JP2965502B2 - Analysis method by surface enhanced Raman scattering measurement - Google Patents
Analysis method by surface enhanced Raman scattering measurementInfo
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Description
【０００１】[0001]
【発明が属する技術分野】本発明は、例えば、臨床検
査、生化学分析、医薬品の品質管理等の分野において微
量成分の検出や定量に使用される分析方法であり、詳し
くは、酵素反応を利用した表面増強ラマン散乱測定によ
る分析方法に関するものである。BACKGROUND OF THE INVENTION 1. Field of the Invention The present invention relates to an analytical method used for detecting and quantifying trace components in fields such as clinical examination, biochemical analysis, and quality control of pharmaceuticals. The present invention relates to an analysis method based on surface enhanced Raman scattering measurement.
【０００２】[0002]
【従来の技術】臨床検査、生化学分析、医薬品の品質管
理等の分野において微量成分の検出や定量に使用される
分析方法としては、抗原抗体反応を利用した免疫学的分
析法（イムノアッセイ）が汎用されている。また、この
イムノアッセイの方法として、表面増強ラマン散乱測定
を利用する方法が報告されている。この方法は、金属粒
子等の表面にラマン活性物質を吸着させると、ラマン散
乱が増幅されるという現象を利用するものであり、例え
ば、特開平６−１７４７２３号公報および特開平７−１
４６２９５号公報に記載の方法がある。2. Description of the Related Art As an analysis method used for detection and quantification of trace components in fields such as clinical examination, biochemical analysis, and quality control of pharmaceuticals, an immunoassay (immunoassay) utilizing an antigen-antibody reaction is known. It is widely used. Further, as a method of this immunoassay, a method utilizing surface enhanced Raman scattering measurement has been reported. This method utilizes the phenomenon that Raman scattering is amplified when a surface of a metal particle or the like is adsorbed with a Raman active substance. For example, JP-A-6-174723 and JP-A-7-1723 disclose the method.
There is a method described in Japanese Patent No. 46295.
【０００３】[0003]
【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
分析方法では、検出感度に一定の限界がある。例えば、
前記特開平６−１７４７２３号公報に記載の方法は、被
分析物質やその特異的結合物質を特有のラマン散乱パタ
ーンを有するラマン活性標識で標識し、これからのラマ
ン散乱を検出することにより、被分析物質を検出しある
いはその量を測定するものである。しかし、この方法
は、表面増強ラマン散乱を利用するが、ラマン活性標識
自体のラマン散乱のみを検出するため、その測定感度
は、前記標識のラマン散乱の検出感度に限定され、それ
以上の感度にすることは理論上不可能となる。例えば、
現在報告されている中で、表面増強ラマン散乱強度が最
も高い色素であるローダミン６Ｇの検出感度は１０-14
Ｍであり（Applied Spectroscopy,49,6,1985）、これに
準ずるクリスタルバイオレットは３×１０-11Ｍ（Anal.
Chem. 58,1116,1986）であると報告されている。よっ
て、特開平６−１７４７２３号公報に記載の方法に、こ
れらの色素をラマン活性標識として用いたとしても、そ
れ以上の検出感度を望むことはできない。また、特開平
６−１７４７２３号公報には、実際に表面増強ラマン散
乱をイムノアッセイに適用した例が示されているが、こ
の方法でも検出感度は、最高で、１０-11 Ｍである。そ
して、被分析物質をラマン活性標識で標識すると、フリ
ーの状態のラマン活性標識に比べ、検出感度が低下する
傾向がある。このため、表面増強ラマン散乱をイムノア
ッセイに適用しても、ラマン活性標識自身の検出感度以
下となり、高感度分析に十分対応できるとは言えない。However, the conventional analysis method has a certain limit in detection sensitivity. For example,
In the method described in JP-A-6-174723, an analyte or a specific binding substance thereof is labeled with a Raman-active label having a unique Raman scattering pattern, and Raman scattering from the label is detected. It detects a substance or measures its amount. However, this method utilizes surface-enhanced Raman scattering, but detects only the Raman scattering of the Raman-active label itself.Therefore, the measurement sensitivity is limited to the Raman scattering detection sensitivity of the label, and the sensitivity is higher. It is theoretically impossible to do so. For example,
Among the currently reported dyes, rhodamine 6G, the dye having the highest surface-enhanced Raman scattering intensity, has a detection sensitivity of 10 -14.
M (Applied Spectroscopy, 49, 6, 1985), and the corresponding crystal violet is 3 × 10 −11 M (Anal.
Chem. 58, 1116, 1986). Therefore, even if these dyes are used as a Raman-active label in the method described in JP-A-6-174723, a higher detection sensitivity cannot be expected. Japanese Patent Application Laid-Open No. 6-174723 discloses an example in which surface-enhanced Raman scattering is actually applied to an immunoassay, but the detection sensitivity is as high as 10 −11 M in this method as well. When the analyte is labeled with the Raman activity label, the detection sensitivity tends to be lower than that of the free Raman activity label. For this reason, even if surface-enhanced Raman scattering is applied to an immunoassay, the detection sensitivity becomes lower than the detection sensitivity of the Raman-active label itself, and it cannot be said that high sensitivity analysis can be adequately performed.
【０００４】本発明は、前記従来の問題点を解決するた
めに、表面増強ラマン散乱を増幅することにより高感度
の分析方法を提供することを目的とする。[0004] It is an object of the present invention to provide a high-sensitivity analysis method by amplifying surface-enhanced Raman scattering to solve the above-mentioned conventional problems.
【０００５】[0005]
【課題を解決するための手段】上記目的を達成するため
に、本発明の第１番目の分析方法は、第１の特異的結合
物質と、ラマン活性物質生成酵素を備えた第２の特異的
結合物質と、被分析物質とを結合反応させて前記三者の
複合体を形成し、この複合体と前記複合体の形成に関与
しない前記第２の特異的結合物質とを分離した後、前記
複合体に対しラマン活性物質生成基質を供給して前記第
２の特異的結合物質の前記酵素と反応させ、ついで生成
したラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に捕
捉し、この状態で前記ラマン活性物質に対し励起光を照
射し、発生する表面増強ラマン散乱を測定するという構
成をとる。In order to achieve the above object, a first analytical method according to the present invention comprises a first specific binding substance and a second specific binding substance comprising a Raman active substance-forming enzyme. The binding substance is reacted with the analyte to form a complex of the three, and after separating the complex and the second specific binding substance not involved in the formation of the complex, A Raman-active substance-forming substrate is supplied to the complex to react with the enzyme of the second specific binding substance, and then the generated Raman-active substance is captured by a surface-enhanced Raman scattering-inducing substrate. The active substance is irradiated with excitation light and the generated surface enhanced Raman scattering is measured.
