JP2980829B2 - Treatment method of chlorine-substituted ethylene by microbiological method - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

【０００１】[0001]

【発明の属する技術分野】本発明は、微生物学的方法に
より塩素置換エチレンを処理する方法に関する。特に
は、トリクロロエチレンなどの塩素置換エチレンを添加
してなる培地で、アルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素生産
能を有する微生物或いは炭素源としてアルケンのみを含
有する培地内で生育可能な微生物を生育させ、当該微生
物を作用させて塩素置換エチレンを微生物学的に酸化し
て分解処理する方法に関する。[0001] The present invention relates to a method for treating chlorinated ethylene by a microbiological method. In particular, in a medium to which chlorine-substituted ethylene such as trichloroethylene is added, a microorganism capable of producing an alkene monooxygenase enzyme or a microorganism capable of growing in a medium containing only alkene as a carbon source is grown. The present invention relates to a method of decomposing a chlorine-substituted ethylene by microbial oxidation by the action of a microorganism.

【０００２】[0002]

【従来の技術】ハロゲン置換脂肪族炭化水素、特に、炭
素数１又は２の塩素置換化合物は、油脂などの有機物を
よく溶解するので洗浄用溶剤として広範に使用されてき
た。例えば、塩素置換エチレンであるトリクロロエチレ
ンは、難水溶性であり且つ揮発性が高い特質を利用し
て、ドライクリ−ニング用溶剤、電子機械工業や半導体
工業での脱脂用洗浄剤として主に使用されてきた溶剤で
ある。トリクロロエチレンは、クロロホルムと同様に中
枢神経系に対し抑制作用、麻酔作用を持ち、更には突然
変異（奇形）誘導性或は発癌性を有することが報告され
ている。その毒性故、回収処理がなされている。不幸に
して排水に混入し漏洩したトリクロロエチレンは、自然
界では分解され難く又難水溶性のため、土壌や地下水脈
に蓄積し汚染を起こしてしっまっている。これら環境汚
染したトリクロロエチレンは、揚水した地下水を曝気
し、大気に揮散し回収する方法、活性炭により吸着除去
する方法、減圧下で土壌ガスを吸着除去する方法などの
物理的な方法により回収されている。また、回収された
トリクロロエチレンは、焼却や触媒を用いた光化学的な
手段で分解処理されている。2. Description of the Related Art Halogen-substituted aliphatic hydrocarbons, particularly chlorine-substituted compounds having 1 or 2 carbon atoms, have been widely used as washing solvents because they dissolve organic substances such as fats and oils well. For example, trichloroethylene, which is a chlorine-substituted ethylene, has been used mainly as a solvent for dry cleaning and a cleaning agent for degreasing in the electronic machinery industry and the semiconductor industry, utilizing its poor water solubility and high volatility. Solvent. Trichloroethylene, like chloroform, has an inhibitory action and an anesthetic action on the central nervous system, and is further reported to have a mutation (deformation) -inducing or carcinogenic property. Due to its toxicity, it has been recovered. Unfortunately, trichlorethylene mixed into wastewater and leaked is difficult to decompose in nature and is poorly water-soluble, so that it accumulates in soil and groundwater veins and causes pollution. These environmentally contaminated trichlorethylenes are collected by physical methods such as a method of aerating the pumped groundwater and volatilizing and collecting them in the atmosphere, a method of adsorbing and removing them with activated carbon, and a method of adsorbing and removing soil gas under reduced pressure. . The collected trichlorethylene is decomposed by incineration or photochemical means using a catalyst.

【０００３】更には、土壌に生息する嫌気性細菌の或る
ものは、トリクロロエチレンからより高い突然変異（奇
形）誘導性或は発癌性を示す塩化ビニル（クロロエチレ
ン）やジクロロエチレンを作ることが見い出されるに至
り(E.J.Bouwer and P.L.McCarty, Appl. Environ. Micr
obiol., 45, 1286 (1983) , T.M.Vogel, C.S.Criddle,
and P.L.McCarty, Environ. Sci. Technol., 21, 722
(1987) , Appl. Environ. Microbiol., 49, 1080 (198
5) などを参照)、環境汚染したトリクロロエチレンの迅
速な処理が益々必要となっている。近年、地下水脈に蓄
積汚染し、広い範囲に比較的低濃度で拡散するトリクロ
ロエチレンを処理する目的で、微生物を用いた分解除去
に期待が寄せられている。In addition, some anaerobic bacteria inhabiting the soil have been found to make vinyl chloride (dichloroethylene) and dichloroethylene from trichloroethylene which are more mutagenic (malformed) or carcinogenic. (EJBouwer and PLMcCarty, Appl.Environ.Micr
obiol., 45 , 1286 (1983), TMVogel, CSCriddle,
and PLMcCarty, Environ. Sci. Technol., 21 , 722
(1987), Appl.Environ.Microbiol., 49 , 1080 (198
5) etc.), and rapid treatment of environmentally contaminated trichlorethylene is increasingly required. 2. Description of the Related Art In recent years, for the purpose of treating trichlorethylene which accumulates and contaminates groundwater veins and diffuses at a relatively low concentration over a wide area, there is an expectation for decomposition and removal using microorganisms.

【０００４】既に、トリクロロエチレンから塩化ビニル
（クロロエチレン）やジクロロエチレンを作る可能性が
ある嫌気性細菌以外に、好気性の細菌のうちにも、ハロ
ゲン置換脂肪族炭化水素を分解する能力を有する細菌が
存在することが報告されている。特に、好気性の微生物
によるトリクロロエチレンの処理方法には、例えば、ト
ルエン資化性菌（トルエンジオキシゲナ−ゼ）(G.J.Zyl
stra, L.P.Wackett, and D.T.Gibson, Appl. Environ.
Microbiol., 55, 3162 (1989) などを参照)、トルエン
資化性菌（トルエンモノオキシゲナ−ゼ）(R.B.Winter,
K-M.Yen, andB.D.Ensley, Bio/Technol. 7, 282 (198
9) などを参照)、メタン資化性菌(メタンモノオキシゲ
ナ−ゼ）(R.Oldenhuis, R.L.J.M.Vink, D.B.Janssen, a
nd B.Witholt, Appl. Environ. Microbiol., 55, 2819
(1989) などを参照)、アンモニア資化性菌(アンモニア
モノオキシゲナ−ゼ）(T.Vannelli, M.Logan, D.M.Arci
ero, and A.B.Hooper, Appl. Environ. Microbiol., 5
6, 1169 (1990) などを参照)など、アンモニア、メタン
或はメチル基を酸化する酵素を生産する微生物、即ち二
重結合を含まない原子団を酸化する酵素を生産する微生
物を用いて、トリクロロエチレンを処理する方法が報告
されている。しかしながら、これらの水素原子をヒドロ
キシ基に酸化転換する酵素以外の炭化水素酸化酵素を利
用するトリクロロエチレンの微生物的手法による処理方
法は、これまでのところ確立されていない。特に、高い
効率でトリクロロエチレンを処理するに適する、新たな
トリクロロエチレンの微生物的手法による処理方法の開
発が望まれている。Already, vinyl chloride is converted from trichlorethylene.
(Chloroethylene) and dichloroethylene
In addition to certain anaerobic bacteria, among aerobic bacteria, halo
Bacteria capable of decomposing gen-substituted aliphatic hydrocarbons
It is reported to be present. In particular, aerobic microorganisms
The method of treating trichlorethylene by
Ruene-utilizing bacteria (toluene dioxygenase) (G.J.Zyl
stra, L.P.Wackett, and D.T.Gibson, Appl.Environ.
Microbiol.,55, 3162 (1989)), toluene
Assimilating bacteria (toluene monooxygenase) (R.B. Winter,
 K-M.Yen, andB.D.Ensley, Bio / Technol.7, 282 (198
9)), methane-utilizing bacteria (methane monooxygen
Nase) (R.Oldenhuis, R.L.J.M.Vink, D.B.Janssen, a
nd B. Witholt, Appl. Environ. Microbiol.,55, 2819
(1989)), ammonia-assimilating bacteria (ammonia
Monooxygenase) (T. Vannelli, M. Logan, D.M.Arci
ero, and A.B.Hooper, Appl.Environ.Microbiol.,Five
6, 1169 (1990)), ammonia, methane
Alternatively, microorganisms that produce enzymes that oxidize methyl groups,
Microbes that produce enzymes that oxidize groups that do not contain heavy bonds
Report on the treatment of trichlorethylene using waste
Have been. However, these hydrogen atoms are
Use of hydrocarbon oxidases other than those that convert oxidatively to xy groups
Of trichlorethylene for use by microbiological techniques
The law has not been established so far. Especially high
New, suitable for processing trichlorethylene with efficiency
Development of treatment method for trichlorethylene by microbiological technique
Departure is desired.

【０００５】加えて、トリクロロエチレンのみでなく、
嫌気性細菌の作用によりトリクロロエチレンから変換さ
れる、塩化ビニル（クロロエチレン）やジクロロエチレ
ンなどの塩素置換エチレンをも同時に処理することがで
きる、塩素置換エチレンの微生物的手法による処理方法
の開発が望まれている。In addition to trichloroethylene,
Development of a microbial treatment method for chlorine-substituted ethylene that can simultaneously treat chlorine-substituted ethylene such as vinyl chloride (chloroethylene) and dichloroethylene, which is converted from trichloroethylene by the action of anaerobic bacteria, is desired. I have.

【０００６】[0006]

【発明が解決しようとする課題】本発明が解決しようと
する課題は、トリクロロエチレン、塩化ビニル（クロロ
エチレン）、ジクロロエチレンなどの塩素置換エチレン
を微生物的手法による新規な処理方法を提供することで
ある。即ち、本発明の目的は、高い効率でトリクロロエ
チレンなどの塩素置換エチレンを分解処理するに適す
る、微生物的手法による塩素置換エチレンの新たな処理
方法を提供することにある。特には、芳香族炭化水素を
酸化する酵素に換えて、非芳香族の炭化水素を酸化する
酵素による酸化過程を利用する、即ち非芳香族の炭化水
素を酸化する酵素を生産する微生物又は非芳香族の炭化
水素を資化する微生物を利用し、効率良く塩素置換エチ
レンを処理する方法を提供することにある。An object of the present invention is to provide a novel method for treating chlorine-substituted ethylene such as trichloroethylene, vinyl chloride (chloroethylene) and dichloroethylene by a microbiological technique. That is, an object of the present invention is to provide a new method for treating chlorine-substituted ethylene by a microbial technique, which is suitable for decomposing chlorine-substituted ethylene such as trichloroethylene with high efficiency. In particular, instead of enzymes that oxidize aromatic hydrocarbons, use the oxidation process of enzymes that oxidize non-aromatic hydrocarbons, that is, microorganisms or enzymes that produce enzymes that oxidize non-aromatic hydrocarbons. It is an object of the present invention to provide a method for efficiently treating chlorine-substituted ethylene by utilizing a microorganism that assimilates a hydrocarbon of a group.

【０００７】[0007]

【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
したところ、非芳香族の炭化水素であるアルケンを資化
する生物活性を有する微生物により、或いはアルケンを
酸化し対応するエポキシドに変換する酵素であるアルケ
ンモノオキシゲナ−ゼ酵素生産能を有する微生物によ
り、トリクロロエチレンなどの塩素置換エチレンが微生
物的に酸化され、トリクロロエチレンオキシドなど、対
応するエポキシドに転換されることを見い出し、本発明
を完成するに至った。Means for Solving the Problems The present inventors have made intensive studies and found that a microorganism having a biological activity to assimilate a non-aromatic hydrocarbon alkene or oxidizing an alkene to a corresponding epoxide. Microorganisms capable of producing an alkene monooxygenase enzyme that is capable of producing microorganisms oxidize chlorinated ethylene such as trichloroethylene microbially and convert it to the corresponding epoxide such as trichloroethylene oxide, completing the present invention. I came to.

【０００８】即ち、本発明は、下記の（１）〜（７）に
記載する微生物学的方法による塩素置換エチレンの処理
方法である。 （１） 置換する塩素数１〜３の塩素置換エチレンを添
加してなる培地で、アルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素生
産能を有する微生物を生育せしめ、当該微生物を作用さ
せて該塩素置換エチレンを微生物学的に酸化して、該塩
素置換エチレンを対応するエポキシドに転換することか
らなる微生物学的方法による塩素置換エチレンの処理方
法。 （２） 置換する塩素数１〜３の塩素置換エチレンを添
加してなる培地で、炭素源としてアルケンのみを含有す
る培地で生育可能な微生物を生育せしめ、当該微生物を
作用させて該塩素置換エチレンを微生物学的に酸化し
て、該塩素置換エチレンを対応するエポキシドに転換す
ることからなる微生物学的方法による塩素置換エチレン
の処理方法。 （３） 前記の微生物が、アルケンモノオキシゲナ−ゼ
酵素の遺伝子ＤＮＡを含有するプラスミドベクタ−を導
入し形質転換してなる該アルケンモノオキシゲナ−ゼ酵
素生産能を有する微生物であることを特徴とする前記
（１）に記載する微生物学的方法による塩素置換エチレ
ンの処理方法。 （４） 前記の微生物が、Nocardia 属(ノカルディア
属)、Rhodococcous 属(ロドコッカス属)、Xanthobacter
属(ザンソバクタ−属)及びMycobacterium 属(ミコバク
テリウム属)よりなる群から選択される属に分類される
微生物であることを特徴とする前記（１）〜（３）の何
れかに記載する微生物学的方法による塩素置換エチレン
の処理方法。 （５） 前記の微生物が、 Nocardia corallina (ノカ
ルディア コラリ−ナ) B-276株 (FERM BP-5124 ; ATCC
31338) であることを特徴とする前記（１）、（２）又
は（４）の何れかに記載する微生物学的方法による塩素
置換エチレンの処理方法。 （６） 前記のアルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素の遺伝
子ＤＮＡが、Nocardia corallina (ノカルディア コラ
リ−ナ) B-276株 (FERM BP-5124 ; ATCC 31338)由来の
アルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素の遺伝子ＤＮＡである
ことを特徴とする前記（３）又は（４）に記載する微生
物学的方法による塩素置換エチレンの処理方法。 （７） 前記のアルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素生産能
を有する微生物が、Eschericha coli (イ− コリ) に分
類される形質転換微生物であることを特徴とする前記
（３）又は（６）に記載する微生物学的方法による塩素
置換エチレンの処理方法。That is, the present invention is a method for treating chlorinated ethylene by a microbiological method described in the following (1) to (7). (1) A microorganism having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability is grown in a medium containing chlorine-substituted ethylene having 1 to 3 chlorine atoms to be substituted, and the microorganism is acted on to produce the microorganism. A method for treating chlorinated ethylene by a microbiological method comprising chemically oxidizing and converting the chlorinated ethylene to the corresponding epoxide. (2) In a medium to which a chlorine-substituted ethylene having 1 to 3 chlorine atoms to be replaced is added, a microorganism capable of growing on a medium containing only alkene as a carbon source is grown, and the microorganism is acted on to grow the microorganism. A method for treating chlorinated ethylene by a microbiological method, comprising microbiologically oxidizing the compound to convert the chlorinated ethylene into the corresponding epoxide. (3) The microorganism is a microorganism having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability obtained by introducing and transforming a plasmid vector containing a gene DNA of an alkene monooxygenase enzyme. The method for treating chlorine-substituted ethylene by the microbiological method described in the above (1). (4) the microorganisms is, Nocardia species (genus Nocardia), Rhodococcous genus (Rhodococcus sp.), Xanthobacter
The microorganism according to any one of the above (1) to (3), which is a microorganism classified into a genus selected from the group consisting of the genus (Zantobacter) and the genus Mycobacterium ( Mycobacterium ). Of chlorine-substituted ethylene by chemical method. (5) The microorganism is Nocardia corallina ( Nocardia corallina ) B-276 strain (FERM BP-5124; ATCC
31338) The method for treating chlorine-substituted ethylene by the microbiological method according to any one of the above (1), (2) or (4), wherein (6) The gene DNA of the alkene monooxygenase enzyme is a gene for an alkene monooxygenase enzyme derived from Nocardia corallina strain B-276 (FERM BP-5124; ATCC 31338). A method for treating chlorinated ethylene by the microbiological method according to (3) or (4), which is DNA. (7) The microorganism according to the above (3) or (6), wherein the microorganism having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability is a transformed microorganism classified as Eschericha coli. Of chlorine-substituted ethylene by a microbiological method.

