JP2981540B2 - 細胞培養用床材 - Google Patents
細胞培養用床材Info
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- JP2981540B2 JP2981540B2 JP8236079A JP23607996A JP2981540B2 JP 2981540 B2 JP2981540 B2 JP 2981540B2 JP 8236079 A JP8236079 A JP 8236079A JP 23607996 A JP23607996 A JP 23607996A JP 2981540 B2 JP2981540 B2 JP 2981540B2
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- Japan
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- cell culture
- flooring
- chitosan
- cells
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、細胞を培養し、増
殖させる際に用いられる細胞培養用床材に関するもので
ある。
殖させる際に用いられる細胞培養用床材に関するもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】現在、医薬品等に用いられている生理活
性物質は哺乳類動物の細胞を用いて生合成させたものが
多い。それ故に、それらの細胞を効率よく増殖させるこ
とが必要であるが、一般に、哺乳類動物を始めとする生
物の細胞は浮遊状態では増殖せず、固体表面に付着して
のみ増殖する性質を有している。このような付着状態で
増殖する性質をもつ細胞を培養し、増殖させるためには
細胞を多量に付着する固体表面、つまり培養床が必要と
なる。従来、ガラスのような無機物質、多糖類のような
天然高分子物質、ポリスチレン等の合成高分子物質など
が培養床として用いられているが、必ずしも効率的に細
胞培養を行うことができないため、新しい細胞培養用床
材の出現が強く望まれている。細胞培養は通常、表面積
の大きな球状あるいは繊維状の床材を水溶液中に浮遊さ
せて行われるため、床材の密度は水の密度と同程度が望
まれ、また、攪拌等の機械的力により床材が破壊されな
いことが望まれる。また、床材に毒性がないことも必須
である。この様に、細胞培養用床材料については未だ満
足するべきものは開発されていない。
性物質は哺乳類動物の細胞を用いて生合成させたものが
多い。それ故に、それらの細胞を効率よく増殖させるこ
とが必要であるが、一般に、哺乳類動物を始めとする生
物の細胞は浮遊状態では増殖せず、固体表面に付着して
のみ増殖する性質を有している。このような付着状態で
増殖する性質をもつ細胞を培養し、増殖させるためには
細胞を多量に付着する固体表面、つまり培養床が必要と
なる。従来、ガラスのような無機物質、多糖類のような
天然高分子物質、ポリスチレン等の合成高分子物質など
が培養床として用いられているが、必ずしも効率的に細
胞培養を行うことができないため、新しい細胞培養用床
材の出現が強く望まれている。細胞培養は通常、表面積
の大きな球状あるいは繊維状の床材を水溶液中に浮遊さ
せて行われるため、床材の密度は水の密度と同程度が望
まれ、また、攪拌等の機械的力により床材が破壊されな
いことが望まれる。また、床材に毒性がないことも必須
である。この様に、細胞培養用床材料については未だ満
足するべきものは開発されていない。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、効率的に細
胞培養を行うために、細胞付着性の高い固体表面を有す
る細胞培養用床材を提供することをその課題とする。
胞培養を行うために、細胞付着性の高い固体表面を有す
る細胞培養用床材を提供することをその課題とする。
【０００４】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記課題
を解決すべく鋭意検討を重ね、本発明を完成するに至っ
た。即ち、本発明によれば、ポリビニルアルコールとキ
トサンとからなる混合高分子の含水ゲルの成形物からな
る細胞培養用床材が提供される。
を解決すべく鋭意検討を重ね、本発明を完成するに至っ
た。即ち、本発明によれば、ポリビニルアルコールとキ
トサンとからなる混合高分子の含水ゲルの成形物からな
る細胞培養用床材が提供される。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明で用いる高分子ゲルは、ポ
リビニルアルコールとキトサンとからなる混合高分子の
含水ゲルである。ポリビニルアルコールとしては、ケン
化度が９８モル％以上、平均重合度１５００以上のもの
が好ましく用いられる。キトサンは、キチンから脱アセ
チル化して合成されるが、脱アセチル化度が７０モル％
以上のものが好ましく用いられる。キトサンの混合比
