JP2981548B1 - DNA purification method - Google Patents

Abstract

【要約】 【解決手段】 ムコ多糖類が混在するＤＮＡ溶液から、
ＤＮＡとムコ多糖類の吸着性の差異を利用してＤＮＡを
精製する方法において、吸着性物質としてヒドロキシア
パタイトを用いることを特徴とする、ＤＮＡの精製方
法。 【効果】 本発明によれば、ムコ多糖類が混在するＤＮ
Ａ溶液からムコ多糖類を除去して高純度のＤＮＡを大量
に、しかも複数検体から同時に精製する簡便な方法が提
供される。本発明方法によれば、ムコ多糖類を含有する
生物試料１ｇ（湿重量）からサザンブロッティング等の
遺伝子分析に供するに十分な量である10μｇ以上の精製
ＤＮＡを得ることができる。Abstract: A DNA solution containing a mucopolysaccharide is used.
What is claimed is: 1. A method for purifying DNA by utilizing the difference in adsorptivity between DNA and mucopolysaccharide, characterized in that hydroxyapatite is used as an adsorbent substance. According to the present invention, DN containing mucopolysaccharide is mixed.
A simple method is provided which removes mucopolysaccharides from solution A and purifies large amounts of high-purity DNA simultaneously from a plurality of samples. According to the method of the present invention, it is possible to obtain 10 μg or more of purified DNA, which is a sufficient amount for use in gene analysis such as Southern blotting, from 1 g (wet weight) of a biological sample containing mucopolysaccharide.

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、ムコ多糖類が混在
するＤＮＡ溶液からＤＮＡを精製する方法に関する。特
に、本発明は、アコヤガイ等の貝類や多くの藻類などム
コ多糖類を大量に含有する生物試料から抽出したＤＮＡ
溶液に混在するムコ多糖類を除去し、高純度のＤＮＡを
大量に精製する方法に関する。[0001] The present invention relates to a method for purifying DNA from a DNA solution containing mucopolysaccharides. In particular, the present invention relates to DNA extracted from a biological sample containing a large amount of mucopolysaccharides such as shellfish such as pearl oysters and many algae.
The present invention relates to a method for removing mucopolysaccharides mixed in a solution and purifying a large amount of high-purity DNA.

【０００２】[0002]

【従来の技術】近年、水産生物の遺伝的系統や品種を調
べたり、種苗の遺伝的多様性を検査して近交弱性の危険
を予防するなど対象生物の遺伝的特性を評価する必要性
が高まっている。ＤＮＡをかかる遺伝子解析に供するた
めには、対象生物の個体、器官、組織、または培養細胞
からのＤＮＡが、高分子量を維持したままで、しかも酵
素反応の基質となりうる純度にまで精製されていなけれ
ばならない。殊に、PCRやサザンブロッティングなどの
高感度遺伝子検出法を用いる最近の研究では、その対象
のＤＮＡが高純度に精製されていることが前提となる。2. Description of the Related Art In recent years, it has been necessary to evaluate the genetic characteristics of target organisms, such as examining the genetic lineage and variety of aquatic products, and examining the genetic diversity of seeds and seedlings to prevent the risk of inbreeding weakness. Is growing. In order for the DNA to be subjected to such genetic analysis, the DNA from an individual, an organ, a tissue, or a cultured cell of the target organism must be purified while maintaining a high molecular weight and at a purity that can serve as a substrate for the enzymatic reaction. Must. In particular, recent studies using high-sensitivity gene detection methods such as PCR and Southern blotting assume that the target DNA is highly purified.

【０００３】これまで生物試料からＤＮＡを精製するに
は、一般的には、細断した生物個体、器官、組織、ある
いは培養細胞をドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等で
溶解し、蛋白質分解酵素を加えてインキュベートして蛋
白質を分解し、その後フェノール抽出またはヨウ化ナト
リウム処理、または塩析法による蛋白質の沈殿除去を行
なった後、エタノールまたはイソプロパノールを加えて
ＤＮＡ画分を沈殿させることにより行われている。[0003] Conventionally, to purify DNA from a biological sample, generally, shredded biological individuals, organs, tissues, or cultured cells are dissolved in sodium dodecyl sulfate (SDS) or the like, and a protease is added thereto. To decompose the protein, and then perform phenol extraction or sodium iodide treatment, or precipitation and removal of the protein by salting out, and then add ethanol or isopropanol to precipitate the DNA fraction. .

【０００４】ところが、貝類や藻類などのムコ多糖類を
多量に含有する生物試料では、上記の手法にてＤＮＡを
精製してもムコ多糖類が除去されずに残ってしまう。ム
コ多糖類がＤＮＡ試料中に混在すると、制限酵素による
ＤＮＡの切断反応や耐熱性ＤＮＡポリメラーゼ等の酵素
反応が阻害され、その結果、PCRを利用した技術やサザ
ンブロッティング、マイクロサテライトＤＮＡフィンガ
ープリント法等への応用が出来ないなど問題が生じる。However, in a biological sample containing a large amount of mucopolysaccharide such as shellfish and algae, mucopolysaccharide remains without being removed even if the DNA is purified by the above-mentioned method. When mucopolysaccharides are mixed in a DNA sample, the DNA cleavage reaction by restriction enzymes and enzyme reactions such as thermostable DNA polymerase are inhibited, and as a result, PCR-based techniques, Southern blotting, microsatellite DNA fingerprinting, etc. Problems arise, such as inability to apply to

【０００５】これまでムコ多糖類のＤＮＡ溶液からの除
去には、一般的にはセチルトリメチルアンモニウムブロ
ミド（ＣＴＡＢ）処理、ボロン修飾ビーズによる処理等
がなされており、生物種によっては良好な結果を得てい
るが、貝類の一部や藻類など多量にムコ多糖類を含む生
物試料からのＤＮＡの精製には有効ではない場合が多
い。また、ＤＮＡ試料を精製する他の方法として、市販
のスピンカラム等が用いられている。これは、ＤＮＡの
リン酸基の負電荷を利用してシリカやDEAE等の担体にＤ
ＮＡを一時吸着させ、不純物を緩衝液で洗い流し、その
後ｐＨや塩強度を変えてＤＮＡを担体から溶出させて得
るのであるが、ムコ多糖類の多くは負電荷を持っている
ためＤＮＡと同じ挙動を示し除去することはできない。Until now, the removal of mucopolysaccharides from DNA solutions has generally been carried out by cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) treatment, treatment with boron-modified beads, etc., and good results are obtained depending on the species. However, in many cases, it is not effective for purifying DNA from a biological sample containing a large amount of mucopolysaccharide such as a part of shellfish or algae. As another method for purifying a DNA sample, a commercially available spin column or the like is used. This is achieved by utilizing the negative charge of the phosphate group of DNA to form a carrier on silica or DEAE.
DNA is eluted from the carrier by temporarily adsorbing NA, washing out impurities with a buffer solution, and then changing the pH and salt strength.Mucopolysaccharides have the same behavior as DNA because they have a negative charge And cannot be removed.