【０００６】また、本発明の第２番目の分析方法は、特
異的結合物質に対し被分析物質と競合結合反応する競合
物質として、第２の非活性サブユニットと会合すると活
性型のラマン活性物質生成酵素が生成し、前記競合物質
が前記特異的結合物質と結合すると前記第２の非活性サ
ブユニットと会合しない第１の非活性サブユニットを備
えた被分析物質を用いる分析方法であり、前記特異的結
合物質に対し前記競合物質と被分析物質とを競合結合反
応させて複合体を形成し、ついで前記第２の非活性サブ
ユニットを供給して前記複合体の形成に関与しなかった
競合物質の第１の非活性サブユニットに前記第２の非活
性サブユニットを会合させて活性型のラマン活性物質生
成酵素を形成させ、このラマン活性物質生成酵素にラマ
ン活性物質生成基質を供給して反応させ、ついで生成し
たラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に捕捉
し、この状態で、前記ラマン活性物質に対し励起光を照
射し、発生する表面増強ラマン散乱を測定するという構
成をとる。[0006] The second analysis method of the present invention is a method for producing an active Raman-active substance as a competitor which reacts with a specific binding substance in a competitive binding reaction with an analyte by associating with a second non-active subunit. An assay method using an analyte having a first inactive subunit that does not associate with the second inactive subunit when the producing enzyme is generated and the competitor binds to the specific binding substance, A competitive binding reaction between the competitor and the analyte with respect to the specific binding substance is carried out to form a complex, and then the second inactive subunit is supplied so that the competition not involved in the formation of the complex is provided. Associating the second non-active subunit with the first non-active subunit of the substance to form an active Raman active substance-forming enzyme; Is supplied and reacted, and then the generated Raman active substance is captured by a surface-enhanced Raman scattering generation substrate, and in this state, the Raman active substance is irradiated with excitation light to measure the generated surface-enhanced Raman scattering. Take the configuration.
【０００７】そして、本発明の第３番目の分析方法は、
特異的結合物質に、被分析物質とラマン活性物質生成酵
素を備えた競合物質とを競合結合反応させて複合体を形
成し、この複合体と前記複合体の形成に関与しなかった
前記ラマン活性物質生成酵素を備えた競合物質とを分離
した後、前記複合体に対しラマン活性物質生成基質を供
給して前記競合物質のラマン活性物質生成酵素と反応さ
せ、生成したラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起
基質に捕捉し、この状態で前記ラマン活性物質に対し励
起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱を測定する
という構成をとる。[0007] The third analysis method of the present invention comprises:
The specific binding substance is subjected to a competitive binding reaction between the analyte and a competitor provided with a Raman active substance-forming enzyme to form a complex, and the Raman activity not involved in the formation of the complex and the complex After separating the competitor with the substance-forming enzyme, a Raman-active substance-forming substrate is supplied to the complex to react with the competitor's Raman-active substance-forming enzyme, and the generated Raman-active substance is subjected to surface-enhanced Raman. In this state, the Raman-active substance is captured by a scattering-inducing substrate, and the Raman-active substance is irradiated with excitation light to measure generated surface-enhanced Raman scattering.
【０００８】すなわち、本発明の分析方法は、ラマン活
性物質生成酵素とラマン活性物質生成基質とを用い、被
分析物質の量に比例（正比例あるいは反比例）した量の
ラマン活性物質を生成させる方法である。このようにす
れば、表面増強ラマン散乱を著しく増幅させることが可
能となる。この結果、従来の分析方法をはるかに上回る
感度で分析することが可能となる。That is, the analysis method of the present invention uses a Raman active substance-forming enzyme and a Raman active substance-forming substrate to produce a Raman active substance in an amount proportional (directly or inversely proportional) to the amount of an analyte. is there. This makes it possible to significantly amplify the surface enhanced Raman scattering. As a result, the analysis can be performed with a sensitivity far higher than that of the conventional analysis method.
【０００９】なお、本発明において、第１の特異的結合
物質および第２の特異的結合物質ならびに特異的結合物
質とは、被分析物質のみに選択的に結合するものをい
い、例えば、抗体、オリゴＤＮＡ、レクチン、レセプタ
ーがあげられる。また、前記抗体の具体例としては、臨
床検査で用いられる抗インスリン抗体、抗α−フェトプ
ロテイン抗体、抗ＣＥＡ抗体、抗Ｔ4 抗体等があげられ
る。In the present invention, the first specific binding substance, the second specific binding substance, and the specific binding substance refer to those that selectively bind only to an analyte, such as an antibody, Oligo DNA, lectin and receptor are mentioned. Specific examples of the antibody, anti-insulin antibody used in clinical tests, the anti-α- fetoprotein antibody, anti-CEA antibody, anti-T 4 antibody, and the like.
【００１０】また、本発明において、「ラマン活性」と
は、励起光を照射すればラマン散乱が生じることをい
い、「ラマン活性物質」とは、前記ラマン活性を有する
物質をいう。そして、「ラマン活性物質生成酵素」と
は、酵素反応により特定の基質をラマン活性物質に変換
する酵素をいい、「ラマン活性物質生成基質」とは、前
記特定の基質をいう。In the present invention, "Raman activity" means that Raman scattering occurs when irradiated with excitation light, and "Raman active substance" refers to a substance having the Raman activity. The “Raman active substance-forming enzyme” refers to an enzyme that converts a specific substrate into a Raman active substance by an enzymatic reaction, and the “Raman active substance-forming substrate” refers to the specific substrate.
【００１１】また、「表面増強ラマン散乱生起基質」と
は、その表面にラマン活性物質を捕捉すると、ラマン散
乱を増強させる性質を有する物質をいう。そして、「ラ
マン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に捕捉し」
とは、ラマン活性物質を表面増強ラマン散乱生起基質に
接近させ、両者の距離を、通常０〜１００ｎｍ、好まし
くは０〜５０ｎｍとすることをいう。また、捕捉の手段
は、例えば、吸着現象を利用する方法や、電位をかけて
電気的に吸着させる方法、ラマン活性物質と反応結合す
る官能基をつけた表面増強ラマン散乱生起基質質に反応
させる方法がある。[0011] The term "surface-enhanced Raman scattering-inducing substrate" refers to a substance having the property of enhancing Raman scattering when a Raman-active substance is trapped on its surface. Then, "capture the Raman active substance on the surface-enhanced Raman scattering generating substrate"
This means that the Raman-active substance is brought close to the surface-enhanced Raman scattering-inducing substrate, and the distance between the two is usually 0 to 100 nm, preferably 0 to 50 nm. In addition, the means for capturing is, for example, a method utilizing an adsorption phenomenon, a method of electrically adsorbing by applying an electric potential, or reacting with a surface-enhanced Raman scattering generating substrate having a functional group reactive with a Raman active substance. There is a way.
【００１２】前記本発明の第２番目の分析方法におい
て、競合物質として、第１の非活性サブユニットを備え
た被分析物質に代えて、第１の非活性サブユニットを備
えた被分析物質類似物を用いてもよい。[0012] In the second analysis method of the present invention, the analyte similar to the analyte having the first inactive subunit is used instead of the analyte having the first inactive subunit as a competitor. An object may be used.
【００１３】前記本発明の第３番目の分析方法におい
て、操作の簡易性や迅速性の理由から、競合物質がラマ
ン活性物質生成酵素を備えた被分析物質であり、前記競
合物質中のラマン活性物質生成酵素は、前記競合物質中
の被分析物質と特異的結合物質とが結合すると失活する
酵素であり、複合体と前記複合体の形成に関与しなかっ
た前記ラマン活性物質生成酵素を備えた競合物質とを分
離することなく前記ラマン活性物質生成酵素の反応を行
うことが好ましい。In the third analysis method of the present invention, the competitor is an analyte provided with a Raman-active substance-forming enzyme, and the Raman activity in the competitor is increased for reasons of simplicity and speed of operation. The substance-forming enzyme is an enzyme that is inactivated when the analyte in the competitor and the specific binding substance bind, and includes the complex and the Raman active substance-forming enzyme that did not participate in the formation of the complex. It is preferable to carry out the reaction of the Raman active substance-forming enzyme without separating the competitor from the Raman active substance-forming enzyme.