は、ポリビニルアルコールと水溶性高分子との混合物に
対し、２０〜４０重量％である。また、混合高分子含水
ゲル中の含水量は、５０〜９５重量％、好ましくは６０
〜８０重量％である。前記の混合高分子含水ゲルからな
る成形物を製造するには、ポリビニルアルコールとキト
サンとを酢酸を含む水溶液状で加圧下及び加熱下におい
て均一に混合する。加熱温度は９５〜１４０℃、好まし
くは１１０〜１２５℃であり、圧力は、内容物が沸騰し
ない圧力であればよい。次に、この混合高分子の水溶液
を所要形状に成形し、得られた成形物を水酸化ナトリウ
ム水溶液中に浸漬して酢酸を中和する。その成形物を十
分水洗した後、混合高分子含水ゲルの成形物を得ること
ができる。本発明の細胞培養用床材は、所望の形状、例
えば、フィルム状、筒状、球状、ケース状、繊維状等の
各種の形状を有するものである。また、本発明の細胞培
養用床材は、それ全体が前記混合高分子含水ゲルから構
成される必要はなく、その表面部のみが前記混合高分子
含水ゲルから構成されていてもよい。
リビニルアルコールとキトサンとからなる混合高分子の
含水ゲルである。ポリビニルアルコールとしては、ケン
化度が９８モル％以上、平均重合度１５００以上のもの
が好ましく用いられる。キトサンは、キチンから脱アセ
チル化して合成されるが、脱アセチル化度が７０モル％
以上のものが好ましく用いられる。キトサンの混合比
は、ポリビニルアルコールと水溶性高分子との混合物に
対し、２０〜４０重量％である。また、混合高分子含水
ゲル中の含水量は、５０〜９５重量％、好ましくは６０
〜８０重量％である。前記の混合高分子含水ゲルからな
る成形物を製造するには、ポリビニルアルコールとキト
サンとを酢酸を含む水溶液状で加圧下及び加熱下におい
て均一に混合する。加熱温度は９５〜１４０℃、好まし
くは１１０〜１２５℃であり、圧力は、内容物が沸騰し
ない圧力であればよい。次に、この混合高分子の水溶液
を所要形状に成形し、得られた成形物を水酸化ナトリウ
ム水溶液中に浸漬して酢酸を中和する。その成形物を十
分水洗した後、混合高分子含水ゲルの成形物を得ること
ができる。本発明の細胞培養用床材は、所望の形状、例
えば、フィルム状、筒状、球状、ケース状、繊維状等の
各種の形状を有するものである。また、本発明の細胞培
養用床材は、それ全体が前記混合高分子含水ゲルから構
成される必要はなく、その表面部のみが前記混合高分子
含水ゲルから構成されていてもよい。
【０００６】
【実施例】次に本発明を実施例によりさらに詳細に説明
する。 実施例１ キトサン（脱アセチル化度８６モル％）に９０ｇの蒸留
水を加え、さらにキトサン１ｇ当り０．８０ｍｌの酢酸
を加えてキトサン水溶液を作成する。ここに、ポリビニ
ルアルコール（ケン化度９９．８５モル％、重合度１７
００）を高分子物質の総重量が１０ｇになるよう各種分
率比で混合し、耐圧硝子容器に入れた。この容器（温度
２０℃）を１００分間かけて徐々に１２０℃まで加熱し
（圧力＝２×１０5Ｐａ）、この温度で１０分間保った
後、４０分間かけて徐々に８０℃まで冷却した。得られ
た均一水溶液をガラス板上に流延し、２４時間風乾し
た。さらに、これを３０℃で２４時間真空乾燥してフィ
ルム試料を得た。その後、この試料を多量の４％水酸化
ナトリウム水溶液に６時間浸漬すると、この試料は含水
ゲル状になった。この水溶液を新しい蒸留水と数回とり
かえることにより、この含水ゲル状試料から溶出する高
分子を完全に取り除いた。この試料を蒸留水中に保存
し、その含水率（含水ゲル状試料の重量に対するゲル中
の水の重量の割合）を測定した（表１）。なお、ポリビ
ニルアルコールとキトサンとの初期重量混合比が９８：
２、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、
７０：３０、６０：４０の７種類の試料を作成した。ま
た、比較のためにポリビニルアルコールだけからなる試
料も作成した。前記のようにして得た含水ゲル状フィル
ム試料は、含水率が高いので、その比重がほぼ１であ
り、細胞培養用床材として水中に浮遊させるのに好都合
である。含水ゲル状フィルム試料のヤング率を表１に示
す。含水率が高いにもかかわらずヤング率が高いこと
は、床材として利用中に機械的力で容易に破壊されない
特徴がある。いずれの混合比の含水ゲル状フィルム試料
も、極めて透明度が高い。
する。 実施例１ キトサン（脱アセチル化度８６モル％）に９０ｇの蒸留
水を加え、さらにキトサン１ｇ当り０．８０ｍｌの酢酸
を加えてキトサン水溶液を作成する。ここに、ポリビニ
ルアルコール（ケン化度９９．８５モル％、重合度１７
００）を高分子物質の総重量が１０ｇになるよう各種分
率比で混合し、耐圧硝子容器に入れた。この容器（温度
２０℃）を１００分間かけて徐々に１２０℃まで加熱し
（圧力＝２×１０5Ｐａ）、この温度で１０分間保った
後、４０分間かけて徐々に８０℃まで冷却した。得られ
た均一水溶液をガラス板上に流延し、２４時間風乾し
た。さらに、これを３０℃で２４時間真空乾燥してフィ
ルム試料を得た。その後、この試料を多量の４％水酸化
ナトリウム水溶液に６時間浸漬すると、この試料は含水