【０００６】一方、ヒドロキシアパタイトを用いてＤＮ
Ａを精製することに関し、既にいくつかの報告があるが
[Wu, R. Jay, E. and Roychoudhury, R. (1976), Meth
odsCancer Res. 12:87-176、Wilkie N.M.and Cortini
R. (1976), Journal of Virology 20:211-221]、それら
はアガロースゲル電気泳動で分離したＤＮＡの精製を目
的としたものであり、ゲル電気泳動やエレクトロエリュ
ーションとの組合せで用いられていて、多検体の同時精
製処理には適さない。したがって、かかる方法では、生
物試料１ｇ当たりから10μｇ以上の精製ＤＮＡを複数検
体から同時に得ることは至難である。On the other hand, using hydroxyapatite for DN
There have already been some reports on the purification of A.
[Wu, R. Jay, E. and Roychoudhury, R. (1976), Meth
odsCancer Res. 12: 87-176, Wilkie NMand Cortini
R. (1976), Journal of Virology 20: 211-221], which aims to purify DNA separated by agarose gel electrophoresis and has been used in combination with gel electrophoresis and electroelution. Therefore, it is not suitable for simultaneous purification of multiple samples. Therefore, in such a method, it is extremely difficult to simultaneously obtain 10 μg or more of purified DNA from multiple specimens per 1 g of biological sample.

【０００７】また別の方法として、ＤＮＡをアガロース
ゲル電気泳動して、アガロースゲル電気泳動途中でDEAE
メンブレンなどの陽電荷膜に吸着させることによりムコ
多糖類を除く方法もあるが [Sambrook,J., Fristsch,
E.F. and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, a
laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 6:24-27] 、かかる方法もまた、1
5キロベース以上の長いＤＮＡでは極めて収率が悪く、
生物試料１ｇ当たりから10μｇ以上の精製ＤＮＡを複数
検体から同時に得ることは至難である。[0007] As another method, DNA is subjected to agarose gel electrophoresis, and DEAE is performed during the agarose gel electrophoresis.
There is also a method of removing mucopolysaccharides by adsorbing on a positively charged membrane such as a membrane, but [Sambrook, J., Fristsch,
EF and Maniatis, T. (1989), Molecular Cloning, a
laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbo
r Laboratory Press, 6: 24-27]
The yield is extremely poor for DNAs longer than 5 kilobases,
It is extremely difficult to simultaneously obtain 10 μg or more of purified DNA from multiple specimens per 1 g of biological sample.

【０００８】[0008]

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の課題
は、ムコ多糖類が混在するＤＮＡ溶液からムコ多糖類を
除去して高純度のＤＮＡを大量に、しかも複数検体から
同時に精製する簡便な方法を提供することにある。SUMMARY OF THE INVENTION Accordingly, an object of the present invention is to remove mucopolysaccharides from a DNA solution containing mucopolysaccharides and to purify large amounts of high-purity DNA simultaneously from a plurality of samples. It is to provide a method.

【０００９】[0009]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、ムコ多糖類を含有
する生物試料から抽出したＤＮＡ溶液をヒドロキシアパ
タイトを用いて精製することにより、高純度のＤＮＡを
大量に得ることができることを見出し、本発明を完成さ
せるに至った。すなわち、本発明は、ムコ多糖類が混在
するＤＮＡ溶液から、ＤＮＡとムコ多糖類の吸着性の差
異を利用してＤＮＡを精製する方法において、吸着性物
質としてヒドロキシアパタイトを用いることを特徴とす
る、ＤＮＡの精製方法である。本発明はまた、生物試料
を尿素を含有する緩衝液にて抽出することにより得られ
たムコ多糖類が混在するＤＮＡ溶液から、ＤＮＡとムコ
多糖類の吸着性の差異を利用してＤＮＡを精製する方法
において、吸着性物質としてヒドロキシアパタイトを用
いることを特徴とする、ＤＮＡの精製方法である。以
下、本発明を詳細に説明する。Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies to solve the above-mentioned problems, and as a result, have purified a DNA solution extracted from a biological sample containing mucopolysaccharide using hydroxyapatite. As a result, it was found that a large amount of highly pure DNA can be obtained, and the present invention was completed. That is, the present invention provides a method for purifying DNA from a DNA solution containing mucopolysaccharides by utilizing the difference in absorptivity between DNA and mucopolysaccharides, wherein hydroxyapatite is used as an adsorbent substance. And a method for purifying DNA. The present invention also provides a method for purifying DNA from a DNA solution containing mucopolysaccharides obtained by extracting a biological sample with a buffer containing urea, utilizing the difference in the adsorptivity between the DNA and the mucopolysaccharides. A method for purifying DNA, characterized in that hydroxyapatite is used as an adsorbent substance. Hereinafter, the present invention will be described in detail.

【００１０】[0010]

【発明の実施の形態】本発明のＤＮＡの精製方法の対象
となる生物試料としては、ムコ多糖類を含有する生物試
料であれば特に限定はされないが、具体的にはムコ多糖
類が多量に含まれるアコヤガイ・シロチョウガイ・クロ
チョウガイ・マルドブガイ・カラスガイ・イケチョウガ
イ・カワシンジュガイ等の海産および淡水産の貝類、ま
たはカイガラアマノリ・アサクサノリ・スサビノリ・マ
クサ等の紅藻類、ヒトエグサ・アオサ・ウスバアオノリ
等の緑藻類、コンブ・ワカメ・モズク等の褐藻類、珪藻
類等から選ばれる藻類、あるいはシラカバ・マツタケ・
イチゴ、サトイモ等の陸上植物が挙げられる。BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION The biological sample to be subjected to the DNA purification method of the present invention is not particularly limited as long as it is a biological sample containing mucopolysaccharide, but specifically, a large amount of mucopolysaccharide. Included are marine and freshwater mussels such as pearl oysters, white mussels, black mussels, mussels, mussels, pokeweeds, and mussels, or red algae such as kaigaramamanori, asakusanori, susabinori, maxa, and green alga, such as amanita, aosa, and umebaanori. Algae selected from brown algae such as kelp, wakame and mozuku, diatoms, and birch, matsutake,
Land plants such as strawberry and taro.