【０００９】[0009]

【発明の実施の形態】本発明の方法で分解処理される、
置換する塩素数１〜３の塩素置換エチレンとは、具体的
には、トリクロロエチレン、 1,1-ジクロロエチレン、c
is-1,2-ジクロロエチレン、trans-1,2-ジクロロエチレ
ン、並びに塩化ビニル(クロロエチレン)をさす。また、
本発明の方法により該塩素置換エチレンから転換され生
成するエポキシドは、培地に多量に含まれる水により、
エポキシ環が水付加開環して対応する塩素置換エタンジ
オ−ルに速やかに変換される。最終的には、該塩素置換
エタンジオ−ルは、更に代謝を受けて微生物学的な分解
を受ける、或いは化学的に置換する塩素原子の水酸基へ
の変換を受け、分解される。なお、該塩素置換エチレン
から生成される対応のエポキシドが、更に酸性或はアル
カリ性条件の下で、水中において化学的に分解される過
程は、Biosci. Biotech. Biochem. 56(3), 486-489 (19
92) などの刊行物に記載されている。DETAILED DESCRIPTION OF THE PREFERRED EMBODIMENTS
The chlorine-substituted ethylene having 1 to 3 chlorine atoms to be substituted is, specifically, trichloroethylene, 1,1-dichloroethylene, c
is-1,2-dichloroethylene, trans-1,2-dichloroethylene, and vinyl chloride (chloroethylene). Also,
The epoxide produced by the conversion from the chlorine-substituted ethylene by the method of the present invention, by a large amount of water contained in the medium,
The epoxy ring is rapidly converted to the corresponding chlorine-substituted ethanediol by water addition ring opening. Finally, the chlorine-substituted ethanediol is further degraded by undergoing metabolism and undergoing microbiological degradation, or by undergoing the conversion of chemically substituted chlorine atoms to hydroxyl groups. The process in which the corresponding epoxide generated from the chlorine-substituted ethylene is further chemically decomposed in water under acidic or alkaline conditions is described in Biosci. Biotech. Biochem. 56 (3), 486-489. (19
92).

【００１０】本発明において利用する微生物、即ち、炭
素源としてアルケンのみを含有する培地で生育可能な微
生物は、土壌中から採取し、プロピレンを唯一の炭素源
として含有する培地を用いて生育させることにより、分
離することができる。特には、プロピレンからプロペン
オキシドを経由して分解する微生物が好適に用いること
ができる。具体的には、プロピレンからプロペンオキシ
ドを生産する能力を有する微生物として、既に報告され
ている Nocardia 属 (ノカルディア属)、 Rhodococcous
属 (ロドコッカス属)、 Xanthobacter 属 (ザンソバク
タ−属)及び Mycobacterium 属 (ミコバクテリウム属)
からなる群に分類される微生物は、プロピレンからプロ
ペンオキシドへの酸化能が高く、好適な微生物である。
これらの菌として、次の文献、 C. G. van Ginkel, H.
G. J. Welten and J. A. M. de Bont, Appl. Environ.
Microbiol. 53, 2903 (1987) に記載される菌を例示す
ることができる。上記する炭素源としてアルケンのみを
含有する培地で生育可能であり、 Nocardia 属 (ノカル
ディア属)、 Rhodococcous 属 (ロドコッカス属)、Xant
hobacter 属 (ザンソバクタ−属)及び Mycobacterium
属 (ミコバクテリウム属)からなる群に分類される微生
物の内、アルケン以外の炭素源、例えばグルコ−スを炭
素源として育成した際にも、置換する塩素数１〜３の塩
素置換エチレンを対応するエポキシドに変換する能力の
高いものは、一層好適な微生物である。[0010] The microorganism used in the present invention, that is, a microorganism that can grow on a medium containing only alkene as a carbon source, is collected from soil and grown on a medium containing propylene as the sole carbon source. Can be separated. In particular, microorganisms that decompose from propylene via propene oxide can be suitably used. Specifically, as microorganisms having the ability to produce propene oxide from propylene, Nocardia genus (Nocardia genus), Rhodococcous
Genus (Rhodococcus), Xanthobacter (Zantobacter) and Mycobacterium ( Mycobacterium )
The microorganisms classified into the group consisting of have a high ability to oxidize propylene to propene oxide and are suitable microorganisms.
As these fungi, the following literature, CG van Ginkel, H.
GJ Welten and JAM de Bont, Appl. Environ.
Microbiol. 53 , 2903 (1987). It can be grown on a medium containing only alkene as the above carbon source, Nocardia genus (Nocardia genus), Rhodococcous genus (Rhodococcus genus), Xant
genus hobacter (Zantobacter) and Mycobacterium
Among the microorganisms classified into the group consisting of the genus (Mycobacterium), when a carbon source other than an alkene, such as glucose, is grown as a carbon source, a chlorine-substituted ethylene having 1 to 3 chlorine atoms to be replaced is used. Those that are more capable of converting to the corresponding epoxides are more suitable microorganisms.

【００１１】また、本発明に用いるアルケンモノオキシ
ゲナ−ゼ酵素生産能を有する微生物は、アルケン代謝に
関わる、初期酸化酵素のアルケンモノオキシゲナ−ゼ酵
素を産生する微生物である。即ち、アルケンから対応す
るエポキシドに変換するアルケンモノオキシゲナ−ゼ酵
素を産生する微生物であり、例えば、アルケンとしてプ
ロピレンを用い、対応するエポキシドを産出する微生物
として土壌中から分離することができる。好適な微生物
として、 Nocardia 属 (ノカルディア属)、 Rhodococco
us 属 (ロドコッカス属)、 Xanthobacter 属 (ザンソバ
クタ−属)及びMycobacterium 属 (ミコバクテリウム属)
からなる群に分類され、且つ末端に炭素−炭素二重結
合を有するアルケンを対応するエポキシドに変換する能
力を有する菌を挙げることができ、具体的には、文献、
C. G. van Ginkel, H. G. J. Welten and J. A. M. de
Bont, Appl. Environ. Microbiol. 53, 2903 (1987)
に記載される菌を例示できる。更には、 Rhodococcous
属 (ロドコッカス属)に属する微生物のうち、好適な種
として、 Rhodococcous rhodochrous を、具体的な菌株
として、 American Type Culture Collection に、受託
番号 ATCC 29675、ATCC 29670、 ATCC 29672 をそれぞ
れ付与され、寄託されている菌株を例示することができ
る（米国特許５３８０６５４号、米国特許５３７６５３
９号特許公報などを参照）。或は、 Rhodococcous sp.
ATCC 29673、 Rhodococcous sp. ATCC29674 などの菌株
を例示することができる（米国特許５３８０６５４号、
米国特許５３７６５３９号特許公報などを参照）。 Xan
thobacter 属 (ザンソバクタ−属)に属する菌として、
Xanthobacter strain Py2 株など( Appl. Environ. Mic
robiol., 58, 3038 (1992) を参照)、 Mycobacterium
属 (ミコバクテリウム属) に属する菌として、 Mycobac
terium strain L1 株 (Biotechnol. Lett., 7,383-388
(1985)、或は J. Gen. Microbiol., 137, 2555-2560 (1
991) を参照)、 Mycobacterium rhodochrous NCIB 703
株 (米国特許４９５６２８４号特許公報を参照）などを
も例示することができる。又、天然より分離されるアル
ケンモノオキシゲナ−ゼ酵素生産能を有する微生物に由
来するアルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素をコ−ドする遺
伝子ＤＮＡを公知の遺伝子組み換え技術によりプラスミ
ドに組み込んでなるプラスミドベクタ−を構築し、宿主
微生物に導入し形質転換してなる当該アルケンモノオキ
シゲナ−ゼ酵素生産能を有する微生物も、該アルケンモ
ノオキシゲナ−ゼ酵素を産生するので好適に用いること
ができる。特には、アルケン以外の炭素源、例えばグル
コ−スを炭素源として育成した際にも、アルケンモノオ
キシゲナ−ゼ酵素生産能が高く維持される微生物は、一
層好適な微生物である。The microorganism having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability used in the present invention is a microorganism which produces an alkene monooxygenase enzyme, which is an early oxidase involved in alkene metabolism. That is, it is a microorganism that produces an alkene monooxygenase enzyme that converts an alkene to a corresponding epoxide. For example, propylene can be used as an alkene and isolated from soil as a microorganism that produces the corresponding epoxide. Suitable microorganisms include the genus Nocardia , Rhodococco
genus us (Rhodococcus), Xanthobacter (Zantobacter) and Mycobacterium ( Mycobacterium )
Bacteria classified into the group consisting of and having the ability to convert an alkene having a carbon-carbon double bond at the terminal into the corresponding epoxide can be mentioned.
CG van Ginkel, HGJ Welten and JAM de
Bont, Appl. Environ. Microbiol. 53 , 2903 (1987)
Can be exemplified. Furthermore, Rhodococcous
Among microorganisms belonging to the genus (Rhodococcus), Rhodococcous rhodochrous is a preferred species, and a specific strain is given to the American Type Culture Collection under accession numbers ATCC 29675, ATCC 29670, ATCC 29672, and deposited. (US Pat. No. 5,380,654, US Pat. No. 5,376,653).
No. 9 patent publication). Or, Rhodococcous sp.
ATCC29673, Rhodococcous sp. ATCC29674 and the like can be exemplified (US Pat. No. 5,380,654,
See U.S. Patent No. 5,376,539 Patent Publication). Xan
As a bacterium belonging to the genus thobacter,
Xanthobacter strain Py2 strain etc. ( Appl.Environ.Mic
robiol., 58, 3038 (1992)), Mycobacterium
Mycobac as a fungus belonging to the genus Mycobacterium
terium strain L1 strain (Biotechnol. Lett., 7,383-388
(1985), or J. Gen. Microbiol., 137, 2555-2560 (1
991)), Mycobacterium rhodochrous NCIB 703
Strains (see U.S. Pat. No. 4,956,284) and the like. Also, a plasmid vector obtained by incorporating a gene DNA encoding an alkene monooxygenase derived from a microorganism capable of producing an alkene monooxygenase isolated from nature into a plasmid by a known gene recombination technique. The microorganism having the alkene monooxygenase enzyme-producing ability obtained by constructing-, introducing into a host microorganism and transforming the alkene monooxygenase enzyme can also be suitably used because it produces the alkene monooxygenase enzyme. In particular, microorganisms that maintain a high alkene monooxygenase enzyme-producing ability even when grown using a carbon source other than alkene, for example, glucose as a carbon source, are more preferable microorganisms.

【００１２】更には、本発明において特に好適な菌とし
て、本発明者らが先の特許出願（特願 平５−１０５１
７１号 の明細書、即ち特開平６−２９２５７１号公報
を参照）に開示する Nocardia corallina (ノカルディ
ア コラリ−ナ) B-276 株 (FERMBP-5124 ; ATCC 31338)
を挙げることができる。又、当該菌株、 Nocardia cora
llina (ノカルディア コラリ−ナ) B-276 株 (FERM BP-
5124 ; ATCC 31338)の産生するアルケンモノオキシゲナ
−ゼ酵素をコ−ドする遺伝子ＤＮＡ、 amoABCD遺伝子を
大腸菌由来のプラスミドに組み込んでなるプラスミドベ
クタ−により形質転換してなる大腸菌、即ち該アルケン
モノオキシゲナ−ゼ酵素生産能を有する大腸菌形質転換
株、例えば、E. coli (大腸菌) JM109 (pDBB-1) 株 (FE
RM BP-4250) なども、特に好適な菌として挙げることが
できる。なお、前記する微生物 Nocardia corallina
(ノカルディア コラリ−ナ) B-276 株 (FERM BP-5124 ;
ATCC31338)は受託番号 FERM BP-5124 を付与され、E.
coli (大腸菌) JM109 (pDBB-1) 株 (FERM BP-4250) は
受託番号 FERM BP-4250 を付与され、ともに通産省工業
技術院生命工学工業技術研究所に寄託されている。ま
た、微生物 Nocardia corallina (ノカルディア コラリ
−ナ) B-276 株 (FERM BP-5124 ; ATCC 31338)は、Amer
ican Type Culture Collection に、受託番号 ATCC 313
38 を付与され、寄託されている。なお、微生物 Nocard
ia corallina (ノカルディア コラリ−ナ)B-276 株 (FE
RM BP-5124 ; ATCC 31338)は、従来、受託番号 P-4094
のもとに国内寄託されていたが、国際寄託に移管され、
新たに通産省工業技術院生命工学工業技術研究所より受
託番号 FERM BP-5124 を付与されている。この二種の微
生物は、アルケン以外の炭素源、例えばグルコ−スを炭
素源として育成した際にも、アルケンモノオキシゲナ−
ゼ酵素生産能が高く維持され、従って、置換する塩素数
１〜３の塩素置換エチレンを対応するエポキシドに変換
する能力が高く保たれるので、特に好適な微生物であ
る。加えて、 Nocardia 属 (ノカルディア属)及び Rhod
ococcous 属 (ロドコッカス属)に属し、アルケンモノオ
キシゲナ−ゼ酵素生産能を有する菌は、一般に、アルケ
ン以外の炭素源、例えばグルコ−スを炭素源として育成
した際にも、アルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素生産能が
高く維持されるので、好適な微生物である。Further, the present inventors have filed a patent application (Japanese Patent Application No. 5-1051) as a particularly preferable bacterium in the present invention.
No. 71, that is, Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-292571) Nocardia corallina B-276 strain (FERMBP-5124; ATCC 31338).
Can be mentioned. In addition, the strain, Nocardia cora
llina (Nocardia coralina ) B-276 strain (FERM BP-
5124; ATCC 31338), a gene DNA encoding an alkene monooxygenase enzyme produced by Escherichia coli transformed with a plasmid vector obtained by incorporating the amoABCD gene into a plasmid derived from Escherichia coli, that is, the alkene monooxygenase. A transformed strain of Escherichia coli having an enzyme producing ability, for example, E. coli (Escherichia coli) JM109 (pDBB-1) strain (FE
RM BP-4250) can also be mentioned as a particularly suitable bacterium. The microorganism Nocardia corallina described above
(Nocardia Coralina) B-276 strain (FERM BP-5124;
ATCC 31338) has been accorded the accession number FERM BP-5124, E.
Escherichia coli JM109 (pDBB-1) strain (FERM BP-4250) has been accorded accession number FERM BP-4250, and both have been deposited with the Ministry of International Trade and Industry at the Institute of Biotechnology and Industrial Technology. The microorganism Nocardia corallina ( Nocardia corallina ) B-276 strain (FERM BP-5124; ATCC 31338) is
Accession number ATCC 313 on ican Type Culture Collection
38 and deposited. The microorganism Nocard
ia corallina B-276 strain (FE
RM BP-5124; ATCC 31338) was previously available under accession number P-4094.
Was deposited domestically, but transferred to an international deposit,
It has been newly assigned the accession number FERM BP-5124 by the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, Ministry of International Trade and Industry of the Ministry of International Trade and Industry. These two types of microorganisms are also capable of producing alkene monooxygenase when grown using a carbon source other than alkene, for example, glucose as a carbon source.
It is a particularly preferred microorganism because its enzyme-producing ability is maintained at a high level, and therefore, the ability to convert the substituted chlorine-substituted ethylene having 1 to 3 chlorine atoms to the corresponding epoxide is maintained at a high level. In addition, Nocardia and Rhod
Bacteria belonging to the genus ococcous (Rhodococcus genus) and having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability are generally alkene monooxygenases even when grown using a carbon source other than alkene, for example, glucose as a carbon source. It is a suitable microorganism because its enzyme-producing ability is maintained at a high level.