ゲル状になった。この水溶液を新しい蒸留水と数回とり
かえることにより、この含水ゲル状試料から溶出する高
分子を完全に取り除いた。この試料を蒸留水中に保存
し、その含水率（含水ゲル状試料の重量に対するゲル中
の水の重量の割合）を測定した（表１）。なお、ポリビ
ニルアルコールとキトサンとの初期重量混合比が９８：
２、９５：５、９０：１０、８５：１５、８０：２０、
７０：３０、６０：４０の７種類の試料を作成した。ま
た、比較のためにポリビニルアルコールだけからなる試
料も作成した。前記のようにして得た含水ゲル状フィル
ム試料は、含水率が高いので、その比重がほぼ１であ
り、細胞培養用床材として水中に浮遊させるのに好都合
である。含水ゲル状フィルム試料のヤング率を表１に示
す。含水率が高いにもかかわらずヤング率が高いこと
は、床材として利用中に機械的力で容易に破壊されない
特徴がある。いずれの混合比の含水ゲル状フィルム試料
も、極めて透明度が高い。
【０００７】実施例２ 前記含水ゲル状フィルムに対する細胞の接着・増殖性を
調べた。すなわち、試料とする９ｍｍ×９ｍｍの含水ゲ
ル状フィルム上にマウス由来の線維芽細胞（Ｌ−９２
９）の培養液（約１３．８万個／ｍｌ）０．３ｍｌを接
触させたまま、二酸化炭素５％、湿度１００％で３７℃
に設定したインキュベーター中に静置した。培養液に
は、１０％牛胎児血清を含むＥａｇｌｅ ＭＥＭを使用
した。また、比較のため、ポリビニルアルコールだけか
らなる試料、高研（株）製コラーゲン試料、和光純薬工
業（株）製の組織培養用プラスチックシートについても
同一手法で試験を行った。所定時間インキュベーター中
に静置後、試料とした含水ゲル状フィルム上に接着して
いる細胞数を、クリスタルバイオレットを染料とする通
常の核染色法により定量した。また、顕微鏡下で細胞数
を直接数える方法でも定量した。３０時間培養後の細胞
増殖率（組織培養用プラスチックシートに接着した細胞
数に対するゲル状フィルムに接着した細胞数の比）とキ
トサン含有率との関係を表１に示す。キトサン含有率の
増加とともに細胞増殖率が急激に増大した。３０時間培
養後の４０％キトサン含有ゲル状フィルムの細胞増殖率
はコラーゲン試料での２５６をも凌ぐ結果であった。さ
らに、試料上に接着した細胞の形態を顕微鏡により観察
した結果、キトサン含有率の低いゲル状フィルムでは細
胞は球状であったが、含有率の増大とともに生体内及び
コラーゲン上で観察されるのと同様の紡錘形を有する細
胞の割合が増加することがわかった。
調べた。すなわち、試料とする９ｍｍ×９ｍｍの含水ゲ
ル状フィルム上にマウス由来の線維芽細胞（Ｌ−９２
９）の培養液（約１３．８万個／ｍｌ）０．３ｍｌを接
触させたまま、二酸化炭素５％、湿度１００％で３７℃
に設定したインキュベーター中に静置した。培養液に
は、１０％牛胎児血清を含むＥａｇｌｅ ＭＥＭを使用
した。また、比較のため、ポリビニルアルコールだけか
らなる試料、高研（株）製コラーゲン試料、和光純薬工
業（株）製の組織培養用プラスチックシートについても
同一手法で試験を行った。所定時間インキュベーター中
に静置後、試料とした含水ゲル状フィルム上に接着して
いる細胞数を、クリスタルバイオレットを染料とする通
常の核染色法により定量した。また、顕微鏡下で細胞数
を直接数える方法でも定量した。３０時間培養後の細胞
増殖率（組織培養用プラスチックシートに接着した細胞
数に対するゲル状フィルムに接着した細胞数の比）とキ
トサン含有率との関係を表１に示す。キトサン含有率の
増加とともに細胞増殖率が急激に増大した。３０時間培
養後の４０％キトサン含有ゲル状フィルムの細胞増殖率
はコラーゲン試料での２５６をも凌ぐ結果であった。さ
らに、試料上に接着した細胞の形態を顕微鏡により観察
した結果、キトサン含有率の低いゲル状フィルムでは細
胞は球状であったが、含有率の増大とともに生体内及び
コラーゲン上で観察されるのと同様の紡錘形を有する細
胞の割合が増加することがわかった。
【０００８】以上の結果からポリビニルアルコールとキ
トサンとの混合物は細胞接着増殖能をもつことが示され
る。
トサンとの混合物は細胞接着増殖能をもつことが示され
る。
【０００９】混合物中のキトサンの含有率（重量％）と
含水率、ヤング率、３０時間培養後の細胞増殖率（組織
培養用プラスチックシートに接着した細胞数に対するゲ
ル状フィルムに接着した細胞数の比）との関係を次表に
示す。
含水率、ヤング率、３０時間培養後の細胞増殖率（組織
培養用プラスチックシートに接着した細胞数に対するゲ
ル状フィルムに接着した細胞数の比）との関係を次表に
示す。
【００１０】
【表１】
【００１１】実施例３ 実施例１において、キトサンとポリビニルアルコールの
総重量が１０ｇのかわりに２０ｇになるようにする以外
は同様の手法で混合高分子の均一水溶液を得た。この水
溶液を細いノズルから−７０℃のメタノール中に押し出
して脱水凝固し、さらに４％の水酸化ナトリウム水溶液
中にて中和した後、新しい蒸留水で数回水洗いすること
により繊維状の細胞培養用床材を成形した。