【００１４】また、前記競合結合反応を利用する本発明
の第３番目の分析方法において、ラマン活性物質生成酵
素を備えた競合物質として、ラマン活性物質生成酵素を
備えた被分析物質に代えて、ラマン活性物質生成酵素を
備えた被分析物質類似物であってもよい。Further, in the third analysis method of the present invention utilizing the competitive binding reaction, the competitor provided with the Raman active substance-forming enzyme may be replaced with an analyte provided with the Raman active substance-forming enzyme. An analyte analog having a Raman active substance producing enzyme may be used.
【００１５】なお、本発明において、「被分析物質類似
物」とは、その一部の構造が被分析物質と近似し、この
結果、前記特異的結合物質と結合するものをいう。ま
た、この被分析物質と被分析物質類似物の具体例として
は、エストラジオールとエストラジオール−６−カルボ
キシメチルオキシム、テストステロンとテストステロン
−２１−ヘミサクシネート等があげられる。[0015] In the present invention, the term "analyte analog" means a substance whose structure is similar to that of an analyte and, as a result, binds to the specific binding substance. Further, specific examples of the analyte and the analyte analog include estradiol and estradiol-6-carboxymethyl oxime, testosterone and testosterone-21-hemisuccinate, and the like.
【００１６】そして、操作の容易性や迅速性の理由か
ら、第１の特異的結合物質、あるいは前記競合結合反応
を利用する分析方法における特異的結合物質は、固相に
固定されていることが好ましい。[0016] Because of the ease and speed of the operation, the first specific binding substance or the specific binding substance in the analysis method using the competitive binding reaction is preferably immobilized on a solid phase. preferable.
【００１７】高い測定精度を確保するという理由から、
前記本発明全てに共通して使用するラマン活性物質生成
酵素は、その基質がラマン活性を有せずかつ酵素反応生
成物のみがラマン活性を有するもの、または前記酵素基
質がラマン活性を有するが酵素反応生成物のラマン活性
シグナルと区別できるものであることが好ましい。そし
て、このラマン活性物質生成酵素およびラマン活性物質
生成基質の具体的好適例は、以下に示すとおりである。
これらの酵素および基質は、ラマン散乱シグナルが強い
ことはもちろんであるが、生成するラマン活性物質が着
色物質であることから共鳴ラマン効果も期待でき、これ
らを用いることにより、さらに高感度の検出や測定が可
能となる。For the reason of ensuring high measurement accuracy,
The Raman-active substance-forming enzyme commonly used in all of the present invention is an enzyme whose substrate does not have Raman activity and only the enzyme reaction product has Raman activity, or the enzyme substrate has Raman activity but the enzyme Preferably, it can be distinguished from the Raman activity signal of the reaction product. Specific preferred examples of the Raman active substance-forming enzyme and the Raman active substance-forming substrate are as follows.
These enzymes and substrates not only have a strong Raman scattering signal, but also a resonance Raman effect can be expected because the generated Raman active substance is a colored substance. Measurement becomes possible.
【００１８】まず、ラマン活性物質生成酵素がペルオキ
シダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、２，２´
−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−サ
ルフォニックアシッド）［２，２−Ａｚｉｎｏ−ｂｉｓ
（３−ｅｔｈｙｌｂｅｎｚｔｈｉａｚｏｌｉｎｅ−６−
ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）］、ｏ−フェニレンジア
ミン［ｏ−Ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ（ＯＰ
Ｄ）］、３，３´，５，５´−テトラメチルベンジジン
［３，３′，５，５′−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎ
ｚｉｄｉｎｅ］、ｏ−ジアニシジン［ｏ−Ｄｉａｎｉｓ
ｉｄｉｎｅ］、５−アミノサリシリックアシッド［５−
Ａｍｉｎｏｓａｌｉｃｙｌｉｃ ａｃｉｄ］、３，３´
−ジアミノベンゼン［３，３′−Ｄｉａｍｉｎｏｂｅｎ
ｚｅ］、３−アミノ−９−エチルカルバゾール［３−Ａ
ｍｉｎｏ−９−ｅｔｈｙｌｃａｒｂａｚｏｌｅ］、４−
クロロ−１−ナフトール［４−Ｃｈｌｏｒｏ−１−ｎａ
ｐｈｔｈｏｌ］からなる群から選択された少なくとも一
つであることが好ましい。First, the Raman active substance producing enzyme is peroxidase, and the Raman active substance producing substrate is 2,2 '
-Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) [2,2-Azino-bis
(3-ethylbenzthiazoline-6-
Sulfonic acid)], o-phenylenediamine [OP-phenylenediamine (OP
D)], 3,3 ′, 5,5′-tetramethylbenzidine [3,3 ′, 5,5′-tetramethylben
zidine], o-dianisidine [o-Dianis
idine], 5-aminosalicylic acid [5-
Aminosalicic acid], 3,3 '
-Diaminobenzene [3,3'-Diaminoben
ze], 3-amino-9-ethylcarbazole [3-A
mino-9-ethylcarbazole], 4-
Chloro-1-naphthol [4-Chloro-1-na
phthol].
【００１９】また、ラマン活性物質生成酵素が、アルカ
リフォスファターゼであり、ラマン活性物質生成基質
が、ｐ−ニトロフェニルフォスフェイト［ｐ−Ｎｉｔｒ
ｏｐｈｅｎｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、５−ブロモ−
４−クロロ−３−インドリルフォスフェイト［５−Ｂｒ
ｏｍｏ−４−ｃｈｌｏｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ ｐｈ
ｏｓｐｈａｔｅ］、ファーストレッドフォスフェイト
［Ｆａｓｔ ｒｅｄ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］、４−メチ
ルアンベリフェリルホスフェイト［４−Ｍｅｔｈｙｌｕ
ｍｂｅｌｌｉｆｅｒｙｌ ｐｈｏｓｐｈａｔｅ］からな
る群から選択された少なくとも一つであることが好まし
い。The Raman-active substance-forming enzyme is alkaline phosphatase, and the Raman-active substance-forming substrate is p-nitrophenyl phosphate [p-Nitr
ophenyl phosphate], 5-bromo-
4-Chloro-3-indolyl phosphate [5-Br
omo-4-chloro-3-indolyl ph
phosphate], Fast red phosphate [Fast red phosphate], 4-methylambelliferyl phosphate [4-Methyllu]
at least one selected from the group consisting of mbelliferyl phosphate].
【００２０】そして、ラマン活性物質生成酵素が、グル
コシダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニ
トロフェニルグルコサイド［ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ
ｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ］および４−メチルアンベリフェ
リルグルコサイド［４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆ
ｅｒｙｌｇｌｕｃｏｓｉｄｅ］の少なくとも一つである
ことが好ましい。The Raman active substance producing enzyme is glucosidase, and the Raman active substance producing substrate is p-nitrophenyl glucoside [p-Nitropheny].
lglucocide] and 4-methylumbelliferyl glucoside [4-methyllumbellif
eryglucoside] is preferable.
