JP2980681B2 - Determination of substances using coumarin derivatives - Google Patents
Determination of substances using coumarin derivativesInfo
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明はクマリン誘導体を用いた化学発光法による過
酸化活性物質、過酸化水素および後記式（Ｉ）もしくは
（II）で表されるクマリン誘導体の定量方法に関する。Description: TECHNICAL FIELD The present invention relates to a method for quantifying a peroxide active substance, hydrogen peroxide and a coumarin derivative represented by the following formula (I) or (II) by a chemiluminescence method using a coumarin derivative.
従来の技術 ごく微量な過酸化水素やペルオキシダーゼ活性を正確
に定量することは分析化学および生化学において重要な
ことであり、特に臨床検査の分野では測定対象物質を最
終的に過酸化水素に変換して定量する手法が多用されて
いる。また抗原、抗体またはDNAをペルオキシダーゼ、
ペルオキシダーゼ以外の酸化酵素または発光化合物で標
識し、ペルオキシダーゼ活性または該酸化酵素の反応に
より生じる過酸化水素または発光化合物を定量すること
により、抗原、抗体またはDNAを定量する方法が知られ
ている。2. Description of the Related Art Accurate quantification of minute amounts of hydrogen peroxide and peroxidase activities is important in analytical chemistry and biochemistry, especially in the field of clinical testing, where the substance to be measured is finally converted to hydrogen peroxide. Quantitative methods are often used. In addition, antigen, antibody or DNA can be used for peroxidase,
There is known a method for quantifying an antigen, an antibody or DNA by labeling with an oxidase or a luminescent compound other than peroxidase and quantifying peroxidase activity or hydrogen peroxide or a luminescent compound generated by the reaction of the oxidase.
過酸化水素やペルオキシダーゼ活性の定量法のなか
で、高感度な定量法としては、生物発光やペルオキシダ
ーゼの基質となる化合物の化学発光を利用する方法が知
られている。特に利用できる発光化合物としてルミノー
ル、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジニウムエス
テル等の化合物が知られている〔生物発光と化学発光、
今井一洋編、p.82−89,（1989），廣川書店〕が、反応
液中にタンパク質が共存したり反応液のpHが酸性側であ
ると、発光強度が低下する等の問題点がある。Among the methods for quantifying hydrogen peroxide and peroxidase activities, methods using bioluminescence and chemiluminescence of a compound serving as a substrate for peroxidase are known as highly sensitive quantification methods. Compounds such as luminol, isoluminol, lucigenin, and acridinium ester are known as particularly usable luminescent compounds (bioluminescence and chemiluminescence,
Kazuhiro Imai, eds. P.82-89, (1989), Hirokawa Shoten] has a problem that if the protein coexists in the reaction solution or the pH of the reaction solution is acidic, the luminescence intensity decreases. is there.
後記式（Ｉ）および式（II）で表されるクマリン誘導
体は蛍光化合物として知られており、また市販されてい
る〔蛍光分析化学、159−161頁（1987）培風館発行；日
本化学会誌、３巻、644頁（1972）；ヘテロサイクロル
ス（Heterocycles）、７巻、933頁（1977）；工業化学
雑誌、71巻、1010頁（1968）；イーストマンコダック
社、和光純薬工業のカタログ等〕。The coumarin derivatives represented by the formulas (I) and (II) described below are known as fluorescent compounds and are commercially available [Fluorescence Analytical Chemistry, pp. 159 to 161 (1987), published by Baifukan; Volume, 644 (1972); Heterocycles, 7, 933 (1977); Industrial Chemistry, 71, 1010 (1968); Catalogs of Eastman Kodak Company, Wako Pure Chemical Industries, etc.] .
クマリン誘導体が過酸化活性物質の存在下、過酸化水
素によって発光するということは知られていない。It is not known that a coumarin derivative emits light by hydrogen peroxide in the presence of a peroxide active substance.
発明の開示 本発明は過酸化水素と式（Ｉ） または式（II） （式中、R1、R2、R3、R4、R5およびR6は同一または異な
って、水素原子、置換もしくは非置換の低級アルキル、
低級アルコキシ、置換もしくは非置換のアラルキル、置
換もしくは非置換のアリール、ハロゲン原子、シアノ、
ニトロ、スルホ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、
アルキルカルバモイル、置換もしくは非置換のアリール
カルバモイル、カルバモイル、ヒドロキシ、置換もしく
は非置換のアミノ、低級アルカノイル、低級アルカノイ
ルオキシまたは複素環基を表すかまたはR1とR2が一緒に
なってアルキレンもしくはアルケニレンを形成するか、
またはR4とR5が一緒になって−CH2CH2CH2NH−を形成す
る）で表されるクマリン誘導体またはその塩を、過酸化
活性物質の存在下に反応させ、反応液の発光量または発
光強度を測定することを特徴とする過酸化活性物質、過
酸化水素または式（Ｉ）もしくは式（II）で表されるク
マリン誘導体を定量する方法に関する。DISCLOSURE OF THE INVENTION The present invention relates to hydrogen peroxide and a compound of formula (I) Or formula (II) (Wherein, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted lower alkyl,
Lower alkoxy, substituted or unsubstituted aralkyl, substituted or unsubstituted aryl, halogen atom, cyano,
Nitro, sulfo, carboxy, alkoxycarbonyl,
Represents an alkylcarbamoyl, substituted or unsubstituted arylcarbamoyl, carbamoyl, hydroxy, substituted or unsubstituted amino, lower alkanoyl, lower alkanoyloxy or heterocyclic group, or R 1 and R 2 together represent alkylene or alkenylene. Form or
Or a combination of R 4 and R 5 to form —CH 2 CH 2 CH 2 NH—) or a salt thereof in the presence of a peroxide active substance; The present invention relates to a method for quantifying a peroxide active substance, hydrogen peroxide or a coumarin derivative represented by the formula (I) or (II), characterized by measuring the amount or luminescence intensity.
本発明の原理は上記反応が化学量論的に進行し反応液
の発光量または光の強度が過酸化活性物質、過酸化水素
またはクマリン誘導体の量に比例していることに基づい
ている。The principle of the present invention is based on the fact that the above reaction proceeds stoichiometrically, and the luminescence amount or light intensity of the reaction solution is proportional to the amount of the peroxide active substance, hydrogen peroxide or coumarin derivative.
反応によって発光した後、クマリン誘導体が如何なる
構造に変化しているか確認されていないが、反応前のク
マリン誘導体と区別される物質の存在がクロマトグラフ
ィーによって確認されており、反応によって発光する化
合物が生成していることは明らかである。After the reaction emits light, it is not confirmed what structure the coumarin derivative has changed to.However, the presence of a substance that is distinguished from the coumarin derivative before the reaction has been confirmed by chromatography, and the reaction produces a compound that emits light. It is clear that you are doing.
式（Ｉ）または式（II）における定義中、低級アルキ
ル、低級アルコキシ、低級アルカノイル、低級アルカノ
イルオキシ、アルコキシカルボニルおよびアルキルカル
バモイルにおけるアルキル部分は、炭素数１〜８の直鎖
または分岐状のアルキル、例えばメチル、エチル、プロ
ピル、イソプロピル、ブチル、tert−ブチル、ペンチ
ル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル等を表し、アラルキ
ルは炭素数７〜15の、例えばベンジル、フェネチル等を
表わし、アリール、アリールカルバモイルにおけるアリ
ール部分はフェニル、ナフチル等を表し、ハロゲン原子
はヨウ素、臭素、塩素、フッ素等を表し、複素環基と
は、ピリジル、ベンゾチアゾリニル等を表す。In the definition in formula (I) or formula (II), the alkyl moiety in lower alkyl, lower alkoxy, lower alkanoyl, lower alkanoyloxy, alkoxycarbonyl and alkylcarbamoyl is a straight-chain or branched alkyl having 1 to 8 carbon atoms, For example, represents methyl, ethyl, propyl, isopropyl, butyl, tert-butyl, pentyl, hexyl, heptyl, octyl, etc., aralkyl represents a group having 7 to 15 carbon atoms, for example, benzyl, phenethyl and the like, aryl, aryl part in aryl carbamoyl Represents phenyl, naphthyl and the like, a halogen atom represents iodine, bromine, chlorine, fluorine and the like, and a heterocyclic group represents pyridyl, benzothiazolinyl and the like.
置換アルキル、置換アラルキル、置換アリールおよび
置換アリールカルバモイルにおける置換基は、同一また
は異なって置換数１〜５のシアノ、ハロゲン原子、置換
もしくは非置換のアミノ、低級アルキル、低級アルコキ
シ、カルボキシ、アルコキシカルボニル、ヒドロキシ等
を表す。低級アルキル、低級アルコキシおよびアルコキ
シカルボニルにおけるアルキル部分およびハロゲン原子
は前記と同義である。Substituents in the substituted alkyl, substituted aralkyl, substituted aryl and substituted aryl carbamoyl may be the same or different and each has 1 to 5 cyano, halogen atom, substituted or unsubstituted amino, lower alkyl, lower alkoxy, carboxy, alkoxycarbonyl, Represents hydroxy and the like. The alkyl moiety and the halogen atom in lower alkyl, lower alkoxy and alkoxycarbonyl are as defined above.