【００１３】一方、宿主微生物としては前記大腸菌に限
らず、Nocardia属（ノカルディア属）やRhodococcus属
（ロドコッカス属）などのノカルディフォルム細菌も好
適に利用できる。すなわち、これらのノカルディフォル
ム細菌由来のプラスミドに、外来のアルケンモノオキシ
ゲナーゼ酵素をコードする遺伝子DNAを組み込んだプラ
スミドベクターを導入して形質転換菌とすることができ
る。このノカルディフォルム細菌由来のプラスミドとし
ては、本発明者が既に提案しているプラスミドpNC500
（特開平５−２４４９５３号公報）、プラスミドpNC903
（特願平６−７３７９５号明細書；特開平７−２５５４
８４公報）などが利用できる。[0013] On the other hand, as the host microorganism is not limited to the E. coli, Nocardia species (genus Nocardia) and genus Rhodococcus (Rhodococcus sp.) Nocardioides form bacteria, such as can also be suitably used. That is, a transformant can be obtained by introducing a plasmid vector into which a gene DNA encoding an exogenous alkene monooxygenase enzyme is introduced into a plasmid derived from the nocardiform bacteria. The plasmid derived from the nocardiform bacteria includes the plasmid pNC500 already proposed by the present inventors.
(Japanese Unexamined Patent Publication No. 5-249553), plasmid pNC903
(Japanese Patent Application No. 6-73795; Japanese Patent Application Laid-Open No. 7-2554)
84 gazette) can be used.

【００１４】即ち、これらノカルディフォルム細菌由来
のプラスミドと大腸菌由来のプラスミドからシャトルベ
クタープラスミドを調製し、これにアルケンモノオキシ
ゲナーゼ酵素をコードする遺伝子DNAを組み込み、発現
ベクター（環状プラスミド）を構築する。かかるアルケ
ンモノオキシゲナーゼ酵素発現ベクターは、例えば、宿
主微生物とするノカルディフォルム細菌の細胞をプロト
プラスト或いはスフェロプラストにして、ポリエチレン
グリコールと共存させて移入する方法（J. Bacteriol.,
170, 638-645(1988)などを参照）、または宿主微生物
の細胞を対数増殖期中期まで培養し、高電圧の電気パル
スを与えて移入する方法（Appl. Environ. Microbio.,
56, 2818-2825(1990)などを参照）等の公知の技術を適
用して、宿主微生物に導入することができる。これによ
り、アルケンモノオキシゲナーゼ酵素生産能を有する形
質転換菌株を調製することができる。That is, a shuttle vector plasmid is prepared from a plasmid derived from the nocardiform bacteria and a plasmid derived from Escherichia coli, and a gene DNA encoding an alkene monooxygenase enzyme is incorporated into the shuttle vector plasmid to construct an expression vector (circular plasmid). Such an alkene monooxygenase enzyme expression vector is prepared, for example, by transferring nocardiform bacterium cells as a host microorganism into protoplasts or spheroplasts and coexisting with polyethylene glycol (J. Bacteriol.,
170, 638-645 (1988), etc.) or a method of culturing cells of a host microorganism until mid-logarithmic growth phase and applying a high-voltage electric pulse to transfer the cells (Appl. Environ. Microbio.,
56, 2818-2825 (1990)) and the like, and can be introduced into a host microorganism. Thus, a transformed strain having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability can be prepared.

【００１５】上記する天然より分離されるアルケンモノ
オキシゲナ−ゼ酵素生産能を有する微生物に由来するア
ルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素をコ−ドする遺伝子ＤＮ
Ａを遺伝子組み換え技術によりプラスミドに組み込んで
なるプラスミドベクタ−を構築し、宿主微生物に導入し
形質転換してなる当該アルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素
生産能を有する微生物を用いる場合、アルケンモノオキ
シゲナ−ゼ酵素としてNocardia corallina (ノカルディ
ア コラリ−ナ) B-276 株 (FERM BP-5124 ; ATCC 3133
8)の産生するアルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素が好適に
用いることができる。この酵素は、アルケンに酸素を付
加しエポキシドを形成するエポキシダ−ゼのスモ−ルサ
ブユニットとラ−ジサブユニットにそれぞれ当たる amo
A と amoC 、前記するエポキシダ−ゼに補酵素 NADH か
ら電子を伝達するレダクタ−ゼ（還元酵素）に当たる a
moD 及びそれらを複合酵素系に構成するカップリングタ
ンパク質と称される amoB の４つの蛋白質部分からなっ
ている。A gene DN encoding an alkene monooxygenase enzyme derived from a microorganism capable of producing an alkene monooxygenase enzyme isolated from nature as described above.
When a microorganism having the alkene monooxygenase enzyme-producing ability obtained by constructing a plasmid vector obtained by incorporating A into a plasmid by a gene recombination technique, introducing the transformed vector into a host microorganism, and transforming the resultant is used as the alkene monooxygenase, Nocardia corallina ( Nocardia coralina ) B-276 strain (FERM BP-5124; ATCC 3133)
The alkene monooxygenase enzyme produced by 8) can be suitably used. This enzyme has the amo and amo subunits of the epoxidase that add oxygen to the alkene to form an epoxide, respectively.
A and amoC correspond to a reductase that transfers electrons from the coenzyme NADH to the epoxidase described above.
It consists of four protein parts of moD and amoB called a coupling protein that constitutes them in a complex enzyme system.

【００１６】この amoA 、 amoB 、 amoC 及び amoD
は、その遺伝子ＤＮＡは配列番号１に示す amoABCD 遺
伝子にクラスタ−としてそれぞれのアミノ酸配列が連続
してコ−ドされている。なお、アミノ酸配列は配列番号
１に示す amoABCD 遺伝子のコドンに対応して示されて
いる（特願 平５−１０５１７１号 の明細書、即ち特開
平６−２９２５７１号公報を参照）。更に、この好適な
amoABCD 遺伝子を市販されている大腸菌由来のプラス
ミド pUC18 (宝酒造株式会社より購入)に組み込んでな
るプラスミドベクタ− pDBB1 (図１を参照)は、E. coli
(大腸菌) JM109(pDBB-1) 株 (FERM BP-4250) に保持さ
れている。前記プラスミドベクタ− pDBB1 を宿主の大
腸菌の種々の菌株に導入してなる形質転換菌株は、E. c
oli (大腸菌) JM109 (pDBB-1) 株 (FERM BP-4250) と同
様に好適なアルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素生産能を有
する微生物として用いることができる。The amoA, amoB, amoC and amoD
In the gene DNA, each amino acid sequence is coded continuously as a cluster in the amoABCD gene shown in SEQ ID NO: 1. The amino acid sequence is shown corresponding to the codon of the amoABCD gene shown in SEQ ID NO: 1 (see the specification of Japanese Patent Application No. 5-105171, that is, JP-A-6-292571). Furthermore, this preferred
Plasmid vector pDBB1 (see FIG. 1) obtained by incorporating the amoABCD gene into a commercially available plasmid pUC18 (purchased from Takara Shuzo Co., Ltd.) derived from Escherichia coli is used for E. coli .
(Escherichia coli) Retained in strain JM109 (pDBB-1) (FERM BP-4250). The plasmid vector -. PDBB1 made by introducing the various strains of host E. coli transformed strain, E c
oli (Escherichia coli) JM109 (pDBB-1) strain (FERM BP-4250) can be used as a suitable microorganism having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability.

【００１７】本発明においては、炭素源としてアルケン
のみを含有する培地で生育可能な微生物、或はアルケン
モノオキシゲナ−ゼ酵素生産能を有する微生物の何れか
を選択し、トリクロロエチレンなど、置換する塩素数１
〜３の塩素置換エチレンを添加してなる培地で、当該微
生物を生育せしめ、該微生物を作用させて該塩素置換エ
チレンを微生物学的に酸化して処理するに際し、該微生
物の生育は通気条件又は好気条件下で行いことが好まし
い。即ち、これらの微生物の産出するアルケンモノオキ
シゲナ−ゼ酵素、或はアルケン代謝に関わる酸化酵素
は、ともに通気条件又は好気条件下においてその酵素活
性を高く維持することができる。In the present invention, a microorganism capable of growing on a medium containing only an alkene as a carbon source, or a microorganism having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability is selected, and a substituted chlorine such as trichloroethylene is substituted. Number 1
When the microorganism is grown in a medium to which chlorine-substituted ethylene is added, the microorganism is allowed to act and the chlorine-substituted ethylene is microbiologically oxidized and treated. Preferably, the reaction is performed under aerobic conditions. That is, the alkene monooxygenase enzymes or oxidases involved in alkene metabolism produced by these microorganisms can both maintain their enzymatic activity high under aeration or aerobic conditions.

【００１８】本発明における微生物の生育には、例え
ば、(a) 該微生物を予め培養増殖して得られる菌体を、
塩素置換エチレンを添加してなる培地で好気条件下に生
育する方法、(b) 該微生物を、その他の炭素源、窒素
源、無機塩類、更には必要に応じて成長促進物質を含有
せしめた栄養培地に塩素置換エチレンを添加してなる培
地で通気条件又は好気条件下に培養生育する方法を好適
に適用することができる。なお、微生物の生育は、培地
の pH を pH 5〜9、好ましくは pH 6〜8の範囲に、温度
を 20〜50 ℃、好ましくは 25〜45 ℃の範囲に保ちつ
つ、1〜6 日間行なう。更には、生育中、当該微生物の
菌体増殖に利する炭素源、窒素源、更にはその他の成分
を適宜添加することにより、菌体とトリクロロエチレン
などの塩素置換エチレンとの反応の活性を維持し或いは
高めることができる。For the growth of the microorganism in the present invention, for example, (a) a cell obtained by culturing and growing the microorganism in advance
A method of growing under aerobic conditions in a medium containing chlorine-substituted ethylene, (b) the microorganism containing other carbon sources, nitrogen sources, inorganic salts, and, if necessary, a growth promoting substance. A method of culturing and growing a nutrient medium in a medium formed by adding chlorine-substituted ethylene under aeration or aerobic conditions can be suitably applied. The growth of the microorganism is carried out for 1 to 6 days while maintaining the pH of the medium at pH 5 to 9, preferably pH 6 to 8, and the temperature at 20 to 50 ° C, preferably 25 to 45 ° C. . Furthermore, during growth, the activity of the reaction between the cells and chlorinated ethylene such as trichloroethylene is maintained by appropriately adding a carbon source, a nitrogen source, and other components that contribute to the growth of the cells of the microorganism. Or it can be enhanced.

【００１９】上記の(a) 該微生物を予め培養増殖する方
法においては、培養増殖のための培地には、まず炭素源
として糖質例えばグルコ−ス、シュ−クロ−ス、糖蜜、
でん粉加水分解物、セルロ−ス加水分解物及び、炭化水
素例えばプロピレン、エチレン、ブタジエンなどの菌体
増殖作用の高いものを用い、窒素源として塩化アンモニ
ウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、硝酸ア
ンモニウム、尿素、アンモニア水、アミノ酸及びその他
の資化性有機窒素化合物など、無機塩類としてリン酸カ
リウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム、硫酸マ
ンガン、硫酸第一鉄、塩化第二鉄、塩化カルシウム、塩
化マンガンなど、更には必要に応じてビタミン類、酵母
エキス、コ−ンスティ−プリカ−の如き成長促進物質を
も添加した培地を用いる。この培養増殖のための培地に
該微生物の菌種を接種し、好気的条件下で培養して菌体
を増殖させる。このようにして得られた菌体培養物に直
接か、又は該培養物から分離した菌体の懸濁液もしくは
菌体を固定化したものに、トリクロロエチレンなどの塩
素置換エチレンを添加してなる培地を加える。In the above-mentioned (a) method of preliminarily culturing and growing the microorganism, a medium for culturing and growing is first prepared by using a saccharide such as glucose, sucrose, molasses, etc. as a carbon source.
Using starch hydrolyzate, cellulose hydrolyzate and hydrocarbons such as propylene, ethylene and butadiene which have a high cell growth activity, and using ammonium chloride, ammonium sulfate, ammonium phosphate, ammonium nitrate, urea, ammonia as a nitrogen source Inorganic salts such as water, amino acids and other assimilating organic nitrogen compounds such as potassium phosphate, sodium phosphate, magnesium sulfate, manganese sulfate, ferrous sulfate, ferric chloride, calcium chloride, manganese chloride, etc. If necessary, use a medium to which a growth promoting substance such as vitamins, yeast extract, and colony plica is added. The medium for this culture and propagation is inoculated with the species of the microorganism and cultured under aerobic conditions to grow the cells. A culture medium obtained by adding a chlorine-substituted ethylene such as trichloroethylene to a cell culture obtained directly or to a suspension of cells isolated from the culture or a cell in which the cells are immobilized. Add.

【００２０】他方、上記の(b) 該微生物を、栄養培地に
塩素置換エチレンを添加してなる培地で通気条件又は好
気条件下に培養生育する方法においては、栄養培地とし
て前記(a) の方法で用いる培養増殖のための培地を用い
て、該微生物の菌種を接種培養する際に、トリクロロエ
チレンなどの塩素置換エチレンを培地に供給して酸化反
応をさせる。On the other hand, in the above method (b) of culturing the microorganism under aeration or aerobic conditions in a medium comprising chlorine-substituted ethylene added to a nutrient medium, the above-mentioned (a) is used as a nutrient medium. When inoculating and culturing the species of the microorganism using a culture medium for culture growth used in the method, chlorinated ethylene such as trichloroethylene is supplied to the medium to cause an oxidation reaction.

【００２１】何れの生育方法においても、塩素置換エチ
レンを培地に添加する方法は、予め微生物を生育する開
始時に所定量を全量を加えても良いし、生育の時間経過
に従い、塩素置換エチレンを回分方式又は連続方式で適
宜加えても良い。添加を回分方式にて行う際は、間歇的
に供給することができる。更には、トリクロロエチレン
などの塩素置換エチレンは液体、或は水に溶解又は拡散
する混合物として添加するのみでなく、該塩素置換エチ
レンの蒸気を含む空気を培地に吹き込むなどの手段を採
り、気相より培地に添加してもよい。好ましくは、培地
に添加する塩素置換エチレンは、培地中の該塩素置換エ
チレン濃度が１ ｍＭを超えない範囲に保つ量を選ぶと
よい。更には、これら菌体反応は、温度３０〜４５℃の
範囲、特には、３５℃付近（３５±５℃）で行うのが好
ましい。In any of the growth methods, the method of adding chlorine-substituted ethylene to the medium may be to add a predetermined amount of the whole amount at the beginning of the growth of the microorganism, or to batch-add the chlorine-substituted ethylene according to the time course of the growth. You may add suitably by a system or a continuous system. When the addition is carried out in a batch mode, it can be supplied intermittently. Furthermore, chlorine-substituted ethylene such as trichloroethylene is not only added as a liquid or a mixture that dissolves or diffuses in water, but also means such as blowing air containing the vapor of the chlorine-substituted ethylene into the culture medium is used. It may be added to the medium. Preferably, the amount of the chlorinated ethylene to be added to the medium is selected so that the concentration of the chlorinated ethylene in the medium does not exceed 1 mM. Further, these cell reactions are preferably carried out at a temperature in the range of 30 to 45 ° C., particularly around 35 ° C. (35 ± 5 ° C.).

【００２２】なお、上記する本発明に用いるアルケンモ
ノオキシゲナ−ゼ酵素生産能を有する微生物、或は炭素
源としてアルケンのみを含有する培地内で生育可能な微
生物は、トリクロロエチレンのみでなく、少なくとの１
つの水素原子を有する塩素置換エチレン、更には少なく
との１つの水素原子を有するフッ素を除くハロゲン置換
エチレンを微生物学的に酸化して分解することができ
る。そのため、好気条件下で当該微生物を汚染された地
下水に含まれるトリクロロエチレンを処理に利用する際
には、土壌に生息する嫌気性細菌がトリクロロエチレン
から生成する塩化ビニル（クロロエチレン）やジクロロ
エチレンが存在していても、同時に処理することができ
る。また、塩化ビニルやジクロロエチレンのより高い毒
性のため、当該微生物の死滅或は生理活性の低下が起こ
ることもなく、長期又は連続的な汚染された地下水に含
まれるトリクロロエチレンの処理に適する。The microorganisms having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability used in the present invention or the microorganisms capable of growing in a medium containing only alkene as a carbon source are not only trichloroethylene but also at least. Of 1
Chlorine-substituted ethylene having two hydrogen atoms, and halogen-substituted ethylene other than fluorine having at least one hydrogen atom, can be decomposed by microbiological oxidation. Therefore, when utilizing the trichlorethylene contained in the groundwater contaminated with the microorganism under aerobic conditions, anaerobic bacteria living in the soil contain vinyl chloride (chloroethylene) and dichloroethylene produced from trichloroethylene. Can be processed at the same time. In addition, because of the higher toxicity of vinyl chloride and dichloroethylene, the microorganism is not killed or its biological activity is not reduced, and it is suitable for long-term or continuous treatment of trichlorethylene contained in contaminated groundwater.

【００２３】更には、本発明に利用される酵素反応又は
菌体反応は、置換する塩素数１〜３の塩素置換エチレン
のみでなく、一般に、塩素、臭素又はヨウ素が１〜３置
換するハロゲノ置換エチレンに対しても有効である。即
ち、それらハロゲノ置換エチレンを対応するエポキシド
に転換することができ、微生物学的方法による該ハロゲ
ノ置換エチレンの処理方法として利用できる。以下実施
例により本発明を更に具体的に説明する。Furthermore, the enzymatic reaction or bacterial cell reaction utilized in the present invention is not limited to chlorine-substituted ethylene having 1 to 3 chlorine atoms, but generally halogeno-substituted wherein 1 to 3 chlorine, bromine or iodine are substituted. It is also effective for ethylene. That is, the halogeno-substituted ethylene can be converted to the corresponding epoxide, and can be used as a method for treating the halogeno-substituted ethylene by a microbiological method. Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples.

【００２４】[0024]

【実施例１】Nocardia corallina（ノカルディア コラ
リ−ナ） B-276 株 (FERM BP-5124 ;ATCC 31338)の菌体
3白金耳を、NBG培地（オキソイド社製ラブレンコパウ
ダ−10g、バクテリオロジカルペプトン 10g、グルコ−
ス 10g 及び塩化ナトリウム 5gに水を加え1 l とし、1N
-苛性ソ−ダ水溶液を加えて pH 7.5 に調製した後、オ
−トクレ−ブ中で120℃、15分加熱殺菌した液体培地）1
00 ml を入れた 500 ml容の坂口フラスコに接種し、30
℃で96 時間振盪し、予め菌体を培養増殖した。Example 1 Cells of Nocardia corallina B-276 strain (FERM BP-5124; ATCC 31338)
3 Platinum loops were placed on an NBG medium (Oxoid Co., Ltd., Rabrenco Powder 10 g, bacteriological peptone 10 g, glucose
Water to 10 g of sodium chloride and 5 g of sodium chloride to make 1 l, and 1N
-A liquid medium sterilized by heating in an autoclave at 120 ° C for 15 minutes after adjusting to pH 7.5 by adding an aqueous solution of caustic soda) 1
Inoculate a 500 ml Sakaguchi flask containing
The mixture was shaken at 96 ° C for 96 hours, and the cells were cultured and grown in advance.

【００２５】この予め培養増殖により得られた培養液を
遠心分離し、集菌した。次に、集菌した菌体を、50 ml
の培地（K₂HPO₄ 1.74g, MgSO₄・7H₂O 1.5g, FeSO₄・H₂O
0.05g,脱イオン水 1 l , pH 8.0 に調製)に再懸濁して
菌懸濁液を調製した。The culture solution obtained by the culture growth in advance was centrifuged and collected. Next, 50 ml of the collected cells
Medium (K ₂ HPO ₄ 1.74 g, MgSO ₄ .7H ₂ O 1.5 g, FeSO ₄ .H ₂ O
The bacterial suspension was resuspended in 0.05 g, adjusted to 1 l of deionized water and adjusted to pH 8.0).

【００２６】フラスコに入れた前記菌懸濁液に、更に2.
5 mlの10 ％ グルコ−ス溶液とトリクロロエチレン(最
終濃度 1 mM）を添加し密閉後、振盪しながら 30 ℃で1
2 時間育成し、トリクロロエチレンと反応させた。その
後、培地の一部を分取し、ガスクロマトグラフィ−測定
により、この培地に残留するトリクロロエチレンによる
シグナル強度(I₁)を決定した。The above bacterial suspension in the flask is further added with 2.
Add 5 ml of 10% glucose solution and trichlorethylene (final concentration 1 mM), seal, and shake at 30 ° C for 1 hour.
They were grown for 2 hours and reacted with trichlorethylene. Thereafter, a part of the medium was collected, and the signal intensity (I ₁ ) due to the residual trichlorethylene in the medium was determined by gas chromatography measurement.

【００２７】他方、参照例として、同じ容量のフラスコ
に入れた菌体を含まない50 mlの培地（K₂HPO₄ 1.74g, M
gSO₄・7H₂O 1.5g, FeSO₄・H₂O 0.05g, 脱イオン水 1 l ,
pH8.0 に調製)に、2.5 mlの10 ％ グルコ−ス溶液とト
リクロロエチレン(最終濃度1 mM）を添加し密閉後、30
℃で12 時間振盪した。この参照例の培地の一部を分取
し、ガスクロマトグラフィ−測定によりこの培地に残留
するトリクロロエチレンによるシグナル強度(I₂)を決定
した。この参照例のシグナル強度(I₂)は、当初のトリク
ロロエチレン(最終濃度 1 mM）を添加した培地において
測定されるトリクロロエチレンのガスクロマトグラフィ
−のシグナル強度(I₀)の９５％以上であった。On the other hand, as a reference example, a 50-ml medium (K ₂ HPO ₄ 1.74 g, M
_{gSO 4 · 7H 2 O 1.5g,} FeSO 4 · H 2 O 0.05g, deionized water 1 l,
pH 8.0), add 2.5 ml of 10% glucose solution and trichloroethylene (final concentration 1 mM), seal, and add
Shake at 12 ° C. for 12 hours. A part of the medium of this reference example was fractionated, and the signal intensity (I ₂ ) due to trichloroethylene remaining in the medium was determined by gas chromatography measurement. The signal intensity (I ₂ ) of this reference example was 95% or more of the signal intensity (I ₀ ) of gas chromatography of trichloroethylene measured in the medium to which trichloroethylene (final concentration: 1 mM) was added.

【００２８】前記シグナル強度(I₁)は、参照例のシグナ
ル強度(I₂)の約２％であった。即ち、当該微生物を生育
することで、培地に残留するトリクロロエチレンの培地
濃度を約２％とすることができ、約９８％のトリクロロ
エチレンが処理分解されたことが判る。なお、上記する
処理において、トリクロロエチレンは、先ずトリクロロ
エチレンオキシドに転換されている。また、該Nocardia
corallina（ノカルディア コラリ−ナ） B-276 株 (FE
RM BP-5124 ; ATCC 31338)は、グルコ−スを炭素源とし
て添加して予め培養し、且つグルコ−スを炭素源として
添加して菌体反応を行わせる際にも、トリクロロエチレ
ンの処理能力が高いことが判る。The signal intensity (I ₁ ) was about 2% of the signal intensity (I ₂ ) of the reference example. That is, by growing the microorganism, the medium concentration of trichlorethylene remaining in the medium can be reduced to about 2%, and it can be seen that about 98% of trichlorethylene has been treated and decomposed. In the above-described treatment, trichloroethylene is first converted to trichloroethylene oxide. In addition, the Nocardia
corallina (Nocardia coralina) B-276 strain (FE
RM BP-5124; ATCC 31338) has the ability to treat trichlorethylene even when glucose is added as a carbon source and cultured in advance, and when a bacterial reaction is performed by adding glucose as a carbon source. It turns out that it is high.

【００２９】[0029]

【実施例２】Nocardia corallina（ノカルディア コラ
リ−ナ） B-276 株 由来のアルケンモノオキシゲナ−ゼ
遺伝子で形質転換した E. coli (大腸菌） JM109 (pDBB
-1)株 (FERM-BP4250)の菌体 1白金耳を、50 μg/ml の
アンピシリン含有 LB 培地（バクト−トリプトン 10g、
バクト−イ−ストエキス 5 g及び塩化ナトリウム NaCl
10gに脱イオン水を加え 1 l とし、1N-苛性ソ−ダ水溶
液を加え pH 7.2 に調製した後、オ−トクレ−ブ中で12
0 ℃、15分加熱殺菌した液体培地）1.5 mlに接種し、37
℃で一晩(約14時間)予め菌体を培養増殖した。得られた
培養物を、再度50 μg/ml のアンピシリン含有 LB 培地
100 mlに接種し、37 ℃で2 時間培養した。この液に最
終濃度が 1 mM となるように IPTG (Isopropyl-β-D-th
iogalactopyranoside)を添加し、更に37 ℃で5 時間振
盪培養した。この一連の培養により得られた培養液の10
mlを遠心分離により集菌し、2 mlの培地（K₂HPO₄ 1.74
g, MgSO₄・7H₂O 1.5g, FeSO₄・H₂O 0.05g, 脱イオン水 1
l , pH 8.0 に調製)に再懸濁して菌懸濁液を調製した。EXAMPLE 2 Nocardia corallina (Nocardia Kolari - Na) B-276 strain derived from alkene monooxyethylene Gena -. E transformed with peptidase gene coli (E. coli) JM109 (pDBB
-1) One platinum loop of the strain (FERM-BP4250) was placed in an LB medium containing 50 μg / ml ampicillin (10 g of bacto-tryptone,
Bacto-east extract 5 g and sodium chloride NaCl
To 10 g of deionized water was added to make up to 1 liter, and a 1N aqueous solution of sodium hydroxide was added to adjust the pH to 7.2.
Inoculate 1.5 ml of liquid medium sterilized by heating at 0 ° C for 15 minutes.
The cells were cultured and grown overnight at about 14 ° C. (about 14 hours). The obtained culture was re-cultured to 50 μg / ml LB medium containing ampicillin.
100 ml was inoculated and cultured at 37 ° C for 2 hours. Add IPTG (Isopropyl-β-D-th) to this solution so that the final concentration is 1 mM.
iogalactopyranoside) was added, and the cells were further cultured with shaking at 37 ° C. for 5 hours. 10% of the culture obtained by this series of cultures
of the medium (K ₂ HPO ₄ 1.74).
g, MgSO ₄・ 7H ₂ O 1.5g, FeSO ₄・ H ₂ O 0.05g, deionized water 1
l, adjusted to pH 8.0) to prepare a bacterial suspension.

【００３０】フラスコに入れた前記菌懸濁液に、100 μ
l の10 ％ グルコ−ス溶液とトリクロロエチレン(最終
濃度 1 mM）を添加し密閉後、振盪しながら30 ℃で12
時間、トリクロロエチレンと反応させた。その後、培地
の一部を分取し、ガスクロマトグラフィ−測定により、
この培地に残留するトリクロロエチレンによるシグナル
強度(I₄)を決定した。100 μl of the bacterial suspension in the flask
l of 10% glucose solution and trichlorethylene (final concentration 1 mM), add, seal, and shake at 30 ° C for 12 hours.
For a period of time, it was reacted with trichlorethylene. Then, a part of the medium was collected and, by gas chromatography measurement,
The signal intensity (I ₄ ) due to trichlorethylene remaining in this medium was determined.

【００３１】他方、参照例として、同じ容量のフラスコ
に入れた菌体を含まない2 mlの培地（K₂HPO₄ 1.74g, Mg
SO₄・7H₂O 1.5g, FeSO₄・H₂O 0.05g, 脱イオン水 1 l , p
H 8.0 に調製)に、100 μl の10 ％ グルコ−ス溶液と
トリクロロエチレン(最終濃度1 mM）を添加し密閉後、3
0 ℃で12 時間振盪した。この参照例の培地の一部を分
取し、ガスクロマトグラフィ−測定によりこの培地に残
留するトリクロロエチレンによるシグナル強度(I₅)を決
定した。この参照のシグナル強度(I₅)は、当初のトリク
ロロエチレン(最終濃度 1 mM）を添加した培地において
測定されるトリクロロエチレンのガスクロマトグラフィ
−のシグナル強度(I₃)の９５％以上であった。On the other hand, as a reference example, 2 ml of a cell-free medium (K ₂ HPO ₄ 1.74 g, Mg
SO ₄・ 7H ₂ O 1.5g, FeSO ₄・ H ₂ O 0.05g, deionized water 1 l, p
H 8.0), add 100 μl of 10% glucose solution and trichloroethylene (final concentration 1 mM), seal, and add
Shake at 0 ° C. for 12 hours. A part of the medium of this reference example was collected, and the signal intensity (I ₅ ) due to trichloroethylene remaining in the medium was determined by gas chromatography measurement. The signal intensity (I ₅ ) of this reference was 95% or more of the signal intensity (I ₃ ) of the gas chromatography of trichloroethylene measured in the medium to which the initial trichlorethylene (final concentration: 1 mM) was added.

【００３２】前記シグナル強度(I₄)は、参照例のシグナ
ル強度(I₅)の約８３％であった。即ち、当該微生物を生
育することで、培地に残留するトリクロロエチレンの培
地濃度を約８３％とすることができ、約１７％のトリク
ロロエチレンが処理分解されたことが判る。なお、上記
する処理においても、トリクロロエチレンは、先ずトリ
クロロエチレンオキシドに転換されている。また、グル
コ−スを炭素源として添加する際にも、該 E. coli (大
腸菌） JM109 (pDBB-1) 株 (FERM-BP4250)は、トリクロ
ロエチレンの処理能力が高いことが判る。The signal intensity (I ₄ ) was about 83% of the signal intensity (I ₅ ) of the reference example. That is, by growing the microorganism, the medium concentration of trichlorethylene remaining in the medium can be made about 83%, and it can be seen that about 17% of trichlorethylene has been treated and decomposed. In the above treatment, trichloroethylene is first converted to trichloroethylene oxide. Also, when glucose is added as a carbon source, the E. coli (E. coli) JM109 (pDBB-1) strain (FERM-BP4250) is found to have high trichlorethylene processing ability.

【００３３】[0033]

【実施例３】Nocardia corallina（ノカルディア コラ
リ−ナ） B-276 株 (FERM BP-5124 ;ATCC 31338)による
トリクロロエチレンの微生物学的な酸化処理速度に対す
る、トリクロロエチレン添加濃度の影響を下記の方法で
検証した。Example 3 The influence of the concentration of trichloroethylene on the microbiological oxidation rate of trichlorethylene by Nocardia corallina B-276 strain (FERM BP-5124; ATCC 31338) was examined by the following method. did.

【００３４】上記の実施例１に記載の培養増殖法に従
い、 Nocardia corallina（ノカルディア コラリ−ナ）
B-276 株 (FERM BP-5124 ; ATCC 31338)を、予め菌体
を培養増殖した。次に、集菌した菌体を、50 mlの培地
（K₂HPO₄ 1.74g, MgSO₄・7H₂O 1.5g, FeSO₄・H₂O 0.05g,
脱イオン水 1 l , pH 8.0 に調製)に再懸濁して菌懸濁
液を調製した。According to the culture propagation method described in Example 1 above, Nocardia corallina
The B-276 strain (FERM BP-5124; ATCC 31338) was cultured and propagated in advance. Then, the cells were harvested, 50 ml of medium _{(K 2 HPO 4 1.74g, MgSO} 4 · 7H 2 O 1.5g, FeSO 4 · H 2 O 0.05g,
The cells were resuspended in 1 l of deionized water (pH adjusted to 8.0) to prepare a bacterial suspension.

【００３５】該菌懸濁液 2 ml を、容量 17 ml のフラ
スコに入れ、更に、エネルギ−源として、100 μl の10
％ グルコ−ス溶液を加え、所定量のトリクロロエチレ
ンを添加し密閉後、振盪しながら 35 ℃で 5 時間、ト
リクロロエチレンと反応させた。なお、この反応時、菌
濃度は、2.44 g/l であった。この間、１時間経過ごと
に、密閉されたフラスコの気相より、１ｍｌの気体をサ
ンプリングし、その中に残存するトリクロロエチレン気
相濃度をガスクロマトグラフィ−法（カラム：Porapak
Q）により分析した。このトリクロロエチレン気相濃度
の測定値を基に、液相に残存するトリクロロエチレン濃
度に換算を行った。2 ml of the bacterial suspension was placed in a 17 ml flask, and 100 μl of 10 μl was added as an energy source.
% Glucose solution, a predetermined amount of trichlorethylene was added, and the mixture was sealed and reacted with trichlorethylene at 35 ° C. for 5 hours with shaking. At the time of this reaction, the bacterial concentration was 2.44 g / l. During this time, every 1 hour, 1 ml of gas was sampled from the gas phase of the sealed flask, and the concentration of the trichloroethylene gas phase remaining therein was determined by gas chromatography (column: Polapak).
Analyzed by Q). Based on the measured value of the trichlorethylene gas phase concentration, the concentration was converted into the concentration of trichloroethylene remaining in the liquid phase.

【００３６】当初に添加するトリクロロエチレンの量
（液相濃度初期値）を種々に採り、該微生物を作用させ
た際、液相に残存するトリクロロエチレン濃度の経時的
変化を比較した一例を、図２に示す。また、液相のトリ
クロロエチレン濃度の減少率を、トリクロロエチレンの
液相濃度初期値に対してプロットした結果の一例を、図
３に示す。これらの結果に示されるように、該 Nocardi
a corallina（ノカルディア コラリ−ナ） B-276 株 (F
ERM BP-5124 ; ATCC 31338) の処理速度は、添加するト
リクロロエチレンの液相濃度初期値にほぼ比例してお
り、少なくともトリクロロエチレンの液相濃度初期値 9
0 mg/l までの範囲では、明確な阻害は見いだされてい
ない。図３に示す結果を基に、基質トリクロロエチレン
のこの酵素反応に対するＫｍ値を算出したところ、Ｋｍ
＝ 90.4 mg/l (0.678 mM) の値が得られた。FIG. 2 shows an example in which the amount of trichlorethylene initially added (the initial value of the liquid phase concentration) was variously measured, and the time-dependent change in the concentration of trichlorethylene remaining in the liquid phase when the microorganism was allowed to act was shown in FIG. Show. FIG. 3 shows an example of the result of plotting the decrease rate of the trichlorethylene concentration in the liquid phase against the initial value of the liquid phase concentration of trichlorethylene. As shown in these results, the Nocardi
a corallina (Nocardia coralina) B-276 strain (F
The processing speed of ERM BP-5124; ATCC 31338) is almost proportional to the initial liquid phase concentration of trichlorethylene to be added.
No clear inhibition was found in the range up to 0 mg / l. Based on the results shown in FIG. 3, the Km value of the substrate trichloroethylene for this enzyme reaction was calculated.
= 90.4 mg / l (0.678 mM).

【００３７】以上の結果より、当該菌 Nocardia corall
ina（ノカルディア コラリ−ナ） B-276 株 (FERM BP-5
124 ; ATCC 31338)は、高いトリクロロエチレン濃度に
おいても、その酵素反応は阻害を受けず、高い処理能力
を保つと判断される。From the above results, the bacterium Nocardia corall
ina (Nocardia Colorina) B-276 strain (FERM BP-5
124; ATCC 31338) does not inhibit its enzymatic reaction even at a high trichloroethylene concentration, and is considered to maintain a high treatment capacity.

【００３８】加えて、Nocardia corallina（ノカルディ
ア コラリ−ナ） B-276 株 (FERM BP-5124 ; ATCC 3133
8)によるトリクロロエチレンの微生物学的な酸化処理速
度に対する、温度の影響を検証した。処理速度に換え
て、菌濃度を、8.0 g/l に採り、トリクロロエチレンの
液相濃度初期値を 50.1 mg/l としたとき、処理開始後6
0 分間経過した時点で、液相に残存するトリクロロエチ
レン濃度を初期値に対する比率で表記した値を、酸化処
理速度の指標とした。培地温度を種々に選び、一定温度
で処理を行った結果を、処理速度(相対値)を培地温度に
対してプロットした一例を、図４に示す。培地温度が３
５℃付近で、処理速度が極大となることが判った。即
ち、３０〜４５℃の範囲、具体的には、この３５℃付近
を中心に前後５℃の範囲で処理することが好ましいこと
が判った。In addition, Nocardia corallina B-276 strain (FERM BP-5124; ATCC 3133)
The effect of temperature on the microbiological oxidation rate of trichlorethylene according to 8) was verified. When the bacterial concentration is adjusted to 8.0 g / l and the initial liquid phase concentration of trichlorethylene is set to 50.1 mg / l, the
At the time when 0 minutes had passed, the value of the concentration of trichlorethylene remaining in the liquid phase expressed as a ratio to the initial value was used as an index of the oxidation treatment rate. FIG. 4 shows an example in which the processing speed (relative value) is plotted with respect to the culture medium temperature as a result of performing the treatment at a constant temperature while variously selecting the culture medium temperature. Medium temperature 3
It was found that the processing speed reached a maximum around 5 ° C. That is, it was found that it is preferable to perform the treatment in the range of 30 to 45 ° C, specifically, in the range of 5 ° C around 35 ° C.

【００３９】[0039]

【実施例４】Ｎｏｃａｒｄｉａ ｃｏｒａｌｌｉｎａ
（ノカルディア コラリーナ） Ｂ−２７６株（ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−５１２４；ＡＴＣＣ ３１３３８）を利用し
て、トリクロロエチレン以外の塩素置換エチレン、即
ち、１，１−ジクロロエチレン、ｃｉｓ−１，２−ジク
ロロエチレン、ｔｒａｎｓ−１，２−ジクロロエチレ
ン、並びに塩化ビニル（クロロエチレン）に付いても、
酸化処理が行えることを検証するため、下記する条件で
処理を試みた。なお、テトラクロロエチレン（パークロ
ロエチレン）と１，２−ジクロロエタンに付いても、併
せて処理を試みた。なお、菌体の培養、及び菌体反応に
用いる培地の組成（基質を除く組成）等の条件は、実施
例１に従った方法を用いた。Embodiment 4Nocardia corallina
(Nocardia Coralina) B-276 strain (FER
MBP-5124; ATCC 31338)
And chlorine-substituted ethylene other than trichloroethylene,
1,1,1-dichloroethylene, cis-1,2-dic
Loroethylene, trans-1,2-dichloroethylene
And vinyl chloride (chloroethylene)
In order to verify that the oxidation treatment can be performed,
Attempted processing. Note thatGLachloroethylene (Perchlo)
Roethylene) and 1,2-dichloroethane.
And tried to process. In addition, for cell culture and cell reaction
Conditions such as the composition of the medium to be used (composition excluding the substrate) etc.
The method according to Example 1 was used.

【００４０】上記の各基質の添加量は、液相濃度初期値
が 20 mg/l を超えない範囲、即ち何れの基質でも菌体
反応に対する基質阻害が見いだされないと予測される範
囲に選択した。具体的には、トリクロロエチレンの液相
濃度初期値が 11.2 mg/l に相当する添加量 100 mg に
選んだ。反応時の菌濃度を、4.0 g/l 又は 8.0 g/lに採
り、上記の実施例３の手法に準じて、気相中の各基質濃
度を経時的に測定し、液相濃度に換算した結果を基に、
処理速度を算出した。各基質の残余量の経時的な変化を
処理時間に対してプロットし、比較した一例を、図５に
示す。The addition amount of each of the above-mentioned substrates was selected in a range in which the initial value of the liquid phase concentration did not exceed 20 mg / l, that is, in a range in which no substrate inhibition was expected to be found in any of the substrates. . Specifically, the addition amount was set to 100 mg, which corresponds to the initial value of the liquid phase concentration of trichlorethylene of 11.2 mg / l. The bacterial concentration at the time of the reaction was taken to 4.0 g / l or 8.0 g / l, and the concentration of each substrate in the gas phase was measured over time according to the method of Example 3 above, and converted to the liquid phase concentration. Based on the result,
The processing speed was calculated. FIG. 5 shows an example in which the change over time of the residual amount of each substrate is plotted against the processing time and compared.

【００４１】算出された各基質に対する処理速度と用い
た反応時菌濃度を、表１に示す。該Ｎｏｃａｒｄｉａ
ｃｏｒａｌｌｉｎａ（ノカルディア コラリーナ） Ｂ
−２７６株（ＦＥＲＭ ＢＰ−５１２４；ＡＴＣＣ ３
１３３８）を利用して、トリクロロエチレン以外の塩素
置換エチレン、即ち、１，１−ジクロロエチレン、ｃｉ
ｓ−１，２−ジクロロエチレン、ｔｒａｎｓ−１，２−
ジクロロエチレンに付いても、処理が行えることが確認
された。しかしながら、テトラクロロエチレン（パーク
ロロエチレン）と１，２−ジクロロエタンに付いては、
処理が行えないことも判った。１，２−ジクロロエタン
は、炭素−炭素二重結合が存在しないので、アルケンモ
ノオキシゲナーゼ酵素の反応により、エポキシドに変換
され得ないものであった。Table 1 shows the calculated processing rates for the respective substrates and the bacterial concentration during the reaction used. The Nocardia
corallina B
-276 strain (FERM BP-5124; ATCC 3
1338), chlorine-substituted ethylene other than trichloroethylene, ie, 1,1-dichloroethylene, ci
s-1,2-dichloroethylene, trans-1,2-
It was confirmed that the treatment could be performed on dichloroethylene. However, with the Te preparative La chloro ethylene (perchlorethylene) 1,2-dichloroethane,
It turned out that the processing could not be performed. 1,2-Dichloroethane could not be converted to an epoxide by the reaction of an alkene monooxygenase enzyme because of the absence of a carbon-carbon double bond.

【００４２】[0042]

【表１】 化合物 処理速度 (mg/l/h) 使用した菌濃度 (g/l) cis-1,2-ジクロロエチレン 72.2 4.0 1,1-ジクロロエチレン 14.8 8.0 trans-1,2-ジクロロエチレン 6.5 4.0 トリクロロエチレン 5.5 4.0 テトラクロロエチレン 0 4.0 1,2-ジクロロエタン 0 4.0[Table 1] Compound treatment rate (mg / l / h) Bacterial concentration used (g / l) cis-1,2-dichloroethylene 72.2 4.0 1,1-dichloroethylene 14.8 8.0 trans-1,2-dichloroethylene 6.5 4.0 trichloroethylene 5.5 4.0 Tetrachloroethylene 0 4.0 1,2-dichloroethane 0 4.0

【００４３】この点からも、本菌体反応は、アルケンモ
ノオキシゲナーゼ酵素反応により、エポキシドに転換さ
れる過程が、その初期反応であることが確認される。更
には、テトラクロロエチレン（パークロロエチレン）で
は酵素反応が起こらず、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチ
レンで酵素反応が最も効率が高い点を考察すると、炭素
−炭素二重結合に残余する水素原子が基質の酵素への付
加過程に不可欠であることが判る。このことは、ｃｉｓ
−１，２−ジクロロエチレンの処理速度が格段に高く、
１，１−ジクロロエチレン（７．４ ｍｇ／ｌ／ｈに相
当する）、ｔｒａｎｓ−１，２−ジクロロエチレン
（６．５ ｍｇ／ｌ／ｈ）、トリクロロエチレン（５．
５ ｍｇ／ｌ／ｈ）の順で僅かづつ減少していることに
も、反映されている。更には、基質の酵素への付加過程
で、炭素−炭素二重結合に一つの水素原子と一つの塩素
原子が同じ配向に存在する基質では、その立体選択性に
本質的な差異が無いため、１，１−ジクロロエチレン、
ｔｒａｎｓ−１，２−ジクロロエチレン、トリクロロエ
チレンの間で、処理速度に顕著な差異が生じていないと
理解される。更には、ｃｉｓ−１，２−ジクロロエチレ
ンと同じく、シス位に二つの水素原子が残る塩化ビニル
（クロロエチレン）に付いても、該酵素反応が速やかに
起こると推察される。なお、塩化ビニル（クロロエチレ
ン）は、発癌性物質であり、常温で気体であるため、上
記の方法による評価は困難であるので、処理速度の確認
は行わなかった。From this point, it is confirmed that this bacterial cell reaction is the initial reaction in which the process of conversion to epoxide by the alkene monooxygenase enzyme reaction is performed. Furthermore, Te DOO La trichlorethylene does not occur (perchlorethylene) In the enzyme reaction, the enzyme reaction with cis-1,2-dichloroethylene is most efficient to consider the high points, the carbon - hydrogen residual carbon double bond It turns out that atoms are essential for the process of adding the substrate to the enzyme. This is cis
The processing speed of -1,2-dichloroethylene is remarkably high,
1,1-dichloroethylene (corresponding to 7.4 mg / l / h), trans-1,2-dichloroethylene (6.5 mg / l / h), trichloroethylene (5.
5 mg / l / h). Furthermore, in the process of adding a substrate to an enzyme, a substrate in which one hydrogen atom and one chlorine atom are present in the same orientation in a carbon-carbon double bond has no essential difference in stereoselectivity, 1,1-dichloroethylene,
It is understood that there is no significant difference in the processing speed between trans-1,2-dichloroethylene and trichloroethylene. Furthermore, as in cis-1,2-dichloroethylene, it is presumed that the enzyme reaction occurs promptly even with vinyl chloride (chloroethylene) in which two hydrogen atoms remain at the cis position. Incidentally, since vinyl chloride (chloroethylene) is a carcinogenic substance and is a gas at ordinary temperature, it is difficult to evaluate by the above method, and therefore, the processing speed was not confirmed.

【００４４】上記の結果から、本発明の処理方法は、ア
ルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素反応により、エポキシド
に転換される過程を利用していることが確認され、該 N
ocardia corallina（ノカルディア コラリ−ナ） B-276
株 (FERM BP-5124 ; ATCC 31338)のみでなく、同種の
アルケンモノオキシゲナ−ゼ酵素を生産する微生物一般
も利用できることが判る。加えて、トリクロロエチレン
を処理する微生物であるならば、1,1-ジクロロエチレ
ン、cis-1,2-ジクロロエチレン、trans-1,2-ジクロロエ
チレン、並びに塩化ビニル(クロロエチレン)をも処理す
ることができる。特には、グルコ−スを炭素源として培
養、菌体反応中に添加する際にも、該 Noc ardia corall
ina（ノカルディア コラリ−ナ） B-276 株 (FERM BP-5
124 ; ATCC31338)は、トリクロロエチレンのみでなく、
1,1-ジクロロエチレン、cis-1,2-ジクロロエチレン、tr
ans-1,2-ジクロロエチレン、並びに塩化ビニル(クロロ
エチレン)に対する処理能力が高いことが判る。[0044] From the above results, the treatment method of the present invention, alkene monooxyethylene Gena - by enzyme reaction, it was confirmed that by using the process of being converted into epoxide, the N
ocardia corallina (Nocardia coralina ) B-276
It can be seen that not only strains (FERM BP-5124; ATCC 31338) but also microorganisms generally producing alkene monooxygenase enzymes of the same species can be used. In addition, if it is a microorganism that treats trichlorethylene, 1,1-dichloroethylene, cis-1,2-dichloroethylene, trans-1,2-dichloroethylene, and vinyl chloride (chloroethylene) can also be treated. Particularly, gluco - culturing a scan as a carbon source, even when added during cell reaction, the Noc ardia corall
ina (Nocardia Colorina) B-276 strain (FERM BP-5
124; ATCC 31338) is not only trichloroethylene,
1,1-dichloroethylene, cis-1,2-dichloroethylene, tr
It can be seen that the processing ability for ans-1,2-dichloroethylene and vinyl chloride (chloroethylene) is high.

【００４５】[0045]

【発明の効果】本発明の方法においては、アルケンを資
化する生物活性を有する微生物により、或いはアルケン
を酸化し対応するエポキシドに変換する酵素であるアル
ケンモノオキシゲナ−ゼ酵素生産能を有する微生物をト
リクロロエチレンなどの置換する塩素数１〜３の塩素置
換エチレンを添加してなる培地で生育することにより、
該塩素置換エチレンを微生物酸化して、効率良く分解処
理することができる。更には、本発明の方法は、トリク
ロロエチレンなどの置換する塩素数１〜３の塩素置換エ
チレンを極く低濃度に含有する汚濁水、或は蒸散するト
リクロロエチレンなどの塩素置換エチレンを含有する排
気など、大量の媒体中に極く低濃度で分散する塩素置換
エチレンを処理する際に、最も合目的な塩素置換エチレ
ンの処理法として利用できる。According to the method of the present invention, a microorganism having an ability to produce an alkene monooxygenase enzyme, which is an enzyme that oxidizes an alkene and converts it to a corresponding epoxide, by a microorganism having a biological activity to assimilate an alkene. By growing in a medium comprising a chlorine-substituted ethylene having 1 to 3 chlorine atoms to be substituted, such as trichloroethylene,
The chlorine-substituted ethylene can be oxidized by microorganisms and efficiently decomposed. Furthermore, the method of the present invention may be a method for producing polluted water containing a very low concentration of chlorine-substituted ethylene having 1 to 3 chlorine atoms, such as trichloroethylene, or exhaust gas containing chlorine-substituted ethylene, such as trichloroethylene, which evaporates. When treating chlorinated ethylene which is dispersed at a very low concentration in a large amount of medium, it can be used as the most suitable method for treating chlorinated ethylene.

