遺伝的欠陥動物系の利用等が挙
げられる。用いられる動物種としては、例えばマウス、
ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、ネコ、イ
ヌ、サル等が挙げられる。
てんかん動物の大脳からの抽出には、水、各種緩衝
液、硫酸アンモニウム水溶液などが用いられる。抽出液
からの蛋白質画分の分離は、塩析、例えば硫安分画等に
よって行なわれる。得られた蛋白質画分より本発明物質
の採取は、透析法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂法、電
気泳動法等を単独あるいは適宜組み合せて行なわれる。
例えば、具体的には次のように行なう。てんかん動物の
大脳皮質を取り出し、35％硫酸アンモニウム溶液中でホ
モゲナイズし、その後４℃で２時間放置し、13,000×ｇ
で30分遠心分離する。この上清を集め、最終濃度が85％
になるように硫酸アンモニウムを加え、同様に２時間放
置後、13,000×ｇで30分遠心分離し沈澱部分を集める。
この沈査を50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.3）に溶解す
る。この溶液を同緩衝液中で透析し、DEAE−5PWカラム
を装着した液体クロマトグラフィーにて分離精製する。
液、硫酸アンモニウム水溶液などが用いられる。抽出液
からの蛋白質画分の分離は、塩析、例えば硫安分画等に
よって行なわれる。得られた蛋白質画分より本発明物質
の採取は、透析法、ゲル濾過法、イオン交換樹脂法、電
気泳動法等を単独あるいは適宜組み合せて行なわれる。
例えば、具体的には次のように行なう。てんかん動物の
大脳皮質を取り出し、35％硫酸アンモニウム溶液中でホ
モゲナイズし、その後４℃で２時間放置し、13,000×ｇ
で30分遠心分離する。この上清を集め、最終濃度が85％
になるように硫酸アンモニウムを加え、同様に２時間放
置後、13,000×ｇで30分遠心分離し沈澱部分を集める。
この沈査を50mMトリス塩酸緩衝液（pH7.3）に溶解す
る。この溶液を同緩衝液中で透析し、DEAE−5PWカラム
を装着した液体クロマトグラフィーにて分離精製する。
かくして得られる本発明のてんかん関連物質は、以下
に示す理化学的性質を有する。
に示す理化学的性質を有する。
（１） 分子量 SDSポリアクリルアミドゲルを用いた電気泳動法によ
る分子量測定はLaemmliの方法（Nature,227,680（197
0））に従い、0.1％SDSを含むアクリルアミドゲルを用
い、２−メルカプトエタノール２％添加した、または無
添加の２％SDS含有トリス緩衝液に溶解した本発明物質
各々0.5μｇの電気泳動を行なう。また、活性測定用と
して部分精製した本発明物質を同時に泳動し、泳動後、
ゲルを5mmスライスし、PBS1mlで４℃16時間抽出後、各
スライス中の生物活性を測定する。泳動条件は20−30mA
で約1.5時間であり、標準分子量キット（バイオラッド
社製）を用いて分子量曲線を作成し、本発明物質の生理
活性及び蛋白銀染色像による泳動距離により分子量を求
める。
る分子量測定はLaemmliの方法（Nature,227,680（197
0））に従い、0.1％SDSを含むアクリルアミドゲルを用
い、２−メルカプトエタノール２％添加した、または無
添加の２％SDS含有トリス緩衝液に溶解した本発明物質
各々0.5μｇの電気泳動を行なう。また、活性測定用と
して部分精製した本発明物質を同時に泳動し、泳動後、
ゲルを5mmスライスし、PBS1mlで４℃16時間抽出後、各
スライス中の生物活性を測定する。泳動条件は20−30mA
で約1.5時間であり、標準分子量キット（バイオラッド
社製）を用いて分子量曲線を作成し、本発明物質の生理
活性及び蛋白銀染色像による泳動距離により分子量を求
める。
その結果、本発明物質の分子量は約70,000±3,000で
あった。
あった。
（２） 等電点 等電点電気泳動法による測定。すなわち、電気泳動装
置ファストシステム（ファルマシア社製、スエーデン）
とファストゲルIEF（ファルマシア社製）を用い、標準
等電点測定マーカーキット（ファルマシア社製）を用い
て等電点を測定する。泳動後、銀染色法により染色後、
等電点マーカーを基準に算出する。
置ファストシステム（ファルマシア社製、スエーデン）