【００１１】生物試料からのＤＮＡの抽出は、上記に挙
げた生物の個体、器官、組織または培養細胞に対して行
えばよい。本発明において生物試料からのＤＮＡの抽出
は、ＤＮＡの抽出に常套的に用いられるトリス塩酸緩衝
液に、ＳＤＳなど細胞を溶解するための界面活性剤、Ｄ
ＮＡ分解を防ぐEDTAを添加した緩衝液にて行い、好適に
は尿素を含有させたものがよい。尿素を含有する抽出液
としては、具体的には、後記実施例に記載する組成を有
するTNES−UREA緩衝液が好適に使用される。The extraction of DNA from a biological sample may be performed on an individual, organ, tissue or cultured cell of the above-mentioned organism. In the present invention, extraction of DNA from a biological sample is performed by adding a surfactant such as SDS to a Tris-HCl buffer commonly used for DNA extraction, such as SDS, for lysing cells.
It is performed in a buffer solution to which EDTA for preventing NA degradation is added, and preferably a solution containing urea is preferable. As the urea-containing extract, specifically, a TNES-UREA buffer having a composition described in Examples described later is suitably used.

【００１２】ＤＮＡの抽出は、例えば上記生物試料の組
織を細断または破砕したものを、その重量(g)の10〜20
倍量(ml)程度のTNES−UREA緩衝液中で70〜80℃でまず５
分間インキュベートし、その後56℃で8〜24時間インキ
ュベートすることにより行う。また、上記のＤＮＡの抽
出において56℃に移行した後に、プロテナーゼＫにて処
理してタンパク質を消化し、続いて、試料由来のタンパ
ク質の分解物および酵素類（プロテナーゼＫなど）を変
性除去する目的でフェノール処理を常套的な手段にて行
う。The DNA is extracted, for example, by chopping or crushing the tissue of the above-mentioned biological sample to a weight (g) of 10 to 20%.
First, at 70-80 ° C in TNES-UREA buffer of about double volume (ml),
This is done by incubating for 5 minutes and then at 56 ° C. for 8 to 24 hours. Further, in the above-mentioned extraction of DNA, after the temperature is shifted to 56 ° C., the protein is digested by treating with proteinase K, and subsequently, the degradation products and enzymes (such as proteinase K) of the protein derived from the sample are denatured and removed. Phenol treatment by conventional means.

【００１３】次に、上記の抽出により得られたＤＮＡ溶
液をヒドロキシアパタイト(Ca₅(PO₄)₃(OH)) を用いて精
製する。本発明で用いるヒドロキシアパタイト(Ca₅(P
O₄)₃(OH)) は、通常のクロマトグラフィー用充填剤とし
て市販されているものであれば特に限定はされず、例え
ばバイオゲルハイドロキシアパタイトＤＮＡグレード・
バイオゲルHPT(130-0520)(Biorad 製) 、ヒドロキシル
アパタイト（Code 187-37)（Nakalai tesque製) 等が例
示される。Next, the DNA solution obtained by the above extraction is purified using hydroxyapatite (Ca ₅ (PO ₄ ) ₃ (OH)). The hydroxyapatite (Ca ₅ (P
O ₄ ) ₃ (OH)) is not particularly limited as long as it is commercially available as a usual packing material for chromatography. For example, biogel hydroxyapatite DNA grade
Biogel HPT (130-0520) (manufactured by Biorad), hydroxylapatite (Code 187-37) (manufactured by Nakalai Tesque) and the like are exemplified.

【００１４】ヒドロキシアパタイトを用いてＤＮＡ溶液
を精製するには、具体的には、ＤＮＡ溶液にヒドロシア
パタイトを添加し、インキュベートすることによりＤＮ
Ａ溶液中のＤＮＡを夾雑成分（ムコ多糖類、ＲＮＡ等）
とともにヒドロキシアパタイトに吸着させ、その後、ヒ
ドロキシアパタイトに吸着した夾雑成分を各種の緩衝液
にて逐次的に溶出させ、最後にヒドロキシアパタイトに
吸着したＤＮＡを高リン酸塩濃度の緩衝液にて溶出させ
る。In order to purify a DNA solution using hydroxyapatite, specifically, a DNA solution is prepared by adding a hydrosiapatite to a DNA solution and incubating the DNA solution.
DNA in solution A is converted to contaminant components (mucopolysaccharide, RNA, etc.)
And then elute the contaminant components adsorbed on hydroxyapatite sequentially with various buffers, and finally elute the DNA adsorbed on hydroxyapatite with a buffer having a high phosphate concentration. .

【００１５】具体的には、上記のフェノール抽出により
得られた上層（水層）を別の容器に移し、ヒドロキシア
パタイトを添加し、穏やかに攪拌させて５分間放置し、
ヒドロキシアパタイトを沈降させた後、吸引除去により
上清を除去し、その後2.5 MNaCl-TE 緩衝液(pH 8.0)を
加えて穏かに攪拌し、5分間放置してヒドロキシアパタ
イト沈降させた後に上清を除去する。かかる操作によ
り、ＤＮＡはヒドロキシアパタイトに非常に強く結合し
て吸着される一方、負電荷を持った殆どのムコ多糖類
は、2.5 M NaClの塩濃度によりヒドロキシアパタイトへ
の吸着が弱まって洗い流される。Specifically, the upper layer (aqueous layer) obtained by the above-mentioned phenol extraction is transferred to another container, hydroxyapatite is added, and the mixture is gently stirred and left for 5 minutes.
After sedimentation of the hydroxyapatite, the supernatant was removed by aspiration, then 2.5 M NaCl-TE buffer (pH 8.0) was added, the mixture was gently stirred, and left for 5 minutes to sediment the hydroxyapatite, followed by supernatant. Is removed. By such an operation, DNA is very strongly bound to hydroxyapatite and is adsorbed, while most of the negatively charged mucopolysaccharides are washed away due to the weakened adsorption to hydroxyapatite due to the salt concentration of 2.5 M NaCl.

【００１６】その後、0.2mM EDTAを含む10 mMリン酸ナ
トリウム緩衝液(pH 7.0)を用いて数回上記と同様にして
ヒドロキシアパタイトを洗浄した後、0.2mM EDTAを含む
200mM のリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)による洗浄を
数回繰り返すことによって、ヒドロキシアパタイトに結
合して残っている可能性のあるリン酸基を有するムコ多
糖類、さらにはＲＮＡや一本鎖ＤＮＡもまた除去するこ
とができる。このようにＲＮＡアーゼを用いずにＲＮＡ
をＤＮＡから除去できるということも、当該発明の副次
的な長所の一つである。Thereafter, hydroxyapatite is washed several times in the same manner as described above using 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.2 mM EDTA, and then containing 0.2 mM EDTA.
By repeating washing with 200 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0) several times, mucopolysaccharides having phosphate groups that may remain bound to hydroxyapatite, as well as RNA and single-stranded DNA Can also be removed. Thus, without using RNAase
Is also one of the secondary advantages of the present invention.

【００１７】次に200 mMリン酸ナトリウム緩衝液を出来
る限り吸引除去した後、0.2 M EDTAを含む0.9 Mのリン
酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)を加え、チューブごと穏や
かに攪拌することによってヒドロキシアパタイトに吸着
したＤＮＡを解離させ、1,000gで5〜15分間遠心を行な
ってヒドロキシアパタイトを強固に沈殿させ、上清を別
の容器に移す。最後に得られた上清中のＤＮＡを常套的
な手段にて脱塩・濃縮し、目的とするＤＮＡを得る。上
記操作は10検体以上の生物試料に対して同時に行うこと
ができ、生物試料１ｇ（湿重量）から10μｇ以上の大量
の精製ＤＮＡを得ることができる。Next, after removing 200 mM sodium phosphate buffer as much as possible by suction, 0.9 M sodium phosphate buffer (pH 7.0) containing 0.2 M EDTA was added, and the tube was gently stirred to give hydroxyapatite. The DNA adsorbed on the substrate is dissociated and centrifuged at 1,000 g for 5 to 15 minutes to strongly precipitate hydroxyapatite, and the supernatant is transferred to another container. The DNA in the finally obtained supernatant is desalted and concentrated by a conventional means to obtain the desired DNA. The above operation can be performed simultaneously on 10 or more biological samples, and a large amount of purified DNA of 10 μg or more can be obtained from 1 g (wet weight) of the biological sample.

【００１８】[0018]

【実施例】以下の実施例により本発明をさらに説明する
が、これらは本発明を限定するものではない。 〔実施例１〕（アコヤガイ貝柱からのＤＮＡの精製) (1) ＤＮＡの抽出 アコヤガイの貝柱を採取し、−20℃で凍結した。別途調
製した表１に示す組成から成るTNES−4M−UREA緩衝液
を、50ml容量の使い捨て型遠心チューブ（以下、チュー
ブという）に20ml加え、75℃に加温した。The present invention is further described by the following examples, which do not limit the invention. [Example 1] (Purification of DNA from pearl oyster scallop) (1) Extraction of DNA A pearl oyster scallop was collected and frozen at -20 ° C. 20 ml of a separately prepared TNES-4M-UREA buffer having the composition shown in Table 1 was added to a 50 ml disposable centrifuge tube (hereinafter, referred to as a tube), and heated to 75 ° C.

【００１９】[0019]

【表１】 TNES −4M−UREA 緩衝液 １M TrisHCl(pH8.0) 10ml ２M NaCl 60ml 0.5M EDTA(pH8.0) 20ml 20% SDS 25ml尿素 240.24g 蒸留水を加えて１リットルにする。Table 1 TNES-4M-UREA buffer 1M TrisHCl (pH8.0) 10ml 2M NaCl 60ml 0.5M EDTA (pH8.0) 20ml 20% SDS 25ml Urea 240.24g Distilled water is added to make up to 1 liter.

【００２０】前記の凍結したアコヤガイ貝柱を、約2〜3
mm角になるように氷上でハサミで切り、この貝柱の細
片を直ちに75℃に加温したTNES−4Ｍ−UREA緩衝液入り
チューブに加え、75℃のままで5分間放置した。次いで
該チューブを56℃の振盪インキュベーターに移し、20分
後に10 mg／mlのプロテナーゼＫ溶液を200μl加え、貝
柱の組織の形が溶けて溶液が均一になるまで約80 rpmで
振盪インキュベートし続けた。その後、室温(25 ℃) で
20 mlのフェノールを加え、同温度で10分間ゆっくり攪
拌し、1,000 g、15分間遠心した。上清を別の50 ml 容
量のチューブに採取した。The frozen pearl oyster scallop is put in about 2-3
The slices of the scallop were immediately added to a tube containing a TNES-4M-UREA buffer solution heated to 75 ° C, and left at 75 ° C for 5 minutes. The tube was then transferred to a shaking incubator at 56 ° C., and after 20 minutes, 200 μl of a 10 mg / ml proteinase K solution was added, followed by shaking and incubation at about 80 rpm until the morphology of the scallop tissue was dissolved and the solution became homogeneous. . Then, at room temperature (25 ° C)
20 ml of phenol was added, the mixture was slowly stirred at the same temperature for 10 minutes, and centrifuged at 1,000 g for 15 minutes. The supernatant was collected in another 50 ml tube.