【配列表】配列番号：１ 配列の長さ：６３７９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ペプチド 起源 ：ノカルディア・コラリーナ B-276（FERM BP-5
124 ; ATCC 31338） ９１０−１９３５ ａｍｏＡ １９３５−２２８５ ａｍｏＢ ２３００−３８０２ ａｍｏＣ ３８０５−４８３０ ａｍｏＤ GGA TCC CCA GGT CCC GAG CCA CCG CGG CGA TCG ACT TCC CCG TCT 45 CAT GCA CGA TCC GCA CAG CCC CCT CAC GGA ACT CCC GGT CGT ACT 90 TTT CCG CTT CTC TGA CAT CCC TAC CCC TTA TAG CTG ATG CCT CCA 135 CGG TCT CGG GGA ATG CCA ATA TGA CTT GGT CAG ATC GTA GGC GGC 180 AAG AAC CAT GGC TTC CTT GGC GGA CTT CAC AGG GGC CTC TCC TCG 225 AGG GCT CGT TCG GGC ATG GGT AGC ACC GTC GAG CGA ACC CGA GGA 270 GAG GCC CCG ATC CGG GGA GGC GAT CGG GAT GAA CGG GGA CGT GTC 315 GAG AAT CGA TCA GAC TTG GTG GGC AGA TTC GTG TCC GCC GGT GGG 360 CAG AAC CCG ATG GCC ATC CAC GGG CAC TTT CGT GGC CAT CAG TGG 405 GCG GTT TCG TGA CCC CCT ATG GGC AGT TTT CCA TGG CCG CCG ACA 450 CAC AGG CCC GCA CCG ATG ACG AGG TAC TGC ACG ACC CGG CCG ACC 495 GCG CGG TGG TTT GCT GCA ACA AAT GAC AAC TTG ATC AAC GCA TCG 540 ATC ACG ACC GGC GCC ACT AAC GCC GCC GCG GCA AGC ATC GAC ATC 585 AAC ACC ATC GCG ACC GTC CGC CCT TCA CAT CGA CGA CAC CTC GGT 630 CGA TGT GTG CAT ACC GCA TGC ATC CGG CAA GAA CCC CGC GGA CTC 675 CGC AGC CGG TGC GGC TAG CCG ATT TCA CCC AAC CTG GGA CGT TGG 720 CTA CGG AAC GTC TCG TGG ATG ACG GCG CCT GCA TGC TGC ATA GAC 765 CCG TCC GTG GCC GCA ATG TCC TGG TGA GGC ATG CGA GCG GCT TCG 810 ATT CCT CTC GGC GGG GCC AAG ACC GGC GGG CCG CGC CTG TCT AAC 855 ATC GCG GCA CAA GGA AAT CGC AAC CGG ACC GAA ACG ATG GAA GGC 900 GTA GCG ATG ACG ACA GAG GCG ACG GTG GCC CGA CCG GTG GAG CTC 945 (amoA)Thr Thr Glu Ala Thr Val Ala Arg Pro Val Glu Leu GAA GGT CAC CGG ACA TTC ACC TGG TTC ACG CCC GCC AGG CGA AAG 990 Glu Gly His Arg Thr Phe Thr Trp Phe Thr Pro A1a Arg Arg Lys CCG ACG GAG TAC GAG CTC TAC ACC GTG GGT CAA CAG TCC ACT CCG 1035 Pro Thr Glu Tyr Glu Leu Tyr Thr Val Gly Gln Gln Ser Thr Pro GAC GAG TGG CTG CAT GTG GAC TGG CCG CTG CGC TTC GAC GAC GGC 1080 Asp Glu Trp Leu His Val Asp Trp Pro Leu Arg Phe Asp Asp G1y CGC GCC CCG TGG GAG GAG GAG TCG AGT GCG GTA CGG ACC TCG GAG 1125 Arg Ala Pro Trp Glu Glu Glu Ser Ser Ala Val Arg Thr Ser Glu TGG TCG GCT TAC CGC GAC CCA CAC CAA CTG TGG CAG CGT CCC TAC 1170 Trp Ser Ala Tyr Arg Asp Pro His Gln Leu Trp Gln Arg Pro Tyr GTC AGC ACG TGC AAC CAG GAC CAG CAG GCC CTC GCG CGG CTG GTC 1215 Val Ser Thr Cys Asn Gln Asp Gln Gln Ala Leu Ala Arg Leu Val CCC GTC CTG ACC ATG GGG TCG GCG GCG ATC ACG CCC ATC TGG TCG 1260 Pro Val Leu Thr Met Gly Ser Ala Ala Ile Thr Pro Ile Trp Ser CAG AAG ATC CTC GCC AGG TCC TAC GCC GCC TGG CCA TTC GTC GAG 1305 Gln Lys Ile Leu Ala Arg Ser Tyr Ala Ala Trp Pro Phe Val Glu TAC GGG CTC TTC CTG AGC CTG GCC TAC GCC GTG CGC CAG GCC ATG l350 Tyr Gly Leu Phe Leu Ser Leu Ala Tyr Ala Val Arg Gln Ala Met TCC GAC ACG GTC CAG TTC AGC GTG GTG TTC CAG GCC GTG GAC CGC 1395 Ser Asp Thr Val Gln Phe Ser Val Val Phe Gln Ala Val Asp Arg ATG CGG CTG CTC CAG GAC ATC GTC CAC CAC CTG GAC CAC CTG CAG 1440 Met Arg Leu Leu Gln Asp Ile Val His His Leu Asp His Leu Gln GAG TCG CCG GAA TTC AGC GAC GCC GGG GCC CGC GAG GCC TGG ATG 1485 Glu Ser Pro Glu Phe Ser Asp Ala Gly Ala Arg Glu Ala Trp Met TCC GAC TCC ACC CTG GTC CCG ATC CGG GAA GTG ATC GAG CGC ATC 1530 Ser Asp Ser Thr Leu Val Pro Ile Arg Glu Val Ile Glu Arg Ile GCC GCC AGC CAG GAC TGG GTG GAG ATC CTG GTC GCC GGC ACG CTC 1575 Ala Ala Ser Gln Asp Trp Val Glu Ile Leu Val Ala Gly Thr Leu GTC TTC GAG CCT CTG GTC GGC CAC CTG GCG AAG GCC GAG TTG TTC 1620 Val Phe Glu Pro Leu Val Gly His Leu Ala Lys Ala Glu Leu Phe AGC CGC CGT GCG CCA ATG TTC GGG GAC GGG ACC CCG CCG GCG GTG 1665 Ser Arg Arg Ala Pro Met Phe Gly Asp Gly Thr Thr Pro Ala Val CTG GCG TCG GCC CTG CTG GAC AGC GGC AGG CAC CTC GAA TCG GTC 1710 Leu Ala Ser Ala Leu Leu Asp Ser Gly Arg His Leu Glu Ser Val CAG GCG CTC GTC CGC CTC GTC TGC CAA GAC CCC GTC CAT GGC GAC 1755 Gln Ala Leu Val Arg Leu Val Cys Gln Asp Pro Val His Gly Asp CAG AAC CAG GCG ACT GTG CGG CGG TGG ATC GAG GAA TGG CAG CCG 1800 Gln Asn Gln Ala Thr Val Arg Arg Trp Ile Glu Glu Trp Gln Pro CGG TGC AAG GCG GCG GCC CAG TCC TTC CTG CCG ACG TTC TCC GAC 1845 Arg Cys Lys Ala Ala Ala Gln Ser Phe Leu Pro Thr Phe Ser Asp TGC GGC ATC GAC GCC AAG GAA AGC GCC AAC GCG CTG TCC CGG GCG 1890 Cys Gly Ile Asp Ala Lys Glu Ser Ala Asn Ala Leu Ser Arg Ala CTG GCG AAC CAG CGG GCC GCC GTC GAG GGC GCC GGC ATC ACG GCA 1935 Leu Ala Asn Gln Arg Ala Ala Val Glu Gly Ala Gly Ile Thr Ala (amoB)M TG ACA GAC GTT AAG GAG ACC ACT GTG ACC AGC ACC CCC TCG GCC 1979 * et Thr Asp Val Lys Glu Thr Thr Val Thr Ser Thr Pro Ser Ala GCC GTG CCG GGA ACC AAG AAC CGC CGC GTT GGT ATC TCG CTG ATC 2024 Ala Val Pro Gly Thr Lys Asn Arg Arg Val Gly 1le Ser Leu Ile AGC AGC AGC GAC ACC GAG GCA GCT GTC GAG CAC ATC GCG GAG ACC 2069 Ser Ser Ser Asp Thr Glu Ala Ala Val Glu His Ile Ala Glu Thr CAG CCG GAC GCG AAG ATC GAC TTT CGG GAC TGC TTC TAC AAG ATC 2114 Gln Pro Asp Ala Lys Ile Asp Phe Arg Asp Cys Phe Tyr Lys Ile GAG CGT GAC GGG CAG CTC AGT TTC GAC ATG GCA GAG CTC AGT GAG 2159 Glu Arg Asp Gly Gln Leu Ser Phe Asp Met Ala Glu Leu Ser Glu ATC GCC GGT CGC GAC ATC GAC ACC GAC ATC TTC CTG GTG AAC ATG 2204 Ile Ala Gly Arg Asp Ile Asp Thr Asp Ile Phe Leu Val Asn Met AGC ACC TAC TAC GGC CGG ATC GTC GTC AGT GAC GGC CGG GTC GAC 2249 Ser Thr Tyr Tyr Gly Arg Ile Val Val Ser Asp Gly Arg Val Asp ATC TAC GCC GAA ATC CAG CCG GCC CGC TTC AAG GAC TGA GAG GAA 2294 Ile Tyr Ala Glu Ile Gln Pro Ala Arg Phe Lys Asp * ACA CC ATG GCA TCG AAC CCC ACC CAG CTC CAC GAG AAG TCG AAG 2338 (amoC) Met Ala Ser Asn Pro Thr Gln Leu His Glu Lys Ser Lys TCC TAC GAC TGG GAC TTC ACC TCC GTC GAG CGG CGC CCC AAG TTC 2383 Ser Tyr Asp Trp Asp Phe Thr Ser Val Glu Arg Arg Pro Lys Phe GAG ACG AAG TAC AAG ATG CCC AAG AAG GGC AAG GAC CCG TTC CGC 2428 Glu Thr Lys Tyr Lys Met Pro Lys Lys Gly Lys Asp Pro Phe Arg GTC CTG ATC CGT GAC TAC ATG AAG ATG GAA GCG GAG AAG GAC GAC 2473 Val Leu Ile Arg Asp Tyr Met Lys Pet Glu A1a Glu Lys Asp Asp CGG ACC CAT GGC TTC CTC GAC GGC GCC GTG CGG ACG CGT GAG GCC 2518 Arg Thr His Gly Phe Leu Asp Gly Ala Val Arg Thr Arg Glu Ala ACC AGG ATT GAG CCG CGG TTC GCT GAG GCC ATG AAG ATC ATG GTG 2563 Thr Arg Ile Glu Pro Arg Phe Ala Glu Ala Met Lys Ile Met Val CCG CAG CTG ACC AAC GCC GAG TAC CAG GCG GTG GCG GGC TGC GGA 2608 Pro Gln Leu Thr Asn Ala Glu Tyr Gln A1a Val Ala Gly Cys Gly ATG ATC ATC TCG GCC GTC GAG AAC CAG GAG CTC CGT CAG GGC TAC 2653 Met Ile Ile Ser Ala Val Glu Asn Gln Glu Leu Arg Gln Gly Tyr GCC GCT CAG ATG CTC GAT GAG GTG CGG CAC GCG CAG CTC GAG ATG 2698 Ala Ala Gln Met Leu Asp Glu Val Arg His Ala Gln Leu Glu Met ACG CTA CGC AAC TAC TAC GCG AAG CAC TGG TGC GAT CCC TCC GGC 2743 Thr Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala Lys His Trp Cys Asp Pro Ser Gly TTC GAC ATC GGT CAG CGC GGC CTG TAC CAG CAC CCC GCG GGG CTG 2788 Phe Asp Ile Gly Gln Arg Gly Leu Tyr Gln His Pro Ala Gly Leu GTG TCC ATC GGC GAG TTC CAG CAC TTC AAT ACT GGT GAC CCG CTT 2833 Val Ser Ile Gly Glu Phe Gln His Phe Asn Thr Gly Asp Pro Leu GAC GTC ATC ATC GAT CTC AAC ATC GTG GCC GAG ACG GCG TTC ACG 2878 Asp Val Ile Ile Asp Leu Asn Ile Val Ala Glu Thr Ala Phe Thr AAC ATC CTG CTG GTG GCC ACT CCA CAG GTC GCC GTG GCC AAC GGG 2923 Asn Ile Leu Leu Val Ala Thr Pro Gln Val Ala Val Ala Asn Gly GAC AAC GCG ATG GCC AGC GTG TTC CTC TCG ATC CAG TCG GAC GAG 2968 Asp Asn Ala Met Ala Ser Val Phe Leu Ser Ile Gln Ser Asp Glu GCC AGG CAC ATG GCC AAC GGG TAC GGC TCG GTC ATG GCG CTG CTG 3013 Ala Arg His Met Ala Asn Gly Tyr Gly Ser Val Met Ala Leu Leu GAG AAC GAG GAC AAC CTC CCG CTG CTC AAC CAG TCT CTC GAT CGG 3058 Glu Asn Glu Asp Asn Leu Pro Leu Leu Asn Gln Ser Leu Asp Arg CAC TTC TGG CGT GCC CAC AAG GCC TTG GAC AAC GCG GTC GGA TCG 3103 His Phe Trp Arg Ala His Lys Ala Leu Asp Asn Ala Val Gly Trp TGT TCG GAG TAT GGC GCC CGC AAG CGG CCA TGG AGC TAC AAG GCC 3148 Cys Ser Glu Tyr Gly Ala Arg Lys Arg Pro Trp Ser Tyr Lys Ala CAG TGG GAG GAA TGG GTC GTC GAC GAC TTC GTG GGC GGC TAC ATC 3193 Gln Trp Glu Glu Trp Val Val Asp Asp Phe Val Gly Gly Tyr Ile GAC CGA CTC AGC GAG TTC GGC GTT CAG GCT CCG GCC TGC CTT GGC 3238 Asp Arg Leu Ser Glu Phe Gly Val Gln Ala Pro Ala Cys Leu Gly GCG GCC GCC GAC GAG GTC AAG TGG TCG CAC CAC ACC CTC GGT CAG 3283 Ala Ala Ala Asp Glu Val Lys Trp Ser His His Thr Leu Gly Gln GTG CTG TCG GCG GTG TGG CCG CTG 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124; ATCC 31338) 910-1935 amoA 1935-2285 amoB 2300-3802 amoC 3805-4830 amoD GGA TCC CCA GGT CCC GAG CCA CCG CGG CGA TCG ACT TCC CCG TCT 45 CAT GCA CGA TCC GCA CAG GCC CCC CCCCT CGT ACT 90 TTT CCG CTT CTC TGA CAT CCC TAC CCC TTA TAG CTG ATG CCT CCA 135 CGG TCT CGG GGA ATG CCA ATA TGA CTT GGT CAG ATC GTA GGC GGC 180 AAG AAC CAT GGC TTC CTT GGC GGA CTT CAC AGG GGC CTC TCC TCG 225 AGG GCT CGT TCG GGC ATG GGT AGC ACC GTC GAG CGA ACC CGA GGA 270 GAG GCC CCG ATC CGG GGA GGC GAT CGG GAT GAA CGG GGA CGT GTC 315 GAG AAT CGA TCA GAC TTG GTG GGC AGA TTC GTG TCC GCC GGT GCA AAC CCG ATG GCC ATC CAC GGG CAC TTT CGT GGC CAT CAG TGG 405 GCG GTT TCG TGA CCC CCT ATG GGC AGT TTT CCA TGG CCG CCG ACA 450 CAC AGG CCC GCA CCG ATG ACG AGG TAC TGC ACG ACC CGG CCG ACC 495 GCG CGG TTT GCT GCA ACA AAT GAC AAC TTG ATC AAC GCA TCG 540 ATC ACG ACC GGC GCC ACT AAC GCC GCC GCG GCA AGC ATC G AC ATC 585 AAC ACC ATC GCG ACC GTC CGC CCT TCA CAT CGA CGA CAC CTC GGT 630 CGA TGT GTG CAT ACC GCA TGC ATC CGG CAA GAA CCC CGC GGA 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GGC CGG GTC GAC 2249 Ser Thr Tyr Tyr Gly Arg Ile Val Val Ser Asp Gly Arg Val Asp ATC TAC GCC GAA ATC CAG CCG GCC CGC TTC AAG GAC TGA GAG GAA 2294 Ile Tyr Ala Glu Ile Gln Pro Ala Arg Phe Lys Asp * ACA CC ATG GCA TCG AAC CCC ACC CAG CTC CAC GAG AAG TCG AAG 2338 (amoC) Met Ala Ser Asn Pro Thr Gln Leu His Glu Lys Ser Lys TCC TAC GAC TGG GAC TTC ACC TCC GTC GAG CGG CGC CCC AAG TTC 2383 Ser Tyr Asp Trp Asp Phe Thr Ser Val Glu Arg Arg Pro Lys Phe GAG ACG AAG TAC AAG ATG CCC AAG AAG GGC AAG GAC CCG TTC CGC 2428 Glu Thr Lys Tyr Lys Met Pro Lys Lys Gly Lys Asp Pro Phe Arg GTC CTG ATC CGT GAC TAC ATG AAG ATG GAA GCG GAG AAG GAC GAC 2473 Val Leu Ile Arg Asp Tyr Met Lys Pet Glu A1a Glu Lys Asp Asp CGG ACC CAT GGC TTC CTC GAC GGC GCC GTG CGG ACG CGT GAG GCC 2518 Arg Thr His Gly Phe Leu Asp Gly Ala Val Arg Thr Arg Glu Ala ACC AGG ATT GAG CCG CGG TTC GCT GAG GCC ATG AAG ATC A TG GTG 2563 Thr Arg Ile Glu Pro Arg Phe Ala Glu Ala Met Lys Ile Met Val CCG CAG CTG ACC AAC GCC GAG TAC CAG GCG GTG GCG GGC TGC GGA 2608 Pro Gln Leu Thr Asn Ala Glu Tyr Gln A1a Val Ala Gly Cys Gly ATG ATC ATC TCG GCC GTC GAG AAC CAG GAG CTC CGT CAG GGC TAC 2653 Met Ile Ile Ser Ala Val Glu Asn Gln Glu Leu Arg Gln Gly Tyr GCC GCT CAG ATG CTC GAT GAG GTG CGG CAC GCG CAG CTC GAG ATG 2698 Ala Ala Gln M Leu Asp Glu Val Arg His Ala Gln Leu Glu Met ACG CTA CGC AAC TAC TAC GCG AAG CAC TGG TGC GAT CCC TCC GGC 2743 Thr Leu Arg Asn Tyr Tyr Ala Lys His Trp Cys Asp Pro Ser Gly TTC GAC ATC GGT CAG CGC GGC CTG TAC CAG CAC CCC GCG GGG CTG 2788 Phe Asp Ile Gly Gln Arg Gly Leu Tyr Gln His Pro Ala Gly Leu GTG TCC ATC GGC GAG TTC CAG CAC TTC AAT ACT GGT GAC CCG CTT 2833 Val Ser Ile Gly Glu Phe Gln His Phe Asn Thr Gly Asp Pro Leu GAC GTC ATC ATC GAT CTC AAC ATC GTG GCC GAG ACG GCG TTC ACG 2878 Asp Val Ile Ile Asp Leu Asn Ile Val Ala Glu Thr Ala Phe Thr AAC ATC CTG CTG GTG GCC ACT CCA CAG GTC GCC GTG GCC A AC GGG 2923 Asn Ile Leu Leu Val Ala Thr Pro Gln Val Ala Val Ala Asn Gly GAC AAC GCG ATG GCC AGC GTG TTC CTC TCG ATC CAG TCG GAC GAG 2968 Asp Asn Ala Met Ala Ser Val Phe Leu Ser Ile Gln Ser Asp Glu GCC AGG CAC ATG GCC AAC GGG TAC GGC TCG GTC ATG GCG CTG CTG 3013 Ala Arg His Met Ala Asn Gly Tyr Gly Ser Val Met Ala Leu Leu GAG AAC GAG GAC AAC CTC CCG CTG CTC AAC CAG TCT CTC GAT CGG 3058 Glu Asn Glu Asp Asn Leu Pro Leu Leu Asn Gln Ser Leu Asp Arg CAC TTC TGG CGT GCC CAC AAG GCC TTG GAC AAC GCG GTC GGA TCG 3103 His Phe Trp Arg Ala His Lys Ala Leu Asp Asn Ala Val Gly Trp TGT TCG GAG TAT GGC GCC CGC AAG CGG CCA TGG AGC TAC AAG GCC 3148 Cys Ser Glu Tyr Gly Ala Arg Lys Arg Pro Trp Ser Tyr Lys Ala CAG TGG GAG GAA TGG GTC GTC GAC GAC TTC GTG GGC GGC TAC ATC 3193 Gln Trp Glu Glu Trp Val Val Asp Asp Phe Val Gly Gly Tyr Ile GAC CGA CTC AGC GAG TTC GGC GTT CAG GCT CCG GCC TGC CTT GGC 3238 Asp Arg Leu Ser Glu Phe Gly Val Gln Ala Pro Ala Cys Leu Gly GCG GCC GCC GAC GAG GTC AAG TGG TCG CAC CAC ACC CTC G GT CAG 3283 Ala Ala Ala Asp Glu Val Lys Trp Ser His His Thr Leu Gly Gln GTG CTG TCG GCG GTG TGG CCG CTG AAC TTC TGG CGC TCG GAC GCC 3328 Val Leu Ser Ala Val Trp Pro Leu Asn Phe Trp Arg Ser Asp Ala ATG GGA CCG GCG GAC TTC GAG TGG TTC GAG AAC CAC TAC CCG GGC 3373 Met Gly Pro Ala Asp Phe Glu Trp Phe Glu Asn His Tyr Pro Gly TGG AGC GCG GCC TAC CAG GGT TAC TGG GAG GGC TAC AAG GCG CTC 3418 Trp Ser Ala Ala Tyr Gln Gly Tyr Trp Glu Gly Tyr Lys Ala Leu GCC GAC CCA GCA GGC GGA CGC ATC ATG CTC CAG GAG CTG CCG GGT 3463 Ala Asp Pro Ala Gly Gly Arg Ile Met Leu Gln Glu Leu Pro Gly CTG CCG CCG ATG TGT CAG GTG CAG GTG CCG TGC GTG ATG CCG 3508 Leu Pro Pro Met Cys Gln Val Cys Gln Val Pro Cys Val Met Pro CGG CTG GAT ATG AAC GCC GCG CGG ATC ATC GAG TTC GAG GGG CAG 3553 Arg Leu Asp Met Asn Ala Ala Arg Ile Ile Glu Phe Glu Gly Gln AAA ATC GCG CTG TGC AGC GAA CCC TGC CAG CGG ATC TTC ACC AAC 3598 Lys Ile Ala Leu Cys Ser Glu Pro Cys Gln Arg Ile Phe Thr Asn TGG CCG GAG GCG TAC TAC CGC CAC CGC AAG CAA TAC TGG GCC C GC TAC 3643 Trp Pro Glu Ala Tyr Arg His Arg Lys Gln Tyr Trp Ala Arg Tyr CAC GGA TGG GAC CTG GCG GAC GTC ATC GTT GAT CTC GGC TAC ATC 3688 His Gly Trp Asp Leu Ala Asp Val Ile Val Asp Leu Cly Tyr IGC CCG GAC GGC AAG ACC CTC ATC GGC CAG CCG CTG CTC GAG ATG 3733 Arg Pro Asp Cly Lys Thr Leu Ile Gly Gln Pro Leu Leu Glu Met GAG CGG CTG TGG ACC ATC GAC GAC ATC CGG GCC CTT CAG TAC GAA 3778 Glu Arg Leu Trp Thr Ile Asp Asp Ile Arg Ala Leu Gln Tyr Clu GTC AAG GAC CCG TTG CAG GAG GCG TG ATG ACG ACG ATC AAT GTG 3822 Val Lys Asp Pro Leu Gln Glu Ala * * (amoD) Met Thr Thr Ile Asn Val CAG CCC TTC TCA CAC GAG TAC TCG TGC GAG GAC GGC GAG AGC CTC 3867 Gln Pro Phe Ser His Glu Tyr Ser Cys Glu Asp G1y Glu Ser Leu CTC GAC GGC GCC CTG CGC AAC AGC CTG CTC CTG AAG TAC GGG TGC 3912 Leu Asp Gly Ala Leu Arg Asn Ser Leu Leu Leu Lys Tyr Gly Cys AAG CAC GGG GGC TGC GGG ACC TGC AAG GTC CGG CTG CTC GAC GGC 3957 Lys His Gly Gly Cys Gly Thr Cys Lys Val Arg Leu Leu Asp Gly GAC GTA GAG GAA CCC GGG TCG TCG TTC GCG CTG ACG CCG GAG GAC 4002 Asp Val Clu Glu Pro Gly Ser Ser Phe Ala Leu Thr Pro Glu Asp CGC GAG AAC GAC GTG ATC CTC GCG TGC GCC AGC GTG CCG CTG GAA 4047 Arg Glu Asn Asp Val Ile Leu Ala Cys Ala Ser Val Pro Leu Glu CCG TGC ACC ATC GAC GTC GAG CCG AGC GGC CTC ACG GAG GAG GAG 4092 Pro Cys Thr Ile Asp Val Glu Pro Ser Gly Leu Thr Clu Glu Glu Glu TTC TTC TCG TGC GGC GAC ACC TCG CGC GAG TTC CAG ACG GTC GTG GGC 4137 Phe Phe Ser Gly Asp Thr Ser Arg Glu Phe Gln Thr Val Val Gly GGT GTC GAG TTT CTC ACG GCG GAC ATC GCC CGG GTC CGG CTC CGG 4182 Gly Val Glu Phe Leu Thr Ala Asp Ile Ala Arg Val Arg Leu Arg CTA GAG CCG GGC GAG GAG ATC GCC TTC ACC GCC GGT CAG TTC GTC 4227 Leu Glu Pro Gly Glu Glu Ile Ala Phe Thr Ala Gly Gln Phe Val AAC GTC GAG GTG CCG GGC ACG GGT CTG CTG CGG ACC TTC TCG CTG 4272 Asn Val Clu Val Pro Gly Thr Gly Leu Leu Arg Thr Phe Ser Leu GCA AAC GCC CCT GAC GAC CCG TCA GTG GTG GAG CTG ATC TGC AAG 4317 Ala Asn Ala Pro Asp Asp Pro Ser Val Val Glu Leu Ile Cys Lys CTC TAC CCG GAT GGC CTC TTC TCC CGC TTC CTG AGG GAC GAG GCT 4362 Leu Tyr Pro Asp Gly Leu Phe Ser Arg Phe Leu Arg Asp Glu Ala GCC CCG GGC ACG CCG GTC CGG GTG TTC GGG CCG TAT GGT CAG CTC 4407 Ala Pro Gly Thr Pro Val Arg Val Phe Gly Pro Tyr Gly Gln Leu AAG ATC CGC TTG TCC CAC CGG CCG ATC CTG ATG ATC GCC GGT GGG 4452 Lys Ile Arg Leu Ser His Arg Pro Ile Leu Met Ile Ala Gly Gly TCC GGT CTC GCC CCG CTG CTC TCG ATG CTG CGA GAC TTG GCC GCC 4497 Ser Gly Leu Ala Pro Leu Leu Ser Met Leu Arg Asp Leu Ala Ala AAG AAG TGC GAC CGG CCG GTC TCG ATG TTC TTC GGC GCA CGC AGC 4542 Lys Lys Cys Asp Arg Pro Val Ser Met Phe Phe Gly Ala Arg Ser GTC GAC GAC CTG TAC CTC ATC GAG GAG ATC CGC GAG ATC GGC GAG 4587 Val Asp Asp Leu Tyr Leu Ile Glu Glu Ile Arg G1u Ile Gly Glu TCG CTA GCC GAT TTC GAG TTC ATC CCC GTG CTC TCG GAG TCG TCG 4632 Ser Leu Ala Asp Phe Glu Phe Ile Pro Val Leu Ser Glu Ser Ser CCA GCC GAC TGG CAC GGC GAG ACG GGC ATG GTC ACC GAC GCC TTG 4677 Pro Ala Asp Trp His Gly Glu Thr Gly Met Val Thr Asp Ala Leu CTG CGG TGG CGC GCC GAA CTG GCG CAT GAC GTC TAC CTG TGC GGG 4722 Leu Arg Trp Arg Ala Glu Leu Ala His Asp Val Tyr Leu Cys Gly CCG CCA CCC ATG ATC GAC GCC GCT GTG CCG CTG CTC GTC GAG CGG 4767 Pro Pro Pro Met Ile Asp Ala Ala Val Pro Leu Leu Val Glu Arg GGC GTG CGC CCA CGC AAC ATC TAC TAC GAC GCA TTC ACC CCA GCT 48l2 Gly Val Arg Pro Arg Asn Ile Tyr Tyr Asp Ala Phe Thr Pro Ala GCT CAG GTA GTC GTC GTC TGA TGG TGC ATA TCC GAT TGG GCG GCC 4857 Ala Gln Val Val Val Val * GGT ACC GGC GGG GTT AGG GCA GGG TAA TCG GCC GCG ATA GAG GCA 4902 GCC AGC AGA GAT GAT GCG CGT GCA AAG CGA AGC TTC GAC TCA GTT 4947 GAC ACC TTC GGC AAT GTG CTG TGC GAG CAC GAT AAC CGT GTG TTA 4992 CGG GTG AGG CTC AAT CGC ACC GGT GCC CTG AGC GCA ATC AAT TCA 5037 GCT ATG GCT GAT CAA TTG CGG GAA GCG TGG GTG TGG GTG CGC AGC 5082 CAA ACC GGA ATT CAT TCA ATC GTC ATC TCG GCT TCG CGG CCG GAG TCG TTT TTG CAT CGG TTT TGA TCC GGC CGA CCC GCC GGA GCC GAT 5172 GTT CGA TCG CCC CAT CAG CCC GAA GGA ATG CGG CGT CGA TCA ACG 5217 CGT CAT AGT CGC GGT GAA CGG CAT CGC GTG CCG CAT CCT GAG CGC 52 62 CGG CGA ACC GAC ACT GCG TAA GCC GGT GAC GGC GGA ACA GGC GAT 5307 GGA GTC GGG CTT GGT TCG GGA GGT CGT ACC GCT TGC ATC GGC TGC 5352 GTT GTC GAG CGA ATA GCT CAG GCG GCA GGA CAT CGT ATA GGG ATT 5397 GTG GGT AGT TGA TCT TCC GCG TGT CGA TGT GTG ACG GGC CGG 5442 ATC TGG CCT ACG AAC AAC ATC AGC AAG CGT GAC CTT CGG CCC ACA 5487 ACA TCG TGC CGT CCG CGA CCG GTG CCG ACC GTG ATC TCG GCG AAG 5532 TCC TGC AGT TCG CGG GGC GGT TCC ACA GCG TTG GGG GTC CCT 5577 CGG CTA CAC CTC GGC GCT GTT CGT CAG CTC CGA CAT CAT CGG TCA 5622 CCC ACA CTC CTG CCC GGT GTT CGG CAA CAT GGT GCA CGA CGG CCA 5667 GGT GACTCT GGT ACG ACA ACG AAT GGG CGA TGC CAA TCC 5712 GTT GCT CGA CCT CGT CGG GGT CAT GGC TGG CGT TCG CTG ACT AGG 5757 CGG CCT GTT CGT GCC GGC CGC AAC ATC CAG CCC GTG AGG AGT TGC 5802 GTA CCG GTC GGC GAG AAA CAC GAC CCG GGC AAC CTC GTC GGG 5847 CTC ACC GAG TCG GCC GAC TGG GAT CTT CGC GAT GAC CCG ATC GAG 5892 CGC CTC CTT GGG CAC CGC AGC AAC TAT CTC GGT GGA GAT GTA GCC 5937 AGG CGG AAC GGA ATT GA C GGT GAT GCC CTT GCG GGC GGT CTC CTG 5982 GGC CAG GGT CTG TGT CCT TAT CTC TTG TCG ACC GAA CAC GGT GTG 6027 CGG TCG AGT TGG TCG GTT TGA TCA GGC GGG AAC GCG GAA TAG GAG 6072 GGC TTC GCC CTG ACC GCC GCC GCA CAG GCC GGC CGC CCC GAC 6117 GCC GCC GCC GCG GCG GGC CAG CTC GAG CAC GAG ATG CAG CGC GAT 6162 CCG GGC GCC GGA GGC GCC GAC CGG GTG CCC CAT GGC GAT CGC GCC 6207 GCC GTT GAC GTT GAC GTT GTC GTC GAT CTG CAG GTC GCG CAT 6252 GGA TTG AAT AGC GAC GGC CGC GAA TGC CTC GTT GAT CTC GTA CAG 6297 GTC CAC ATC CAT GGC GGA GAG TCC TTC GCG GCG CAG CGC CCT GGC 6342 GAT CGC GTT GGA GGG TTG CGA CAGG CAGA ATC C 6379

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

【図１】 E. coli (大腸菌) JM109 (pDBB-1) 株 (FERM
BP-4250) に保持されているプラスミドベクタ− pDBB1
の制限酵素地図及び amoABCD 遺伝子の組込み部位を示
す。Figure 1: E. coli JM109 (pDBB-1) strain (FERM
BP-4250)
1 shows a restriction map of the present invention and an integration site of the amoABCD gene.

【図２】 添加するトリクロロエチレンの量（液相濃度
初期値）を種々に採り、Nocardia corallina（ノカルデ
ィア コラリ−ナ） B-276 株 (FERM BP-5124; ATCC 313
38)を作用させた際、液相に残存するトリクロロエチレ
ン濃度の経時的変化を比較する。FIG. 2 The amount of trichlorethylene to be added (the initial value of the liquid phase concentration) was measured variously, and the Nocardia corallina B-276 strain (FERM BP-5124; ATCC 313) was used.
38) Compare the changes over time in the concentration of trichlorethylene remaining in the liquid phase when acted on.

【図３】 Nocardia corallina（ノカルディア コラリ
−ナ） B-276 株 (FERM BP-5124 ; ATCC 31338)による
トリクロロエチレン処理速度のトリクロロエチレン添加
量依存性を示す。FIG. 3 shows the dependence of the rate of trichloroethylene treatment by Nocardia corallina strain B-276 (FERM BP-5124; ATCC 31338) on the amount of trichloroethylene added.

【図４】 Nocardia corallina（ノカルディア コラリ
−ナ） B-276 株 (FERM BP-5124 ; ATCC 31338)による
トリクロロエチレン処理速度の温度依存性を示す。FIG. 4 shows the temperature dependence of the trichlorethylene treatment rate by Nocardia corallina strain B-276 (FERM BP-5124; ATCC 31338).

【図５】 Nocardia corallina（ノカルディア コラリ
−ナ） B-276 株 (FERM BP-5124 ; ATCC 31338)による
処理における、各基質の残余量の経時的な変化を比較す
る。FIG. 5 compares the time course of the residual amount of each substrate in the treatment with Nocardia corallina strain B-276 (FERM BP-5124; ATCC 31338).

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 17/02 Ｃ１２Ｒ 1:365） (56)参考文献 特開 平２−312587（ＪＰ，Ａ) 特開 平６−105691（ＪＰ，Ａ) ＡＰＰＬＩＥＤ ＡＮＤ ＥＮＶＩＲ ＯＮＭＥＮＴＡＬ ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ ＯＧＹ，Ｖｏｌ．58，Ｎｏ．４，ｐ. 1220−1226（1992) Ｊ．ＧＥＮ．ＭＩＣＲＯＢＩＯＬ，Ｖ ｏｌ．137，Ｎｏ．11，ｐ．2555−2560 （1991) (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 17/02 C02F 3/34 C12N 15/53 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI (C12P 17/02 C12R 1: 365) (56) References JP-A-2-312587 (JP, A) JP-A-6-105569 (JP, A) APPLIED AND ENVIR ONMENTAL MICROBIOL OGY, Vol. 58, No. 4, p. 1220-1226 (1992); GEN. MICROBIOL, Vol. 137, no. 11, p. 2555-2560 (1991) (58) Fields investigated (Int. Cl. ⁶ , DB name) C12P 17/02 C02F 3/34 C12N 15/53 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】 置換する塩素数１〜３の塩素置換エチレ
ンを添加してなる培地で、アルケンモノオキシゲナーゼ
酵素生産能を有する微生物であるNocardia corallina
（ノカルディア コラリーナ）B-276株（FERM BP-512
4；ATCC 31338）及び／又は該Nocardia corallina（ノ
カルディア コラリーナ）B-276株（FERM BP-5124；ATC
C 31338）由来のアルケンを酸化して対応するエポキシ
ドに変換するアルケンモノオキシゲナーゼ酵素の遺伝子
DNAを含有するプラスミドベクターを導入し形質転換し
てなる該アルケンモノオキシゲナーゼ酵素生産能を有す
る微生物を生育せしめ、当該微生物を作用させて該塩素
置換エチレンを対応するエポキシドに転換することを特
徴とする微生物学的方法による塩素置換エチレンの処理
方法。1. A chlorine-substituted ethylene having 1 to 3 chlorine atoms to be substituted.
Alkene monooxygenase
A microorganism capable of producing enzymesNocardia corallina
(Nocardia Coralina) B-276 strain (FERM BP-512)
4; ATCC 31338) and / orNocardia corallina(No
Cardia coralina) B-276 strain (FERM BP-5124; ATC)
C 31338)Oxidized alkene and corresponding epoxy
Convert toAlkene monooxygenase enzyme gene
A plasmid vector containing DNA is introduced and transformed.
Having the ability to produce the alkene monooxygenase enzyme
To grow the microorganisms,
The conversion of substituted ethylenes to the corresponding epoxides is
Treatment of chlorinated ethylene by microbiological methods.
Method. 【請求項２】 前記Nocardia corallina（ノカルディア
コラリーナ）B-276株（FERM BP-5124；ATCC 31338）
由来のアルケンモノオキシゲナーゼ酵素の遺伝子DNAを
含有するプラスミドベクターを導入し形質転換してなる
該アルケンモノオキシゲナーゼ酵素生産能を有する微生
物が、Eschericha coli（イー コリ）に分類される形
質転換微生物であることを特徴とする請求項１に記載す
る微生物学的方法による塩素置換エチレンの処理方法。2. The Nocardia corallina B-276 strain (FERM BP-5124; ATCC 31338).
The microorganism having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability obtained by introducing and transforming a plasmid vector containing the gene DNA of the alkene monooxygenase enzyme derived from Escherichia coli is a transformed microorganism classified as Eschericha coli. The method for treating chlorine-substituted ethylene by the microbiological method according to claim 1. 【請求項３】 前記Nocardia corallina（ノカルディア
コラリーナ）B-276株（FERM BP-5124；ATCC 31338）
由来のアルケンモノオキシゲナーゼ酵素の遺伝子DNAを
含有するプラスミドベクターを導入し形質転換してなる
該アルケンモノオキシゲナーゼ酵素生産能を有する微生
物が、Nocardia属（ノカルディア属）、Rhodococcous属
（ロドコッカス属）、Xanthobacter属（ザンソバクター
属）及びMycobacterium属（ミコバクテリウム属）より
なる群から選択される属に分類される形質転換微生物で
あることを特徴とする請求項１に記載する微生物学的方
法による塩素置換エチレンの処理方法。3. The Nocardia corallina B-276 strain (FERM BP-5124; ATCC 31338).
Microorganisms having the alkene monooxygenase enzyme-producing ability obtained by introducing and transforming a plasmid vector containing the gene DNA of the alkene monooxygenase enzyme derived from Nocardia (Nocardia), Rhodococcous (Rhodococcus), and Xanthobacter The chlorinated ethylene according to the microbiological method according to claim 1, wherein the microorganism is a transformed microorganism classified into a genus selected from the group consisting of the genus (Zantobacter) and the genus Mycobacterium ( Mycobacterium ). Processing method. 【請求項４】 アルケンモノオキシゲナーゼ酵素生産能
を有する微生物として、Nocardia corallina（ノカルデ
ィア コラリーナ）B-276株（FERM BP-5124；ATCC 3133
8）を用いることを特徴とする請求項１に記載する微生
物学的方法による塩素置換エチレンの処理方法。4. A microorganism having an alkene monooxygenase enzyme-producing ability, which is Nocardia corallina strain B-276 (FERM BP-5124; ATCC 3133).
8. The method for treating chlorine-substituted ethylene by the microbiological method according to claim 1, wherein 8) is used. 【請求項５】 Nocardia corallina（ノカルディア コ
ラリーナ）B-276株（FERM BP-5124；ATCC 31338）由来
のアルケンモノオキシゲナーゼ酵素の遺伝子DNAを含有
するプラスミドベクターを導入し形質転換してなる該ア
ルケンモノオキシゲナーゼ酵素生産能を有する微生物と
して、E. coli（大腸菌）JM109（pDBB-1）株（FERM BP-
4250）を用いることを特徴とする請求項１に記載する微
生物学的方法による塩素置換エチレンの処理方法。5. The alkene mono obtained by introducing and transforming a plasmid vector containing a gene DNA of an alkene monooxygenase enzyme derived from Nocardia corallina strain B-276 (FERM BP-5124; ATCC 31338). E. coli (Escherichia coli) JM109 (pDBB-1) strain (FERM BP-
The method for treating chlorine-substituted ethylene according to the microbiological method according to claim 1, wherein 4250) is used.