置換アミノにおける置換基は、同一または異なって置
換数１〜２の低級アルキル、置換もしくは非置換の複素
環基を表す。低級アルキルは前記と同義であり、複素環
基は、例えばトリアジニル、ピラジニル、ピリジル、ピ
リミジニル等を表す。置換複素環基における置換基は、
同一または異なって置換数１〜２のシアノ、ハロゲン原
子、アミノ、低級アルコキシ、ヒドロキシ、ジアルキル
アミノ等を表す、低級アルコキシおよびアルキルアミノ
におけるアルキル部分は前記と同義である。The substituents on the substituted amino are the same or different and represent a lower alkyl having 1 or 2 substituents, a substituted or unsubstituted heterocyclic group. Lower alkyl has the same meaning as described above, and the heterocyclic group represents, for example, triazinyl, pyrazinyl, pyridyl, pyrimidinyl and the like. The substituent in the substituted heterocyclic group is
The alkyl moiety in lower alkoxy and alkylamino, which is the same or different and represents a cyano, halogen atom, amino, lower alkoxy, hydroxy, dialkylamino or the like having 1 or 2 substituents, is as defined above.
アルキレンとしては炭素数２〜４の基を包含し、−
（CH2）２−、−（CH2）３−、−（CH2）４−等が挙げ
られ、アルケニレンとしては炭素数２〜４の基を包含
し、−CH＝CH−、−CH＝CH−CH2−、−CH＝CH−CH＝CH
−等が挙げられる。The alkylene includes a group having 2 to 4 carbon atoms,
(CH 2 ) 2 —, — (CH 2 ) 3 —, — (CH 2 ) 4 — and the like. Alkenylene includes a group having 2 to 4 carbon atoms, and —CH ＝ CH—, —CH ＝ CH-CH 2 -, - CH = CH-CH = CH
-And the like.
化合物（Ｉ）または（II）の許容される塩としては、
酸付加塩、例えば塩酸塩、硫酸塩、燐酸塩等の無機酸塩
および酢酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、クエン酸塩
の有機酸塩があげられる。As the acceptable salt of the compound (I) or (II),
Acid addition salts include, for example, inorganic acid salts such as hydrochloride, sulfate and phosphate, and organic acid salts of acetate, maleate, fumarate and citrate.
本発明で用いられている具体的化合物を第１表に示
す。Table 1 shows specific compounds used in the present invention.
第１表に記載したクマリン誘導体は、公知化合物であ
り、例えば日本化学会誌、３巻、644頁（1972）；ヘテ
ロサイクルス、７巻、933頁（1977）；工業化学雑誌、7
1巻、1010頁（1968）等に記載の方法と同様にして製造
することができる。また該化合物は、イーストマンコダ
ック社、アルドリッチ社、ダイトーケミックス社等から
購入することも可能である。 The coumarin derivatives described in Table 1 are known compounds, for example, The Chemical Society of Japan, vol. 3, p. 644 (1972); Heterocycles, vol. 7, p. 933 (1977);
Volume 1, p. 1010 (1968) and the like. The compound can also be purchased from Eastman Kodak Co., Aldrich Co., Ltd., Daito Mixmix Co., or the like.
本発明方法で用いられる過酸化活性物質とはペルオキ
シダーゼ活性を有する化合物の総称であって、例えば、
植物、動物または微生物由来のペルオキシダーゼ〔EC.
1.11.1.7〕、ヘモグロビン、ヘム、酸化鉄、塩化鉄、ヨ
ウ化ナトリムウ、ヨウ化アンモニウム、モリブデン酸塩
等があげられる。The peroxidation active substance used in the method of the present invention is a general term for compounds having peroxidase activity, for example,
Peroxidases derived from plants, animals or microorganisms (EC.
1.11.1.7], hemoglobin, heme, iron oxide, iron chloride, sodium iodide, ammonium iodide, molybdate and the like.
本発明方法によって定量分析を行う際一般に下記によ
って行われる。When performing a quantitative analysis by the method of the present invention, it is generally performed as follows.
反応は塩酸、酢酸、酢酸塩、コハク酸塩、ショウ酸
塩、ホウ酸塩、フタル酸塩、グリシン、バルビタール
塩、グッド（GOOD）等の緩衝剤を組合せてpH2〜８に調
整された緩衝液（0.005〜2mol/l）中で行われる。The reaction is performed in a buffer adjusted to pH 2 to 8 by combining a buffer such as hydrochloric acid, acetic acid, acetate, succinate, succinate, borate, phthalate, glycine, barbital salt, and good (GOOD). (0.005 to 2 mol / l).
化合物（Ｉ）または（II）は0.01μmol/l〜100mol/
l、過酸化水素は10μmol/l〜100mmol/l、過酸化活性物
質は10-9〜２×102mg/ml好ましくはペルオキシダーゼが
10-9〜102U/mlで用いられる。Compound (I) or (II) is 0.01 μmol / l to 100 mol /
l, hydrogen peroxide is 10 μmol / l to 100 mmol / l, and the peroxide active substance is 10 −9 to 2 × 10 2 mg / ml, preferably peroxidase.
Used at 10 -9 to 10 2 U / ml.
これらの３成分の中の測定すべき成分以外の成分を緩
衝液に加えて試薬液とし、これに測定すべき成分を含有
する試料を加えて−10〜90℃、好ましくは20〜50℃で反
応させる。反応液の全発光量あるいは一定時間の発光量
を190〜750nmの波長領域で発光光度計等により測定し、
予め既知量の測定すべき成分含有試料を用いて作成した
検量線を利用して試料中の定量すべき成分を定量するこ
とができる。Components other than the component to be measured among these three components are added to a buffer solution to prepare a reagent solution, and a sample containing the component to be measured is added to the reagent solution at -10 to 90 ° C, preferably 20 to 50 ° C. Let react. The total light emission amount of the reaction solution or the light emission amount for a certain period of time is measured by a light emission photometer or the like in a wavelength region of 190 to 750 nm,
The component to be quantified in the sample can be quantified using a calibration curve prepared using a known amount of the sample containing the component to be measured.
発光量は測定すべき成分の量に対応しているので反応
の終了に伴い測定した積算発光量から定量できるが、一
般に一定時間の積算発光量から計算される。Since the luminescence amount corresponds to the amount of the component to be measured, it can be quantified from the integrated luminescence amount measured at the end of the reaction, but is generally calculated from the integrated luminescence amount for a certain period of time.
測定すべき成分が酵素活性の場合には、発光量の単位
時間当りの変化量を測定することによって目的を達成で
きる。When the component to be measured is an enzyme activity, the object can be achieved by measuring the amount of change in the amount of luminescence per unit time.
本発明方法を実施する際、反応液の濁りの発生防止等
のため、必要に応じて界面活性剤〔例えば、トリトンＸ
−100（米山薬品工業製）〕を、その濃度が0.01〜5wt％
になるように加えることができる。When performing the method of the present invention, a surfactant [for example, Triton X
-100 (manufactured by Yoneyama Pharmaceutical Co., Ltd.)] with a concentration of 0.01 to 5 wt%
Can be added.
発光化合物の発光強度を増強するため、必要に応じて
タンパク質、ポリアルキル４級アミン、蛍光剤、ジメチ
ルスルホキシド等を用いることができる。さらに必要に
応じて、アルカリ溶液を添加することができる。タンパ
ク質としては、例えば、ウシ血清アルブミン（BSA）、
ヒト血清アルブミン（HSA）、ヒト免疫グロブリン、卵
白アルブミン等があげられ、ポリアルキル４級アミンと
しては、例えば、ポリジアリールジメチルアンモニウム
クロライド、ポリ〔ビニルベンジル（ベンジルジメチル
−アンモニウムクロライド）〕等があげられ、蛍光剤と
しては、例えば、フルオレッセイン、４−フルオロ−７
−ニトロベンゾフラザン、７−フルオロ−４−ニトロベ
ンゾキサジアゾールとアミン、アミノ酸、ペプチドまた
はタンパク質との結合物もしくはそれらの誘導体等を使
用することができる。アルカリ溶液としては、例えば、
水酸化ナトリウム、水酸化カリウム等の水溶液を使用す
ることができる。これら発光増強剤は反応液の0.0001〜
10wt％の濃度で用いられる。In order to enhance the emission intensity of the light emitting compound, a protein, a polyalkyl quaternary amine, a fluorescent agent, dimethyl sulfoxide, or the like can be used as necessary. Further, if necessary, an alkaline solution can be added. Examples of proteins include bovine serum albumin (BSA),
Examples include human serum albumin (HSA), human immunoglobulin, ovalbumin, and the like, and examples of polyalkyl quaternary amines include polydiaryldimethylammonium chloride and poly [vinylbenzyl (benzyldimethyl-ammonium chloride)]. Examples of the fluorescent agent include fluorescein and 4-fluoro-7.
A conjugate of -nitrobenzofurazan, 7-fluoro-4-nitrobenzoxadiazole with an amine, amino acid, peptide or protein or a derivative thereof can be used. As the alkaline solution, for example,
An aqueous solution such as sodium hydroxide or potassium hydroxide can be used. These luminescence enhancers are used in an amount of 0.0001 to
Used at a concentration of 10 wt%.