【００２１】(2) ＤＮＡの精製 前記上清を入れた50 ml容量のチューブにヒドロキシア
パタイト〔バイオゲルハイドロキシアパタイトＤＮＡグ
レード バイオゲルHPT(130-0520) （Bio-Rad製) 〕２g
を加え、約１分間穏かに攪拌した。TE(pH 8.0)をチュー
ブ一杯(50ml)まで加えてさらに約１分間穏かに攪拌し、
５分間チューブを立てて放置したところ、ヒドロキシア
パタイトが沈降した。アスピレーターで上清約35 mlを
取り除き、再びTEをチューブ一杯まで加えて約１分間攪
拌し、５分間放置した。上清を取り除き、同じチューブ
に2.5M NaCl-TE緩衝液をチューブ一杯まで加えて約１分
間攪拌した後、５分間放置した。アスピレーターで上清
を取り除き、同じチューブに2.5M NaCl−TE緩衝液をチ
ューブ一杯まで加えて約１分間攪拌した後、５分間放置
した。次いでアスピレーターで上清約35 ml を取り除
き、10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)−0.2mM EDTA
をチューブ一杯まで加えて約１分間攪拌し、５分間放置
し、上清35 mlを取り除く操作を３回繰り返し行なっ
た。さらに、200mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH 7.0)−
0.2mM EDTAをチューブ一杯まで加えて約１分間攪拌し、
５分間放置し、上清35 mlを取り除く操作を２回繰り返
して行なった。最後に、0.9 Mリン酸ナトリウム緩衝液
(pH 7.0)−0.2mM EDTAをチューブに15ml加えて攪拌し、
1000g で15分間遠心した。以上の操作は全て室温(25
℃)にて行った。(2) Purification of DNA 2 g of hydroxyapatite [Biogel hydroxyapatite DNA grade Biogel HPT (130-0520) (manufactured by Bio-Rad)] is placed in a 50 ml tube containing the supernatant.
Was added and stirred gently for about 1 minute. Add TE (pH 8.0) to the full tube (50 ml) and gently stir for about another minute,
When the tube was left standing for 5 minutes, the hydroxyapatite precipitated. About 35 ml of the supernatant was removed with an aspirator, TE was added again to the full tube, stirred for about 1 minute, and left for 5 minutes. The supernatant was removed, 2.5 M NaCl-TE buffer was added to the same tube to fill the tube, stirred for about 1 minute, and then left for 5 minutes. The supernatant was removed with an aspirator, and 2.5 M NaCl-TE buffer was added to the same tube to fill the tube, stirred for about 1 minute, and left for 5 minutes. Then, about 35 ml of the supernatant was removed with an aspirator, and 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)-0.2 mM EDTA
Was added to the full tube, stirred for about 1 minute, allowed to stand for 5 minutes, and the operation of removing 35 ml of the supernatant was repeated three times. Furthermore, 200 mM sodium phosphate buffer (pH 7.0)
Add 0.2mM EDTA to the full tube and stir for about 1 minute,
The operation of leaving the mixture for 5 minutes and removing 35 ml of the supernatant was repeated twice. Finally, 0.9 M sodium phosphate buffer
(pH 7.0)-Add 15 ml of -0.2 mM EDTA to the tube and stir,
Centrifuged at 1000g for 15 minutes. All of the above operations are performed at room temperature (25
C).

【００２２】(3) 精製されたＤＮＡの濃縮および脱塩 上記で遠心したチューブの上清約24 mlを新しいチュー
ブにとり、蒸留水を加えて30 mlとし、3M酢酸カリウム
(pH5.5)を15 ml 加え、Qiagen−tip500を用いてＤＮＡ
を濃縮した。以上の操作はQIAGEN Plasmid Purificatio
n Handbook(January, 1997）のProtocol 9以降に従っ
た。上記の操作により、19個体のアコヤガイの貝柱約1g
からそれぞれ以下の表２に示す量のＤＮＡが得られた。(3) Concentration and desalting of the purified DNA Transfer about 24 ml of the supernatant of the tube centrifuged as above to a new tube, add distilled water to 30 ml, and add 3M potassium acetate.
(pH 5.5) and add DNA using Qiagen-tip500.
Was concentrated. The above procedure is for QIAGEN Plasmid Purificatio
n Protocol 9 or later of Handbook (January, 1997) was followed. By the above operation, 19 pearl oyster scallops about 1 g
From the above, the amounts of DNA shown in Table 2 below were obtained.

【００２３】[0023]

【表２】 [Table 2]

【００２４】図１に上記のアコヤガイの貝柱から精製さ
れたＤＮＡの吸収スペクトルの一例を示す。また、19個
体のうちの8個体のアコヤガイ(＃1〜＃8)から精製され
たＤＮＡのアガロースゲル電気泳動パターンを図２に示
す。図２に示す泳動パターンより、高分子量の位置（約
２万bp）に、アコヤガイＤＮＡのバンドが観察された。FIG. 1 shows an example of the absorption spectrum of DNA purified from the pearl oyster scallop. FIG. 2 shows an agarose gel electrophoresis pattern of DNA purified from 8 pearl oysters (# 1 to # 8) out of 19 individuals. From the electrophoresis pattern shown in FIG. 2, a band of pearl oyster DNA was observed at a high molecular weight position (about 20,000 bp).

【００２５】さらに、別の２個体(＃1および＃３)から
精製されたＤＮＡ(10μg／個体)を制限酵素AluIおよびH
infI で消化した。これに等量のプラスミドpUC118を加
えて切断状況をモニターする指標とした。アガロースゲ
ル電気泳動パターンを図３に示す。消化されたアコヤガ
イＤＮＡのスメアバンドの上に乗っているpUC118の断片
のパターンが、右端のレーンのプラスミド単独での完全
消化パターンと一致していることから、アコヤガイのＤ
ＮＡも完全に消化されたものと判断した。Further, DNA (10 μg / individual) purified from another two individuals (# 1 and # 3) was ligated with restriction enzymes Alu I and H
Digested with inf I. To this, an equal amount of plasmid pUC118 was added to serve as an index for monitoring the cleavage status. The agarose gel electrophoresis pattern is shown in FIG. Since the pattern of the pUC118 fragment on the smear band of the digested pearl oyster DNA was consistent with the complete digestion pattern of the plasmid alone in the rightmost lane, the pearl oyster D
NA was also determined to be completely digested.

