JP2969177B2 - 分析方法 - Google Patents

分析方法

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Description

【発明の詳細な説明】 本発明は分析技術及び該技術を実行するための手段に
関する。特に、本発明はより優れた信号対雑音比及び感
度を提供する分析技術の改良に関する。
本願が関係する分析技術は分析すべき値（以後、「配
位子」と呼ぶ）と、特定種類の表面に塗布される配位子
用の特定の結合材（以後、特定の結合パートナと呼ぶ）
との間の親和性に基づいている。このような技術は被覆
された光学的構造体について本技術分野では良く知られ
ており、配位子を特定の結合パートナに結合すると、上
記光学的構造体の光学的特性の検出可能な変化が起こ
る。また、このような技術は例えば欧州特願公開第0112
721号及び第0178083号公報に述べられている。本発明は
従来の分析よりも多くの利点を有する分析方法を提供す
る。
本発明はその最も広い側面では、 （ａ）光学的構造体の一表面に支持された、検出しよう
とする配位子用の特定の結合パートナとの接触状態で試
料を培養し； （ｂ）光学的構造体及び／または特定の結合パートナの
層内で光線の共振及び／または全内部反射が起こるよう
に、光学的構造体の他の表面を法線に対して適切な角度
または角度範囲で照射し； （ｃ）反射光線及び／または発生光線を分析して、発生
光線及び／または光学的構造体の光学的特性が複合体の
形成により変化したかどうか、また望むなら、変化した
程度及び／または変化した割合を測定する；各工程より
なる試料中の配位子の分析方法の改良に関する。
ここで使用する「発生光線」という用語は、螢光及び
燐光を含むことを理解されたい。本発明は、以後、特に
螢光について説明するが、燐光にも適用し得る。
光学的構造体は基質と、必要に応じてこの基質と上記
光学的構造体の表面に支持された特定の結合パートナ層
との間に介在された１つまたはそれ以上の材料層とより
なる。一般に、特定の結合パートナ層は連続でも不連続
でもよい。しかしながら、後述の本発明の或る実施例で
は、特にいずれの介在材料層もなしに特定の結合パート
ナが直接、光学的構造体の基質表面に支持されている場
合、特定の結合パートナの連続層が好ましい。
意外にも、本発明の方法は或る表面の光学的特定に基
づいた直接及び間接検知分析方法の感度を高めるために
一般に適用できることが分かった。本発明の内容におけ
る直接検知は生化学反応（例えば、抗原／抗体結合）か
ら生じる信号の変調を監視することを含む。間接検知は
生化学反応を定量するために標識化同位体（例えば、発
螢光団）をトランスデューサによって監視することを含
む。
この技術によれば、光学的構造体の表面における電場
の強さを大幅に高め、それにより励起光線と、配位子−
特定の結合パートナ複合体との間の相互作用を高め、か
くして光学的構造体の表面における複合体形成に対する
応答性を最大にし、間接検知技術を用いた実施例では、
背景信号レベルを大幅に低下させることができる。
かくして、分析中の配位子の結合時の光学的構造体に
支持された表面層の屈折率の変化に基づく直接検知方法
を使用する場合、本発明の方法を適用して入射光線源に
より生じられる表面電場の強さを高め、上記表面層内を
伝播するモードへの結合と関連された共振を鋭くするこ
とができる。
かくして、本発明の１つの側面によれば、 （ａ）検出しようとする配位子用の特定の結合パートナ
と接触状態で試料を培養し、その際、前記特定の係合パ
ートナは光学的構造体の一表面に支持されており、前記
光学的構造体は薄い金属層で被覆された透過性基質より
なり、前記金属層は１つまたはそれ以上の導光モードを
支持するのに適した厚さの誘電材料層でそれ自身被覆さ
れており、前記特定の結合パートナは前記光学的構造体
の前記誘電材料層の表面に支持され； （ｂ）光線が全て内部反射すると共に、前記誘電材料層
によって支持される導光モードに結合されるように前記
光学的構造体の他の表面を照射し； （ｃ）反射した前記光線を分析して、前記光学的構造体
及びこれに支持された特定の結合パートナにより構成さ
れるセンサの光学的特性が前記配位子と前記特定の結合
パートナとの複合体の形成により変化したかどうか、ま
た望むなら、変化した程度及び／または変化した割合を
測定する；各工程よりなる、試料中の配位子の分析方法
が提供される。
例えば、本発明の一つの実施例では、入射光線を特定
の形状寸法の光学的構造体により支持することができる
導光モードに結合するのがよい。適当な形状寸法の光学
的構造体は螢光免疫学的分析に関して米国特許第464928
0号に以前開示された。しかしながら、類似した技術を
直接検知分析方法に適用することができるということは
これまで認められていなかった。好ましくは、光学的構
造体は銀又は金のような薄い金属層で被覆された透過性
（少なくとも使用される光線の波長の）基質を備えてお
り、この金属層はそれ自身、シリカ等の誘電材料層で被
覆されている。この誘電性材料層は例えば、１つまたは
それ以上の導光モードを支持するのに十分な使用される
入射光線の波長ほどの厚さのものであるが、単一の導光
TEまたはTMモードのみを支持する誘電性材料の厚さを用
いるのが特に好ましい。例えば、50nmの銀層及び543nm
の入射光線波長を有する屈折率1.52の基質の場合、単一
横方向磁気（TM）導光モードのための誘電性シリカ層の
厚さは350nm〜750nmである。横方向電気光線の単一導光
モードを伝播するのに同様の厚さを必要とする。
本発明の別の直接検知実施例では、入射光線を金属層
の各側に表面プラズモンの相互作用から生じる長範囲表
面プラズモンモードに結合する。この実施例では、光学
的構造体は例えばガラス基質及び金属層よりなり、銀ま
たは金のような金属の層は基質より低い屈折率を有する
誘電性層、例えば、MgF2の層によって基質からずれてい
る。長範囲表面プラズモン共振（LRSPR）は金属層の各
側の誘電層の屈折率が同じである形状寸法と慣例的に関
連されている。しかしながら、あまり大きくない屈折率
の不整合があるときにもLRSPRを達成することができる
こと、また異なる厚さの層を使用することによって、及
び／または適切に整合していない屈折率の材料を選択す
ることによって或る範囲の感度が可能であるということ
がわかった。かくして、誘電層の厚さを減少すると、入
射光線と長範囲表面プラズモンとの共振結合を最適にす
るために金属層の厚さを増大することが必要である。
従って、本発明は更に、基質と、金属層と、これらの
基質と金属層との間に介在されて、上記基質の屈折率よ
り低い屈折率を有する誘電材層と、上記金属層（直接或
いは間接的に）に吸収あるいは結合された検出しようと
する配位子用の特定の結合パートナとを備え、上記諸層
は、使用状態において、長範囲表面プラズモン共振を伝
播できる、試料中の配位子の検出するセンサを提供す
る。
好ましくは、金属層は厚さ10〜50nm、より詳細に言え
ば15.5nmであり、誘電層は厚さ10〜2000nm、より詳細に
言えば1500nmのMgF2層である。
直接検知分析の感度はセンサの分解能から従来の方法
で評価することができる。分解能は反射共振最小値の角
半幅に対する金属表面に隣接した媒体の屈折率の特定の
変化のための共振ピークの角移動の比として定めること
ができる。ここで使用する「角半幅」とは、共振がその
最小値の半分である共振反射率最小値と関連された入射
角または放出角の片側における入射角または反射角間の
角範囲を意味している。分解能が大きければ大きいほ
ど、配位子結合による共振の変化を分解する際の検知装
置の感度が大きくなり、従って分析感度を向上させる。
同等の構成では、屈折率の同じ変化の場合、上記第１実
施例で述べた好適な材料及び寸法は５より大きいｒ値を
もたらし、上記第２実施例で述べた好適な材料及び寸法
は12より大きいｒ値をもたらすが（１度の６分の１の角
半幅）、無被覆の銀幕を使用した場合、ｒ値は0.47〜0.
76であり、角半幅は約1.5度である。
しかしながら、本発明の方法は表面結合発螢光団に基
づいた技術などの間接検知分析方法に適用するときには
特に有利である。直接検知技術についてすでに述べたよ
うに、この方法を入射光線により生じる表面電場の強さ
を高めかつ生じる共振ピークを鋭敏にするために使用し
ても良い。これ自身により、結合発螢光団が光学的構造
体の外面に生じる消失性電場により励起されるため、螢
光分析の特質及び感度が大いに向上される。これにより
未結合発螢光団の励起を最小にし、かくして背景信号を
減少させる。また、表面電場の大きさは全内部反射を介
する直接照射及び消失性照射の両方に比較して非常に高
められ、有効エネルギがより大きく、結合発螢光団から
得られる信号は非常に著しく高められる。
しかしながら、発光された螢光を光学的構造体を介し
て検出器に入力結合することによって更に他の利点を得
ることができ、実質的に結合発螢光団によって発光され
た光線のみが検出されるように検出器の角範囲を制限す
ることができる。更に、検出器を照射及び反射平面の外
側に設置することにより、背景信号のなお一層の低減を
達成することができる。次いで、反射ではなく散乱励起
光線を除去するのに、検出光を濾過するだけでよい。全
内部反射または表面プラズモン共振を介して光学的構造
体に入力結合された結合発螢光団の螢光発光を測定する
光検出器の適当な構成が、例えば、欧州特願公開第0170
376号公報に述べられており、また全内部反射を使用し
た消失性電場励起の使用は米国特許第4608344号、第444
7546号及び第4558014号公報に記載されている。しかし
ながら、これらの方法が従来技術以上のかなりの利点を
もたらすのに変更法で単独または組合せで一般に適用で
きることは以前は認められていなかった。
本発明の他の側面によれば、 （ａ）検出しようとする配位子用の特定の結合パートナ
と接触状態で試料を培養し、その際、前記特定の結合パ
ートナは別の試薬Ｘの存在下で光学的構造体の一表面に
支持され、該試薬Ｘは前記特定の結合パートナに有効な
螢光または燐光標識化された配位子アナログか、または
検出しようとする前記配位子用の螢光または燐光標識化
された別の特定の係合パートナのいずれかであり、前記
光学的構造体は基質を含み、更に好ましくは該基質及び
前記特定の結合パートナの間に介装される１つ又はそれ
以上の材料層を含み； （ｂ）前記材料層の平面と直角を成す平面において、光
線が全て内部反射すると共に、螢光または燐光が発生す
るように、法線に対して適切な角度または角度範囲で前
記光学的構造体の他の表面を照射し； （ｃ）前記光学的構造体の縁部から出現する発生螢光ま
たは燐光を監視し、この螢光または燐光を分析してそれ
らが複合体形成により変化したかどうか、また望むな
ら、その変化した程度及び／または変化した割合を測定
し、それによって、検出光線の軸線は前記光学的構造体
が照射されると共に前記光学的構造体からの反射が生じ
る前記平面と略直角であるかどうかを測定する；各工程
よりなる試料中の配位子の分析方法が提供される。
例えば、本発明の一実施例では、全内部反射と関連し
た消失性電場を使用して光学的構造体（試料の界面）の
約１ミクロン以上の発螢光団を励起することができる。
光学的構造体は検出光線の軸線と略直角な平面内で単一
の反射光で照射される。これにより上記米国特許に開示
されている構成より優れた利点が得られる。何故なら、
検出光線及び源光線が異なる平面にあり、従って入射及
び放出光線の解析が簡単になるからである。散乱光線を
除去するだけのための検出光の濾過が必要である、背景
解析螢光により発せられる光線のかかる散乱は消失性励
起を使用して除去される。
標識化同位体として使用するのに適した螢光分子の例
を挙げると、ローダミンイソチオシアネート、ダンシル
クロライド、FITC及びXRITCがある。
本発明の更に別の側面によれば、 （ａ）検出しようとする配位子用の特定の結合パートナ
と接触状態で試料を培養し、その際、前記特定の結合パ
ートナは別の試薬Ｘの存在下で光学的構造体の一表面に
支持され、該試薬Ｘは前記特定の結合パートナに有効な
螢光または燐光標識化された配位子アナログか、または
検出しようとする前記配位子用の螢光または燐光標識化
された別の特定の結合パートナのいずれかであり、前記
光学的構造体は基質、金属層、及びこれら両者間に介装
されると共に前記基質の屈折率より低い屈折率の誘電材
料層とを有し、前記特定の結合パートナは前記金属層に
直接または間接的に吸着あるいは結合され； （ｂ）長範囲表面プラズモン共振が起こるように、かつ
螢光または燐光が発生されるように、法線に対して適切
な角度または角度範囲で前記光学的構造体の他の表面を
照射し； （ｃ）発生した前記螢光または燐光を分析してその螢光
または燐光が複合体の形成によって変化したかどうか、
また望むなら、その変化した程度及び／または変化した
割合を測定する；各工程よりなる、試料中の配位子の分
析方法が提供される。
また本発明の更に別の側面によれば、 （ａ）検出しようとする配位子用の特定の結合パートナ
と接触状態で試料を培養し、その際、前記特定の結合パ
ートナは別の試薬Ｘの存在下で光学的構造体の一表面に
支持され、該試薬Ｘは前記特定の結合パートナに有効な
螢光または燐光標識化された配位子アナログか、または
検出しようとする前記配位子用の螢光または燐光標識化
された別の特定の結合パートナのいずれかであり、前記
光学的構造体は基質と、金属層とを含み、更に好ましく
は該金属層及び前記特定の結合パートナ間に介装される
誘電層を含み； （ｂ）前記光学的構造体内またはその表面で表面プラズ
モン共振が起こるように、かつ螢光または燐光が発生す
るように、法線に対して適切な角度または角度範囲で前
記光学的構造体の他の表面を照射し； （ｃ）発生螢光または燐光を分析してそれが複合体形成
により変化したかどうか、また望むなら、変化した程度
及び／または変化した割合を測定する；各工程よりなる
試料中の配位子の分析方法が提供される。
本発明の更に他の実施例では、入射光線を、例えば銀
または金の薄い金属層と、例えばシリカ、ホスフェート
ガラスまたはシラン（例えばグリシドキシプロピルトリ
メトキシシラン）である誘電層との間に発生される表面
プラズモン共振（SPR）モードへ結合する。シリカは金
属を腐食から保護しかつ特定の結合パートナを例えば共
有結合で有利に不動化することができる表面を形成する
不動能化層として作用する。しかしながら、特定の結合
パートナが金属層に直接吸着されてそれ自身誘電材層を
形成することがあるということはわかるであろう。この
特定の実施例では、上記特定の結合パートナが少なくと
も光学的構造体の個々の領域にわたって連続層を形成す
るのが好ましい。入射光線を２次元表面波に結合する集
中効果により、表面プラズモンの消失性電場の強さが全
内部反射と関連したものと比較して非常に高められるこ
とを示した。表面プラズモン共振を使用して達成できる
表面電場の強さは波長に依存しており、最適な光学的構
造体内の波長が長くなると、大きくなる。
消失電場内の螢光は適切な波長の表面プラズモンによ
り励起され、高められた発光が起こる。かくして、高め
られた表面電場の強さ及び励起特性の一般的な利点は本
発明の方法により達成される。しかしながら、これらの
利点はまた、励起螢光をその発光をストーク（Stoke）
のシフト波長の表面プラズモンに入力結合することによ
って基底状態まで戻すことができる往復動光学的構造体
を使用して非常に高められる。この実施例では、表面プ
ラズモンの分散及び螢光発光スペクトル（例えば、ブナ
ー外のオプティックスコミュニケーション、30、第145
〜149頁（1979年）を参照）によって定められる狭い角
度範囲にわたって高められた螢光発光が起こる。次い
で、上記欧州特願公開第0170376号公報に記載のものと
同様な光学的構造体によって表面プラズモンエネルギの
後続光線を検出することができる。消失性光線単独につ
いては、未結合溶液発螢光団（すなわち、使用した入射
光線の波長よりかなり大きい表面からの距離をへだてた
発螢光団）を入射光線の散乱によって励起することがで
きる、消失性電場内の発螢光団の螢光発光の狭い角度及
び金属膜の表面プラズモン共振特性を考慮して、このよ
うないずれの溶液信号も金属膜によって更に減衰され、
従って背景信号は更に低減される。金属の表面プラズモ
ンに対する励起発螢光団の結合可能性は特定の結合パー
トナ層を金属層から適当に間隔をあけることによって抑
制することができる（例えば、ウエバー及びイーガンの
オプティックスレターズ４、第236頁（1979年）を参
照）。
本発明の更に他の実施例では、長範囲表面プラズモン
共振と関連した消失性電場を用いて表面結合螢光を励起
する。LRSPRを伝播し得る上記のようなセンサがかかる
分析に使用するのに適している。LRSPRを使用する利点
は、表面電場の増大が表面プラズモン共振の場合よりも
大きく（10倍）、発光角が、発光された光がそれ自身LR
SPRを介して光学的構造体に入力結合される場合に特に
有利であるより狭い角度である意外、あらゆる点で表面
プラズモン共振について先に述べた利点と同じである。
本発明の方法は必要とされる機器の多くの変更例によ
り光学的構造体の照射、及び、反射光線、透過光線及び
／または伝播光線の分析が現実的に可能になった。かく
して、本発明は更に、 （ａ）分析しようとする配位子用の特定の結合パートナ
を光学的構造体に支持してなるセンサを備え、該光学的
構造体は基質と、該基質及び特定の結合パートナの間に
介装された１つまたはそれ以上の材料層とよりなり； （ｂ）使用状態において、光線が光学的構造体内に適切
な角度で入り、その光学的構造体内に全内部反射、及び
表面プラズモン共振、長範囲表面プラズモン共振、また
は共振導光モード結合である共振を生じるように配置す
ることができる平行化された光源と； （ｃ）使用状態において、反射光線または発生光線を分
析する手段と；よりなる上述の分析方法に使用するのに
適した装置を提供する。
光線を例えば１〜２゜内で平行化し、使用状態におい
て、それを例えば上記装置内に位置決めされた光学的構
造体の基質を通してあるいはプリズムまたは格子カップ
ラーを経て上記光学的構造体に導入することができる。
理想的には、光源の光線は偏光され、好ましくは横方向
磁気偏光されるが、未偏光の光線を使用してもよい。
分析方法が例えば全内部反射により表面結合発螢光団
の螢光を光学的構造体に入力結合することを含む場合、
この方法の感度は検出手段の視界角度範囲が入力結合螢
光発光角度に相当するように例えば約３゜に制限された
装置を使用して更に高められる。この効果の理論上の分
析が欧州特願公開第0170376号公報に示されている。
本発明の方法を免疫学的分析に適用すること、詳細に
は、欧州特願公開第0170376号公報に開示されている光
学的分析方法とともに、欧州特願公開第0171148号公報
に記載の装置と類似の特に反応性の高い試料を採取／試
験する装置を使用することが特に好ましい。かくして、
本発明は、各々が試料液を毛管作用により吸入すること
ができるのに十分な小寸法の１つまたはそれ以上の空洞
を有し、この空洞の壁部の少なくとも一部が試料中の配
位子を検出するためのセンサよりなり、該センサが一般
にここに記載の種類のものである特に反応性の試料を採
取及び試験する装置を提供する。本発明のこの特定の実
施例では、光学的構造体は平らな導波管よりなる。
このような装置の好適な実施例では、センサよりなる
壁部から離れた毛管空洞の壁部は螢光または燐光標識化
された配位子アナログまたは更に特定の結合パートナを
乾燥した放出可能な形態で支持している。
しかしながら、本発明による分析方法で使用される光
学的構造体は平らな導波管に限定されるものではなく、
試料を通る以外の入射光線を共振及び／または全内部反
射が起こることができるような適当な角度または角度範
囲で導入するための適当な形状寸法を選ぶことができれ
ば、上記光学的構造体が格子、プリズム、光ファイバ及
びスライドなどの他の光学的構造体も本発明の範囲に含
まれることは理解されよう。
本発明の好適な実施例では、配位子は抗原であり、特
定の結合パートナは上記抗原に対する抗体よりなる。し
かしながら、本発明は抗体または抗原の分析だけに限定
されないことを理解されたい。本発明の方法により分析
し得る配位子の例を、各場合の適当な特定の結合パート
ナの指示とともに下記表１に示してある。
本発明の方法は非常に広い応用性があるが、特に、ペ
プチドホルモン（例えば、甲状腺刺激ホルモン（TS
H）、黄体形成ホルモン（LH）、人体絨毛膜生殖腺刺激
ホルモン（hCG）、小胞刺激ホルモン（FSH）、インシュ
リン及びプロラクチン）またはノンペプチドホルモン
（例えば、コーチソン、エストラジオール、プロゲステ
ロン及びテストステロンなどの甲状腺ホルモン、またチ
ロキシン（T4）及びトリヨードチロニンなどの甲状腺ホ
ルモン）、プロテイン（例えば、癌胎児抗原（CEA）及
びアルファフェトプロテイン（AFP））、薬剤（後え
ば、ジゴキシン）、糖、毒素、ビタミン、インフルエン
ザ、パラインフルエンザ、アデノ−ウイルス、肝炎ウイ
ルス、呼吸器官ウイルス及びエイズウイルスなどのウイ
ルス、または微生物を分析するのに使用することができ
る。
ここで使用する語「抗体」とは、その範囲内で以下の
ものを含むことを理解されたい。
（ａ）例えば、羊、うさぎ、やぎまたはねずみなどの従
来から使用されている動物から得られる種々のクラスま
たはサブクラスの免疫グロブリン、例えば、IgG、LgA、
IgM、IgEのすべて、 （ｂ）モノクロナル抗体 （ｃ）抗体、モノクロナルまたはポリクロナルのそのま
まの分子または断片、これらの断片とは、抗体の結合領
域を含有するもの、すなわち、Fc部分（例えば、Fab、F
ab′、Ｆ（ab′２）のない断片、或いはそのままの抗体
中の重鎖成分を連結するジスルフィド結合の還元分解に
より得られるいわゆる「半分子」である。
抗体の断片の製造方法は本技術分野でよく知られてい
るので、ここでは説明しない。
ここで使用している語「抗原」とは、永久的抗原種
（例えば、プロテイン、バクテリア、バクテリア断片細
胞、細胞断片及びウイルス）、及び適当な条件下で抗原
にされるハプテンを含むものと理解されたい。
更に、本発明は、上記方法により試料中の配位子を検
出するためのセンサを提供する。このセンサは薄い金属
層で被覆された基質を有する光学的構造体を備えてお
り、金属層はそれ自身、センサが使用中であるとき、用
いた波長の光線の１つまたはそれ以上の導光モードを使
用するのに適した厚さの誘電材層で被覆されており、こ
の誘電層は検出しようとする配位子用の特定の結合パー
トナを支持している。
限定しない以下の例は本発明の特定の特徴を示してい
る。
例１ 共振励起形状寸法の比較 第２は第１図に概略的に示すように光学的構造体を使
用して理論上得ることができる結果の比較を示してい
る。すべての機構についての励起波長は543nmであり、
発螢光団は570nmでのピーク発光及び35nmの半幅（550nm
〜590nm）を伴うローダミンＢであった。
例２ 全内部反射 （ａ）第２図は543nmの波長（緑色HeNeレーザ）で多数
の水中ガラススライドについての角度の枚数としてプロ
ットした表面電場の強さを示している。1.52の屈折率を
有するガラススライドの場合、電場は70゜の入射光線の
ものの2.5倍である。
（ｂ）第３図は角度の関数としてプロットした電場透過
を示している。これは臨界角から離れたゆっくり変化す
る入射角の関数である。上記（ａ）で示した例の場合、
電場透過は70゜で約90nmである。透過は非常に大きく、
乏しい表面識別が起こるため、臨界角に極く近づいて作
用するのは望ましくない。かくして、電場の強さと透過
の深さとのバランスをとらなければならない。
例３ 表面プラズモン共振 第４図は543nmで者された水平の50nm銀膜の反射率及
び表面電場の強さを示している。入射光線の強さと比較
すると、電場の強さが25倍高められる。
例４ SPR及び全内部反射の比較 第５図は表面プラズモン共振及び全内部反射によるロ
ーダミンＢ溶液の励起の比較を示している。SPR形状寸
法についての発光強さの増大及び狭い発光範囲が明瞭に
示されている。実験の詳細は次の如くである。
ｉ）光学的構造体の製造 25mm×75mmのガラススライドを洗浄剤溶液中で超音波
洗浄した。真空蒸着を使用して、クロムをマスクを介し
て各スライドの一表面の半分に1nmの厚さまで蒸着し
た。同じようにして、銀をクロム層に54nmの厚さまで蒸
着した。マスクを取りはずし、10nmのシリカ皮膜で同様
な手段で上記表面の全体に付着させて各スライドの表面
の両半部が同じ物理化学特性を有するようにした。これ
らのスライドを極めて純粋な水で洗浄した。各スライド
をけがき、３の部片に切断し、各部材を半銀被覆した。
各部片を使用して同様な大きさの他のグラム片及び両面
接着テープを用いてキャピラリセルを製造した。
ii）実験手順 ローダミンＢで標識化された適切濃度の適当なプロテ
インを使用して試料溶液を作製した。実験の構成は下記
例５の部分（iii）に記載の如くであった。
例５ 間接表面プラズモン共振技術を使用した人間の絨毛膜ゴ
ナドトロピン（hCG）の分析 ｉ）光学的構造体の製造 25nm×75nmのガラススライドを洗浄剤溶液で超音波洗
浄した。真空蒸着を使用してアルミニウムをマスクを介
して各スライドの一表面の半分に1nmの厚さまで蒸着し
た。同じようにして、銀をアルミニウム層に54nmの厚さ
まで蒸着した。マスクを取りはずし、10nmのシリカ皮膜
を同様な手段により上記表面の全体に付着させ、各スラ
イドの表面の両半部が同じ表面化学特性を有するように
した。これらのスライドをシリカ表面のシラン化のため
にGOPS（グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン）
プールの上方に20℃で２時間吊下げ、その後、スライド
を60℃で１時間焼付けした。HEPES緩衝剤中α12/17抗hC
G抗体の20μg/ml溶液の一滴75uを各スライドの各半部
に落し、これらのスライドを２時間放乾した。これらの
スライドを加めて純粋な水で洗浄し、次いでサクロース
とトリ（ヒドロキシメチル）アミノメタン及びアジ化ア
トリウムとの溶液をスライドの表面にスピニングによっ
て付着させた。各スライドをけがき、３つの部片に切断
し、各部片を半銀被覆した。各部片を使用して、同様な
大きさの他のガラス片及び両面接着テープを用いてキャ
ピラリセルを製造した。
ii）分析手順 キャピラリセル中に不動化されたhCG/XRITC標識化抗
体の馬の血清中予備混合溶液を使用してサンドイッチ式
分析を行った。使用したXRITC標識化抗体の濃度は2.5ug
/mlであった。部分（ｉ）と同様に製造されたキャピラ
リセルによって試料溶液を採取して読み取る前に15分間
培養した。
iii）実験の構成 適当な屈折率の流体を使用して充填済みのキャピラリ
セルを半円筒形セルに連結した。次いで緑色ヘリウム／
ネオンレーザからの光を表面プラズモン共振が起こるの
に適した角度でレンズの平らな壁部を通してスライド
（すなわち不動化抗原を支持したセルのプレート）に当
てた。入射／反射光の平面と直角な平面で光倍率器管を
回転させることによって螢光発光を監視した。PMT検出
器に達した光は610nmの帯域フィルタを通っていずれの
散乱励起光を除去した。１℃の角分解能をもたらすため
にスリットをフィルタの背後に配置した。２つのレンズ
により、スリットを通過した光を検出器に集中させた。
セルの銀被覆半部及び未被覆半部を交互に識別するよう
にセルをプリズム上で回転させることによって、表面プ
ラズモン共振から生じる螢光と全内部反射から生じる螢
光との比較を行った。
結果 第６図はSPR及びTIR励起により得られる場合の血清中
8105mIU/mlのhCGを収容したキャピラリセルから60〜80
゜の角発光範囲にわたって得られた信号の比較を示して
いる。SPR励起の場合の約74゜の信号の強いピークが特
に顕著である。70゜と78゜との間の統合信号はTIR励起
を使用した場合よりSPR励起を使用した場合の法が5.2倍
大きい。金属層の最適化及び改良プロテイン不動化技術
により、より大きな増大を達成することができる。
第７図はhCGを含有していない血清をセルに充填した
以外は同じ角度範囲にわたって得られた信号を示してい
る。
SPR励起から生じた発光はXRITC標識化抗体の非特定結
合により76゜でわずかなピークを示す。
例６ 屈折率の変化に対する直接導光モードセンサの感度の実
証 ｉ）光学的構造体の製造 ガラス顕微鏡スライドを洗浄溶液で超音波洗浄し、極
めて純粋な水で広い範囲に濯ぎ洗浄した。真空蒸着技術
を使用して、1nm厚さのアルミニウム層をガラスの表面
に蒸着した後、54nm厚さの銀層を蒸着した。次いで、シ
リカゾルゲル（HTプロダクツ社、USA）を300rpmで装置
にスピンコーティングすることによって銀層をガラス膜
で被覆した。これらの光学的構造体を60℃夜通し焼付け
した。両面接着テープを使用して光学的構造体及び同じ
寸法の他のガラス片からキャピラリセルを作製した。
ii）実験の構成 充填済みのキャピラリセルを適切な流体の使用により
直角クラウンガラスプリズムに光学的に連結した。この
セルにTM偏向HeNeレーザをガラス器質を通して銀膜上に
当て、反射光の強さを光ダイオード装置で測定した。測
定中、プリズムを所定角度範囲にわたって回転させた。
セルに極めて純粋な水（屈折率1.3316）を充填し、最小
反射率の位置を記録した。次いで、極めて純粋な水を５
％サクロース溶液（屈折率1.3382）次いで10％サクロー
ス溶液（屈折率1.3450）で置換し、反射光の強さが最小
の位置をこれらのサクロース溶液の存在下で測定した。
iii）結果 第８図は光学的構造体における導光モード光の反射光
の強さが最小の位置を示している。光学的構造体と接触
している媒体の屈折率が増大すると、上記最小の反射光
が生じる角度の移動があり、これは装置が屈折率の変化
に敏感であることを示している。
装置表面に不動化された適切な生物学的分子（例えば
抗体）に配位子（例えば抗原）を結合すると、屈折率が
変化する。これにより、導光モードセンサを直接光免疫
学的センサとして使用することができる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 シャンクス イアン アレクサンダー イギリス エイチ ピー 10 ８ エイ チ ティー，バックス，ペン，チャナー ドライブ，フリントウッド コティッ ジ （番地なし) (56)参考文献 特開 平２−44230（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−292044（ＪＰ，Ａ) 特開 昭61−75604（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502418（ＪＰ，Ａ) 特表 昭61−502420（ＪＰ，Ａ) 特表 平１−502930（ＪＰ，Ａ) 米国特許4649280（ＵＳ，Ａ) 英国特許2185308（ＧＢ，Ｂ) (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/543

Claims (9)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】（ａ）検出しようとする配位子用の特定の
    結合パートナと接触状態で試料を培養し、その際、前記
    特定の結合パートナは別の試薬Ｘの存在下で光学的構造
    体の一表面に支持され、該試薬Ｘは前記特定の結合パー
    トナに有効な螢光または燐光標識化された配位子アナロ
    グか、または検出しようとする前記配位子用の螢光また
    は燐光標識化された別の特定の結合パートナのいずれか
    であり、前記光学的構造体は基質、金属層、及びこれら
    両者間に介装されると共に前記基質の屈折率より低い屈
    折率の誘電材料層とを有し、前記特定の結合パートナは
    前記金属層に直接または間接的に吸着あるいは結合さ
    れ； （ｂ）長範囲表面プラズモン共振が起こるように、かつ
    螢光または燐光が発生されるように、法線に対して適切
    な角度または角度範囲で前記光学的構造体の他の表面を
    照射し； （ｃ）発生した前記螢光または燐光を分析してその螢光
    または燐光が複合体の形成によって変化したかどうか、
    また望むなら、その変化した程度及び／または変化した
    割合を測定する；各工程よりなる試料中の配位子の分析
    方法。
  2. 【請求項２】（ａ）検出しようとする配位子用の特定の
    結合パートナと接触状態で試料を培養し、その際、前記
    特定の結合パートナは光学的構造体の一表面に支持され
    ており、前記光学的構造体は薄い金属層で被覆された透
    過性基質よりなり、前記金属層は１つまたはそれ以上の
    導光モードを支持するのに適した厚さの誘電材料層でそ
    れ自身被覆されており、前記特定の結合パートナは前記
    光学的構造体の前記誘電材料層の表面に支持され； （ｂ）光線が全て内部反射すると共に、前記誘電材料層
    によって支持される導光モードに結合されるように前記
    光学的構造体の他の表面を照射し； （ｃ）反射した前記光線を分析して、前記光学的構造体
    及びこれに支持された特定の結合パートナにより構成さ
    れるセンサの光学的特性が前記配位子と前記特定の結合
    パートナとの複合体の形成により変化したかどうか、ま
    た望むなら、変化した程度及び／または変化した割合を
    測定する；各工程よりなる、試料中の配位子の分析方
    法。
  3. 【請求項３】（ａ）検出しようとする配位子用の特定の
    結合パートナと接触状態で試料を培養し、その際、前記
    特定の結合パートナは別の試薬Ｘの存在下で光学的構造
    体の一表面に支持され、該試薬Ｘは前記特定の結合パー
    トナに有効な螢光または燐光標識化された配位子アナロ
    グか、または検出しようとする前記配位子用の螢光また
    は燐光標識化された別の特定の結合パートナのいずれか
    であり、前記光学的構造体は基質を含み、更に好ましく
    は該基質及び前記特定の結合パートナの間に介装される
    １つ又はそれ以上の材料層を含み； （ｂ）前記材料層の平面と直角を成す平面において、光
    線が全て内部反射すると共に、螢光または燐光が発生す
    るように、法線に対して適切な角度または角度範囲で前
    記光学的構造体の他の表面を照射し； （ｃ）前記光学的構造体の縁部から出現する発生螢光ま
    たは燐光を監視し、この螢光または燐光を分析してそれ
    が複合体形成により変化したかどうか、また望むなら、
    その変化した程度及び／または変化した割合を測定し、
    それによって、検出光線の軸線は前記光学的構造体が照
    射されると共に前記光学的構造体からの反射が生じる前
    記平面と略直角であるかどうかを測定する；各工程より
    なる試料中の配位子の分析方法。
  4. 【請求項４】（ａ）検出しようとする配位子用の特定の
    結合パートナと接触状態で試料を培養し、その際、前記
    特定の結合パートナは別の試薬Ｘの存在下で光学的構造
    体の一表面に支持され、該試薬Ｘは前記特定の結合パー
    トナに有効な螢光または燐光標識化された配位子アナロ
    グか、または検出しようとする前記配位子用の螢光また
    は燐光標識化された別の特定の結合パートナのいずれか
    であり、前記光学的構造体は基質と、金属層とを含み、
    更に好ましくは該金属層及び前記特定の結合パートナ間
    に介装される誘電層を含み； （ｂ）前記光学的構造体内またはその表面で表面プラズ
    モン共振が起こるように、かつ螢光または燐光が発生す
    るように、法線に対して適切な角度または角度範囲で前
    記光学的構造体の他の表面を照射し； （ｃ）発生螢光または燐光を分析してそれが複合体形成
    により変化したかどうか、また望むなら、変化した程度
    及び／または変化した割合を測定する；各工程よりなる
    試料中の配位子の分析方法。
  5. 【請求項５】薄い金属層で被覆された基質を有する光学
    的構造体よりなり、該金属層は、センサが使用中である
    ときに用いる波長の、１つ又はそれ以上の導光モードの
    光線を支持するのに適した厚さの誘電材料層でそれ自身
    被覆されており、該誘電材料層は検出しようとする配位
    子用の特定の結合パートナを支持してなる、請求項２に
    記載の方法により試料中の配位子を検出するためのセン
    サ。
  6. 【請求項６】前記金属層は銀または金よりなりその厚さ
    は約50mmであり、前記誘電材料層はシリカよりなる、請
    求項５に記載のセンサ。
  7. 【請求項７】毛管作用による試料液の吸入を可能とする
    のに十分な小寸法の空洞を１つ或いは複数有し、該空洞
    の壁部の少なくとも一部が請求項５又は６に記載のセン
    サよりなる、特に反応性の高い試料採取及び試験装置。
  8. 【請求項８】センサよりなる壁部から離隔した、毛管作
    用をなす空洞の壁部は、螢光または燐光標識化された配
    位子アナログ、或いは別の特定の結合パートナを放出可
    能な乾燥形態で支持している、請求項７に記載の装置。
  9. 【請求項９】（ａ）請求項５又は６に記載のセンサと、 （ｂ）光源と、 （ｃ）使用状態において、前記センサから反射される光
    線を分析するための手段とよりなる、請求項２に記載の
    分析方法で使用する装置。
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