JP2986592B2 - Method for separating 24-position epimer of 24-hydroxycholesterol derivative - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【産業上の利用分野】本発明は、２４―ヒドロキシコレ
ステロール誘導体の２４位エピマーの分離法に関するも
のである。The present invention relates to a method for separating the 24-position epimer of a 24-hydroxycholesterol derivative.

【０００２】２４―ヒドロキシコレステロール誘導体、
例えば１α，２４―ジヒドロキシコレステロールは、ビ
タミンＤ₃ 活性代謝物である２５―ヒドロキシコレカル
シフェロール［Biochemistry 7,3317(1968) ］、１，
２５―ジヒドロキシコレカルシフェロール［Biochemist
ry, 10,2799(1971) ］、２４，２５―ジヒドロキシコレ
カルシフェロール［Biochemistry, 11,4251(1972) ］、
１α，２４，２５―トリヒドロキシコレカルシフェロー
ル［J.Biol.Chem.248,6691(1973)］等のアナログである
１α，２４―ジヒドロキシコレカルシフェロールの合成
中間体として非常に有用な化合物である。[0002] 24-hydroxycholesterol derivatives,
For example, 1α, 24-dihydroxycholesterol is an active metabolite of vitamin D ₃ , 25-hydroxycholecalciferol [Biochemistry 7 , 3317 (1968)], 1,
25-dihydroxycholecalciferol [Biochemist
ry, 10 , 2799 (1971)], 24,25-dihydroxycholecalciferol [Biochemistry, 11 , 4251 (1972)],
It is a very useful compound as a synthetic intermediate of 1α, 24-dihydroxycholecalciferol which is an analog such as 1α, 24,25-trihydroxycholecalciferol [J. Biol. Chem. 248,6691 (1973)]. .

【０００３】この１α，２４―ジヒドロキシコレカルシ
フェロールは、その２４位のエピマー中、いずれか一方
が生理活性を示すこと、あるいはエピマー間で、生理活
性が質的又は量的に異なることが知られている。そこで
このような１α，２４―ジヒドロキシコレカルシフェロ
ールの合成においては、２４位エピマーを別個に合成す
る必要がある。[0003] It is known that 1α, 24-dihydroxycholecalciferol has a physiological activity in one of the epimers at position 24, or that the physiological activity differs qualitatively or quantitatively among the epimers. ing. Therefore, in the synthesis of 1α, 24-dihydroxycholecalciferol, it is necessary to separately synthesize the 24-position epimer.

【０００４】ところで１α，２４―ジヒドロキシコレカ
ルシフェロールは、１α，２４―ジヒドロキシコレステ
ロール誘導体を経て公知の反応によって合成される。[0004] Incidentally, 1α, 24-dihydroxycholecalciferol is synthesized by a known reaction via a 1α, 24-dihydroxycholesterol derivative.

【０００５】従って、１α，２４―ジヒドロキシコレカ
ルシフェロールの合成中間体である１α，２４―ジヒド
ロキシコレステロール誘導体の２４位エピマーの効率的
分離法は、上記エピマーの選択的かつ工業的合成におい
て利用することができる。Accordingly, an efficient method for separating the 24-position epimer of a 1α, 24-dihydroxycholesterol derivative, which is an intermediate for the synthesis of 1α, 24-dihydroxycholecalciferol, can be used in the selective and industrial synthesis of the above-mentioned epimer. Can be.

【０００６】[0006]

【従来の技術】従来２４―ヒドロキシコレステロール誘
導体の２４位エピマーの分離は、該ステロールを２４―
ベンゾイルオキシコレステリルベンゾエートに導いて分
別結晶法［J.Am.Chem.Soc.,75,3284(1953)］又は薄層ク
ロマトグラフィー［J.Chromatogr.,49,555(1970)］を用
いることにより、２４―ヒドロキシコレステロール誘導
体の２４位をベンゾイル化した２４―ベンゾイルオキシ
コレステロール誘導体をシリカゲルカラムクロマトグラ
フィー［特公昭５３―２７２６８号公報］を用いること
により、あるいは２４―ヒドロキシコレステロール―３
―アセテート等をシリカゲルカラムクロマトグラフィー
［特開昭５７―１１６０９６号公報］を用いることによ
り達成されるという報告がある。2. Description of the Related Art Conventionally, the separation of the 24-position epimer of a 24-hydroxycholesterol derivative has been carried out by converting the sterol to 24-hydroxy cholesterol.
By using a fractionated crystallization method [J. Am. Chem. Soc., 75, 3284 (1953)] or thin-layer chromatography [J. Chromatogr., 49, 555 (1970)] by leading to benzoyloxycholesteryl benzoate, A 24-benzoyloxycholesterol derivative obtained by benzoylating the 24-position of the hydroxycholesterol derivative is subjected to silica gel column chromatography [Japanese Patent Publication No. 53-27268] or 24-hydroxycholesterol-3.
-There is a report that acetate and the like can be achieved by using silica gel column chromatography [Japanese Patent Laid-Open No. 57-116096].

【０００７】また、２４位に加えてさらに１α位に水酸
基が導入された１α，２４―ジヒドロキシコレステロー
ルは、海藻中に多量存在し、抽出等の簡単な操作によっ
て工業原料として容易に得られるフコステロールを出発
物質とし［Chem.Pharm.Bull.21,2568 〜2570(1973)］、
まず２４―オキソコレステロールが、次いで１α，２４
―ジヒドロキシコレステロールが合成され、この得られ
た１α，２４―ジヒドロキシコレステロールの水酸基を
保護して２４位エピマーが分離される。Further, 1α, 24-dihydroxycholesterol having a hydroxyl group introduced at the 1α-position in addition to the 24-position is present in a large amount in seaweed, and can be easily obtained as an industrial raw material by a simple operation such as extraction. Starting material [Chem. Pharm. Bull. 21 , 2568-2570 (1973)],
First, 24-oxo cholesterol, then 1α, 24
-Dihydroxycholesterol is synthesized, and the 24-position epimer is isolated by protecting the hydroxyl group of the obtained 1α, 24-dihydroxycholesterol.