【００２６】表２に記載のアコヤガイ19個体から精製さ
れたＤＮＡを各40ng用いて、PCRが正常に働くかどうか
を調べた。既にCampbell, D.C., Hoekstra, K.J. and C
arter, J.G. (1997) (in) Johnston, P.A. and Haggar
t, J.(Eds.), The Bivalvia :Half a Billion Years of
Evolution-Essays in Honor of Norman D.Newell ;Uni
versity of Calgary Press (1997)に記載されているメ
キシコアコヤガイの18ＳリボソームＲＮＡ遺伝子の配列
などに基づいて設計したプライマー、18Ｓ−rＲＮＡｆ
(5'−AAGGCAGCAGGCRCGCAAAT−3')および18Ｓ−rＲＮＡ
ｒ(5'−TACKCTAYTGRAGCTGGART−3')を合成し、反応液に
ミネラルオイルを添加した後、以下の条件下でPCR反応
を行なった。PCR反応条件 容量:50μl Taqポリメラーゼ：TAKARA Taq (1ユニット) プライマー量：各20 pmol ｄNTP：各10 nmol マグネシウム濃度： 2 mM 反応チューブ: 0.6 ml容量 96℃で30秒、50℃で1分、70℃で2分を１サイクルとして
40サイクルUsing 40 ng of each of the DNAs purified from 19 pearl oysters shown in Table 2, it was examined whether PCR works normally. Already Campbell, DC, Hoekstra, KJ and C
arter, JG (1997) (in) Johnston, PA and Haggar
t, J. (Eds.), The Bivalvia: Half a Billion Years of
Evolution-Essays in Honor of Norman D. Newell; Uni
primers designed based on the sequence of the 18S ribosomal RNA gene of pearl oysters described in the versity of Calgary Press (1997), 18S-rRNAf
(5'-AAGGCAGCAGGCRCGCAAAT-3 ') and 18S-rRNA
r (5'-TACKCTAYTGRAGCTGGART-3 ') was synthesized, and mineral oil was added to the reaction solution, followed by a PCR reaction under the following conditions. PCR reaction conditions Volume: 50 μl Taq polymerase: TAKARA Taq (1 unit) Primer amount: 20 pmol each dNTP: 10 nmol each Magnesium concentration: 2 mM Reaction tube: 0.6 ml volume 30 seconds at 96 ° C, 1 minute at 50 ° C, 70 1 minute cycle at 2 ℃
40 cycles

【００２７】得られたPCR産物のアガロースゲル電気泳
動パターンを図４に示す。使用したＤＮＡのいずれから
も、予想された長さ(185 bp)のPCR産物が得られた。こ
の結果より、ムコ多糖類によるPCR反応の阻害は全く起
きていないことが確認された。図４中のレーン1〜19
は、それぞれ表２の個体番号＃１〜19に対応している。
またレーン20は大腸菌のＤＮＡを用いた場合のPCR産物
のアガロースゲル電気泳動パターンを示し、アコヤガイ
のアガロースゲル電気泳動パターンとは異なる位置に複
数の非特異的と思われるバンドが観察された。FIG. 4 shows an agarose gel electrophoresis pattern of the obtained PCR product. A PCR product of the expected length (185 bp) was obtained from any of the DNAs used. From this result, it was confirmed that the inhibition of the PCR reaction by the mucopolysaccharide did not occur at all. Lanes 1 to 19 in FIG.
Correspond to the individual numbers # 1 to # 19 in Table 2, respectively.
Lane 20 shows the agarose gel electrophoresis pattern of the PCR product when Escherichia coli DNA was used, and a plurality of non-specific bands were observed at positions different from those of the pearl oyster agarose gel electrophoresis pattern.

【００２８】〔実施例２〕（スサビノリ糸状体からのＤ
ＮＡの精製) 試料として0120系および0130系のスサビノリ糸状体を使
用した。使用した試料の重量は湿重量で0120系は1g、01
30系は0.5gであり、これを液体窒素で凍結した後、零下
に冷やした乳鉢内で粉砕した。これ以降は実施例１と同
様にしてＤＮＡを抽出・精製した。以上の操作により、
0120系および0130系のスサビノリ糸状体それぞれから表
３に示す量のＤＮＡが得られた。[Example 2] (D from a sasabinori filamentous material)
Purification of NA) As a sample, a filamentous body of Susabinori of 0120 series and 0130 series was used. The weight of the sample used is 1 g, 01
The weight of the 30 series was 0.5 g, which was frozen in liquid nitrogen and then pulverized in a mortar cooled to zero. Thereafter, DNA was extracted and purified in the same manner as in Example 1. By the above operation,
The amounts of DNA shown in Table 3 were obtained from each of the filamentous filaments of the sasabinori line of the 1201 line and the 0130 line.

【００２９】[0029]

【表３】 [Table 3]

【００３０】上記のうち0120系から精製されたスサビノ
リＤＮＡの吸収スペクトルを図５に示す。また、同ＤＮ
Ａのアガロースゲル電気泳動パターンを図６に示す。図
６に示す泳動パターンより、高分子量の位置（約２万 b
p)にスサビノリＤＮＡのバンドが観察された。また、両
系統から精製されたスサビノリＤＮＡ(5μg/個体)を制
限酵素HaeIIIで消化した。これに等量のプラスミドpUC1
18 を加えて切断状況をモニターする指標とした。アガ
ロースゲル電気泳動パターンを図７に示す。消化された
スサビノリＤＮＡのスメアバンドの上に乗っているpUC1
18の断片のパターンが、右のレーンのプラスミド単独で
の完全消化パターンと一致していることから、スサビノ
リのＤＮＡも完全に消化されたものと判断した。FIG. 5 shows the absorption spectrum of Susabinori DNA purified from the 0120 system. In addition, the DN
The agarose gel electrophoresis pattern of A is shown in FIG. From the migration pattern shown in FIG. 6, the position of high molecular weight (about 20,000 b
In p), a band of Susabinori DNA was observed. In addition, Susabinori DNA (5 μg / individual) purified from both strains was digested with restriction enzyme Hae III. Add an equal amount of plasmid pUC1
18 was added as an index to monitor the cutting status. The agarose gel electrophoresis pattern is shown in FIG. PUC1 riding on the smear band of digested Susabinori DNA
Since the pattern of the 18 fragments matched the complete digestion pattern of the plasmid alone in the right lane, it was judged that the DNA of Susabinori was also completely digested.

【００３１】さらに表３に記載のスサビノリから精製さ
れたＤＮＡを各40 ng用いて、PCRが正常に働くかどうか
を調べた。実施例１と同様の条件下でPCR を試みたとこ
ろ、目的のPCR増幅産物が得られた。図８にそのアガロ
ースゲル電気泳動パターンを示す。ここで使用した２つ
のプライマー、ITS-F（5'-GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCT
GC-3'）およびITS-R（5'-GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGG
T-3'）は、アマノリのリボソームＲＮＡ遺伝子の介在配
列(ＩＴＳ)を増やすように設計されたものである。アガ
ロースゲル電気泳動の結果、約１kbのPCR産物が得ら
れ、これはチシマクロノリで得られた長さとほぼ一致し
ていた。Further, using 40 ng of each of the DNAs purified from Susabinori described in Table 3, it was examined whether or not the PCR worked normally. When PCR was attempted under the same conditions as in Example 1, the desired PCR amplification product was obtained. FIG. 8 shows the agarose gel electrophoresis pattern. The two primers used here, ITS-F (5'-GGGATCCGTTTCCGTAGGTGAACCT
GC-3 ') and ITS-R (5'-GGGATCCATATGCTTAAGTTCAGCGGG
T-3 ′) is designed to increase the intervening sequence (ITS) of the ribosomal RNA gene of Amanori. As a result of agarose gel electrophoresis, a PCR product of about 1 kb was obtained, which almost coincided with the length obtained with Chisima macronori.