本発明によって定量できる過酸化水素は、試料中に溶
存する過酸化水素のみならず酵素反応によって定量的に
生成する過酸化水素も定量できる。Hydrogen peroxide that can be quantified according to the present invention can quantify not only hydrogen peroxide dissolved in a sample but also hydrogen peroxide that is quantitatively generated by an enzymatic reaction.
定量できる過酸化活性物質としては前述の反応に用い
られる物がいずれも定量できる。As the peroxidative active substance that can be quantified, any substance used in the above-mentioned reaction can be quantified.
本発明は従来診断薬の分野において行われている過酸
化水素またはペルオキシダーゼ活性の測定に適用するこ
とができる。The present invention can be applied to the measurement of hydrogen peroxide or peroxidase activity conventionally performed in the field of diagnostic agents.
従来、例えば生体試料中の基質から酵素を利用して化
学量論的に過酸化水素を生成させ、これを定量すること
による基質の定量が行われている。2. Description of the Related Art Conventionally, for example, hydrogen peroxide is stoichiometrically generated from a substrate in a biological sample using an enzyme, and the amount of the hydrogen peroxide is quantified to quantify the substrate.
また生体試料中の酵素活性を測定するために適当な酵
素や基質を加えて酵素反応を行わせ生成する過酸化水素
の生成速度を測定することによって試料中の酵素活性の
定量が行われている。In addition, in order to measure the enzyme activity in a biological sample, the enzyme activity in the sample is quantified by measuring the rate of hydrogen peroxide generated by performing an enzyme reaction by adding an appropriate enzyme or substrate. .
これらの具体例として、例えば、特異的オキシダーゼ
（例えば、グルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキ
シダーゼ、コレステロールオキシダーゼ、ウリカーゼ
等）反応の基質の定量や、モノアミンオキシダーゼ、コ
リンエステラーゼ等の酵素の活性測定があげられる。Specific examples thereof include quantification of a substrate for a specific oxidase (eg, glucose oxidase, galactose oxidase, cholesterol oxidase, uricase, etc.) reaction, and measurement of the activity of an enzyme such as monoamine oxidase, cholinesterase.
さらに、抗原抗体反応を酵素免疫測定法（EIA法）用
いて定量する際標識物質としてペルオキシダーゼが用い
られ、抗原抗体反応後のペルオキシダーゼ活性またはこ
の活性の作用によって生成させた過酸化水素の定量が行
われている。例えば、酵素免疫測定法（石川榮治ら編、
1987年、医学書院）に記載の各方法、例えば固定化した
抗体に抗原を反応させ、その抗原に例えば、ペルオキシ
ダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素を標識した抗
体を反応させ、該酵素活性自身または該酵素の作用によ
り生成する過酸化水素を定量する方法があげられる。本
発明を該EIA法等に用いることにより、血清、尿等に含
まれる薬物、ホルモンまたは臨床検査の指標物質として
用いられている癌胎児性抗原（CEA）、α−フェトプロ
ティン（AFP）、前立腺酸性フォスファターゼ（PAP）等
生体内微量成分等を測定することが可能である。In addition, when quantifying the antigen-antibody reaction using the enzyme immunoassay (EIA method), peroxidase is used as a labeling substance, and the peroxidase activity after the antigen-antibody reaction or hydrogen peroxide generated by the action of this activity is quantified. Have been done. For example, enzyme immunoassay (Eiji Ishikawa et al.,
1987, Medical Shoin), for example, by reacting an antigen with an immobilized antibody, and reacting the antigen with, for example, an antibody labeled with an enzyme such as peroxidase or glucose oxidase. Of hydrogen peroxide produced by the action of By using the present invention for the EIA method or the like, a carcinoembryonic antigen (CEA), α-fetoprotein (AFP), It is possible to measure in vivo trace components such as acid phosphatase (PAP).
上記に例示される過酸化水素またはペルオキシダーゼ
活性の測定に本発明を適用することによって微量の成分
を定量できる。By applying the present invention to the measurement of hydrogen peroxide or peroxidase activity exemplified above, trace components can be quantified.
さらに化合物（Ｉ）または（II）を標識物質として用
い、抗原抗体反応物を用いて本発明方法による反応を行
わせ、発光量または発光強度を測定することによって抗
原または抗体を定量できる。Further, the compound (I) or (II) is used as a labeling substance, the reaction is carried out by the method of the present invention using an antigen-antibody reactant, and the antigen or antibody can be quantified by measuring the amount or intensity of luminescence.
また、本発明はポリヌクレオチド測定法に応用するこ
とができる。ポリヌクレオチド測定法としては、被検査
ポリヌクレオチドと相補的に結合するポリヌクレオチド
にペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ等の酵素
又は化合物（Ｉ）又は（II）を標識し、被検ポリヌクレ
オチドと相補的に結合した該酵素標識化又は該化合物標
識化ポリヌクレオチドの酵素活性を測定または標識化合
物を定量して被検ポリヌクレオチド量を定量する方法が
あげられる。当該方法は、「DNAプローブ」（ジスク
社、1988年版）、「DNAプローブII」（ジスク社、1990
年版）等に記載されている。Further, the present invention can be applied to a polynucleotide measuring method. As a polynucleotide measuring method, a polynucleotide that complementarily binds to a test polynucleotide is labeled with an enzyme such as peroxidase or glucose oxidase, or a compound (I) or (II), and then complementarily binds to the test polynucleotide. Examples of the method include measuring the enzyme activity of the enzyme-labeled or compound-labeled polynucleotide or quantifying the labeled compound to determine the amount of the test polynucleotide. The method is described in "DNA Probe" (disc, 1988 edition) and "DNA Probe II" (disc, 1990).
Year version).
式（Ｉ）または（II）で表されるクマリン誘導体を用
いる本発明の特徴は、発光を生じるpH範囲がpH1〜10と
広いことであり、特にpH5〜７の酸性〜中性域において
は強い発光量が得られることである。従来用いられてい
たルミノール、イソルミノール、ルシゲニン、アクリジ
ニウムエステル等は強アルカリ条件下でなければ満足の
いく発光量が得られず、ペルオキシダーゼ等の酵素の至
適pHが中性以下の場合は検出が困難であった。本発明方
法を用いることにより、酵素の至適pHが中性以下の場合
でも、その酵素の至適pHでの測定を行うことが可能であ
る。また、これにより至適pHが酸性領域にあり、ルミノ
ール等公知の発光物質を用いた定量法では使えなかった
酸化酵素の使用が可能になる。従って本発明方法の場
合、上記の性質を持つ酵素の活性を測定するとき、酵素
の最も活性の高い領域で行えるので、従来より微量の酵
素でも検出することが可能である。The feature of the present invention using the coumarin derivative represented by the formula (I) or (II) is that the pH range at which light emission occurs is as wide as pH 1 to 10, especially in the acidic to neutral range of pH 5 to 7. That is, a light emission amount can be obtained. Conventionally used luminol, isoluminol, lucigenin, acridinium ester, etc. cannot obtain a satisfactory luminescence amount unless under strong alkaline conditions, and when the optimal pH of an enzyme such as peroxidase is less than neutral, Detection was difficult. By using the method of the present invention, even when the optimum pH of an enzyme is neutral or lower, it is possible to perform measurement at the optimum pH of the enzyme. In addition, this makes it possible to use an oxidase which has an optimum pH in an acidic region and cannot be used in a quantitative method using a known luminescent substance such as luminol. Therefore, in the case of the method of the present invention, when the activity of the enzyme having the above properties is measured, it can be carried out in the region where the enzyme has the highest activity, so that it is possible to detect even a trace amount of the enzyme compared to the conventional method.
図面の簡単な説明 図１は、各種濃度の過酸化水素を用いたときの化合物
1,5,9およびルミノールの発光強度の変化を示す。BRIEF DESCRIPTION OF THE FIGURES FIG. 1 shows compounds using various concentrations of hydrogen peroxide.
The change of the luminescence intensity of 1,5,9 and luminol is shown.
符号の説明 −○− 化合物１ −●− 化合物５ −−□−− 化合物９ −−×−− ルミノール 図２は各種濃度の過酸化水素を用いたときの化合物1
0,12,14,23およびルミノールの発光強度の変化を示す。Explanation of symbols − −− Compound 1 − ● − Compound 5 −− □ −− Compound 9 −− × −− Luminol Figure 2 shows Compound 1 when various concentrations of hydrogen peroxide were used.
5 shows changes in the emission intensity of 0, 12, 14, 23 and luminol.
符号の説明 −●− 化合物10 −−□−− 化合物12 −△− 化合物14 −○− 化合物23 −−×−− ルミノール 図３は各種pHにおける化合物１およびルミノールの発
光強度の変化を示す。Explanation of symbols − ● − Compound 10 −− □ −− Compound 12 − △ − Compound 14 − ○ − Compound 23 −−−−− Luminol FIG. 3 shows changes in the luminescence intensity of Compound 1 and Luminol at various pHs.
符号の説明 −○− 化合物１ −−□−− ルミノール 図４は各種濃度のペルオキシダーゼを用いたときの化
合物１およびルミノールの発光強度の変化を示す。Explanation of reference symbols -O- Compound 1-----------------------------Luminol FIG.
符号の説明 −●− 化合物１ −−□−− ルミノール 図５は各種濃度のCEAを用いたときの化合物１の発光
強度の変化を示す。Explanation of Symbols-●-Compound 1 ---- □-Luminol FIG. 5 shows changes in the emission intensity of Compound 1 when various concentrations of CEA were used.
符号の説明 −●− 化合物１ 図６は各種濃度のAFPを用いたときの化合物35の発光
強度の変化を示す。Explanation of Symbols-●-Compound 1 FIG. 6 shows the change in the emission intensity of Compound 35 when various concentrations of AFP were used.
符号の説明 −○− 化合物35 図７は各種濃度のPAPを用いたときの化合物35の発光
強度の変化を示す。Explanation of Symbols -−- Compound 35 FIG. 7 shows the change in the luminescence intensity of Compound 35 when various concentrations of PAP were used.
符号の説明 −○− 化合物35 図８は各種濃度のBSAを用いたときの化合物31,35およ
びアクリジニウムエステル（アクリジニウム−I:同仁化
学研究所）のBSA無添加時の発光強度に対する比率を示
す。Explanation of Symbols -−- Compound 35 FIG. 8 shows the ratio of the compound 31, 35 and the acridinium ester (acridinium-I: Dojindo Laboratories) to the luminescence intensity without BSA when various concentrations of BSA were used. Show.
符号の説明 −□− 化合物31 −◇− 化合物35 −○− アクリジニウムエステル 発明を実施するための最良の形態 以下に本発明の実施例を示す。DESCRIPTION OF SYMBOLS-□-Compound 31-◇-Compound 35-○-Acridinium ester BEST MODE FOR CARRYING OUT THE INVENTION Examples of the present invention are shown below.
実施例１（ペルオキシダーゼ反応によるクマリン誘導体
を用いる化学発光） 20mmolのリン酸緩衝液（pH6.0）100mlに西洋ワサビ由
来のペルオキシダーゼ（東洋紡績製：以下同じ）100U、
50mgのトリトンＸ−100および第２表に記載のクマリン
誘導体または比較化合物としてのルミノール（東京化成
製：以下同じ）各10mgを溶解し試薬液とした。Example 1 (chemiluminescence using coumarin derivative by peroxidase reaction) 100 U of a horseradish peroxidase (manufactured by Toyobo: same hereafter) in 100 ml of 20 mmol phosphate buffer (pH 6.0),
50 mg of Triton X-100 and 10 mg of each of the coumarin derivatives listed in Table 2 or 10 mg of luminol as a comparative compound (manufactured by Tokyo Chemical Industry; the same applies hereinafter) were dissolved to prepare reagent solutions.
試験管に該試薬液を400μｌとり、37℃に10分間放置
したのち、37℃の恒温状態に保たれた発光光度計（ルミ
カウンター1000:日音医理科器械製作所製：以下同じ）
に装着し3mmol/lの過酸化水素を10μｌおよび1Nの水酸
化ナトリウム水溶液を10μｌ添加し、反応液の１分間の
積算発光量〔発光強度（cpm）〕を測定した。その結果
を第２表に示す。400 μl of the reagent solution is placed in a test tube, left at 37 ° C. for 10 minutes, and then kept at a constant temperature of 37 ° C. by a luminescence photometer (Lumicounter 1000: manufactured by Nichion Medical Science Instrument Co., Ltd .: the same applies hereinafter).
Then, 10 μl of 3 mmol / l hydrogen peroxide and 10 μl of a 1N aqueous solution of sodium hydroxide were added, and the integrated luminescence amount [luminescence intensity (cpm)] of the reaction solution for 1 minute was measured. Table 2 shows the results.
第２表によれば、本実施例に用いたクマリン誘導体
は、過酸化水素の存在下ペルオキシダーゼと反応させる
ことにより、pH6.0においてルミノールと同等かそれ以
上の発光強度を示した。 According to Table 2, the coumarin derivative used in the present example showed a luminescence intensity equal to or higher than that of luminol at pH 6.0 by reacting with oxidase in the presence of hydrogen peroxide.
実施例２（過酸化水素の定量） 20mmolのリン酸緩衝液（pH6.0）100mlにペルオキシダ
ーゼ100U、50mgのトリトンＸ−100、および化合物１、
５、９、10、12、14、23、比較化合物としてルミノール
をそれぞれ10mg溶解し試薬液とした。Example 2 (Quantification of hydrogen peroxide) 100 U of peroxidase, 50 mg of Triton X-100, and compound 1 in 100 ml of 20 mmol phosphate buffer (pH 6.0)
5, 9, 10, 12, 14, 23 and 10 mg of luminol as a comparative compound were each dissolved to prepare a reagent solution.
試験管に該試薬液を400μｌとり、37℃に10分間放置
したのち、37℃の恒温状態に保たれた発光光度計に装着
し各種濃度（５×1011〜２×10-8g/反応液）の過酸化水
素を10μｌおよび1Nの水酸化ナトリウム水溶液を10μｌ
添加し、反応液の１分間の積算発光量を測定した。その
結果を図１および図２に示す。Take 400 μl of the reagent solution in a test tube, leave it at 37 ° C. for 10 minutes, attach it to a luminescence photometer maintained at a constant temperature of 37 ° C., and attach it to various concentrations (5 × 10 11 to 2 × 10 -8 g / reaction). Liquid) and 10 μl of 1N aqueous sodium hydroxide solution
The reaction mixture was added, and the integrated luminescence of the reaction solution for one minute was measured. The results are shown in FIGS.
図１および図２によれば、用いられたクマリン誘導体
はルミノールと同等かそれ以上の発光強度を示した。According to FIGS. 1 and 2, the coumarin derivative used showed an emission intensity equal to or higher than that of luminol.
実施例３（各種pHにおけるペルオキシダーゼ反応による
クマリン誘導体を用いた化学発光の強度） 20mmolフタル酸緩衝液（pH2.5〜5.5）、20mmolリン酸
緩衝液（pH5.5〜8.0）または20mmolホウ酸緩衝液（pH8.
0〜10）各100mlにペルオキシダーゼ100U、トリトンＸ−
100を50mgおよび化合物１または比較化合物としてルミ
ノールをそれぞれ10mg溶解し試薬液とした。Example 3 (Intensity of chemiluminescence using coumarin derivative by peroxidase reaction at various pH) 20 mmol phthalate buffer (pH 2.5 to 5.5), 20 mmol phosphate buffer (pH 5.5 to 8.0) or 20 mmol borate buffer Liquid (pH 8.
0-10) Peroxidase 100U, Triton X-
50 mg of 100 and 10 mg of luminol as the compound 1 or the comparative compound were each dissolved to prepare a reagent solution.
試験管に試薬液を400μｌとり、37℃に10分間放置し
たのち、37℃の恒温状態に保たれた発光光度計に装着し
3mmol/lの過酸化水素を10μｌ添加し、反応液の１分間
の積算発光量を測定した。最大発光量を示したpHにおけ
る発光量を100％としたときの各pHにおける発光量の比
を図３に示す。Take 400 μl of the reagent solution in a test tube, leave it at 37 ° C for 10 minutes, and attach it to a luminescence photometer maintained at a constant temperature of 37 ° C.
10 μl of 3 mmol / l hydrogen peroxide was added, and the integrated luminescence amount of the reaction solution for one minute was measured. FIG. 3 shows the ratio of the luminescence amount at each pH when the luminescence amount at the pH showing the maximum luminescence amount is 100%.
図３によれば、化合物１の至適発光pHは酸性領域にあ
り、ルミノールと比較して極めて広いことが示された。FIG. 3 shows that the optimum luminescence pH of Compound 1 is in an acidic region, which is much wider than that of Luminol.
実施例４（ペルオキシダーゼ活性の測定） 20mmolのリン酸緩衝液（pH6.0）100mlに、50mgのトリ
トンＸ−100、および化合物１または比較化合物として
のルミノール各10mg溶解し試薬液１とした。対照として
100mmolのホウ酸緩衝液（pH9.5）100mlに、50mgのトリ
トンＸ−100およびルミノールを10mg溶解し試薬液２と
した。試験管に試薬液１または試薬液２を400μｌと
り、37℃に10分間放置したのち、37℃の恒温状態に保た
れた発光光度計に装着し300mmol/lの過酸化水素を10μ
ｌおよび各濃度のペルオキシダーゼ溶液を10μｌ添加
し、反応液の１分間の積算発光量を測定した。その結果
を図４に示す。Example 4 (Measurement of peroxidase activity) 50 mg of Triton X-100 and 10 mg of each of compound 1 or luminol as a comparative compound were dissolved in 100 ml of a 20 mmol phosphate buffer (pH 6.0) to obtain a reagent solution 1. As a control
Reagent solution 2 was obtained by dissolving 50 mg of Triton X-100 and 10 mg of luminol in 100 ml of 100 mmol of borate buffer (pH 9.5). Take 400 μl of reagent solution 1 or reagent solution 2 in a test tube, leave it at 37 ° C. for 10 minutes, and attach it to a luminescence photometer kept at a constant temperature of 37 ° C., and add 300 μm / l of hydrogen peroxide at 10 μl.
and 10 μl of a peroxidase solution of each concentration were added, and the integrated luminescence amount of the reaction solution for one minute was measured. FIG. 4 shows the results.
図４によれば、化合物１を用いた場合、ルミノールを
用いた場合より低濃度でペルオキシダーゼ活性の検量線
が得られた。According to FIG. 4, a calibration curve of peroxidase activity was obtained at a lower concentration when compound 1 was used than when luminol was used.
実施例５〔癌胎児性抗原（CEA）の定量〕 （１） ウサギ抗ヒトCEA抗体のグルコースオキシダー
ゼ（GOD）による標識化 抗CEA抗体に対するGODの標識は石川らの方法（酸素免
疫測定法、82頁、石川榮治ら編、1987年、医学書院刊）
に従って作成した。すなわち、Ｎ−サクシニミジル−４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート〔ピアス（PIERCE）社製〕を用いてGODに
マレイミド基を導入した。一方抗CEA抗体をペプシン消
化して得られたＦ（ab′）２画分を還元し、SH基を遊離
させたＦ（ab′）を調製した。両者を混合し反応させ、
GOD標識抗CEA抗体を得た。Example 5 [Quantification of carcinoembryonic antigen (CEA)] (1) Labeling of rabbit anti-human CEA antibody with glucose oxidase (GOD) GOD labeling of anti-CEA antibody was carried out according to the method of Ishikawa et al. Page, edited by Eiji Ishikawa et al., 1987, published by the Medical School.)
Created according to. That is, N-succinimidyl-4
A maleimide group was introduced into the GOD using-(N-maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (manufactured by PIERCE). On the other hand, the F (ab ') 2 fraction obtained by digesting the anti-CEA antibody with pepsin was reduced to prepare F (ab') from which the SH group was released. Mix and react both,
GOD-labeled anti-CEA antibody was obtained.
（２） 抗CEA抗体固定化磁性粒子の調製 磁性粒子としてマグノスフェア〔（Magnosphere:商品
名）ステロジェンバイオセパレーション社製、以下同
じ〕を抗CEA抗体固定化磁性粒子に使用した。0.1molリ
ン酸緩衝液（pH7.0）に溶解した抗CEA抗体溶液を該微粒
子に等量添加し、カップリング試薬である水素化ホウ素
ナトリウムを終濃度0.1molになるように添加し、２時間
攪拌し反応させた。磁石で粒子を集め、上清を吸引除去
後、0.1％BSAおよび0.1％NaN3を含むリン酸緩衝液を500
μｌ加え抗CEA抗体固定化磁性粒子として保存した。(2) Preparation of anti-CEA antibody-immobilized magnetic particles Magnosphere ((Magnosphere: trade name, manufactured by Sterogen Bioseparation Co., Ltd .; the same applies hereinafter)) was used as the anti-CEA antibody-immobilized magnetic particles. An equal amount of an anti-CEA antibody solution dissolved in 0.1 mol phosphate buffer (pH 7.0) is added to the fine particles, and sodium borohydride as a coupling reagent is added to a final concentration of 0.1 mol, and the mixture is added for 2 hours. The mixture was stirred and reacted. After collecting the particles with a magnet and removing the supernatant by suction, 500 μl of phosphate buffer containing 0.1% BSA and 0.1% NaN 3 was added.
μl was added and stored as anti-CEA antibody-immobilized magnetic particles.
（３） CEAの定量 20mmolのリン酸緩衝液（pH6.0）100mlにペルオキシダ
ーゼ100U、50mgのトリトンＸ−100および化合物１を10m
g溶解し試薬液とした。試験管に試薬液を400μｌとり、
37℃に10分間放置したのち、37℃の恒温状態に保たれた
発光光度計に装着した。別に、各濃度の標準CEAを50μ
ｌ、抗CEA抗体固定化磁性粒子を100μｌ、GOD標識抗CEA
抗体を100μｌ混合し、37℃にて１時間反応させ、CEAを
GOD標識抗CEA抗体および抗CEA抗体固体化磁性粒子に結
合させた。磁石で粒子を集め、上清を吸引除去後、CEA
と結合したGODの基質として10mmolのクエン酸緩衝液（p
H5.0）に54mg/mlの濃度でグルコースを溶解した液100μ
ｌを加え37℃にて30分反応させた後、停止液として50mm
olグリシン緩衝液（pH11.0）を100μｌ添加した。磁石
で粒子を分離し、この液の上清10μｌを発光光度計に装
着しておいた試薬液に添加し１分間の積算発光量を測定
した。その結果を図５に示す。(3) Quantification of CEA 100 U of peroxidase, 50 mg of Triton X-100 and compound 1 were added to 100 ml of a 20 mmol phosphate buffer (pH 6.0) in 100 ml.
g was dissolved to give a reagent solution. Take 400 μl of the reagent solution into a test tube,
After being left at 37 ° C. for 10 minutes, it was attached to a luminescence photometer maintained at a constant temperature of 37 ° C. Separately, add 50 μl of standard CEA at each concentration.
l, 100 μl of anti-CEA antibody-immobilized magnetic particles, GOD-labeled anti-CEA
100 μl of the antibody was mixed and reacted at 37 ° C. for 1 hour.
GOD-labeled anti-CEA antibody and anti-CEA antibody were bound to solidified magnetic particles. After collecting the particles with a magnet and removing the supernatant by suction, CEA
10 mmol citrate buffer (p
H5.0) in which glucose was dissolved at a concentration of 54 mg / ml, 100μ
After the reaction at 37 ° C for 30 minutes, 50 mm
100 μl of ol glycine buffer (pH 11.0) was added. The particles were separated with a magnet, and 10 μl of the supernatant of this solution was added to the reagent solution mounted on the luminometer, and the integrated luminescence amount for one minute was measured. The result is shown in FIG.
実施例６（ペルオキシダーゼ反応によるクマリン誘導体
を用いる化学発光） 20mmolの酢酸緩衝液（pH4.0）100mlにペルオキシダー
ゼ100U、50mgのトリトンＸ−100および第３表に記載の
クマリン誘導体または比較化合物としてのルミノール各
10mgを溶解し試薬液とした。Example 6 (chemiluminescence using coumarin derivative by peroxidase reaction) 100 U of peroxidase, 50 mg of triton X-100 in 100 ml of 20 mmol acetate buffer (pH 4.0) and coumarin derivative shown in Table 3 or luminol as a comparative compound each
10 mg was dissolved to prepare a reagent solution.
試験管に該試薬液を400μｌとり、37℃に10分間放置
したのち、37℃の恒温状態に保たれた発光光度計に装着
し3mmol/lの過酸化水素を10μｌおよび1Nの水酸化ナト
リウム水溶液を10μｌ添加し、反応液の１分間の積算発
光量を測定した。その結果を第３表に示す。Take 400 μl of the reagent solution in a test tube, leave it at 37 ° C. for 10 minutes, attach it to an emission photometer kept at a constant temperature of 37 ° C., attach 10 μl of 3 mmol / l hydrogen peroxide and 1N aqueous sodium hydroxide solution. Was added, and the integrated luminescence amount of the reaction solution for one minute was measured. Table 3 shows the results.
第３表によれば、本実施例に用いたクマリン誘導体
は、ペルオキシダーゼの存在下、過酸化水素と反応させ
ることにより、pH4.0の酸性条件においてもルミノール
をはるかに上回る発光強度を示した。 According to Table 3, the coumarin derivative used in this example showed a luminescence intensity far higher than that of luminol even under acidic conditions of pH 4.0 by reacting with hydrogen peroxide in the presence of peroxidase.
実施例７（クマリン誘導体を用いる化学発光によるクマ
リン誘導体の定量） 20mmolの酢酸緩衝液（pH4.0）または20mmolのリン酸
緩衝液（pH6.0）100mlにペルオキシダーゼ100U、50mgの
トリトンＸ−100および第４表に記載のクマリン誘導体
を所定の濃度に溶解し試薬液とした。Example 7 (Quantification of coumarin derivative by chemiluminescence using coumarin derivative) In 100 ml of 20 mmol acetate buffer (pH 4.0) or 20 mmol phosphate buffer (pH 6.0), 100 U of peroxidase, 50 mg of Triton X-100 and The coumarin derivatives shown in Table 4 were dissolved at a predetermined concentration to prepare a reagent solution.
試験管に該試薬液を400μｌとり、37℃に10分間放置
したのち、37℃の恒温状態に保たれた発光光度計に装着
し、3mmol/lの過酸化水素を10μｌ添加し、反応液の１
分間の積算発光量を測定した。その結果を第４表に示
す。Take 400 μl of the reagent solution in a test tube, leave it at 37 ° C. for 10 minutes, attach it to an emission photometer kept at a constant temperature of 37 ° C., add 10 μl of 3 mmol / l hydrogen peroxide, and add the reaction solution. 1
The integrated light emission amount per minute was measured. Table 4 shows the results.
第４表によれば、化合物31および化合物35を筆頭に、
化合物4,5,8,9,12,23,32,33,42,46,47,49および50自体
は極めて低い濃度まで化学発光法によって定量すること
ができることが判る。 According to Table 4, compound 31 and compound 35 are the leading,
It can be seen that compounds 4, 5, 8, 9, 12, 23, 32, 33, 42, 46, 47, 49 and 50 themselves can be quantified by chemiluminescence to very low concentrations.
実施例８〔α−フェトプロテイン（AFP）の定量〕 （１） ヤギ抗ヒトAFP抗体の化合物35による標識化 抗AFP抗体に対する化合物35の標識体は次のようにし
て作製した。すなわち、化合物35の有するカルボキシル
基と抗AFP抗体の有するアミノ基とを１−エチル−３−
（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（以下
EDC）を用いてpH7.0にて反応、結合させ、化合物35標識
抗AFP抗体を得た。Example 8 [Quantification of α-fetoprotein (AFP)] (1) Labeling of goat anti-human AFP antibody with compound 35 A labeled compound of compound 35 for anti-AFP antibody was prepared as follows. That is, the carboxyl group of the compound 35 and the amino group of the anti-AFP antibody were combined with 1-ethyl-3-
(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (hereinafter referred to as
The mixture was reacted and bound at pH 7.0 using EDC) to obtain a compound 35-labeled anti-AFP antibody.
（２） 抗AFP抗体固定化磁性粒子の調製 磁性粒子としてマグノスフェアを抗AFP抗体固定化磁
性粒子に使用した。0.1molリン酸緩衝液（pH7.0）に溶
解した抗AFP抗体溶液を該微粒子に等量添加し、カップ
リング試薬である水素化ホウ素ナトリウムを終濃度0.1m
olになるように添加し、２時間攪拌し反応させた。磁石
で粒子を集め、上清を吸引除去後、0.1％BSAおよび0.1
％NaN3を含むリン酸緩衝液を500μｌ加え抗AFP抗体固定
化磁性粒子として保存した。(2) Preparation of anti-AFP antibody-immobilized magnetic particles Magnosphere was used as anti-AFP antibody-immobilized magnetic particles as magnetic particles. An equal amount of an anti-AFP antibody solution dissolved in 0.1 mol phosphate buffer (pH 7.0) was added to the fine particles, and sodium borohydride as a coupling reagent was added to a final concentration of 0.1 m
ol, and the mixture was stirred and reacted for 2 hours. After collecting the particles with a magnet and removing the supernatant by suction, 0.1% BSA and 0.1%
500 μl of a phosphate buffer solution containing% NaN 3 was added and stored as anti-AFP antibody-immobilized magnetic particles.
（３） AFPの定量 20mmolの酢酸緩衝液（pH4.0）100mlにペルオキシダー
ゼ100Uおよび50mgのトリトンＸ−100を溶解し試薬液と
した。別に、各濃度の標準AFPを50μｌ、抗AFP抗体固定
化磁性粒子を100μｌ、化合物35標識抗AFP抗体を100μ
ｌ混合し、37℃にて１時間反応させ、AFPを化合物35標
識抗AFP抗体および抗AFP抗体固定化磁性粒子に結合させ
た。磁石で粒子を集め、上清を吸引除去後、37℃の恒温
状態に保たれた発光光度計に装着し、予め37℃に保温し
た試薬液400μｌおよび3mmol/lの過酸化水素を20μｌ添
加し、反応液の１分間の積算発光量を測定した。その結
果を図６に示す。(3) Determination of AFP A reagent solution was prepared by dissolving 100 U of peroxidase and 50 mg of Triton X-100 in 100 ml of 20 mmol acetate buffer (pH 4.0). Separately, 50 μl of standard AFP at each concentration, 100 μl of anti-AFP antibody-immobilized magnetic particles, and 100 μl of compound 35-labeled anti-AFP antibody
After mixing and reacting at 37 ° C. for 1 hour, AFP was bound to compound 35-labeled anti-AFP antibody and anti-AFP antibody-immobilized magnetic particles. The particles were collected by a magnet, and the supernatant was removed by suction.Then, the sample was attached to an emission photometer maintained at a constant temperature of 37 ° C., and 400 μl of a reagent solution preliminarily maintained at 37 ° C. and 20 μl of 3 mmol / l hydrogen peroxide were added. The integrated luminescence amount of the reaction solution for one minute was measured. FIG. 6 shows the result.
実施例９〔前立腺酸性フォスファターゼ（PAP）の定
量〕 （１） ヤギ抗ヒトPAP抗体の化合物35による標識化 抗PAP抗体に対する化合物35の標識体は次のようにし
て作製した。すなわち、50mgの化合物35をジオキサン10
mlに溶解し、EDC 75mgおよびＮ−ヒドロキシコハク酸
イミド50mgを添加後、室温にて24時間攪拌し、反応液を
濃縮乾固した。固形分を酢酸エチル／水にて抽出し、有
機層を濃縮乾固した。これをジオキサン10mlに再溶解
し、β−アラニン50mgを添加して室温にて４時間反応
後、濃縮乾固し、固形分を得た。Example 9 [Quantification of prostatic acid phosphatase (PAP)] (1) Labeling of goat anti-human PAP antibody with compound 35 A labeled compound of anti-PAP antibody with compound 35 was prepared as follows. That is, 50 mg of compound 35 was added to dioxane 10
The mixture was dissolved in 50 ml, and added with 75 mg of EDC and 50 mg of N-hydroxysuccinimide, stirred at room temperature for 24 hours, and concentrated to dryness. The solid was extracted with ethyl acetate / water, and the organic layer was concentrated to dryness. This was redissolved in 10 ml of dioxane, 50 mg of β-alanine was added, and the mixture was reacted at room temperature for 4 hours, and concentrated to dryness to obtain a solid.
上記固形分とヤギ抗ヒトPAP抗体とをEDCを用いてpH7.
0にて反応、結合させ、化合物35標識抗PAP抗体を得た。The solid content and the goat anti-human PAP antibody were adjusted to pH 7.
Reaction and binding were performed at 0 to obtain a compound 35-labeled anti-PAP antibody.
（２） 抗PAP抗体固定化磁性粒子の調製 磁性粒子としてマグノスフェアを抗PAP抗体固定化磁
性粒子に使用した。0.1molリン酸緩衝液（pH7.0）に溶
解した抗PAP抗体溶液を該微粒子に等量添加し、カップ
リング試薬である水素化ホウ素ナトリウムを終濃度0.1m
olになるように添加し、２時間攪拌し反応させた。磁石
で粒子を集め、上清を吸引除去後、0.1％BSAおよび0.1
％NaN3を含むリン酸緩衝液を500μｌ加えた抗PAP固体固
定化磁性粒子として保存した。(2) Preparation of anti-PAP antibody-immobilized magnetic particles Magnosphere was used as anti-PAP antibody-immobilized magnetic particles as magnetic particles. An equivalent amount of an anti-PAP antibody solution dissolved in 0.1 mol phosphate buffer (pH 7.0) is added to the fine particles, and sodium borohydride as a coupling reagent is added to a final concentration of 0.1 m
ol, and the mixture was stirred and reacted for 2 hours. After collecting the particles with a magnet and removing the supernatant by suction, 0.1% BSA and 0.1%
It was stored as anti-PAP solid immobilized magnetic particles to which 500 μl of a phosphate buffer containing% NaN 3 was added.
（３） PAPの定量 20mmolの酢酸緩衝液（pH4.0）100mlにペルオキシダー
ゼ100Uおよび50mgのトリトンＸ−100を溶解し試薬液と
した。別に、各濃度の標準PAPを50μｌ、抗PAP抗体固定
化磁性粒子を100μｌ、化合物35標識抗PAP抗体を100μ
ｌ混合し、37℃にて１時間反応させ、PAPを化合物35標
識抗PAP抗体および抗PAP抗体固定化磁性粒子に結合させ
た。磁石で粒子を集め、上清を吸引除去後37℃の恒温状
態に保たれた発光光度計に装着し、予め37℃に保温した
試薬液400μｌおよび3mmol/lの過酸化水素を20μｌ添加
し、反応液の１分間の積算発光量を測定した。その結果
を図７に示す。(3) Determination of PAP 100 U of peroxidase and 50 mg of Triton X-100 were dissolved in 100 ml of 20 mM acetate buffer (pH 4.0) to prepare a reagent solution. Separately, 50 μl of standard PAP at each concentration, 100 μl of anti-PAP antibody-immobilized magnetic particles, and 100 μl of compound 35-labeled anti-PAP antibody
After mixing and reacting at 37 ° C. for 1 hour, PAP was bound to the compound 35-labeled anti-PAP antibody and the magnetic particles immobilized with the anti-PAP antibody. The particles were collected by a magnet, the supernatant was removed by suction, attached to an emission photometer maintained at a constant temperature of 37 ° C., and 400 μl of a reagent solution previously heated to 37 ° C. and 20 μl of 3 mmol / l hydrogen peroxide were added. The integrated luminescence amount of the reaction solution for one minute was measured. FIG. 7 shows the result.
実施例10（タンパク質の影響） 20mmolの酢酸緩衝液（pH4.0）100mlにペルオキシダー
ゼ100U、50mgのトリトンＸ−100および化合物31または
化合物35を10mg溶解し、それぞれ試薬液とした。Example 10 (Effect of Protein) 100 U of peroxidase, 50 mg of Triton X-100, and 10 mg of Compound 31 or Compound 35 were dissolved in 100 mL of 20 mmol acetate buffer (pH 4.0) to prepare reagent solutions.
対照化合物として、20mmolのリン酸緩衝液（pH6.0）1
00mlに50mgのトリトンＸ−100およびアクリジニウムエ
ステル（アクリジニウム−I:同仁化学研究所）0.1mgを
溶解し試薬液とした。As a control compound, 20 mmol phosphate buffer (pH 6.0) 1
50 mg of Triton X-100 and 0.1 mg of acridinium ester (acridinium-I: Dojindo Laboratories) were dissolved in 00 ml to prepare a reagent solution.
各試薬液に所定の濃度のBSAを添加し、この試薬液を
試験管に400μｌとり、37℃に10分間放置したのち、37
℃の恒温状態に保たれた発光光度計に装着した。化合物
31または化合物35の場合は、3mmol/lの過酸化水素を10
μｌ、アクリジニウムエステルの場合は3mmol/lの過酸
化水素を10μｌおよび1Nの水酸化ナトリウム水溶液を10
μｌ添加し、反応液の１分間の積算発光量を測定した。
その結果を図８に示す。A predetermined concentration of BSA is added to each reagent solution, 400 μl of this reagent solution is placed in a test tube, and left at 37 ° C. for 10 minutes.
It was mounted on a luminescence photometer maintained at a constant temperature of ° C. Compound
In the case of 31 or compound 35, 3 mmol / l hydrogen peroxide is added to 10
μl, in the case of acridinium ester, 10 μl of 3 mmol / l hydrogen peroxide and 10 μl of 1N aqueous sodium hydroxide solution.
μl was added, and the integrated luminescence amount of the reaction solution for one minute was measured.
FIG. 8 shows the result.
図８によりば、アクリジニウムエステルに比較して、
化合物31および化合物35は共存するBSAの影響を極めて
うけにくいことが判る。According to FIG. 8, compared to the acridinium ester,
It can be seen that Compound 31 and Compound 35 are extremely unlikely to be affected by coexisting BSA.
発明の効果 本発明のクマリン誘導体を用いる化学発光方法によれ
ば、反応液のpHが中性から酸性側であっても微量の過酸
化水素、過酸化活性物質もしくはクマリン誘導体、また
は過酸化活性物質、酸化酵素もしくはクマリン誘導体を
化学結合させた物質（例えば、CEA,AFP,PAP等）をタン
パク質の影響をほとんど受けることなく定量できる。Effects of the Invention According to the chemiluminescence method using the coumarin derivative of the present invention, even when the pH of the reaction solution is from neutral to acidic, a trace amount of hydrogen peroxide, a peroxide active substance or a coumarin derivative, or a peroxide active substance In addition, a substance (for example, CEA, AFP, PAP, etc.) to which an oxidase or a coumarin derivative is chemically bonded can be quantified almost without being affected by proteins.
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12Q 1/28 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continued on the front page (58) Field surveyed (Int.Cl. 6 , DB name) C12Q 1/28 CA (STN) REGISTRY (STN)
Claims (15)
くは非置換のアミノのとき、R1、R2、R3、R4およびR6は
同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の
低級アルキル、低級アルコキシ、置換もしくは非置換の
アリール、ハロゲン原子、シアノ、カルボキシ、アルコ
キシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールカルバ
モイル、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアミノ、低
級アルカノイルまたは複素環基を表すかまたはR1とR2が
一緒になってアルキレンもしくはアルケニレンを形成す
るか、またはR4とR5が一緒になって−CH2CH2CH2NH−を
形成し、 R5がヒドロキシのとき、R1は、置換もしくは非置換の低
級アルキル、置換もしくは非置換のアリール、ハロゲン
原子、カルボキシまたは複素環基、R2は、置換もしくは
非置換の低級アルキル、R3は水素原子、R4は水素原子ま
たはアルコキシおよびR6は水素原子、置換もしくは非置
換のアルキルまたは置換もしくは非置換アミノを表す）
で表されるクマリン誘導体またはその塩を、過酸化活性
物質の存在下に反応させ、反応液の発光量または発光強
度を測定することを特徴とする過酸化活性物質、過酸化
水素または式（Ｉ）もしくは式（II）で表されるクマリ
ン誘導体またはその塩の定量方法。1. Hydrogen peroxide and a compound of the formula (I) Or formula (II) (Wherein, when R 5 is lower alkoxy, nitro, or substituted or unsubstituted amino, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 6 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted Represents lower alkyl, lower alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, halogen atom, cyano, carboxy, alkoxycarbonyl, substituted or unsubstituted arylcarbamoyl, hydroxy, substituted or unsubstituted amino, lower alkanoyl or heterocyclic group, or or R 1 and R 2 together form an alkylene or alkenylene, or R 4 and R 5 together form a -CH 2 CH 2 CH 2 NH-, when R 5 is hydroxy, R 1 is a substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted aryl, halogen atom, carboxy, or a heterocyclic group, R 2 is a substituted or unsubstituted Lower alkyl, R 3 is a hydrogen atom, R 4 is a hydrogen atom or an alkoxy, and R 6 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl or substituted or unsubstituted amino)
A coumarin derivative or a salt thereof is reacted in the presence of a peroxide active substance, and the luminescence amount or luminescence intensity of the reaction solution is measured. ) Or a method for quantifying a coumarin derivative represented by the formula (II) or a salt thereof.
しくは非置換のアリール、シアノ、低級アルコキシ、カ
ルボキシ、アルコキシカルボニル、低級アルカノイルま
たは複素環基であり、R2、R3、R4および６は同一または
異なって、水素原子または置換もしくは非置換の低級ア
ルキルであり、R5は置換もしくは非置換のアミノ、ニト
ロ、低級アルコキシであり、またはR1とR2が一緒になっ
てアルキレンもしくはアルケニレンを形成するか、また
はR4とR5が一緒になって−CH2CH2CH2NH−を形成するも
のである請求項１記載の定量方法。2. In the formula (I), R 1 is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted aryl, cyano, lower alkoxy, carboxy, alkoxycarbonyl, lower alkanoyl or heterocyclic group, and R 2 , R 3 , R 4 and 6 are the same or different and are a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted lower alkyl, R 5 is a substituted or unsubstituted amino, nitro, lower alkoxy, or R 1 and R 2 together or form an alkylene or alkenylene, or R 4 and quantification method of claim 1, wherein R 5 together and forms a -CH 2 CH 2 CH 2 NH-.
コキシカルボニル、カルボキシ、水素原子、低級アルコ
キシ、置換もしくは非置換のアリール、低級アルカノイ
ル、複素環基であり、R2およびR3は同一または異なっ
て、水素、置換もしくは非置の換低級アルキルであり、
またはR1とR2が一緒になって、アルキレンまたはアルケ
ニレンを形成するものである請求項１記載の定量方法。3. In the formula (II), R 1 is cyano, lower alkoxycarbonyl, carboxy, hydrogen atom, lower alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, lower alkanoyl, heterocyclic group, and R 2 and R 3 are The same or different, hydrogen, substituted or unsubstituted substituted lower alkyl,
Or the method of claim 1 , wherein R 1 and R 2 together form alkylene or alkenylene.
換のアリールまたはシアノであり、R2、R3、R4およびR6
が同一または異なって水素原子または置換もしくは非置
換の低級アルキルであり、R5が置換もしくは非置換のア
ミノ、ニトロまたは低級アルコキシである請求項１記載
の定量方法。4. In the formula (I), R 1 is a substituted or unsubstituted aryl or cyano, and R 2 , R 3 , R 4 and R 6
Is the same or different and is a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted lower alkyl, and R 5 is a substituted or unsubstituted amino, nitro or lower alkoxy.
シカルボニルまたはカルボキシであり、R2およびR3が水
素原子である請求項１記載の定量方法。5. The method according to claim 1, wherein in the formula (II), R 1 is cyano, alkoxycarbonyl or carboxy, and R 2 and R 3 are hydrogen atoms.
求項１記載の定量方法。6. The method according to claim 1, wherein the component to be determined is a peroxide active substance.
請求項６記載の定量方法。7. The method according to claim 6, wherein the peroxidation active substance is peroxidase.
されている請求項７記載の定量方法。8. The method according to claim 7, wherein the peroxidase is labeled on an antigen or an antibody.
１記載の定量方法。9. The method according to claim 1, wherein the component to be determined is hydrogen peroxide.
９記載の定量方法。10. The method according to claim 9, wherein the hydrogen peroxide is derived from an enzymatic reaction.
くは非置換のアミノのとき、R1、R2、R3、R4およびR6は
同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の
低級アルキル、低級アルコキシ、置換もしくは非置換の
アリール、ハロゲン原子、シアノ、カルボキシ、アルコ
キシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールカルバ
モイル、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアミノ、低
級アルカノイルまたは複素環基を表すかまたはR1とR2が
一緒になってアルキレンもしくはアルケニレンを形成す
るか、またはR4とR5が一緒になって、CH2CH2CH2NH−を
形成し、 R5がヒドロキシのとき、R1は、置換もしくは非置換の低
級アルキル、置換もしくは非置換のアリール、ハロゲン
原子、カルボキシまたは複素環基、R2は、置換もしくは
非置換の低級アルキル、R3は水素原子、R4は水素原子ま
たはアルコキシおよびR6は水素原子、置換もしくは非置
換のアルキルまたは置換もしくは非置換アミノを表す）
で表されるクマリン誘導体またはその塩および過酸化活
性物質からなる、発光量または発光強度測定法による過
酸化水素定量用試薬。11. The formula (I) Or formula (II) (Wherein, when R 5 is lower alkoxy, nitro, or substituted or unsubstituted amino, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 6 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted Represents lower alkyl, lower alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, halogen atom, cyano, carboxy, alkoxycarbonyl, substituted or unsubstituted arylcarbamoyl, hydroxy, substituted or unsubstituted amino, lower alkanoyl or heterocyclic group, or or R 1 and R 2 together form an alkylene or alkenylene, or R 4 and R 5 together, CH 2 CH 2 CH 2 NH- to form, when R 5 is hydroxy, R 1 is a substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted aryl, halogen atom, carboxy, or a heterocyclic group, R 2 is a substituted or unsubstituted Lower alkyl, R 3 is a hydrogen atom, R 4 is a hydrogen atom or an alkoxy, and R 6 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl or substituted or unsubstituted amino)
A reagent for quantitatively determining hydrogen peroxide by a luminescence amount or luminescence intensity measurement method, comprising a coumarin derivative or a salt thereof represented by the formula:
くは非置換のアミノのとき、R1、R2、R3、R4およびR6は
同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の
低級アルキル、低級アルコキシ、置換もしくは非置換の
アリール、ハロゲン原子、シアノ、カルボキシ、アルコ
キシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールカルバ
モイル、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアミノ、低
級アルカノイルまたは複素環基を表すかまたはR1とR2が
一緒になってアルキレンもしくはアルケニレンを形成す
るか、またはR4とR5が一緒になって−CH2CH2CH2NH−を
形成し、 R5がヒドロキシのとき、R1は、置換もしくは非置換の低
級アルキル、置換もしくは非置換のアリール、ハロゲン
原子、カルボキシまたは複素環基、R2は、置換もしくは
非置換の低級アルキル、R3は水素原子、R4は水素原子ま
たはアルコキシおよびR6は水素原子、置換もしくは非置
換のアルキルまたは置換もしくは非置換アミノを表す）
で表されるクマリン誘導体またはその塩および過酸化水
素からなる、発光量または発光強度測定法による過酸化
活性物質定量用試薬。12. The formula (I) Or formula (II) (Wherein, when R 5 is lower alkoxy, nitro, or substituted or unsubstituted amino, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 6 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted Represents lower alkyl, lower alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, halogen atom, cyano, carboxy, alkoxycarbonyl, substituted or unsubstituted arylcarbamoyl, hydroxy, substituted or unsubstituted amino, lower alkanoyl or heterocyclic group, or or R 1 and R 2 together form an alkylene or alkenylene, or R 4 and R 5 together form a -CH 2 CH 2 CH 2 NH-, when R 5 is hydroxy, R 1 is a substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted aryl, halogen atom, carboxy, or a heterocyclic group, R 2 is a substituted or unsubstituted Lower alkyl, R 3 is a hydrogen atom, R 4 is a hydrogen atom or an alkoxy, and R 6 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl or substituted or unsubstituted amino)
A reagent for quantifying a peroxide active substance by a luminescence amount or luminescence intensity measurement method, comprising a coumarin derivative represented by the formula (1) or a salt thereof and hydrogen peroxide.
る、発光量または発光強度測定法による式（Ｉ） または式（II） （式中、R5が低級アルコキシ、ニトロ、または置換もし
くは非置換のアミノのとき、R1、R2、R3、R4およびR6は
同一または異なって、水素原子、置換もしくは非置換の
低級アルキル、低級アルコキシ、置換もしくは非置換の
アリール、ハロゲン原子、シアノ、カルボキシ、アルコ
キシカルボニル、置換もしくは非置換のアリールカルバ
モイル、ヒドロキシ、置換もしくは非置換のアミノ、低
級アルカノイルまたは複素環基を表すかまたはR1とR2が
一緒になってアルキレンもしくはアルケニレンを形成す
るか、またはR4とR5が一緒になって−CH2CH2CH2NH−を
形成し、 R5がヒドロキシのとき、R1は、置換もしくは非置換の低
級アルキル、置換もしくは非置換のアリール、ハロゲン
原子、カルボキシまたは複素環基、R2は、置換もしくは
非置換の低級アルキル、R3は水素原子、R4は水素原子ま
たはアルコキシおよびR6は水素原子、置換もしくは非置
換のアルキルまたは置換もしくは非置換アミノを表す）
で表されるクマリン誘導体またはその塩の定量用試薬。13. A compound of formula (I) comprising a peroxide active substance and hydrogen peroxide, which is determined by a method for measuring the amount or intensity of luminescence. Or formula (II) (Wherein, when R 5 is lower alkoxy, nitro, or substituted or unsubstituted amino, R 1 , R 2 , R 3 , R 4 and R 6 are the same or different and each represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted Represents lower alkyl, lower alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, halogen atom, cyano, carboxy, alkoxycarbonyl, substituted or unsubstituted arylcarbamoyl, hydroxy, substituted or unsubstituted amino, lower alkanoyl or heterocyclic group, or or R 1 and R 2 together form an alkylene or alkenylene, or R 4 and R 5 together form a -CH 2 CH 2 CH 2 NH-, when R 5 is hydroxy, R 1 is a substituted or unsubstituted lower alkyl, substituted or unsubstituted aryl, halogen atom, carboxy, or a heterocyclic group, R 2 is a substituted or unsubstituted Lower alkyl, R 3 is a hydrogen atom, R 4 is a hydrogen atom or an alkoxy, and R 6 represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl or substituted or unsubstituted amino)
A reagent for quantifying a coumarin derivative or a salt thereof represented by the formula:
もしくは非置換のアリール、シアノ、低級アルコキシ、
カルボキシ、アルコキシカルボニル、低級アルカノイル
または複素環基であり、R2、R3、R4および６は同一また
は異なって、水素原子または置換もしくは非置換の低級
アルキルであり、R5は置換もしくは非置換のアミノ、ニ
トロ、低級アルコキシであり、またはR1とR2が一緒にな
ってアルキレンもしくはアルケニレンを形成するか、ま
たはR4とR5が一緒になって−CH2CH2CH2NH−を形成する
ものである請求項11、12または13に記載の定量試薬。14. In the formula (I), R 1 is a hydrogen atom, substituted or unsubstituted aryl, cyano, lower alkoxy,
A carboxy, alkoxycarbonyl, lower alkanoyl or heterocyclic group, R 2 , R 3 , R 4 and 6 are the same or different and are a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted lower alkyl, and R 5 is substituted or unsubstituted amino, nitro, lower alkoxy, or R 1 and one R 2 form an alkylene or alkenylene together, or R 4 and R 5 together with -CH 2 CH 2 CH 2 NH- 14. The quantitative reagent according to claim 11, 12 or 13, which is formed.
ルコキシカルボニル、カルボキシ、水素原子、低級アル
コキシ、置換もしくは非置換のアリール、低級アルカノ
イル、複素環基であり、R2およびR3は同一または異なっ
て、水素、置換もしくは非置の換低級アルキルであり、
またはR1とR2が一緒になって、アルキレンまたはアルケ
ニレンを形成するものである請求項11、12または13に記
載の定量試薬。15. In the formula (II), R 1 is cyano, lower alkoxycarbonyl, carboxy, hydrogen atom, lower alkoxy, substituted or unsubstituted aryl, lower alkanoyl, heterocyclic group, and R 2 and R 3 are The same or different, hydrogen, substituted or unsubstituted substituted lower alkyl,
14. The quantification reagent according to claim 11, 12 or 13, wherein R 1 and R 2 are combined to form an alkylene or an alkenylene.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP5513100A JP2980681B2 (en) | 1992-02-04 | 1993-02-03 | Determination of substances using coumarin derivatives |
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP1904392 | 1992-02-04 | ||
| JP4-19043 | 1992-02-04 | ||
| PCT/JP1993/000128 WO1993015219A1 (en) | 1992-02-04 | 1993-02-03 | Method of quantitative determination of substance with coumarin derivative |
| JP5513100A JP2980681B2 (en) | 1992-02-04 | 1993-02-03 | Determination of substances using coumarin derivatives |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
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ID=26355836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP5513100A Expired - Lifetime JP2980681B2 (en) | 1992-02-04 | 1993-02-03 | Determination of substances using coumarin derivatives |
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| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2980681B2 (en) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008528965A (en) * | 2005-01-26 | 2008-07-31 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ，インコーポレイティド | Coumarin-based cyanine dyes for nonspecific protein binding |
-
1993
- 1993-02-03 JP JP5513100A patent/JP2980681B2/en not_active Expired - Lifetime
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Ｐｒｏｃ．Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ． |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2008528965A (en) * | 2005-01-26 | 2008-07-31 | バイオ−ラッド ラボラトリーズ，インコーポレイティド | Coumarin-based cyanine dyes for nonspecific protein binding |
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