【０００８】しかしながら、この１α，２４―ジヒドロ
キシコレステロールの保護基のない２４位エピマーを直
接分離する方法は知られていない。[0008] However, there is no known method for directly separating the 24-position epimer without the protecting group of 1α, 24-dihydroxycholesterol.

【０００９】[0009]

【発明が解決しようとする課題】このように従来技術に
おいては２４―ヒドロキシコレステロール誘導体のヒド
ロキシ基を保護することなしに２４位エピマーを効率良
く分離する方法がなかった。As described above, in the prior art, there was no method for efficiently separating the 24-position epimer without protecting the hydroxy group of the 24-hydroxycholesterol derivative.

【００１０】そのため活性型ビタミンＤ₃ の合成におい
て、中間体２４位エピマーの分離に際しヒドロキシ基の
保護、脱保護プロセスのために全体的な反応工程数が増
え、また収率の点でも、より工業生産に適した有効な２
４位エピマーの分離法が望まれていた。[0010] In the synthesis of for active vitamin D _3, protection of the hydroxy group upon separation of the intermediate 24-position epimers, global response number of steps for the deprotection process is increased, also in terms of yield, more industrial Effective 2 suitable for production
A method for separating the 4-position epimer has been desired.

【００１１】本発明者らはかかる従来技術の問題点に鑑
みて鋭意検討の結果本発明に到達したものである。The inventors of the present invention have arrived at the present invention as a result of intensive studies in view of the problems of the prior art.

【００１２】[0012]

【課題を解決するための手段】即ち、本発明は、２４―
ヒドロキシコレステロール誘導体の２４位エピマーの混
合物から該誘導体の２４位エピマーを分離するに際し
て、下記式［Ｉ］Means for Solving the Problems That is, the present invention provides 24-
In separating the 24-position epimer of the hydroxycholesterol derivative from the mixture of the 24-position epimer, the following formula [I]

【００１３】[0013]

【化２】 Embedded image

【００１４】［式中、Ｒ₁ はＣ₁ 〜Ｃ₂₂の脂肪族基及び
／又はＣ₆ 〜Ｃ₁₀の芳香族基を示し、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄
はハロゲン原子、低級アルコキシ基又は低級アルキル基
であって、Ｒ₂ 〜Ｒ₄ のうち少なくともひとつはハロゲ
ン原子又は低級アルコキシ基を示す。］で表わされるケ
イ素化合物を反応させて得られるシリカゲルからなる充
填剤で充填された液体クロマトグラフィーを使用するこ
とからなる該誘導体の２４位エピマーの分離法である。[Wherein R ₁ represents a C ₁ -C ₂₂ aliphatic group and / or a C ₆ -C ₁₀ aromatic group, and R ₂ , R ₃ , R ₄
Represents a halogen atom, a lower alkoxy group or a lower alkyl group, and at least one of R _{2 to} R ₄ represents a halogen atom or a lower alkoxy group. And a liquid chromatography packed with a filler made of silica gel obtained by reacting a silicon compound represented by the formula (1).

【００１５】本発明の２４―ヒドロキシコレステロール
誘導体とは、少なくとも２４位にヒドロキシ基を有する
コレステロール及びその誘導体、例えば２４―ヒドロキ
シコレステロール；１α，２４―ジヒドロキシコレステ
ロール；２４，２５―ジヒドロキシコレステロール；１
α，２４，２５―トリヒドロキシコレステロール；１
α，２４―ジヒドロキシコレスタ―５，７―ジエン；２
４―ヒドロキシコレスタ―５，７―ジエン等をいう。こ
れらのなかでも、本発明の２４―ヒドロキシコレステロ
ール誘導体としては１α，２４―ヒドロキシコレステロ
ール、１α，２４―ジヒドロキシコレスタ―５，７―ジ
エン等が好ましい。The 24-hydroxycholesterol derivative of the present invention includes cholesterol having a hydroxy group at least at position 24 and derivatives thereof, for example, 24-hydroxycholesterol; 1α, 24-dihydroxycholesterol; 24,25-dihydroxycholesterol;
α, 24,25-trihydroxycholesterol; 1
α, 24-dihydroxycholesta-5,7-diene; 2
Refers to 4-hydroxycholesta-5,7-diene and the like. Among them, as the 24-hydroxycholesterol derivative of the present invention, 1α, 24-hydroxycholesterol, 1α, 24-dihydroxycholesta-5,7-diene and the like are preferable.

【００１６】本発明において、該誘導体の２４位エピマ
ーとは、２４位の不整炭素原子に基づく立体異性体（Ｒ
体、Ｓ体）をいう。In the present invention, the 24-position epimer of the derivative refers to a stereoisomer (R
Body, S body).

【００１７】上記式［Ｉ］において、Ｒ₁ はＣ₁ 〜Ｃ₂₂
の脂肪族基及び／又はＣ₆ 〜Ｃ₁₀の芳香族基を示す。か
かる脂肪族基及び又は芳香族基としては適度な疎水性基
を持つものであれば、直鎖状又は分岐状であっても良
く、不飽和基、その他の置換基を含んでもよいが、好ま
しくは直鎖状のものが良い。なかでも、Ｒ₁ としてはＣ
₄ 〜Ｃ₁₈の脂肪族基又はＣ₆ の芳香族基を好ましいもの
として挙げられる。さらに好ましくは、Ｃ₄ 〜Ｃ₁₈の飽
和脂肪族基、例えばｎ―ブチル基（Ｃ₄ ）、ｎ―オクチ
ル基（Ｃ₈ ）、オクタデシル基（Ｃ₁₈）、又はフェニル
基（Ｃ₆ ）が挙げられる。In the above formula [I], R ₁ is C ₁ -C ₂₂
And / or C ₆ -C ₁₀ aromatic groups. As such an aliphatic group and / or an aromatic group, those having an appropriate hydrophobic group may be linear or branched, and may contain an unsaturated group or another substituent, but are preferably used. Is preferably a linear one. Above all, R ₁ is C
₄ it is mentioned as preferable an aliphatic group or an aromatic group C ₆ of -C _18. More preferably, a C ₄ -C ₁₈ saturated aliphatic group, for example, an n-butyl group (C ₄ ), an n-octyl group (C ₈ ), an octadecyl group (C ₁₈ ), or a phenyl group (C ₆ ) is exemplified. Can be