【００３２】〔実施例３〕（カイガラアマノリ葉状体か
らのＤＮＡの精製） ＣＴＡＢ法のみを用いてカイガラアマノリ葉状体（0.3
g）からＤＮＡの抽出・精製を試みたところ、得られた
ＤＮＡは制限酵素により切断されず、PCRが働かなかっ
た。このＤＮＡはTE（pH 8.0）に溶解していたので、引
き続きTEを加えて10 mlとし、1gのヒドロキシアパタイ
ト〔バイオゲルハイドロキシアパタイトＤＮＡグレード
・バイオゲルHPT(130-0520)(Bio-Rad 製) 〕を添加して
ＤＮＡを吸着させた。これ以降は実施例１のヒドロキシ
アパタイトを用いた精製法に従って行なった。以上の操
作により、0.3gのカイガラアマノリ葉状体から5μgのＤ
ＮＡが得られた。得られたカイガラアマノリＤＮＡのア
ガロースゲル電気泳動パターンを図９に示す。図９に示
す泳動パターンより、高分子量の位置（約２万bp) にカ
イガラアマノリＤＮＡのバンドが観察された。[Example 3] (Purification of DNA from the leaf-shape of the sea anemone) The leaf-shape of the sea anemone (0.3) was obtained using only the CTAB method.
When an attempt was made to extract and purify the DNA from g), the obtained DNA was not cleaved by the restriction enzyme, and the PCR did not work. Since this DNA was dissolved in TE (pH 8.0), TE was subsequently added to make 10 ml, and 1 g of hydroxyapatite [Biogel hydroxyapatite DNA grade Biogel HPT (130-0520) (manufactured by Bio-Rad)] Was added to adsorb the DNA. Thereafter, the purification was performed according to the purification method using hydroxyapatite of Example 1. By the above-mentioned operation, 5 μg of D
NA was obtained. FIG. 9 shows an agarose gel electrophoresis pattern of the thus obtained Kaigara amanori DNA. According to the electrophoresis pattern shown in FIG. 9, a band of the giant sea anemone DNA was observed at a high molecular weight position (about 20,000 bp).

【００３３】また、精製されたカイガラアマノリＤＮＡ
5μg を、制限酵素HaeIIIで消化した。これに等量のプ
ラスミドpUC118を加えて切断状況をモニターする指標と
した。アガロースゲル電気泳動パターンを図１０に示
す。消化されたカイガラアマノリＤＮＡ(レーン2)のス
メアバンドの上に乗っているpUC118の断片のパターン
が、プラスミド単独での完全消化パターン(レーン3)と
一致していることから、カイガラアマノリのＤＮＡも完
全に消化されたものと判断した。In addition, purified Kaigara amanori DNA
5 μg was digested with the restriction enzyme Hae III. To this, an equal amount of plasmid pUC118 was added to serve as an index for monitoring the cleavage status. The agarose gel electrophoresis pattern is shown in FIG. Since the pattern of the pUC118 fragment on the smear band of the digested Kaigara amanori DNA (lane 2) matches the complete digestion pattern of the plasmid alone (lane 3), Judged to be completely digested.

【００３４】さらに、カイガラアマノリから精製された
ＤＮＡ 10 ngを用いて、PCRが正常に働くかどうかを調
べた。実施例２と同様の条件下で実施例２で用いた２つ
のプライマーと同じプライマーセットを使用してPCRを
試みたところ、目的とするPCR増幅産物が得られた。図1
1にそのアガロースゲル電気泳動パターンを示す。約1kb
のPCR産物が得られ、このバンドはチシマクロノリおよ
び実施例２のスサビノリで得られた長さとほぼ一致して
いた。Furthermore, using 10 ng of DNA purified from the sea anemone, whether or not PCR works normally was examined. When PCR was attempted under the same conditions as in Example 2 using the same primer set as the two primers used in Example 2, the desired PCR amplification product was obtained. Figure 1
Fig. 1 shows the agarose gel electrophoresis pattern. About 1kb
This band was almost identical to the length obtained with Chisima macronori and Susabinori of Example 2.

【００３５】[0035]

【発明の効果】本発明によれば、ムコ多糖類が混在する
ＤＮＡ溶液からムコ多糖類を除去して高純度のＤＮＡを
大量に、しかも複数検体から同時に精製する簡便な方法
が提供される。本発明方法によれば、ムコ多糖類を含有
する生物試料１ｇ（湿重量）からサザンブロッティング
等の遺伝子分析に供するに十分な量である10マイクログ
ラム以上の精製ＤＮＡを得ることができる。According to the present invention, there is provided a simple method for removing mucopolysaccharide from a DNA solution containing mucopolysaccharide and purifying a large amount of high-purity DNA simultaneously from a plurality of samples. According to the method of the present invention, it is possible to obtain 10 μg or more of purified DNA, which is a sufficient amount for subject to gene analysis such as Southern blotting, from 1 g (wet weight) of a biological sample containing mucopolysaccharide.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】本発明の方法によりアコヤガイの貝柱から精製
されたＤＮＡの吸収スペクトルを示す。FIG. 1 shows an absorption spectrum of DNA purified from a pearl oyster scallop by the method of the present invention.

【図２】本発明の方法によりアコヤガイ8個体（＃1〜＃
8）から精製されたＤＮＡのアガロースゲル電気泳動写
真である。図中のＭ（両端のレーン）は分子量マーカー
を示す。FIG. 2 shows eight pearl oysters (# 1 to #
8 is an agarose gel electrophoresis photograph of DNA purified from 8). M (lane at both ends) in the figure indicates a molecular weight marker.