【００２１】また、ラマン活性物質生成酵素が、ガラク
トシダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニ
トロフェニルガラクトサイド［ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎ
ｙｌｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ］および４−メチルアンベ
リフェリルガラクトサイド［４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅ
ｌｌｉｆｅｒｙｌｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ］の少なくと
も一つであることが好ましい。The Raman active substance producing enzyme is galactosidase, and the Raman active substance producing substrate is p-nitrophenylgalactoside [p-Nitrophen
ylgalactoside] and 4-methylumbelliferyl galactoside [4-methylumbe
llifelygalactoside].
【００２２】そして、ラマン活性物質生成酵素が、サル
ファターゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニ
トロフェニルサルフェイト［ｐ−Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙ
ｌｓｕｌｆａｔｅ］および４−メチルアンベリフェリル
サルフェイト［４−Ｍｅｔｈｙｌｕｍｂｅｌｌｉｆｅｒ
ｙｌ ｓｕｌｆａｔｅ］の少なくとも一つであることが
好ましい。The Raman active substance producing enzyme is sulfatase, and the Raman active substance producing substrate is p-nitrophenyl sulfate [p-Nitropheny].
sulphate] and 4-methylumbelliferyl sulfate [4-methylumbelliferer
yl sulfate].
【００２３】さらに、ラマン活性物質生成酵素が、ウレ
アーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、尿素および
ブロモクレゾールパープル［Ｂｒｏｍｏｃｒｅｓｏｌ
ｐｕｒｐｌｅ］の少なくとも一つであることが好まし
い。Further, the Raman active substance-forming enzyme is urease, and the Raman active substance-forming substrate is urea and bromocresol purple [Bromocresol.
[purple] is preferable.
【００２４】前記本発明に共通して用いられる表面増強
ラマン散乱生起基質としては、導電性物質が表面増強ラ
マン散乱を生起しやすいという理由から、金属コロイ
ド、金属フィルム、金属フォイル、電極、導電体および
半導体からなる群から選択された少なくとも一つである
ことが好ましい。具体的には、銀コロイド、金コロイ
ド、銀電極、銀フィルム、ＣａＰ等があげられる。The surface-enhanced Raman scattering-inducing substrate commonly used in the present invention includes a metal colloid, a metal film, a metal foil, an electrode, and a conductor, since a conductive substance easily causes surface-enhanced Raman scattering. And at least one selected from the group consisting of semiconductors. Specific examples include colloidal silver, colloidal gold, silver electrodes, silver films, and CaP.
【００２５】[0025]
【発明の実施の形態】つぎに、本発明を具体的に説明す
る。Next, the present invention will be specifically described.
【００２６】本発明の第１番目の分析方法の一例を図１
に基づき説明する。この例は、抗原抗体反応を利用した
例である。FIG. 1 shows an example of the first analysis method of the present invention.
It will be described based on. This example uses an antigen-antibody reaction.
【００２７】すなわち、まず、第１の特異的結合物質で
ある抗体１を、固相７に固定する。この固相７として
は、ポリスチレン、ラテックス、セファロース、ポリア
クリルアミド、アミノ基導入ラテックス等があげられ
る。また、固定の方法は、例えば、物理的吸着法、化学
結合法等があげられる。そして、抗体１に対し、被分析
物質である抗原８を添加し、抗体１に結合させる。そし
て、第２の特異的結合物質である抗体２を添加し、抗原
８に結合させる。この抗体２は、ラマン活性物質生成酵
素３を標識したものである。このようにすると、抗体１
および抗体２が、被分析物質（抗原）８を挟んでサンド
イッチ状に結合して、前記三者が複合体を形成する。な
お、被分析物質（抗原）８と抗体２の添加は同時に行っ
てもよい。そして、前記複合体の形成に関与しなかった
抗体２をＢ／Ｆ分離（Ｂｏｕｎｄ／Ｆｒｅｅ分離）して
除去する。この分離の方法は、イムノアッセイに適用さ
れる従来公知の方法が使用でき、例えば、緩衝液での洗
浄や、クロマト現象を利用した方法等があげられる。つ
いで、前記複合体に対し、ラマン活性物質生成基質４を
添加して酵素反応によりラマン活性物質（生成物）５を
生じさせる。そして、このラマン活性物質を表面増強ラ
マン散乱生起基質（ＳＥＲＳ化基質）６で捕捉する。こ
の捕捉は、先に述べた吸着法等により行うことができ
る。そして、この状態で、前記ラマン活性物質（生成
物）５に対し、励起光を照射し、発生する表面増強ラマ
ン散乱光を測定する。この表面増強ラマン散乱は、生成
したラマン活性物質の量に応じたものであることから、
ラマン活性物質の量が増加すれば強度を高くすることが
可能である。したがって、本発明の分析方法では、被分
析物質の量に比例して検出感度を向上させることが可能
であり、従来の方法では達成できなかったレベルの高感
度分析が可能である。That is, first, the antibody 1 as the first specific binding substance is immobilized on the solid phase 7. Examples of the solid phase 7 include polystyrene, latex, sepharose, polyacrylamide, and amino group-introduced latex. Examples of the fixing method include a physical adsorption method and a chemical bonding method. Then, an antigen 8 which is a substance to be analyzed is added to the antibody 1 to bind to the antibody 1. Then, antibody 2 which is a second specific binding substance is added to bind to antigen 8. The antibody 2 is obtained by labeling the Raman active substance producing enzyme 3. In this way, antibody 1
And the antibody 2 are bound in a sandwich manner with the analyte (antigen) 8 interposed therebetween, and the three form a complex. The analyte (antigen) 8 and the antibody 2 may be added simultaneously. Then, the antibody 2 not involved in the formation of the complex is removed by B / F separation (bound / free separation). As this separation method, a conventionally known method applied to an immunoassay can be used, and examples thereof include a washing with a buffer solution and a method utilizing a chromatographic phenomenon. Next, a Raman active substance-forming substrate 4 is added to the complex to generate a Raman active substance (product) 5 by an enzymatic reaction. Then, the Raman-active substance is captured by a surface-enhanced Raman scattering generation substrate (SERS-substituted substrate) 6. This capture can be performed by the above-described adsorption method or the like. Then, in this state, the Raman-active substance (product) 5 is irradiated with excitation light, and the generated surface-enhanced Raman scattered light is measured. Since this surface-enhanced Raman scattering depends on the amount of the generated Raman active substance,
The strength can be increased by increasing the amount of the Raman active substance. Therefore, in the analysis method of the present invention, the detection sensitivity can be improved in proportion to the amount of the analyte, and a high-sensitivity analysis at a level that cannot be achieved by the conventional method is possible.
【００２８】なお、前記励起光の照射および表面増強ラ
マン散乱の測定は、一般的なラマン散乱測定装置を用い
ることができる。また、測定条件は、用いる酵素や基質
の種類および添加量並びに被分析物質の濃度等により適
宜決定されるが、通常は、アルゴンイオンレーザーの強
度が５０ｍＷ〜２００ｍＷで、この強度が高い程良い。
また、ラマン散乱生起基質は、前記酵素によって生成さ
れたラマン活性物質よりも大過剰であることが望まし
い。The irradiation of the excitation light and the measurement of the surface enhanced Raman scattering can be performed using a general Raman scattering measuring device. The measurement conditions are appropriately determined depending on the types and amounts of the enzymes and substrates to be used, the concentration of the analyte, and the like. Usually, the intensity of the argon ion laser is 50 mW to 200 mW, and the higher the intensity, the better.
It is also desirable that the Raman scattering-inducing substrate is in a large excess of the Raman active substance produced by the enzyme.
【００２９】つぎに、本発明の第２番目の分析方法は、
サブユニット構造をとるラマン活性物質生成酵素を用
い、かつ競合結合反応を利用する方法である。Next, the second analysis method of the present invention is as follows.
This is a method using a Raman active substance-forming enzyme having a subunit structure and utilizing a competitive binding reaction.
【００３０】この方法の具体例を図２に示す。この具体
例は、前述の本発明の第１の方法と同様に、抗原抗体反
応を利用したものである。なお、図において、操作の流
れは、左から右へとなっている。図示のように、まず、
被分析物質（抗原）８とその競合物質である前記第１の
非活性サブユニット３ａを備えた被分析物質８とを準備
し、これに特異的結合物質である抗体１を供給する。す
ると、競合物質が多い場合は、主として競合物質と抗体
１とが複合体を形成し、被分析物質８が多い場合は、主
として被分析物質８と抗体１とが複合体を形成する。同
図では、競合物質において、複合体を形成する場合と複
合体を形成しない場合を示している。そして、これらに
第２の非活性サブユニット３ｂを供給すると、複合体を
形成しない競合物質中の第１の非活性サブユニットにの
み上記第２の非活性サブユニット３ｂが会合し、活性化
されたラマン活性物質生成酵素３が形成される。このと
き複合体における第１の非活性サブユニット３ａは立体
的な構造変化が生じて第２の非活性サブユニット３ｂと
会合不能となっている。この状態で、ラマン活性物質生
成基質を供給すると、酵素反応により、複合体形成に関
与しない競合物質の量に応じて、ラマン活性物質が生成
する。ついで、このラマン活性物質を表面増強ラマン散
乱生起基質に捕捉し、この状態で前記ラマン活性物質に
対し励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱を測
定するのである。FIG. 2 shows a specific example of this method. This specific example utilizes an antigen-antibody reaction as in the first method of the present invention described above. In the drawing, the operation flow is from left to right. As shown,
An analyte (antigen) 8 and an analyte 8 having the first inactive subunit 3a as a competitor thereof are prepared, and the antibody 1 as a specific binding substance is supplied thereto. Then, when there are many competitors, the competitor mainly forms a complex with the antibody 1, and when there are many analytes 8, the analyte 8 and the antibody 1 mainly form a complex. The figure shows the case where a competitor forms a complex and the case where a complex does not form. When the second inactive subunit 3b is supplied thereto, the second inactive subunit 3b associates only with the first inactive subunit in the competitor that does not form a complex, and is activated. Raman active substance producing enzyme 3 is formed. At this time, the first inactive subunit 3a in the complex undergoes a three-dimensional structural change, and is unable to associate with the second inactive subunit 3b. When a substrate for producing a Raman active substance is supplied in this state, a Raman active substance is produced by an enzymatic reaction in accordance with the amount of a competitor which does not participate in complex formation. Next, the Raman-active substance is captured by a substrate for generating surface-enhanced Raman scattering, and in this state, the Raman-active substance is irradiated with excitation light to measure the generated surface-enhanced Raman scattering.
【００３１】このように競合結合反応を利用すれば、被
分析物質の量とラマン散乱強度とが正比例の関係にな
る。前述のように、被分析物質が競合物質より多けれ
ば、主として被分析物質が特異的結合物質と結合し、複
合体形成に関与しない競合物質が増加して発生するラマ
ン散乱強度が強くなる。これとは逆に、被分析物質の量
が競合物質より少なければ、主として競合物質が特異的
結合物質と結合するため、複合体形成に関与しない競合
物質が少なくなりラマン散乱強度が低くなるのである。When the competitive binding reaction is used as described above, the amount of the analyte and the Raman scattering intensity have a directly proportional relationship. As described above, when the amount of the analyte is larger than the competitor, the analyte mainly binds to the specific binding substance, and the intensity of Raman scattering generated by increasing the number of competitors not involved in complex formation increases. Conversely, if the amount of the analyte is smaller than that of the competitor, the competitor mainly binds to the specific binding substance, so that there is less competitor not involved in complex formation and the Raman scattering intensity is lower. .
【００３２】また、この分析方法では、サブユニット構
造をとるラマン活性物質生成酵素を用い、複合体と複合
体形成に関与しなかった物質との分離操作を省略可能と
しており、分析操作が簡単である。Further, in this analysis method, the Raman-active substance-forming enzyme having a subunit structure is used, and the separation operation of the complex and the substance not involved in the complex formation can be omitted. is there.
【００３３】なお、この分析方法に使用されるサブユニ
ット構造をとるラマン活性物質生成酵素としては、例え
ば、β−ガラクトシダーゼがあげられる。As a Raman active substance producing enzyme having a subunit structure used in this analysis method, for example, β-galactosidase can be mentioned.
【００３４】つぎに、本発明の第３番目の分析方法は、
前述の本発明第２の方法と同様に競合結合反応を利用す
る方法である。この方法は、特異的結合物質に対し、被
分析物質とラマン活性物質生成酵素を備えた競合物質と
を競合結合反応させて複合体を形成し、この複合体と前
記複合体の形成に関与しなかった前記ラマン活性物質生
成酵素を備えた競合物質とを分離した後、前記複合体に
対しラマン活性物質生成基質を供給して前記ラマン活性
物質生成酵素と反応させ、生成したラマン活性物質を表
面増強ラマン散乱生起基質に捕捉し、この状態で前記ラ
マン活性物質に対し励起光を照射し、発生する表面増強
ラマン散乱を測定する方法である。Next, the third analysis method of the present invention is as follows.
This is a method utilizing a competitive binding reaction as in the aforementioned second method of the present invention. In this method, a specific binding substance is subjected to competitive binding reaction between an analyte and a competitor provided with a Raman active substance-forming enzyme to form a complex, and the complex is involved in the formation of the complex. After separating the competitor with the Raman active substance-forming enzyme that did not exist, a Raman active substance-forming substrate was supplied to the complex to react with the Raman active substance-forming enzyme, and the generated Raman active substance was added to the surface of the complex. This is a method of capturing surface-enhanced Raman scattering-producing substrates, irradiating the Raman-active substance with excitation light in this state, and measuring the generated surface-enhanced Raman scattering.
【００３５】この方法では、前述の本発明の第２の方法
とは逆に、被分析物質の量とラマン散乱強度とが反比例
の関係になる。すなわち、被分析物質が競合物質より多
ければ、主として被分析物質が特異的結合物質と結合
し、発生するラマン散乱強度が弱くなる。これとは逆
に、被分析物質の量が競合物質より少なければ、主とし
て競合物質が特異的結合物質と結合するため、ラマン散
乱強度が高くなるのである。In this method, contrary to the above-described second method of the present invention, the amount of the analyte and the Raman scattering intensity have an inversely proportional relationship. That is, if the amount of the analyte is larger than that of the competitor, the analyte mainly binds to the specific binding substance, and the generated Raman scattering intensity decreases. Conversely, if the amount of the analyte is smaller than that of the competitor, the Raman scattering intensity increases, mainly because the competitor binds to the specific binding substance.
【００３６】そして、この競合結合法を利用した分析方
法において、ラマン活性物質生成酵素として、ラマン活
性物質生成酵素を備えた被分析物質において、この被分
析物質が特異的結合物質と結合すると失活する酵素を用
いれば、複合体と複合体形成に関与しなかった競合物質
の分離操作を省略することができることは、先に述べた
とおりである。このような酵素としては、例えば、β−
ガラクトシダーゼがあげられる。In the analysis method using the competitive binding method, in the analyte having the Raman active substance-forming enzyme as the Raman active substance-forming enzyme, the analyte is inactivated when the analyte binds to the specific binding substance. As described above, the use of such an enzyme can omit the operation of separating a complex and a competitor that has not been involved in complex formation. Such enzymes include, for example, β-
Galactosidase.
【００３７】つぎに、実施例について説明する。なお、
以下にいう「ＳＥＲＳ］とは、表面増強ラマン散乱をい
う。Next, an embodiment will be described. In addition,
“SERS” referred to below means surface enhanced Raman scattering.
【００３８】[0038]
【実施例１】 （銀コロイド溶液の調製）１ｍＭ硝酸銀５０ｍｌと２ｍ
Ｍ水素化ホウ素ナトリウム１５０ｍｌを氷冷下にて攪拌
しながら混和し還元させて、銀コロイド溶液を調製し
た。この最大吸収波長は、３９０ｎｍであった。なお、
使用したビーカ等の器具類は、精製水または蒸留水で洗
浄し、極力、塩類等のコンタミネーションを避けるよう
に注意した。Example 1 (Preparation of colloidal silver solution) 50 ml of 1 mM silver nitrate and 2 m
150 ml of M sodium borohydride was mixed and reduced with stirring under ice-cooling to prepare a silver colloid solution. This maximum absorption wavelength was 390 nm. In addition,
The instruments such as beakers used were washed with purified water or distilled water, and care was taken to avoid contamination with salts and the like as much as possible.
【００３９】（酵素反応条件）１０-6ｍｏｌ／ｍｌｏ−
フェニレンジアミン１０ｍｌ（１００ｍＭ燐酸緩衝液・
ｐＨ５に溶解）に３０％過酸化水素１３．６μｌを添加
した。これに５μｇ／ｍｌペルオキシダーゼ（ＰＯＤ，
オリエンタル酵母社製）１０μｌを添加し、３０℃で２
０分間酵素反応させたところ、最大吸収波長４２０nmの
アゾ化合物が生成した。このアゾ化合物の生成反応を図
３に示す。(Enzyme reaction conditions) 10 -6 mol / ml-
10 ml of phenylenediamine (100 mM phosphate buffer
(dissolved in pH 5) 13.6 μl of 30% hydrogen peroxide was added. 5 μg / ml peroxidase (POD,
Oriental Yeast Co., Ltd.) (10 μl), and add
When the enzyme reaction was performed for 0 minutes, an azo compound having a maximum absorption wavelength of 420 nm was generated. FIG. 3 shows the reaction for producing the azo compound.
【００４０】（ＳＥＲＳ生起条件）前記銀コロイド溶液
と酵素反応液を９：１の体積割合で混合し、アルゴンレ
ーザー（励起波長５１４ｎｍ、出力５０ｍＷ）でＳＥＲ
Ｓ測定（波数１４４２cm-1）を行った。なお、このとき
の測定装置は、プリンストン社製のものを用いた。その
ＳＥＲＳスペクトルを図４に示す。なお、酵素反応前の
各試薬は、ＳＥＲＳが生起しないことを予め確認した。
すなわち、酵素反応時と同じ濃度の０．１３６％過酸化
水素、０．１％ＰＯＤ及び１０-6ｍｏｌ／ｍｌｏ−フェ
ニレンジアミンのＳＥＲＳを測定した。その結果、それ
ぞれ図５、図６および図７のグラフに示すように、いず
れもＳＥＲＳの生起は認められなかった。(SERS Occurrence Conditions) The silver colloid solution and the enzyme reaction solution were mixed at a volume ratio of 9: 1, and SER was performed with an argon laser (excitation wavelength: 514 nm, output: 50 mW).
An S measurement (wave number 1442 cm -1 ) was performed. In this case, a measuring device manufactured by Princeton was used. FIG. 4 shows the SERS spectrum. In addition, it was previously confirmed that SERS did not occur in each reagent before the enzyme reaction.
That is, SERS of 0.136% hydrogen peroxide, 0.1% POD and 10 -6 mol / ml of o-phenylenediamine at the same concentration as in the enzyme reaction were measured. As a result, as shown in the graphs of FIGS. 5, 6, and 7, no occurrence of SERS was observed.
【００４１】（ＳＥＲＳ−酵素イムノアッセイ）免疫測
定用マイクロプレートに１０μｇ／ｍｌヤギ抗マウスＩ
ｇＧ（ポリクローナル抗体、ＭＢＬ社製）１００μｌを
添加し、室温で２時間インキュベートした後、０．５％
ＢＳＡ（牛血清アルブミン）でブロッキングを４℃で１
２時間行った。この感作プレートに、１０、５、２．
５、１.２５、０．６２５、０.３１５、０.１５７５ｎ
ｇ／ｍｌのマウスＩｇＧ（ダコ社製）を１００μｌずつ
添加し、室温で１時間反応させた後、Ｂ／Ｆ分離後、洗
浄した。これに、抗マウスＩｇＧ−ＰＯＤ標識抗体（ダ
コ社製）１００μｌ添加して、１時間反応させた後、Ｂ
／Ｆ分離洗浄した。ついで、０.１Ｍ燐酸クエン酸緩衝
液（ｐＨ５.０）に溶解した１２ｍＭｏ−オルトフェニ
レンジアミン−０.１３６％過酸化水素００μｌを添加
し、２０分間反応させた。その反応液について、前記の
ＳＥＲＳ生起条件と同様にしてＳＥＲＳ測定を行った。
その強度とマウスＩｇＧ（抗原）の濃度との関係をプロ
ットしたところ、図８に示す検量線が得られた。(SERS-enzyme immunoassay) 10 μg / ml goat anti-mouse I
After adding 100 μl of gG (polyclonal antibody, MBL) and incubating at room temperature for 2 hours, 0.5%
Block with BSA (bovine serum albumin) at 4 ° C for 1
Performed for 2 hours. This sensitized plate was added to 10, 5, 2,.
5, 1.25, 0.625, 0.315, 0.1575n
100 μl of g / ml mouse IgG (manufactured by Dako) was added thereto, and the mixture was reacted at room temperature for 1 hour, followed by B / F separation and washing. To this was added 100 μl of an anti-mouse IgG-POD labeled antibody (manufactured by Dako), and reacted for 1 hour.
/ F separation washing. Next, 00 μl of 12 mM o-orthophenylenediamine-0.136% hydrogen peroxide dissolved in 0.1 M phosphate citrate buffer (pH 5.0) was added, and the mixture was reacted for 20 minutes. The SERS measurement was performed on the reaction solution in the same manner as in the SERS occurrence conditions described above.
When the relationship between the intensity and the concentration of mouse IgG (antigen) was plotted, the calibration curve shown in FIG. 8 was obtained.
【００４２】これによれば、検出限界は、０．５ｎｇ／
ｍｌ未満であり、従来の分析方法に比べ、高感度である
ことがわかる。According to this, the detection limit is 0.5 ng /
ml, which indicates that the sensitivity is higher than that of the conventional analysis method.
【００４３】[0043]
【発明の効果】以上のように、本発明の分析方法は、従
来の表面増強ラマン散乱を利用した分析方法がなし得な
かった高いレベルの検出および測定が可能な分析方法で
ある。また、その操作も簡便なものであることから、実
施が容易である。したがって、本発明の分析方法の適用
により、臨床検査、生化学分析、医薬品の品質管理等の
分野において、検査や分析の信頼性が向上するようにな
る。As described above, the analysis method of the present invention is an analysis method capable of high-level detection and measurement that could not be achieved by the conventional analysis method using surface-enhanced Raman scattering. In addition, since the operation is simple, the operation is easy. Therefore, by applying the analysis method of the present invention, the reliability of testing and analysis is improved in fields such as clinical testing, biochemical analysis, and quality control of pharmaceuticals.
【図１】本発明の一例における概念を説明する模式図で
ある。FIG. 1 is a schematic diagram illustrating the concept of an example of the present invention.
【図２】本発明のその他の例における概念を説明する模
式図である。FIG. 2 is a schematic diagram illustrating a concept in another example of the present invention.
【図３】本発明の一実施例におけるＰＯＤによるｏ−フ
ェニレンジアミンと過酸化水素の酸化縮合反応を示す図
である。FIG. 3 is a diagram showing an oxidative condensation reaction of o-phenylenediamine and hydrogen peroxide by POD in one example of the present invention.
【図４】前記実施例における酵素反応生成物のＳＥＲＳ
スペクトル図である。FIG. 4 shows the SERS of the enzyme reaction product in the above example.
It is a spectrum diagram.
【図５】前記実施例における過酸化水素液のＳＥＲＳス
ペクトル図である。FIG. 5 is a SERS spectrum diagram of a hydrogen peroxide solution in the example.
【図６】前記実施例におけるペルオキシダーゼのＳＥＲ
Ｓスペクトル図である。FIG. 6: SER of peroxidase in the above example
It is an S spectrum figure.
【図７】前記実施例におけるｏ−フェニレンジアミンの
ＳＥＲＳスペクトル図である。FIG. 7 is a SERS spectrum diagram of o-phenylenediamine in the example.
【図８】前記実施例におけるＳＥＲＳー酵素イムノアッ
セイにおけるマウスＩｇＧ濃度とＳＥＲＳ強度との関係
を示すグラフである。FIG. 8 is a graph showing the relationship between mouse IgG concentration and SERS intensity in the SERS-enzyme immunoassay in the above example.
１ 抗体 ２ 抗体 ３ 酵素 ４ 酵素基質 ５ 生成物 ６ ＳＥＲＳ化基質 ７ 固相 ８ 抗原 DESCRIPTION OF SYMBOLS 1 Antibody 2 Antibody 3 Enzyme 4 Enzyme substrate 5 Product 6 SERS-ized substrate 7 Solid phase 8 Antigen
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献 特開 平３−164195（ＪＰ，Ａ) 特開 平７−146295（ＪＰ，Ａ) Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅ ｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．182（1989）ｐ 388−398 Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅ ｍ．Ｖｏｌ．308（1991）ｐ227−237 ＡｃｔａＢｉｏｃｈｉｍｉｉｃａＰｏ ｌｏｎｉｃａ Ｖｏｌ．26，Ｎｏ．４ （1979）ｐ327−333 Ａｄｖ．Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃ．Ｖｏ ｌ．16（1988）ｐ91−153 化学の領域増刊号Ｎｏ．140（1983) ｐ83−100 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 21/64 - 21/65 G01N 33/543 G01N 33/566 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＪＩＣＳＴファイル（ＪＯＩＳ) ＷＰＩ／Ｌ（ＱＵＥＳＴＥＬ)──────────────────────────────────────────────────続 き Continuation of the front page (56) References JP-A-3-164195 (JP, A) JP-A-7-146295 (JP, A) Analytical Biochemistry Vol. 182 (1989) pp. 388-398. Electroanal. Chem. Vol. 308 (1991) pp. 227-237 ActaBiochimicaPolonica Vol. 26, No. 4 (1979) p327-333 Adv. Spectrosc. Vol. 16 (1988) pp. 91-153 Special Issue on Chemistry, No. 140 (1983) p83-100 (58) Fields investigated (Int. Cl. 6 , DB name) G01N 21/64-21/65 G01N 33/543 G01N 33/566 BIOSIS (DIALOG) JICST file (JOIS) WPI / L (QUESTEL)
Claims (16)
質生成酵素を備えた第２の特異的結合物質と、被分析物
質とを結合反応させて、前記三者の複合体を形成し、こ
の複合体と前記複合体の形成に関与しない前記第２の特
異的結合物質とを分離した後、前記複合体に対しラマン
活性物質生成基質を供給して前記第２の特異的結合物質
の前記酵素と反応させ、ついで生成したラマン活性物質
を表面増強ラマン散乱生起基質に捕捉し、この状態で前
記ラマン活性物質に対し励起光を照射し、発生する表面
増強ラマン散乱を測定する分析方法。1. A binding reaction between a first specific binding substance, a second specific binding substance provided with a Raman active substance-forming enzyme, and an analyte to form a complex of the three. Separating the complex and the second specific binding substance not involved in the formation of the complex, and then supplying a Raman active substance-forming substrate to the complex to form the second specific binding substance. An analysis method comprising reacting the enzyme with the enzyme, and then capturing the generated Raman active substance on a surface-enhanced Raman scattering generating substrate, irradiating the Raman active substance with excitation light in this state, and measuring the generated surface-enhanced Raman scattering.
れている請求項１記載の分析方法。2. The analysis method according to claim 1, wherein the first specific binding substance is immobilized on a solid phase.
結合反応する競合物質として、第２の非活性サブユニッ
トと会合すると活性型のラマン活性物質生成酵素が生成
し、前記競合物質が前記特異的結合物質と結合すると前
記第２の非活性サブユニットと会合しない第１の非活性
サブユニットを備えた被分析物質を用いる分析方法であ
り、前記特異的結合物質に対し前記競合物質と被分析物
質とを競合結合反応させて複合体を形成し、ついで前記
第２の非活性サブユニットを供給して前記複合体の形成
に関与しなかった競合物質の第１の非活性サブユニット
に前記第２の非活性サブユニットを会合させて活性型の
ラマン活性物質生成酵素を形成させ、このラマン活性物
質生成酵素にラマン活性物質生成基質を供給して反応さ
せ、ついで生成したラマン活性物質を表面増強ラマン散
乱生起基質に捕捉し、この状態で、前記ラマン活性物質
に対し励起光を照射し、発生する表面増強ラマン散乱を
測定する分析方法。3. An active Raman active substance-forming enzyme is produced as a competitor which reacts competitively with an analyte with respect to a specific binding substance when it associates with a second non-active subunit. An analysis method using an analyte having a first inactive subunit that does not associate with the second inactive subunit when bound to a specific binding substance, wherein the analyte binds to the specific binding substance with the competitor. A complex is formed by subjecting the analyte to a competitive binding reaction, and then the second non-active subunit is supplied so that the first non-active subunit of the competitor that has not been involved in the formation of the complex is added to the first non-active subunit The second inactive subunit was associated to form an active Raman active substance-forming enzyme, and a Raman active substance-forming substrate was supplied to the Raman active substance-forming enzyme to cause a reaction. An analysis method in which a Raman-active substance is captured by a surface-enhanced Raman-scattering substrate, and in this state, the Raman-active substance is irradiated with excitation light to measure generated surface-enhanced Raman scattering.
ットを備えた被分析物質に代えて、第１の非活性サブユ
ニットを備えた被分析物質類似物を用いる請求項３記載
の分析方法。4. The analysis method according to claim 3, wherein an analyte analog having the first inactive subunit is used as the competitor instead of the analyte having the first inactive subunit. .
活性物質生成酵素を備えた競合物質とを競合結合反応さ
せて複合体を形成し、この複合体と前記複合体の形成に
関与しなかった前記ラマン活性物質生成酵素を備えた競
合物質とを分離した後、前記複合体に対しラマン活性物
質生成基質を供給して前記競合物質のラマン活性物質生
成酵素と反応させ、生成したラマン活性物質を表面増強
ラマン散乱生起基質に捕捉し、この状態で前記ラマン活
性物質に対し励起光を照射し、発生する表面増強ラマン
散乱を測定する分析方法。5. A complex is formed by subjecting an analyte and a competitor provided with a Raman active substance-forming enzyme to a competitive binding reaction with a specific binding substance to form a complex, and the complex is involved in the formation of the complex. After separating the competitor with the Raman active substance-forming enzyme that did not exist, a Raman active substance-forming substrate was supplied to the complex to react with the Raman active substance-forming enzyme of the competitor, and the Raman activity generated An analytical method in which a substance is captured by a substrate that causes surface-enhanced Raman scattering, and the Raman-active substance is irradiated with excitation light in this state to measure the generated surface-enhanced Raman scattering.
えた被分析物質であり、前記競合物質中のラマン活性物
質生成酵素は、前記競合物質中の被分析物質と特異的結
合物質が結合すると失活する酵素であり、複合体と前記
複合体の形成に関与しなかった前記ラマン活性物質生成
酵素を備えた競合物質とを分離することなく前記ラマン
活性物質生成酵素の反応を行う請求項５に記載の分析方
法。6. The competitor is an analyte provided with a Raman active substance synthase, and the Raman active substance synthase in the competitor binds to the analyte and a specific binding substance in the competitor. 6. The reaction of the Raman-active substance-forming enzyme without separating the complex and a competitor comprising the Raman-active substance-forming enzyme that did not participate in the formation of the complex. Analysis method described in 1.
素を備えた被分析物質に代えて、ラマン活性物質生成酵
素を備えた被分析物質類似物を用いる請求項６記載の分
析方法。7. The analysis method according to claim 6, wherein an analyte analog having a Raman active substance-forming enzyme is used instead of the analyte having a Raman active substance-forming enzyme as the competitor substance.
請求項５〜７のいずれか一項に記載の分析方法。8. The analysis method according to claim 5, wherein the specific binding substance is immobilized on a solid phase.
ラマン活性を有せずかつ酵素反応生成物のみがラマン活
性を有するもの、または前記酵素基質がラマン活性を有
するが酵素反応生成物のラマン活性シグナルと区別でき
るものである請求項１〜８のいずれか一項に記載の分析
方法。9. A Raman-active substance-forming enzyme, wherein the substrate has no Raman activity and only the enzyme reaction product has Raman activity, or the enzyme substrate has Raman activity but the Raman The analysis method according to any one of claims 1 to 8, which can be distinguished from an activity signal.
ダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、２，２´−
アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−サル
フォニックアシッド）、ｏ−フェニレンジアミン、３，
３´，５，５´−テトラメチルベンジジン、ｏ−ジアニ
シジン、５−アミノサリシリックアシッド、３，３´−
ジアミノベンゼン、３−アミノ−９−エチルカルバゾー
ル、４−クロロ−１−ナフトールからなる群から選択さ
れた少なくとも一つのラマン活性物質生成基質である請
求項１〜９のいずれか一項に記載の分析方法。10. The Raman active substance producing enzyme is peroxidase, and the Raman active substance producing substrate is 2,2′-
Azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid), o-phenylenediamine, 3,
3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine, o-dianisidine, 5-aminosalicylic acid, 3,3'-
The analysis according to any one of claims 1 to 9, which is at least one Raman active substance-forming substrate selected from the group consisting of diaminobenzene, 3-amino-9-ethylcarbazole, and 4-chloro-1-naphthol. Method.
フォスファターゼであり、ラマン活性物質生成基質が、
ｐ−ニトロフェニルフォスフェイト、５−ブロモ−４−
クロロ−３−インドリルフォスフェイト、ファーストレ
ッドフォスフェイト、４−メチルアンベリフェリルホス
フェイトからなる群から選択された少なくとも一つのラ
マン活性物質生成基質である請求項１〜９のいずれか一
項に記載の分析方法。11. The Raman active substance-forming enzyme is alkaline phosphatase, and the Raman active substance-forming substrate is
p-nitrophenyl phosphate, 5-bromo-4-
It is at least one Raman-active substance-forming substrate selected from the group consisting of chloro-3-indolyl phosphate, fast red phosphate, and 4-methylambelliferyl phosphate, according to any one of claims 1 to 9, Analysis method as described.
ダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニトロ
フェニル−グルコサイドおよび４−メチルアンベリフェ
リルグルコサイドの少なくとも一つのラマン活性物質生
成基質である請求項１〜９のいずれか一項に記載の分析
方法。12. The Raman active substance-forming enzyme is glucosidase, and the Raman active substance-forming substrate is at least one Raman active substance-forming substrate of p-nitrophenyl-glucoside and 4-methylambelliferyl glucoside. The analysis method according to claim 1.
シダーゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニト
ロフェニル−ガラクトサイドおよび４−メチルアンベリ
フェリルガラクトサイドの少なくとも一つのラマン活性
物質生成基質である請求項１〜９のいずれか一項に記載
の分析方法。13. The Raman active substance-forming enzyme is galactosidase, and the Raman active substance-forming substrate is at least one Raman active substance-forming substrate of p-nitrophenyl-galactoside and 4-methylumbelliferyl galactoside. The analysis method according to claim 1.
ターゼであり、ラマン活性物質生成基質が、ｐ−ニトロ
フェニルサルフェイトおよび４−メチルアンベリフェリ
ルサルフェイトの少なくとも一つのラマン活性物質生成
基質である請求項１〜９のいずれか一項に記載の分析方
法。14. The Raman active substance-forming enzyme is a sulfatase, and the Raman active substance-forming substrate is at least one Raman active substance-forming substrate of p-nitrophenyl sulfate and 4-methylambelliferyl sulfate. The analysis method according to claim 1.
ゼであり、ラマン活性物質生成基質が、尿素およびブロ
モクレゾールパープルの少なくとも一つのラマン活性物
質生成基質である請求項１〜９のいずれか一項に記載の
分析方法。15. The method according to claim 1, wherein the Raman active substance-forming enzyme is urease, and the Raman active substance-forming substrate is at least one Raman active substance-forming substrate of urea and bromocresol purple. Analysis method as described.
コロイド、金属フィルム、金属フォイル、電極、導電体
および半導体からなる群から選択された少なくとも一つ
である請求項１〜１５のいずれか一項に記載の分析方
法。16. The surface-enhanced Raman scattering generating substrate is at least one selected from the group consisting of a metal colloid, a metal film, a metal foil, an electrode, a conductor, and a semiconductor. Analysis method described in 1.
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| Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｖｏｌ．１８２（１９８９）ｐ３８８−３９８ |
| Ｊ．Ｅｌｅｃｔｒｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ．３０８（１９９１）ｐ２２７−２３７ |
| 化学の領域増刊号Ｎｏ．１４０（１９８３）ｐ８３−１００ |
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