JP2984584B2 - ラッカーゼiiおよびその生産方法 - Google Patents
ラッカーゼiiおよびその生産方法Info
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Description
用性に優れかつ、フェノール化合物にも作用する、耐熱
性の良いラッカーゼIIおよびこのようなラッカーゼIIを
担子菌培養物から生産する方法に関する。
ゼまたはリグニン分解酵素とも呼ばれ、酸素の存在下、
フェノール性化合物を酸化する酵素である。ラッカーゼ
は、リグニン分解作用、ウルシオールやラッコール等の
芳香族化合物の酸化重合作用を有する為、例えば、毒性
の強い芳香族アミンを含む廃液の処理、パルプ製造処理
等におけるリグニン除去、人工漆の製造、コンクリート
混和剤の合成(日経バイオテク、1993年10月25日)、ココ
ア、コーヒー及び紅茶の褐変処理(元田ら、日本食品工
業学会誌、第29巻、第1号、p11-15、(1982))、化粧品
用メラニン製造(特開平6-90776号公報)、臨床検査試薬
(特開昭59-227300号公報)など様々な用途が期待されて
いる。人工漆製造には、漆の指触乾燥の効果を高めるた
め、酸化力が強く、かつ耐熱性の良好なラッカーゼが、
特に必要である(寺田ら、塗装工学、Vol.26、No.6、(1
991))。また、パルプ製造処理におけるリグニン除去お
よび芳香族アミン廃液処理でも、屋外で夏期に実施する
場合には高温となるため、熱安定性に優れるラッカーゼ
が必要とされる。特に芳香族アミンは、微生物を使った
活性汚泥法では除去困難であるため、芳香族アミンに作
用性の高い酵素を使った処理が望まれる。
るラッカーゼが知られている。例えば、木材腐朽菌であ
る、シゾフィラン・コミューン、コリオラス・ベルシカ
ラー(特開昭62-220190号公報)、レンチテス・ベツリ
ナ(特公平7-46989号公報)、ピクノポラス・コクシネ
ウス(寺田ら、塗装工学、Vol.26,No.6,(1991))、不完
全菌類のボツリチス・シネレア(インダストリアル・バ
イオプロセシング、6月号(1994))に由来するラッカー
ゼが知られている。この他、動物、植物にもラッカーゼ
の存在が知られている。
族アミン類に特異性が低いこと、耐熱性が低い等の理由
から、上記用途、特に芳香族アミンを含む廃液の処理へ
の実用化がなされていないのが現状である。
課題を解決するものであり、その目的とするところは、
芳香族アミンへの作用性が高くかつフェノール化合物に
も作用する耐熱性の良好なラッカーゼII、その生産方法
および生産菌を提供することである。これまで芳香族ア
ミン類に作用性の高い耐熱性のラッカーゼおよびこれを
生産する微生物は知られていない。
タケ(Trametes)属に属する、新たに単離した担子菌か
ら、新規なラッカーゼIIを誘導し、本発明を完全するに
至った。
る。 (1)分子量:約62,000である。 (2)作用適温の範囲:至適温度は78℃以上である。 (3)熱安定性:pH7.8で30分間保持した場合に、約55
℃まで安定である。 (4)至適pH:約5.0である。 (5)安定pH範囲:30℃で3時間処理する場合におい
て、pH5.0〜10.0である。 (6)等電点:約5.9である。 このことによって上記目的が達成される。
の担子菌、特に平成6年8月12日に工業技術院生命工学
工業技術研究所(生命研と略称する)に寄託したTramet
es sp. Ha1株(生命研菌寄第14472号;FERM P-14472)
により生産される。このことによって上記目的が達成さ
れる。
ーゼIIは銅分子を有する青緑色のタンパク質であって、
さらに阻害剤、メルカプトエタノール、システィン、ジ
チオスレイトール、アジ化ナトリウム、シアン化カリウ
ム、およびα−ナフトールで阻害される。
由来のラッカーゼは、これまで知られていない。
生産菌をp−キシリジンの存在下で培養し、培養物より
該ラッカーゼIIを分離精製する工程を包含する。このこ
とによって上記目的が達成される。
の担子菌、特にTrametes sp. Ha1株(生命研菌寄第1447
2号;FERM P-14472)により生産される。この菌株は、
発明者らが土壌、海水および淡水、ならびに腐朽物から
ラッカーゼを生産する微生物を広くスクリーニングした
結果、新たに竹の枯葉から単離された新菌株である。
リグニン分解能を有する白色腐朽菌であること、培養菌
糸に骨格菌糸およびかすがい連結(clamp connection)
を有するがシスチジアおよび剛毛状菌糸などの異形細胞
は存在しないこと、ならびに培養菌糸に分生胞子が形成
されないこと、等の菌学的性質を有することにより、ホ
ウロクタケ(Trametes)属に属する担子菌と同定され、
Trametessp. Ha1と命名した。
通りである。
後7日目において、コロニーの表面および裏面は共に白
色であり、直径5〜10mmに成長し、気中菌糸は短く
密で綿毛状である。菌糸は、特徴的な結合菌糸を伴い、
少数の骨格菌糸が認められ、かすがい連結を有する。菌
糸の表面は、平坦であり、幅は2〜6μmである。シス
チジアおよび剛毛状菌糸は認められない。分生胞子の形
成は認められない。
おいて、コロニーの表面は白色、裏面は薄茶色であり、
直径3〜7mmに成長し、気中菌糸は短く疎である。菌
糸は、特徴的な結合菌糸を伴い、少数の骨格菌糸が認め
られ、かすがい連結を有する。菌糸の表面は、平坦であ
り、幅1〜4μmである。分生胞子の形成は認められな
い。
の没食子酸または0.5%のタンニン酸を含むサブロー
寒天培地に本菌を接種し、30℃で培養条件下、菌体の
周囲が褐変する反応陽性が認められる。従って、本菌は
リグニン分解性木材腐朽菌(白色腐朽菌)の一種であ
る。
培地(ポテトエキス末4g、ブドウ糖20gおよび寒天2
0gを、1リットルの蒸留水中に溶解する。)におい
て、約4〜40℃、pHは約2〜12であり、生育好適
温度は25〜35℃、生育好適pHは4.0〜8.0であ
る。特に好ましい生育条件は、30℃でpHが約5.5
である。
するための条件について説明する。本菌は、液体培養ま
たは固体培養のいずれでも培養し得る。本菌を生育させ
る培地としては、特に限定されず、通常の液体培地また
は固体培地が用いられる。炭素源としては、本菌が同化
し得るものなら何でもよく、グルコース、ショ糖、糖蜜
等の糖類、澱粉、木粉、麩(フスマ)などが用いられ得
る。窒素源としては、ペプトン、酵母エキス、麦芽エキ
ス、肉エキス、大豆分解物、尿素、アミノ酸などの有機
窒素源の他、硝酸アンモニウム、硝酸ナトリウム等の無
機窒素源も使用し得る。必要に応じてリン酸塩、硫酸マ
グネシウム、カリウム、カルシウム、銅、ナトリウム、
マンガン、亜鉛等の無機塩類、ビタミン類、核酸関連化
合物類等が添加され得る。これら培地成分は、本菌の生
育を阻害しない濃度であればよく、炭素源は0.1〜2
0重量%、好ましくは5〜10重量%、窒素源は0.0
1〜5重量%、好ましくは0.1〜2重量%である。
は4.0〜8.0に調製し、滅菌して使用する。培養温度
は、担子菌類が生育し得る温度であればよく、実用上、
10〜40℃、好ましくは25〜35℃である。本菌を
液体培養する場合は、通気培養または振盪培養が好まし
い。培養時間は、種々の培養条件によって異なるが、通
気または振盪培養の場合は、通常2〜10日間が好まし
い。
により誘導後菌体外に分泌生産され、培養液中に蓄積さ
れる。p−キシリジンは培地に最終濃度が1mM〜20mM、
より好ましくは1mM〜5mMとなるように添加される。
製 本菌の培養液から本発明のラッカーゼII(以下、本ラッ
カーゼIIという)を分離精製するには、既知の精製法、
例えば透析、塩析、各種カラムクロマトグラフィー、等
電点沈澱、ゲル濾過、電気泳動が単独もしくは併用して
利用され得る。培養後、菌体等の不溶物を遠心分離、濾
紙または濾布などによる濾過等により除去し、本ラッカ
ーゼIIを含む培養液(粗酵素液)を回収する。濃縮、硫
安分画(塩析)、透析、各種クロマトグラフィー、ゲル
濾過などの一般的に用いられる酵素の精製方法により、
得られた粗酵素液から本ラッカーゼIIが精製され得る。
例えば、上記得られた粗酵素液を濃縮後、透析、各種ク
ロマトグラフィー、限外濾過、等電点電気泳動に順次供
試することにより、精製された高活性の本ラッカーゼII
を含有する画分が得られる。
が触媒する、4-アミノアンチピリンと、水素供与体との
酸化縮合による発色反応で測定する。水素供与体として
はフェノール、N,N-ジエチルアニリン(DEA)が挙げら
れる。酸化縮合による発色反応系において、505nm(フ
ェノール)あるいは555nm(DEA)における吸光度を測定
した。本願においては、7.5マイクロモルのフェノール
および1.25マイクロモルの4-アミノアンチピリンを含む
190mM酢酸ナトリウム緩衝液(pH4.5)520μlを30℃にて
1分間プレインキュベートした後、酵素液20μlを混
合して、505nmの吸光度の変化を測定した。1分間に吸
光度を0.01増加させる酵素活性を1単位(U;ユニッ
ト)とする。
説明するが、これらはなんら本発明を限定するものでは
ない。
Lを含有する2L容坂口フラスコ(2本)で28℃、7日間
振盪培養する(130r.p.m.,往復振盪)。
ルコースを添加し、更に一方には20mMとなるようp-キ
シリジンを添加する。
以下の本培養用培地を含む50L容培養タンクに植菌し28
℃で10日間、通気攪拌培養(攪拌回数300r.p.m.)し
た。
た後、殺菌済培地へ添加した。培養5日目からは培養液
のpHが下がったが、0.5M苛性ソーダにて、5.5〜6.0にな
るよう調整した。この様に培養した結果、タンクの培養
液は、8日目で94(U/mL)と活性は最高値を示し、10日目
で71(U/mL)と減少した。
液を遠心処理(8,000r.p.m.,20min)して得た上清を濾
紙で濾過し、回収した濾液を粗酵素液とした。
整し限外濾過により濃縮後、20mMトリス−塩酸緩衝液
(pH7.5)で透析し、凍結した(−80〜−20℃)。これ
を融解し不溶物を遠心分離により除去して、上清を得
た。
7.5)で平衡化したDEAE−セファセルカラム(5.5×18.7
cm;Pharmacia社製)に供試した。上記カラムを同緩衝
液で洗浄後、10mMリン酸カリウム緩衝液(pH5.7)によ
り、上記カラムに吸着された本ラッカーゼIIを溶出し、
分画回収した。本ラッカーゼIIは、カラムでの溶出移動
中、緑青色のバンドとなって現れるので、分画回収は、
カラム溶出口から本ラッカーゼIIが溶出される直前から
始めた。
性の測定に供試し、比活性(活性値(U/mL)/OD280)を
測定した。比活性がが45以上であった画分を合わせ、限
外濾過により濃縮した。濃縮液を0.5M塩化ナトリウム含
有20mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5;以下、STHBと略
記)に対して透析し、透析内液を得た。
セファロースカラム(5.5×6cm;Pharmacia社製)に供
試した。非吸着物質を洗浄溶出後、1M D-グルコースを
含む上記緩衝液を用いて本ラッカーゼIIを溶出したが、
活性のテーリングがみられたので0.1Mホウ酸含有リン酸
カリウム緩衝液で完全に溶出した。本ラッカーゼIIを含
む液は0.5M苛性ソーダでpH7に調整後、限外濾過により
濃縮し、そして10mMトリス−塩酸緩衝液(pH7.5)で透
析した。透析内液に生じた不溶物を遠心分離で除いた。
得られた上清についてはポアサイズが0.2μmのフィルタ
ーで濾過した。濾液を分取用等電点電気泳動装置(ロト
フォア;Bio-Rad社製)に供試し、更に分画精製し、酵
素精製液を得た。
の精製度およびタンパク質溶液当たりの比活性を表3に
示す。
ル電気泳動(SDS-PAGE)法(Laemli,U.K., Nature,227,
680(1970))で本ラッカーゼIIの分子量を測定した。
および分子量マーカーとして既知の6種のタンパク質
(分子量約97,400、66,300、42,400、30,000、20,100お
よび14,400)を同時に泳動した。泳動終了後、クーマシ
ーブリリアントブルーで染色し、本ラッカーゼIIと各分
子量マーカーとの相対泳動距離より本ラッカーゼIIの分
子量を測定した。
一バンドを示した。本ラッカーゼIIのSDS-PAGEにおける
分子量は、約62,000である。
性を、上記発色反応系において種々の温度条件(15、2
0、30、40、50、60、70、78℃)下で測定した。結果を
図1に示す。図中の横軸は反応温度(℃)を表し、縦軸
は最大活性値を100とした場合の相対活性(%)を表す。本
ラッカーゼIIの至適温度は78℃以上である。
々の温度条件(0、30、40、45、50、55、60、65、70、
95℃)下、リン酸緩衝液(pH7.8)中で30分間インキュ
ベートした後、活性を測定した。結果を図2に示す。図
中の横軸は処理温度(℃)を表し、縦軸は最大活性値を
100とした場合の相対残存活性(%)を表す。本ラッカーゼ
IIは処理温度が60℃の場合においても酵素活性の70%以
上が保持され、安定である。本ラッカーゼIIは、処理温
度条件が55℃では、酵素活性は100%保持される。
たは50mMトリス塩酸緩衝液を用いて、pHを1.5〜7.8(1.
5、3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.1、7.1、7.3、7.5、7.
8)に調整し、上記実施例2で得られた精製された本ラ
ッカーゼIIの活性を測定した。結果を図3に示す。図中
の横軸は反応pHを表し、縦軸は最大活性値を100とした
場合の相対活性(%)を表す。本ラッカーゼIIの至適pH
は、約5.0である。
(1.5、3.0、4.0、4.6、5.0、5.5、6.1、7.1、7.3、7.
5、7.8、8.9、9.0、10.3、11.3、12.0)に調整し、30℃
で3時間インキュベートした。次いで、各pH処理液中の
活性を測定した。結果を図4に示す。図中の横軸は処理
pHを表し、縦軸は最大活性値を100とした場合の相対残
存活性(%)を表す。本ラッカーゼIIの安定pH範囲は、5.0
〜10.0である。
ラッカーゼIIの等電点を測定した。測定の結果、本ラッ
カーゼIIの等電点は、約5.9である。
れた本ラッカーゼIIの基質特異性を検討した。基質とし
て、カテコール、レゾルシノール、ヒドロキノン、カフ
ェイン酸、ヒドロカフェイン酸、グアヤコール、ピロガ
ロール、o-クレゾール、m-クレゾール、p-クレゾール、
p-ヒドロキシ安息香酸、フェノール、2,6-ジメトキシフ
ェノール、p-フェニレンジアミン、p-トルイジン、ジメ
チルアニリン、ジエチルアニリン、TOOS(N-エチル-N-
(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-3-メチルアニリ
ン)、ABTS(2,2'-アジノ−ビス(3-エチルベンゾチアゾ
リン-6-スルホン酸))、3-インドール酢酸、3-インド
ールアセトニトリル、L(+)-アスコルビン酸、3-メチル
カテコール、4-メチルカテコールまたは4-クロロカテコ
ールを用いた。測定は基質の酸化に伴う酸素消費量を酸
素電極により電気信号に変換する酸素電極法によった。
詳細には、10マイクロモルの上記基質を含む200mM酢酸
ナトリウム緩衝液(pH4.5)1980μlを、30℃で、10分
間、空気中で平衡化した後、酵素液20μlを添加するこ
とで反応を開始し、クラーク型酸素電極で酸素の消費量
を測定した。本ラッカーゼIIの他に、比較の為に、ピク
ノポラス・コクシネウスおよびコリオラス・ベルシカラ
ー由来のラッカーゼについても同様に調べた。カテコー
ルを基質とした場合の測定値を100とした、相対値(%)を
表4に示す。
2,6-ジヒドロキシフェノールといった一部のフェノール
化合物や、p-トルイジン、ジメチルアニリン、ジエチル
アニリン、TOOSなどの芳香族アミンに対して特に高い特
異性を示した。L(+)-アスコルビン酸に対する特異性も
他のラッカーゼと異なる。
本ラッカーゼIIの阻害剤を検討した。阻害剤として、
α,α-ジピリジル、アセチルアセトン、システィン、ジ
チオスレイトール、シアン化カリウム、ネオクプロイ
ン、メルカプトエタノール、α-ナフトール、チオシア
ン酸バリウム、フェニルヒドラジンまたはアジ化ナトリ
ウムを用いて、これらの阻害剤による酵素活性阻害度を
測定することにより阻害活性を調べた。詳細には分光光
度計内で30℃恒温条件下マイクロセル中で行い、0.6マ
イクロモルの上記阻害剤を含む218mM酢酸ナトリウム緩
衝液(pH5.0)550μlを入れ、酵素液20μlを添加した。
3分間反応させた後、0.1M p-フェニレンジアミン溶液
を30μl添加し、460nmの波長における吸光度の変化を調
べた。阻害剤を添加しない時の1分間当たりの吸光度の
増加量を100として、阻害活性を表した。その結果を表
5に示す。
化合物(システィン、ジチオスレイトール、メルカプト
エタノールなど)および電子伝達系阻害剤(シアン化カ
リウム、α-ナフトール、アジ化ナトリウムなど)に強
く阻害された。これは、従来知られているラッカーゼの
阻害剤と同じであった。
ッカーゼ、およびその生産方法が提供される。本ラッカ
ーゼIIは、従来のラッカーゼに比べ、芳香族アミン類へ
の作用が高くフェノール化合物にも作用し、かつ、耐熱
性も良好である。そのため、本ラッカーゼIIは、芳香族
アミンやフェノールを含有する廃液の処理、人工漆の生
産、パルプ製造処理工程、有用ポリフェノールの合成等
に有用である。本ラッカーゼIIは、担子菌の培養によっ
て生産されるため、安価に大量に本ラッカーゼIIを提供
することができ、試薬または工業用途に広く利用され得
る。
た場合の相対活性を示す。
キュベーション後に測定した相対残存活性を示す。
した場合の相対活性を示す。
で3時間インキュベーション後に測定した相対残存活性
を示す。
Claims (5)
- 【請求項1】 以下の特性 (1)分子量:約62,000; (2)作用適温の範囲:至適温度は78℃以上である; (3)熱安定性:pH7.8で30分間保持した場合
に、約55℃まで安定である; (4)至適pH:約5.0;および(5)基質特異性:フェノール化合物および芳香族アミ
ンと作用する; を有するラッカーゼII。 - 【請求項2】 請求項1に記載のラッカーゼIIであっ
て、以下の特性(6)安定pH範囲:30℃で3時間処
理する場合において、pH5.0〜10.0;および (7)等電点:約5.9; をさらに有する、ラッカーゼII。 - 【請求項3】 ホウロクタケ(Trametes)属に
属する担子菌Trametes sp. Hal株(生
命研菌寄託第14472号)が生産する、請求項1また
は2に記載のラッカーゼII。 - 【請求項4】 以下の特性: (1)分子量:約62,000; (2)作用適温の範囲:至適温度は78℃以上である; (3)熱安定性:pH7.8で30分間保持した場合
に、約55℃まで安定である; (4)至適pH:約5.0;および(5)基質特異性:フェノール化合物および芳香族アミ
ンと作用する; を有するラッカーゼIIを生産する方法であって、該ラ
ッカーゼIIを生産するホウロクタケ属に属する担子菌
をp−キシリジンの存在下で培養する工程、及び、培養
物より該ラッカーゼIIを分離精製する工程を包含す
る、方法。 - 【請求項5】 前記ラッカーゼIIが、以下の特性: (6)安定pH範囲:30℃で3時間処理する場合にお
いて、pH5.0〜10 .0;および (7)等電点:約5.9; をさらに有する、請求項4に記載の方法。
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---|---|---|---|
JP21085995A JP2984584B2 (ja) | 1995-08-18 | 1995-08-18 | ラッカーゼiiおよびその生産方法 |
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JP21085995A JP2984584B2 (ja) | 1995-08-18 | 1995-08-18 | ラッカーゼiiおよびその生産方法 |
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JPH0956378A JPH0956378A (ja) | 1997-03-04 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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US7183090B2 (en) | 2000-05-23 | 2007-02-27 | Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus | Laccase enzyme and the gene encoding the enzyme |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100516443B1 (ko) * | 1998-11-04 | 2005-11-25 | 씨제이 주식회사 | 미생물을 이용한 효소 락카아제의 제조방법 |
JP4446085B2 (ja) | 2001-10-05 | 2010-04-07 | 独立行政法人産業技術総合研究所 | フェノールオキシダーゼ遺伝子を導入した植物、及び該植物によるフェノールオキシダーゼの生産方法 |
-
1995
- 1995-08-18 JP JP21085995A patent/JP2984584B2/ja not_active Expired - Fee Related
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Title |
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Applied and Environmental Microbiology,61(5)(May 1995),p.1876−1880 |
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US7183090B2 (en) | 2000-05-23 | 2007-02-27 | Valtion Teknillinen Tutkimuskeskus | Laccase enzyme and the gene encoding the enzyme |
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JPH0956378A (ja) | 1997-03-04 |
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