【図３】本発明の方法によりアコヤガイから精製された
ＤＮＡ10μg を２種の制限酵素（AluI,HinfI) でそれぞ
れ消化し、プラスミドpUC118を加えてこれを切断状況の
マーカーとした場合に生成したＤＮＡ断片のアガロース
ゲル電気泳動写真である。図中のＭ（左端のレーン）は
分子量マーカーを示す。FIG. 3 shows a DNA produced by digesting 10 μg of DNA purified from pearl oysters by the method of the present invention with two types of restriction enzymes ( Alu I, Hinf I), adding plasmid pUC118 and using this as a marker for cleavage status. It is an agarose gel electrophoresis photograph of a DNA fragment. M (left end lane) in the figure indicates a molecular weight marker.

【図４】本発明の方法によりアコヤガイ19個体（＃1〜
＃19）から精製されたＤＮＡ、および大腸菌のＤＮＡに
ついてPCRを行なった場合に得られたPCR産物のアガロー
スゲル電気泳動写真である。図中のＭ（両端のレーン）
は分子量マーカーを示す。FIG. 4 shows 19 pearl oysters (# 1 to # 1) produced by the method of the present invention.
9 is an agarose gel electrophoresis photograph of a PCR product obtained when PCR was performed on DNA purified from # 19) and E. coli DNA. M in the figure (lanes at both ends)
Indicates a molecular weight marker.

【図５】本発明の方法によりスサビノリ（0120系）糸状
体から精製したＤＮＡの吸収スペクトルを示す。FIG. 5 shows an absorption spectrum of DNA purified from a susabinori (0120 series) filament according to the method of the present invention.

【図６】本発明の方法によりスサビノリ（0120系）糸状
体から精製したＤＮＡのアガロースゲル電気泳動写真で
ある。図中のＭ（両端のレーン）は分子量マーカーを示
す。FIG. 6 is an agarose gel electrophoresis photograph of DNA purified from a filamentous Susabinori (0120) filament according to the method of the present invention. M (lane at both ends) in the figure indicates a molecular weight marker.

【図７】本発明の方法によりスサビノリ糸状体から精製
したＤＮＡ5 μg を制限酵素HaeIIIで消化し、プラスミ
ドpUC118を加えてこれを切断状況のマーカーとした場合
に生成したＤＮＡ断片のアガロースゲル電気泳動写真で
ある。図中のＭ（両端のレーン）は分子量マーカーを示
す。FIG. 7 shows an agarose gel electrophoresis of a DNA fragment generated when 5 μg of DNA purified from a filamentous filament of Susabino lari by the method of the present invention is digested with a restriction enzyme Hae III, and a plasmid pUC118 is added to use this as a marker for a cleavage state. It is a photograph. M (lane at both ends) in the figure indicates a molecular weight marker.

【図８】本発明の方法によりスサビノリ糸状体から精製
したＤＮＡをPCRにかけて得られたPCR産物のアガロース
ゲル電気泳動写真である。図中のＭ（両端のレーン）は
分子量マーカーを示す。FIG. 8 is an agarose gel electrophoresis photograph of a PCR product obtained by subjecting a DNA purified from a filamentous filament of Sasabinori by the method of the present invention to PCR. M (lane at both ends) in the figure indicates a molecular weight marker.

【図９】本発明の方法によりカイガラアマノリ葉状体か
ら精製したＤＮＡのアガロースゲル電気泳動写真であ
る。図中のＭ（左端のレーン）は分子量マーカーを示
す。FIG. 9 is an agarose gel electrophoresis photograph of DNA purified from the leaf thrush of the sea anemone by the method of the present invention. M (left end lane) in the figure indicates a molecular weight marker.

【図１０】本発明の方法によりカイガラアマノリ葉状体
から精製したＤＮＡ５μgを制限酵素HaeIIIで消化し、
プラスミドpUC118を加えてこれを切断状況のマーカーと
した場合のアガロースゲル電気泳動写真である。図中の
Ｍ（両端のレーン）は分子量マーカーを示す。FIG. 10 shows digestion of 5 μg of DNA purified from the leaf thimulus of the sea anemone by the method of the present invention with the restriction enzyme Hae III.
It is an agarose gel electrophoresis photograph in the case where plasmid pUC118 was added and used as a marker for the status of cleavage. M (lane at both ends) in the figure indicates a molecular weight marker.

【図１１】本発明の方法によりカイガラアマノリ葉状体
から精製したＤＮＡをPCRにかけて得られたPCR産物のア
ガロースゲル電気泳動写真である。図中のＭ（左端のレ
ーン）は分子量マーカーを示す。FIG. 11 is an agarose gel electrophoresis photograph of a PCR product obtained by subjecting a DNA purified from A. anemone leaves to PCR by the method of the present invention. M (left end lane) in the figure indicates a molecular weight marker.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 岡内 正典 三重県度会郡玉城町佐田411番地２号 (56)参考文献 特開 平10−127285（ＪＰ，Ａ) 特開 平10−127284（ＪＰ，Ａ) 特開 平９−173065（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−143879（ＪＰ，Ａ) 特開 昭63−154696（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/10 C07H 21/04 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＭＥＤＬＩＮＥ（ＳＴＮ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (72) Inventor Masanori Okauchi 411-2 Sada, Tamaki-cho, Mie Prefecture, Japan (56) References JP-A-10-127285 (JP, A) JP-A-10-127284 (JP) , A) JP-A-9-173065 (JP, A) JP-A-7-143879 (JP, A) JP-A-63-154696 (JP, A) (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁶ , DB Name) C12N 15/10 C07H 21/04 BIOSIS (DIALOG) JICST file (JOIS) MEDLINE (STN) WPI (DIALOG)

Claims (2)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 ムコ多糖類が混在するＤＮＡ溶液から、
ＤＮＡとムコ多糖類の吸着性の差異を利用してＤＮＡを
精製する方法において、吸着性物質としてヒドロキシア
パタイトを用いることを特徴とする、ＤＮＡの精製方
法。1. A DNA solution containing mucopolysaccharides,
What is claimed is: 1. A method for purifying DNA by utilizing the difference in adsorptivity between DNA and mucopolysaccharide, characterized in that hydroxyapatite is used as an adsorbent substance. 【請求項２】 ＤＮＡ溶液が、生物試料を尿素を含有す
る緩衝液にて抽出したものであることを特徴とする、請
求項１記載のＤＮＡの精製方法。2. The method for purifying DNA according to claim 1, wherein the DNA solution is obtained by extracting a biological sample with a buffer containing urea.