【００１８】また上記式［Ｉ］において、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、
Ｒ₄ はハロゲン原子、低級アルコキシ基又は低級アルキ
ル基であって、Ｒ₂ 〜Ｒ₄ のうち少なくともひとつはハ
ロゲン原子又は低級アルコキシ基を示す。In the above formula [I], R ₂ , R ₃ ,
R ₄ is a halogen atom, a lower alkoxy group or a lower alkyl group, and at least one of R _{2 to} R ₄ represents a halogen atom or a lower alkoxy group.

【００１９】かかるはハロゲン原子としては、フッ素、
塩素原子、臭素原子等が挙げられる。なかでも好ましく
は塩素原子があげられる。また低級アルコキシ基として
は、例えばメトキシ基、エトキシ基、プロポキシ基、ブ
トキシ基等のＣ₁ 〜Ｃ₆ の直鎖状、分岐状のアルコキシ
基を挙げることができる。なかでも好ましくは、メトキ
シ基、エトキシ基があげられる。低級アルキル基として
は例えばメチル基、エチル基、プロピル基、ブチル基等
のＣ₁ 〜Ｃ₆ の直鎖状、分岐状アルキル基を挙げること
ができる。なかでも好ましくはメチル基があげられる。
これらのなかでもＲ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ としては、Ｒ₂ 、Ｒ
₃ 、Ｒ₄ がハロゲン原子、Ｃ₁ 〜Ｃ₄ の低級アルコキシ
基又はＣ₁ 〜Ｃ₄ の低級アルキル基であって、Ｒ₂ 〜Ｒ
₄ のうち少なくともひとつはハロゲン原子又はＣ₁ 〜Ｃ
₄ の低級アルコキシ基であるのが好ましい。より好まし
くは、Ｒ₂ 〜Ｒ₄ のひとつあるいは２つが塩素原子で、
他がメチル基であるものがあげられる。Such halogen atoms include fluorine,
Examples include a chlorine atom and a bromine atom. Of these, a chlorine atom is preferred. Examples of the lower alkoxy group include a C ₁ -C ₆ linear or branched alkoxy group such as a methoxy group, an ethoxy group, a propoxy group, and a butoxy group. Of these, a methoxy group and an ethoxy group are preferred. Examples of the lower alkyl group include C ₁ -C ₆ linear or branched alkyl groups such as methyl group, ethyl group, propyl group and butyl group. Of these, a methyl group is preferred.
Among them, R ₂ , R ₃ and R ₄ are R ₂ , R
_3, R ₄ is a lower alkyl group halogen atoms, C ₁ -C ₄ lower alkoxy group or a C ₁ ~C _4, R ₂ ~R
_At least one of the _four is a halogen atom or C ₁ -C
_It is preferably a lower alkoxy group of ₄ . More preferably, one or two of R _{2 to} R ₄ are chlorine atoms,
Others are methyl groups.

【００２０】本発明の充填剤は、上記式［Ｉ］で表わさ
れるケイ素化合物をシリカゲルと反応させて得られるシ
リカゲルからなる充填剤をいうが、このケイ素化合物と
シリカゲルとの反応は従来公知の反応によってすること
ができる。また、このような充填剤は、本発明の目的、
効果を達成する範囲において上記以外のシリカゲル等を
充填剤として含んでいても良い。The filler of the present invention refers to a filler made of silica gel obtained by reacting the silicon compound represented by the above formula [I] with silica gel. The reaction of this silicon compound with silica gel is a conventionally known reaction. Can be done by Also, such a filler is an object of the present invention,
Silica gel or the like other than the above may be included as a filler as long as the effect is achieved.

【００２１】本発明の充填剤は、ケイ素化合物と反応さ
せて得られるシリカゲルからなるが、その反応程度は充
填剤の炭素含有量として表わすことができる。かかる場
合、充填剤の炭素含有量は１〜２５wt％の範囲が好まし
い。なかでも好ましくは５〜２５wt％、更に好ましくは
１０〜２５wt％の範囲があげられる。The filler of the present invention comprises silica gel obtained by reacting with a silicon compound, and the degree of the reaction can be expressed as the carbon content of the filler. In such a case, the carbon content of the filler is preferably in the range of 1 to 25% by weight. Among them, the range is preferably 5 to 25 wt%, more preferably 10 to 25 wt%.

【００２２】上記ケイ素化合物と反応させるシリカゲ
ル、即ちベースゲルとしては、公知のシリカゲルを挙げ
ることができる。かかるシリカゲルとしては、球状及び
破砕状シリカゲルが主として用いられるが、好ましくは
球状シリカゲルが用いられる。As the silica gel to be reacted with the silicon compound, that is, the base gel, known silica gel can be used. As such silica gel, spherical and crushed silica gels are mainly used, but spherical silica gel is preferably used.

【００２３】本発明の充填剤の粒径としては、３〜３０
０μｍ径の範囲のものが用いられるが、好ましくは５〜
１００μｍ径の範囲のものが用いられる。粒径が小さす
ぎる分離能が低くなりがちである。細孔径としては５０
〜５００オングストローム、好ましくは６０〜３００オ
ングストロームのものが用いられるが、更に好ましくは
８０〜２００オングストロームのものが用いられる。The particle size of the filler of the present invention is 3 to 30.
Those having a diameter of 0 μm are used, preferably 5 to
Those having a diameter of 100 μm are used. Particle sizes that are too small tend to result in poor separation power. The pore size is 50
Those having a thickness of from 500 to 500 angstroms, preferably from 60 to 300 angstroms are used, and more preferably from 80 to 200 angstroms.

【００２４】このような充填剤として、例えばワイエム
シー社のC8-120-S5 （カラム名：YMC-A-202 ）、ODS-A1
20-S5 （カラム名：YMC-A-302 ）、C4-120-S5 （カラム
名：YMC-A-802 ）、YMC-ODS-20AM（あるいはYMC-ODS-AM
-120-S20といわれている）、同50AQ（あるいはYMC-ODS-
AQ120-S50 といわれている）等；野村化学社のDevelosi
l ODS-120-S5（カラム名：Develosil-ODS ），Develosi
l ODS-A-120-S5（カラム名：Develosil-A ），Develosi
l ODS-T-120-S5（カラム名：Develosil-T ）；ガスクロ
工業社のInertsil（登録商標）ODS-2 （カラム名：ODS-
2 ）；資生堂社のODS-SG-120（カラム名：Capcell Pack
SG-120 ）等を挙げることができる。Examples of such a filler include C8-120-S5 (column name: YMC-A-202) and ODS-A1 manufactured by YMC Corporation.
20-S5 (column name: YMC-A-302), C4-120-S5 (column name: YMC-A-802), YMC-ODS-20AM (or YMC-ODS-AM)
-120-S20), 50AQ (or YMC-ODS-
AQ120-S50), etc .; Develosi of Nomura Chemical
l ODS-120-S5 (column name: Develosil-ODS), Develosi
l ODS-A-120-S5 (column name: Develosil-A), Develosi
l ODS-T-120-S5 (column name: Develosil-T); Inertsil (registered trademark) ODS-2 (column name: ODS-
2); Shiseido ODS-SG-120 (Column: Capcell Pack)
SG-120) and the like.

【００２５】また、本発明においては、充填剤としては
アセトニトリル／水＝３０／７０の組成を有する溶離液
系において下記式［II］Further, in the present invention, the following formula [II] is used as the filler in an eluent system having a composition of acetonitrile / water = 30/70.

【００２６】[0026]

【数２】 で表わされるＫｐ値が−１．０〜０．２である充填剤が
好ましい。なかでも好ましくはＫｐ値が−１．０〜−
０．１のものがあげられる。(Equation 2) A filler having a Kp value of -1.0 to 0.2 represented by is preferable. Among them, the Kp value is preferably -1.0 to-
0.1.

【００２７】本発明のＫｐ値を求める条件としては、例
えば高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）；例えば
日本分光PU-880、875UV ， カラム；各種カラム， 溶離液；アセトニトリル／水＝３０／７０， 空筒流速；０．１cm／sec ， 検出波長；２０７nm， カラム温度；３０±１℃， があげられる。Ｋｐ値は、一般に、置換基Ｒ₁ を含むケ
イ素化合物でシリカゲルを処理し、更に、低分子ケイ素
化合物、例えばトリメチルクロルシランで処理する程度
により変化する。処理率が高い程、Ｋｐ＝−ＸでのＸの
絶対値は大きくなる傾向である。Conditions for obtaining the Kp value of the present invention include, for example, high performance liquid chromatography (HPLC); for example, JASCO PU-880, 875UV, column; various columns, eluent; acetonitrile / water = 30/70, empty cylinder Flow rate: 0.1 cm / sec, detection wavelength: 207 nm, column temperature: 30 ± 1 ° C. The Kp value generally varies depending on the degree to which silica gel is treated with a silicon compound containing the substituent R ₁ and further treated with a low molecular weight silicon compound such as trimethylchlorosilane. The higher the processing rate, the larger the absolute value of X at Kp = −X tends to be.

【００２８】本発明の分離法は、試料としての２４―ヒ
ドロキシコレステロール誘導体をそのヒドロキシル基を
保護することなく液体クロマトグラフィーを使用するこ
とによりなされる。具体的には、ガラス、ステンレス、
あるいはチタンなどからなるカラムに充填剤を密に充填
し、カラムの入口側に送液ポンプおよび試料注入器を、
また出口側に紫外検出器あるいは示差屈折型検出器等
を、又必要に応じてフラクションコレクターを接続し、
送液ポンプにて溶離液を送液して注入した２４―ヒドロ
キシコレステロール誘導体をカラム中で展開し分離す
る。The separation method of the present invention is performed by using liquid chromatography of a 24-hydroxycholesterol derivative as a sample without protecting its hydroxyl group. Specifically, glass, stainless steel,
Alternatively, a column made of titanium or the like is densely packed with a packing material, and a liquid sending pump and a sample injector are provided at the inlet side of the column.
Also, an ultraviolet detector or a differential refraction detector is connected to the outlet side, and a fraction collector is connected if necessary.
The eluent is sent by the liquid sending pump, and the injected 24-hydroxycholesterol derivative is developed and separated in the column.

【００２９】好ましい溶離液系としては、例えばアセト
ニトリル／水、メタノール／水、エタノール／水、ｎ―
プロピルアルコール／水、イソプロピルアルコール／
水、アセトン／水、テトラヒドロフラン／水、ジオキサ
ン／水、ジメチルホルムアミド／水、ジメチルアセトア
ミド／水、ジメチルスルホキサイド／水、Ｎ―メチルピ
ロリドン／水、エチレングリコールモノメチルエーテル
／水系が挙げられる。これらの中でもとくにアセトニト
リル／水、メタノール／水、エタノール／水、アセトン
／水系が良く、各々の溶媒は任意の割合に混ぜてもよい
が、水が多くなると溶出時間が遅くなり、１回あたりの
時間が長くなり経済的でない。また、有機溶媒が多すぎ
ると２４位エピマーの分離が悪くなる。Preferred eluent systems include, for example, acetonitrile / water, methanol / water, ethanol / water, n-
Propyl alcohol / water, isopropyl alcohol /
Water, acetone / water, tetrahydrofuran / water, dioxane / water, dimethylformamide / water, dimethylacetamide / water, dimethylsulfoxide / water, N-methylpyrrolidone / water, ethylene glycol monomethyl ether / water system. Of these, acetonitrile / water, methanol / water, ethanol / water, and acetone / water systems are particularly preferable. Each solvent may be mixed at an arbitrary ratio. Time is long and not economical. On the other hand, if the amount of the organic solvent is too large, the separation of the 24-position epimer becomes worse.

【００３０】よって各々の溶媒によって最適組成は異な
る。例えば、アセトニトリル／水系では、４０／６０〜
８５／１５が好ましく、メタノール／水系では６０／４
０〜９０／１０が好ましい。また２種以上の有機溶媒を
混合してもよい。Therefore, the optimum composition differs depending on each solvent. For example, in an acetonitrile / water system, 40 / 60-
85/15 is preferred, and 60/4 in a methanol / water system.
0 to 90/10 is preferred. Further, two or more organic solvents may be mixed.

【００３１】また溶離液中のpHは４．０〜８．０の範囲
に保つのが良い。更に好ましくは、pH５．０〜７．５が
カラムの寿命から好ましい。The pH of the eluent is preferably kept in the range of 4.0 to 8.0. More preferably, pH 5.0 to 7.5 is preferable from the viewpoint of the life of the column.

【００３２】試料を溶解する溶媒としては代表的なもの
として、水と混ざり合うジメチルホルムアミド、ジメチ
ルアセトアミド、ジメチルスルホキサイド、Ｎ―メチル
ピロリドン、ジオキサン、テトラヒドロフラン、メタノ
ール、エタノール、イソプロピルアルコール、アセト
ン、アセトニトリル等が好ましい。また、これらの溶媒
に水を加えたものでも良い。Representative solvents for dissolving the sample include dimethylformamide, dimethylacetamide, dimethylsulfoxide, N-methylpyrrolidone, dioxane, tetrahydrofuran, methanol, ethanol, isopropyl alcohol, acetone, and acetonitrile, which are mixed with water. Are preferred. Further, those obtained by adding water to these solvents may be used.

【００３３】また、試料濃度は０．１〜３５w/w ％、好
ましくは２〜３０w/w ％が良い。あまり低濃度では、特
に試料を良く溶解する溶媒では分離が悪くなる。又、濃
度が高すぎると溶離液と接したときに析出してしまう危
険がある。このため、用いる溶離液と試料溶解溶媒によ
り最適な濃度が存在する。The sample concentration is 0.1 to 35 w / w%, preferably 2 to 30 w / w%. At very low concentrations, separation is poor, especially with solvents that dissolve the sample well. On the other hand, if the concentration is too high, there is a danger of precipitation when coming into contact with the eluent. Therefore, there is an optimum concentration depending on the eluent used and the sample dissolving solvent.

【００３４】カラム及び溶離液の温度としては、用いる
充填剤や、溶離液、試料濃度、流量により異なるが、５
〜６０℃が良い。好ましくは、１５〜５０℃が良い。温
度が低すぎると溶離液の粘度が高くなったり、試料の溶
解度が低下する等により分離性能は低下してしまう。一
方温度が高すぎてもやはり分離性能の低下及び溶離液の
揮発による組成変化が起こり易く好ましくない。The temperature of the column and the eluent varies depending on the packing material used, the eluent, the sample concentration and the flow rate.
~ 60 ° C is good. Preferably, 15-50 degreeC is good. If the temperature is too low, the separation performance will decrease due to an increase in the viscosity of the eluent and a decrease in the solubility of the sample. On the other hand, if the temperature is too high, the composition is likely to deteriorate due to deterioration of the separation performance and volatilization of the eluent, which is not preferable.

【００３５】また溶離液の流速は、カラムの寸法、負荷
量、溶離液組成、溶離液温度により異なるが、遅すぎる
と溶出時間が長くなりカラム性能が低下する。一方、速
すぎてもカラム圧力が高くなり、又分離性能が低下す
る。The flow rate of the eluent varies depending on the column size, the load, the eluent composition and the eluent temperature. If the flow rate is too slow, the elution time will become longer and the column performance will decrease. On the other hand, if it is too fast, the column pressure will increase, and the separation performance will decrease.

【００３６】また、負荷量は、多すぎると分離性能は低
下し、目的とする純度が得られない。また負荷量が少な
すぎると分離回数が多くなり経済的ではない。On the other hand, if the load is too large, the separation performance is lowered, and the desired purity cannot be obtained. On the other hand, if the load is too small, the number of separations increases, which is not economical.

【００３７】かくして、本発明の分離法によって、２４
―ヒドロキシコレステロール誘導体のヒドロキシ基を保
護することなしに、例えば２４―ヒドロキシコレステロ
ールの場合であれば３位及び２４位ヒドロキシ基のいず
れについても、あるいは１α，２４―ジヒドロキシコレ
ステロールの場合であれば１α位、３位及び２４位ヒド
ロキシ基のいずれについてもフリーのままで２４位エピ
マーを選択的かつ工業的に分離することが可能となる。Thus, according to the separation method of the present invention, 24
Without protecting the hydroxy group of the hydroxy cholesterol derivative, for example, in the case of 24-hydroxy cholesterol, any of the 3- and 24-position hydroxy groups, or in the case of 1α, 24-dihydroxy cholesterol, the 1α-position It is possible to selectively and industrially separate the 24-position epimer while leaving any of the 3- and 24-position hydroxy groups free.

【００３８】以下、実施例により本発明を更に詳細に説
明する。Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples.

【００３９】[0039]

【実施例１〜４，比較例１及び２】 Ｒ₁ と分離度の関係 表１記載のワイエムシー（ＹＭＣ）社製の各種充填剤を
充填したカラム（カラムサイズ；４．６×２５０Ｌmm／
充填剤の粒径；５μｍ）を用い、１α，２４―ジヒドロ
キシコレステロールの２４Ｒ体及び２４Ｓ体を分離し
た。[Examples 1-4, Comparative Examples 1 and 2] column packed with R ₁ and YMC degree of separation relationship shown in Table 1 (YMC) manufactured by various fillers (column size; 4.6 × 250Lmm /
Using a filler having a particle size of 5 μm), the 24R-form and 24S-form of 1α, 24-dihydroxycholesterol were separated.

【００４０】なお分離は、サンプルとして１α，２４―
ジヒドロキシコレステロール２０％ＴＨＦ溶液を用い、
これを注入量１．０μｌ、溶離液アセトニトリル／水＝
６／４、流速１．０ml／min で行った。The separation was performed using 1α, 24-
Using dihydroxy cholesterol 20% THF solution,
This was injected in an amount of 1.0 μl and the eluent acetonitrile / water =
6/4 at a flow rate of 1.0 ml / min.

【００４１】分離度と保持時間についてＳ体の結果を表
１に示した。表１からＲ₁ がｎＣ₄ Ｈ₉ 、ｎＣ₈ Ｈ₇ 、
ｎＣ₁₈Ｈ₃₇基である場合に分離度が優れていることがわ
かる。Table 1 shows the results of the S-form for the degree of separation and the retention time. From Table 1, R ₁ is nC ₄ H ₉ , nC ₈ H ₇ ,
It can be seen that the degree of separation is excellent when nC ₁₈ H ₃₇ is used.

【００４２】なお、実施例１〜４においてＲ₂ 〜Ｒ₄ の
少なくともひとつはメチル基又は塩素原子である。In Examples 1 to ₄ , at least one of R _{2 to} R ₄ is a methyl group or a chlorine atom.

【００４３】[0043]

【表１】 [Table 1]

【００４４】[0044]

【実施例５〜１１】 Ｒ₁ とＫｐ値等との関係 表２記載の市販各社の充填剤を充填したカラム（カラム
サイズ；４．６×２５０Ｌmm／充填剤の粒径；５μｍ）
を用い、１α，２４―ジヒドロキシコレステロールの２
４Ｒ体及び２４Ｓ体を分離した。Examples 5 to 11 Relationship between R ₁ and Kp value, etc. Columns packed with packing materials from various commercial companies listed in Table 2 (column size: 4.6 × 250 Lmm / particle size of packing material: 5 μm)
Of 1α, 24-dihydroxycholesterol
The 4R form and the 24S form were separated.

【００４５】なお分離は、前記実施例１とサンプル、溶
離液、流速とも同一条件で行い、同様にして分離度を求
めた。Separation was performed under the same conditions for the sample, eluent, and flow rate as in Example 1, and the degree of separation was determined in the same manner.

【００４６】サンプルとしてピリジン、フェノール各５
３mg／５０mlを注入量１．５μｌで、またＫｐ値は、溶
離液アセトニトリル／水＝３／７、流速１．０ml／min
の条件下、各サンプルの保持時間から前記式［II］の計
算式により求めた。As a sample, pyridine and phenol each 5
3 mg / 50 ml was injected in a volume of 1.5 μl, and the Kp value was eluent acetonitrile / water = 3/7, flow rate 1.0 ml / min.
Was determined from the retention time of each sample by the above formula [II].

【００４７】これらのＫｐ値、分離度を表２に示した。Table 2 shows the Kp values and the degrees of separation.

【００４８】[0048]

【表２】 表２からＫｐ値が−１．０〜０．１である場合に優れた
分離度が得られることがわかる。[Table 2] From Table 2, it can be seen that an excellent degree of separation is obtained when the Kp value is -1.0 to 0.1.

【００４９】[0049]

【実施例１２】１α，２４―ジヒドロキシコレステロー
ルの粗生成物１２５０mgをテトラヒドロフランにて５ml
に定容して調製した試料溶液の０．４７mlを、市販充填
剤（ＹＭＣ社、ODS-20AM、粒径２０μｍ、細孔径１２０
オングストローム、Ｋｐ＝−０．４２、Ｒ₁ ＝Ｃ
₁₈Ｈ₃₇、Ｒ₂ 〜Ｒ₄ のうち少くともひとつは塩素原子又
はメチル基）を充填したカラム［YMC-SH-343-20AM 、カ
ラムサイズ：φ２０×２５０Ｌmm］に注入し、アセトニ
トリル／水＝７５／２５、流量２０ml／min （０．１０
cm／sec ）の溶離液で２０分で展開した。Ｒ及びＳ体の
溶出ピーク部を８分割し各々のフラクションを下記分析
法にて純度を確認し、相当するフラクションをまとめ溶
媒を溜去することにより１α，２４Ｒ―ジヒドロキシコ
レステロール５４mg（収率９５％、純度９９．１％）を
得た。Example 12 1250 mg of a crude product of 1α, 24-dihydroxycholesterol was added in 5 ml of tetrahydrofuran.
0.47 ml of a sample solution prepared in a constant volume by using a commercially available filler (YMC, ODS-20AM, particle size 20 μm, pore size 120).
_{Å, Kp = -0.42, R 1 =} C
₁₈ H ₃₇ , at least one of R _{2 to} R ₄ is a chlorine atom or a methyl group) and injected into a column [YMC-SH-343-20AM, column size: φ20 × 250 Lmm], and acetonitrile / water = 75 / 25, flow rate 20ml / min (0.10
cm / sec) in 20 minutes. The R and S-form elution peaks were divided into 8 parts, the purity of each fraction was confirmed by the following analytical method, the corresponding fractions were combined, and the solvent was distilled off to obtain 54 mg of 1α, 24R-dihydroxycholesterol (yield 95%). , Purity 99.1%).

【００５０】目的物１α，２４Ｒ―ジヒドロキシコレス
テロールを得たカラム性能は、３．４×１０^-2mg／min
・cm³ （カラム体積）であった。 ＜分析条件＞ カラム：YMC-AM-303（φ４．６×２５０ＬmmODS-AM、粒
径５μｍ、細孔径１２０オングストローム）， 溶離液：アセトニトリル／水＝６０／４０， 流量：１．５ml／min ， 検出波長：２０７nm， カラム温度：３０℃， ＨＰＬＣ：日本分光PU-880、UV-875 ＜カラム性能＞単位時間当り（分）、単位カラム空筒体
積当り（cc）に目的物、１α，２４Ｒ―ジヒドロキシコ
レステロールを分離する重量（mg）で表わす。The column performance of obtaining the target product 1α, 24R-dihydroxycholesterol was 3.4 × 10 ^-2 mg / min.
Cm ³ (column volume). <Analysis conditions> Column: YMC-AM-303 (φ4.6 × 250 L mm ODS-AM, particle size 5 μm, pore size 120 Å), eluent: acetonitrile / water = 60/40, flow rate: 1.5 ml / min, detection Wavelength: 207 nm, Column temperature: 30 ° C., HPLC: JASCO PU-880, UV-875 <Column performance> The target substance, 1α, 24R-dihydroxy per unit time (min) and unit column cylinder volume (cc) Expressed by weight (mg) to separate cholesterol.

【００５１】[0051]

【実施例１３】１α，２４―ジヒドロキシコレステロー
ルの粗生成物２０００mgをテトラヒドロフランにて１０
mlに定容して調製した試料溶液の１．３０mlを、市販充
填剤（ＹＭＣ社、ODS-50AQ、粒径５０μｍ、細孔径１２
０オングストローム、Ｋｐ＝−０．８８、Ｒ₁ ＝Ｃ₁₈Ｈ
₃₇、Ｒ₂ 〜Ｒ₄ のうち少くともひとつは塩素原子又はメ
チル基）を充填したカラム［YMC-SH-343-50AQ 、カラム
サイズ：φ２０×２５０Ｌmm］に注入した。溶離液とし
てメタノール／水＝７５／２５、流量３０ml／min 、３
７℃で４４分で溶出展開した。ピークを８分割した。各
々のフラクションを実施例１２と同様の分析法にて純度
を確認し、相当するフラクションをまとめ溶媒を溜去す
ることにより１α，２４Ｒ―ジヒドロキシコレステロー
ル９９mg（収率８０％、純度９８．０％）を得た。Example 13 2000 mg of a crude product of 1α, 24-dihydroxycholesterol was dissolved in tetrahydrofuran for 10 minutes.
1.30 ml of the sample solution prepared to a fixed volume of 0.1 ml was filled with a commercially available filler (YMC, ODS-50AQ, particle size 50 μm, pore size 12).
0 _{angstrom, Kp = -0.88, R 1 =} C 18 H
₃₇ , and at least one of R _{2 to} R ₄ was injected into a column [YMC-SH-343-50AQ, column size: φ20 × 250 Lmm] packed with a chlorine atom or a methyl group. Methanol / water = 75/25 as eluent, flow rate 30 ml / min, 3
It eluted and developed at 7 ° C for 44 minutes. The peak was divided into eight. The purity of each fraction was confirmed by the same analytical method as in Example 12, and the corresponding fractions were combined and the solvent was distilled off to give 99 mg of 1α, 24R-dihydroxycholesterol (yield 80%, purity 98.0%). I got

【００５２】目的物１α，２４Ｒ―ジヒドロキシコレス
テロールを得た。カラム性能は、２．９×１０^-2mg／mi
n ・cm³ （カラム体積）であった。The desired product 1α, 24R-dihydroxycholesterol was obtained. Column performance is 2.9 × 10 ^-2 mg / mi
n · cm ³ (column volume).

【００５３】[0053]

【実施例１４】１α，２４―ジヒドロキシコレスタ―
５，７―ジエンの粗生成物５００mgをテトラヒドロフラ
ンにて５mlに定容して調製した試料溶液の６００μｌ
を、市販充填剤（ＹＭＣ社、ODS-50AQ、粒径５０μｍ、
細孔径１２０オングストローム、Ｋｐ＝−０．８８、Ｒ
₁ ＝Ｃ₁₈Ｈ₃₇、Ｒ₂ 〜Ｒ₄ のうち少くともひとつは塩素
原子又はメチル基）を充填したカラム（カラムサイズ：
φ２０×２５０Ｌmm）に注入した。溶離液としてアセト
ニトリル／水＝５７／４３、流量２８ml／min 、２５℃
で約２０分で溶出展開し、ピークを８分割した。各々の
フラクションを実施例１２と同様の分析法にて純度を確
認し、相当するフラクションをまとめて溶媒を溜去する
ことにより１α，２４Ｒ―ジヒドロキシコレスタ―５，
７―ジエン２３mg（収率８０％、純度９８．０％）を得
た。Example 14 1α, 24-dihydroxycholester
600 μl of a sample solution prepared by making 500 mg of a crude product of 5,7-diene to a volume of 5 ml with tetrahydrofuran
With a commercially available filler (YMC, ODS-50AQ, particle size 50 μm,
120 Å pore diameter, Kp = −0.88, R
₁ = C ₁₈ H ₃₇ , at least one of R _{2 to} R ₄ is a chlorine atom or a methyl group) (column size:
(φ20 × 250 Lmm). Acetonitrile / water = 57/43, flow rate 28 ml / min, 25 ° C. as eluent
And eluted and developed in about 20 minutes, and the peak was divided into eight. The purity of each fraction was confirmed by the same analytical method as in Example 12, and the corresponding fractions were combined and the solvent was distilled off to give 1α, 24R-dihydroxycholester-5,
23 mg (yield 80%, purity 98.0%) of 7-diene were obtained.

【００５４】[0054]

【比較例３】１α，２４―ジヒドロキシコレステロール
の粗生成物２０００mgをイソプロピルアルコール４０ml
に溶解したアプライ溶液を、市販充填剤［大曹ゲルIR-1
20、シリカゲル、粒径１０〜２５μｍ、細孔径１２０オ
ングストローム］を充填したカラム［φ５０×１０００
Ｌmm］に注入して、ｎ―ヘキサン／イソプロピルアルコ
ール＝９５／５、流量１１４ml／min （０．１０cm／se
c ）の溶離液で２５℃で溶出展開した。溶出し終るのに
２８０分かかった。ピークを３０分割した。各フラクシ
ョンを分析カラムにて上記分取条件と同条件で分析し、
純度を確認し、相当するフラクションをまとめ溶媒を溜
去することにより１α，２４Ｒ―ジヒドロキシコレステ
ロール８２４mg（収率８４％、純度９９．７％）を得
た。Comparative Example 3 2000 mg of a crude product of 1α, 24-dihydroxycholesterol was added to 40 ml of isopropyl alcohol.
The applied solution dissolved in water was added to a commercially available filler [Soda soda gel IR-1].
20, silica gel, particle size 10 to 25 μm, pore size 120 Å]
Lmm], n-hexane / isopropyl alcohol = 95/5, flow rate 114 ml / min (0.10 cm / se
It eluted and developed at 25 degreeC with the eluent of c). It took 280 minutes to complete the elution. The peak was divided into 30. Analyze each fraction on the analytical column under the same conditions as the above fractionation conditions,
The purity was confirmed, the corresponding fractions were combined, and the solvent was distilled off to obtain 824 mg of 1α, 24R-dihydroxycholesterol (yield 84%, purity 99.7%).

【００５５】目的物１α，２４Ｒ―ジヒドロキシコレス
テロールを得るカラム性能は、１．５×１０^-3mg／min
・cm³ （カラム体積）であった。The column performance for obtaining the target product 1α, 24R-dihydroxycholesterol was 1.5 × 10 ⁻³ mg / min.
Cm ³ (column volume).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C07J 9/00 C07J 75/00 ──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of front page (58) Field surveyed (Int. Cl. ⁶ , DB name) C07J 9/00 C07J 75/00

Claims (4)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】２４―ヒドロキシコレステロール誘導体の
２４位エピマーの混合物から該誘導体の２４位エピマー
を分離するに際して、下記式［Ｉ］ 【化１】 ［式中、Ｒ₁ はＣ₁ 〜Ｃ₂₂の脂肪族基及び／又はＣ₆ 〜
Ｃ₁₀の芳香族基を示し、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ₄ はハロゲン原
子、低級アルコキシ基又は低級アルキル基であって、Ｒ
₂ 〜Ｒ₄ のうち少なくともひとつはハロゲン原子又は低
級アルコキシ基を示す。］で表わされるケイ素化合物を
反応させて得られるシリカゲルからなる充填剤で充填さ
れた液体クロマトグラフィーを使用することからなる該
誘導体の２４位エピマーの分離法。1. A method for separating the 24-position epimer of a 24-hydroxycholesterol derivative from a mixture of the 24-position epimer of the derivative, which is represented by the following formula [I]: [Wherein, R ₁ represents a C ₁ -C ₂₂ aliphatic group and / or C _6-
An aromatic group of _{C 10, R 2, R 3} , R 4 is a halogen atom, a lower alkoxy group or a lower alkyl radical, R
_At least one of _{2 to} R ₄ represents a halogen atom or a lower alkoxy group. And a liquid chromatography packed with a filler comprising silica gel obtained by reacting the silicon compound represented by the formula (1). 【請求項２】上記式［Ｉ］においてＲ₁ がＣ₄ 〜Ｃ₁₈の
脂肪族基又はＣ₆ のフェニル基であり、Ｒ₂ 、Ｒ₃ 、Ｒ
₄ はハロゲン原子、Ｃ₁ 〜Ｃ₄ の低級アルコキシ基、又
はＣ₁ 〜Ｃ₄ の低級アルキル基であって、Ｒ₂ 〜Ｒ₄ の
うち少なくともひとつはハロゲン原子又はＣ₁ 〜Ｃ₄ の
低級アルコキシ基である請求項１記載の分離法。2. In the above formula [I], R ₁ is a C ₄ -C ₁₈ aliphatic group or a C ₆ phenyl group, and R ₂ , R ₃ , R
_{And 4} is a halogen atom, a C ₁ -C ₄ lower alkoxy group, or a C ₁ -C ₄ lower alkyl group, and at least one of R ₂ -R ₄ is a halogen atom or a C ₁ -C ₄ lower alkoxy group. The separation method according to claim 1, which is a group. 【請求項３】該充填剤がアセトニトリル／水＝３０／７
０の組成を有する溶離液系において下記式［II］ 【数１】 で表わされるＫｐ値が−１．０〜０．２である請求項１
記載の分離法。3. The filler is acetonitrile / water = 30/7.
In an eluent system having a composition of 0, the following formula [II] The Kp value represented by the formula is from -1.0 to 0.2.
Separation method as described. 【請求項４】該誘導体が１α，２４―ジヒドロキシコレ
ステロール、又は１α，２４―ジヒドロキシコレスタ―
５，７―ジエンである請求項１記載の分離法。(4) the derivative is 1α, 24-dihydroxycholesterol or 1α, 24-dihydroxycholesterase;
2. The separation method according to claim 1, wherein the separation method is 5,7-diene.