とファストゲルIEF（ファルマシア社製）を用い、標準
等電点測定マーカーキット（ファルマシア社製）を用い
て等電点を測定する。泳動後、銀染色法により染色後、
等電点マーカーを基準に算出する。
その結果、本発明物質の等電点は4.7〜4.8であった。
（３） 蛋白の確認 ローリー法〔生化学実験講座1,蛋白質の化学1,51−53
（1976）東京化学同人〕により確認する。
（1976）東京化学同人〕により確認する。
その結果、本発明物質は陽性であった。
（４） 糖の確認 アルシアンブルーによる染色。すなわち、WardiとMic
hosの方法（Anal.Biochem.,49,607（1972））に従って
確認する。
hosの方法（Anal.Biochem.,49,607（1972））に従って
確認する。
その結果、本発明物質は陽性であった。
（５） アミノ酸組成 本発明物質10μｇについて、6N塩酸で110℃、20時間
減圧下に加水分解後、アミノ酸アナライザー（日本分光
社製TRI−６型）によりアミノ酸組成を決定する。表
中、AsxはAsp及び／又はAspNH2を、GlxはGlu及び／又は
Glu（NH2）を示す。
減圧下に加水分解後、アミノ酸アナライザー（日本分光
社製TRI−６型）によりアミノ酸組成を決定する。表
中、AsxはAsp及び／又はAspNH2を、GlxはGlu及び／又は
Glu（NH2）を示す。
（６） 生物活性 本発明物質は、てんかん惹起作用を有する。また、こ
の作用は抗てんかん薬により抑制される。本発明物質を
ニューロンに作用させると、ニューロンのナトリウムチ
ャンネルを活性化する。
の作用は抗てんかん薬により抑制される。本発明物質を
ニューロンに作用させると、ニューロンのナトリウムチ
ャンネルを活性化する。
次に実施例を挙げて、本発明をさらに詳細に説明す
る。
る。
実施例１ てんかん関連物質の分離精製： 10週齢Wistar系ラット100匹をバルビタール麻酔後、
頭骸を開き、各々の硬膜上にコバルト20mgを投与し、コ
バルト焦点てんかんラットを作成した。これらラットの
大脳皮質約5gを取り出し、35％硫酸アンモニウム溶液20
mlを加え、氷中でホモゲナイズした。その後４℃で２時
間放置し、13,000×ｇで30分間遠心分離し上清を得、こ
の上清に最終濃度が85％になるように硫酸アンモニウム
を加え、同様に２時間放置した後、13,000×ｇで30分遠
心分離し、沈査約10mgを得た。得られた沈査を50mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.3）1mlに溶解し、遠心操作により不
溶性分画を除いた後、可溶性分画を50mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.3）中で24時間透析した。この溶液を予め同緩
衝液で平衡化したDEAE−5PWカラム（0.78×7.5cm）を装
着した液体クロマトグラフィー（東ソー社製）にて分離
精製した。得られた溶出液には、19個のピークが得ら
れ、フラクション番号20から25の分画（6ml）にてんか
ん惹起活性が認められた。この活性分画を濃縮し、再度
上記同様の50mMトリス塩酸緩衝液で平衡化したDEAE−5P
Wカラムにかけ、当該緩衝液を用いた塩化ナトリウム濃
度グラジエント（50mM−150mM）で溶出し本発明物質1mg
を得た。
頭骸を開き、各々の硬膜上にコバルト20mgを投与し、コ
バルト焦点てんかんラットを作成した。これらラットの
大脳皮質約5gを取り出し、35％硫酸アンモニウム溶液20
mlを加え、氷中でホモゲナイズした。その後４℃で２時
間放置し、13,000×ｇで30分間遠心分離し上清を得、こ
の上清に最終濃度が85％になるように硫酸アンモニウム
を加え、同様に２時間放置した後、13,000×ｇで30分遠
心分離し、沈査約10mgを得た。得られた沈査を50mMトリ
ス塩酸緩衝液（pH7.3）1mlに溶解し、遠心操作により不
溶性分画を除いた後、可溶性分画を50mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.3）中で24時間透析した。この溶液を予め同緩
衝液で平衡化したDEAE−5PWカラム（0.78×7.5cm）を装
着した液体クロマトグラフィー（東ソー社製）にて分離
精製した。得られた溶出液には、19個のピークが得ら
れ、フラクション番号20から25の分画（6ml）にてんか
ん惹起活性が認められた。この活性分画を濃縮し、再度
上記同様の50mMトリス塩酸緩衝液で平衡化したDEAE−5P
Wカラムにかけ、当該緩衝液を用いた塩化ナトリウム濃
度グラジエント（50mM−150mM）で溶出し本発明物質1mg
を得た。
クロマトグラフィーの溶出パターンを図1A及び図1Bに
示す。
示す。
また、得られた本発明物質は前述の理化学的性質を有
していることを確認した。
していることを確認した。
実施例２ てんかん惹起試験1: バルビタール麻酔下にてWistarラットの頭骸を開き、
麻酔覚醒後精製した本発明物質の5mg/ml生理食塩水溶液
１μを10μ注射シリンジにて大脳皮質運動野に注入
した。また対照としてラットアルブミン溶液を用いて同
様の操作を行った。活性の評価は、脳波計（日本光電工
業社製）を用い、脳波上に惹起されるてんかん様放電の
有無により行なった。その結果、本発明物質を注入され
たラットは脳波上にてんかん様放電が見られた。この作
用は、抗てんかん薬フェニトイン又はフェノバルビター
ルにより抑制された。結果を図２に示す。
麻酔覚醒後精製した本発明物質の5mg/ml生理食塩水溶液
１μを10μ注射シリンジにて大脳皮質運動野に注入
した。また対照としてラットアルブミン溶液を用いて同
様の操作を行った。活性の評価は、脳波計（日本光電工
業社製）を用い、脳波上に惹起されるてんかん様放電の
有無により行なった。その結果、本発明物質を注入され
たラットは脳波上にてんかん様放電が見られた。この作
用は、抗てんかん薬フェニトイン又はフェノバルビター
ルにより抑制された。結果を図２に示す。
実施例３ てんかん惹起試験2: ラット大脳皮質スライス標本中のニューロンに実施例
２と同様の本発明物質生理食塩水溶液を、圧注入法によ
り0.5秒間注入した。その結果、細胞内電位は突発性脱
分極変化（paroxysmal depolarization shift）の特徴
を有するてんかん様放電に変化した。結果を図３に示
す。更に、電位固定法で本発明物質の作用機序を検索し
たところ、不活性化が遅いナトリウムチャンネルを突発
性に賦活した。結果を図４に示す。
２と同様の本発明物質生理食塩水溶液を、圧注入法によ
り0.5秒間注入した。その結果、細胞内電位は突発性脱
分極変化（paroxysmal depolarization shift）の特徴
を有するてんかん様放電に変化した。結果を図３に示
す。更に、電位固定法で本発明物質の作用機序を検索し
たところ、不活性化が遅いナトリウムチャンネルを突発
性に賦活した。結果を図４に示す。
本発明のてんかん関連物質は、てんかん惹起作用を有
し、生体内でてんかん惹起物質として作用していると考
えられる。従って、これを用いればてんかん治療剤開発
が可能となる。
し、生体内でてんかん惹起物質として作用していると考
えられる。従って、これを用いればてんかん治療剤開発
が可能となる。
図1Aは、本発明物質の、DEAE−5PWカラムによる高速液
体クロマトグラフィー溶出パターンである。図1Bは、図
1Aにおける矢印ピークの同条件による再クロマトグラフ
ィーの溶出パターンである。 図２は、大脳皮質運動野に本発明物質を注入したときの
脳波変化を示す図面である。 図３は、ラット大脳皮質スライス標本中のニューロンに
本発明物質を作用させた時の細胞内電位の変化を示す図
面である。 図４は、本発明物質のニューロンの膜電位に対する作用
を示す図面である。
体クロマトグラフィー溶出パターンである。図1Bは、図
1Aにおける矢印ピークの同条件による再クロマトグラフ
ィーの溶出パターンである。 図２は、大脳皮質運動野に本発明物質を注入したときの
脳波変化を示す図面である。 図３は、ラット大脳皮質スライス標本中のニューロンに
本発明物質を作用させた時の細胞内電位の変化を示す図
面である。 図４は、本発明物質のニューロンの膜電位に対する作用
を示す図面である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 辻谷 典彦 神奈川県横浜市戸塚区柏尾町560 ポー ラ化成工業株式会社新薬研究所内 (56)参考文献 特開 昭60−100597（ＪＰ，Ａ) Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔ ｅｒｓ，115（1990）ｐ．49−54 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C07K 1/14 C07K 14/435 ＣＡ（ＤＩＡＬＯＧ）) ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (1)
- 【請求項１】てんかん動物の大脳より水又は水性媒体に
て抽出し、得られた抽出液より蛋白画分を分離し、この
蛋白画分から採取される下記の理化学的性質を有するて
んかん関連物質。 （１）分子量（SDS−PAGE法） 約70,000±3,000 （２）等電点（等電点電気泳動法） 4.7〜4.8 （３）呈色反応 ローリー法 陽性 アルシアンブルー染色 陽性 （４）アミノ酸組成 6N塩酸で110℃、20時間減圧下に加水分解後、アミノ酸
分析したアミノ酸組成（モル％）はメチオニンを1.0と
して以下の通り。 Asx 9.3 Thr 5.7 Ser 4.7 Glx 15.7 Pro 5.7 Gly 4.6 Ala 10.7 Val 6.1 Met 1.0 Ile 2.5 Leu 9.7 Tyr 3.3 Phe 4.4 Lys 9.4 His 2.9 Arg 4.3 Trp 測定せず Cys 測定せず
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2050263A JP3007974B2 (ja) | 1990-03-01 | 1990-03-01 | てんかん関連物質 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2050263A JP3007974B2 (ja) | 1990-03-01 | 1990-03-01 | てんかん関連物質 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH03255100A JPH03255100A (ja) | 1991-11-13 |
| JP3007974B2 true JP3007974B2 (ja) | 2000-02-14 |
Family
ID=12854089
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2050263A Expired - Fee Related JP3007974B2 (ja) | 1990-03-01 | 1990-03-01 | てんかん関連物質 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3007974B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20120021694A (ko) * | 2010-08-13 | 2012-03-09 | 한국과학기술원 | 주의력 결핍 과잉 행동 모델 마우스, 상기 모델 마우스를 이용한 집중력 장애 질병 예방 및 완화 효과 검증 방법, 및 비특이적 ｔ?타입 칼슘 억제제를 함유하는 집중력 장애 질병 예방 및 치료용 조성물 |
| KR101625575B1 (ko) * | 2013-03-21 | 2016-06-13 | 한국과학기술원 | 주의력 결핍 과잉 행동 모델 마우스, 상기 모델 마우스를 이용한 집중력 장애 질병 예방 및 완화 효과 검증 방법, 및 비특이적 ｔ―타입 칼슘 억제제를 함유하는 집중력 장애 질병 예방 및 치료용 조성물 |
-
1990
- 1990-03-01 JP JP2050263A patent/JP3007974B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１１５（１９９０）ｐ．４９−５４ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH03255100A (ja) | 1991-11-13 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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