総重量が１０ｇのかわりに２０ｇになるようにする以外
は同様の手法で混合高分子の均一水溶液を得た。この水
溶液を細いノズルから−７０℃のメタノール中に押し出
して脱水凝固し、さらに４％の水酸化ナトリウム水溶液
中にて中和した後、新しい蒸留水で数回水洗いすること
により繊維状の細胞培養用床材を成形した。
【００１２】実施例４ 実施例３において、混合高分子の均一水溶液を細いノズ
ルから押し出すかわりに、この水溶液を−７０℃のメタ
ノール中へ一定量ずつ滴下すること以外は同様の手法に
より、球状の細胞培養用床材を成形した。
ルから押し出すかわりに、この水溶液を−７０℃のメタ
ノール中へ一定量ずつ滴下すること以外は同様の手法に
より、球状の細胞培養用床材を成形した。
【００１３】
【発明の効果】本発明の細胞培養用床材は、細胞の接着
増殖能をもつことから、従来の細胞培養用床材に見られ
た不都合な問題を解決したもので、その価値は多大であ
る。
増殖能をもつことから、従来の細胞培養用床材に見られ
た不都合な問題を解決したもので、その価値は多大であ
る。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平６−209767（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−33486（ＪＰ，Ａ) 特開 昭62−51982（ＪＰ，Ａ) 特開 平３−117483（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12N 5/00 - 5/28
Claims (1)
- 【請求項１】 ポリビニルアルコール８０〜６０重量％
とキトサン２０〜４０重量％とからなる混合高分子の含
水ゲルの成形物からなる細胞培養用床材。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8236079A JP2981540B2 (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | 細胞培養用床材 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8236079A JP2981540B2 (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | 細胞培養用床材 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1075775A JPH1075775A (ja) | 1998-03-24 |
| JP2981540B2 true JP2981540B2 (ja) | 1999-11-22 |
Family
ID=16995419
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8236079A Expired - Lifetime JP2981540B2 (ja) | 1996-09-06 | 1996-09-06 | 細胞培養用床材 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2981540B2 (ja) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20020000580A (ko) * | 2000-06-23 | 2002-01-05 | 김범철 | 피부 상처 치료용 드레싱제 및 그 제조방법 |
| JP2005034069A (ja) * | 2003-07-16 | 2005-02-10 | Fuji Photo Film Co Ltd | バイオリアクター及びそれを用いた細胞培養方法 |
| JP2006246883A (ja) * | 2005-02-14 | 2006-09-21 | Fuji Photo Film Co Ltd | 細胞培養担体 |
| JP2007259735A (ja) * | 2006-03-28 | 2007-10-11 | Fujifilm Corp | 細胞培養担体 |
-
1996
- 1996-09-06 JP JP8236079A patent/JP2981540B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH1075775A (ja) | 1998-03-24 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| S533 | Written request for registration of change of name |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533 |
|
| R350 | Written notification of registration of transfer |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |