JP2955653B2

JP2955653B2 - 絹蛋白質／コラーゲン複合体およびその製造方法

Info

Publication number: JP2955653B2
Application number: JP3301098A
Authority: JP
Inventors: 益裕塚田; 昭白田
Original assignee: NORINSUISANSHO SANSHI KONCHU NOGYO GIJUTSU KENKYUSHO
Current assignee: NORINSUISANSHO SANSHI KONCHU NOGYO GIJUTSU KENKYUSHO
Priority date: 1998-02-16
Filing date: 1998-02-16
Publication date: 1999-10-04
Anticipated expiration: 2018-02-16
Also published as: JPH11228837A

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、絹蛋白質／コラー
ゲン複合体およびそれらの製造方法に関わり、更に詳し
くは、昆虫生体高分子の絹蛋白質と、生体結合組織の主
要な蛋白質であり、各種バイオ材料として利用価値の高
いコラーゲンとを水性溶液または水性分散液の状態で混
合することによって製造できる素材であり、優れた生体
適合性を持つ絹蛋白質／コラーゲン複合体およびこれら
の製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】絹蛋白質は、カイコなどの昆虫が生産す
る昆虫生体高分子であり、従来から衣料材料として利用
されてきた。絹蛋白質繊維が染色性、吸・放湿性、力学
的特性などの実用特性に優れているため、従来より衣料
材料として重宝されてきた。最近、絹蛋白質が有する優
れた生体適合性に着目し、先端分野の医用材料として利
用され始めるようになった。外科手術用縫合糸に絹糸を
用いる歴史は１１世紀にまで遡るといわれ、細菌処理が
容易で、体内に埋め込んでも抗原抗体反応が起こり難い
ことから、付加価値の高いバイオ材料や医用材料として
の利用が可能となりつつある。

【０００３】末梢静脈内試料被膜系留置法で、絹フィブ
ロイン膜を静脈内に２週間留置しても、絹フィブロイン
膜表面には血液の凝固が認められないことが知られてい
る。このことから、絹蛋白質膜は血液と接触しても血液
凝固が起こり難く、血液適合性の高い素材として使用で
きる。また、絹蛋白質膜は、その表面では生体細胞が良
好に付着増殖するので、バイオ材料としても利用でき
る。例えば、絹フィブロイン膜を１０％仔牛血清を含ん
だマウス由来の繊維芽細胞浮遊液に浸漬して細胞を培養
すると、絹フィブロイン膜表面に細胞が良好に付着し、
増殖することが確認されており（特公平４−４１５９５
号）、絹フィブロインを細胞培養床基材として利用する
ことにより、有用な細胞を低コストで、かつ効率的に培
養できる見通しが得られている。かくして、絹蛋白質
を、細胞工学や免疫工学分野で利用できる。

【０００４】一方、コラーゲンは、動物由来の生体結合
組織の主要な蛋白質であり、皮膚、血管、骨、歯など多
くの組織に分布する。このコラーゲンは、天然生体高分
子の中にあって、優れた生体機能を持ち、人工血管、人
工臓器の材料として広く利用されていると共に、抗原抗
体反応のメカニズムが分子レベルで解析されている。コ
ラーゲンからなる繊維、膜は比較的優れた強度特性を示
し、かつ生体組織との適合性が良いので、縫合糸として
用いられている。コラーゲンはバイオ材料として重要視
されており、また、コラーゲンの変性物であるゼラチン
は人工臓器材料の表面被覆材としてなくてはならない材
料である。コラーゲンは生体細胞や組織と優れた親和性
を持つため、組織の治癒を促し自己と同等の組織にまで
回復できるバイオ材料としても有望である。また、コラ
ーゲンは血小板粘着、凝集に端を発する血栓形成に関与
していることから、血液適合性に優れたバイオ材料を設
計する上でも有益である。コラーゲンは、膜、糸、スポ
ンジ、ゲルなど各種形状に加工できる。

【０００５】コラーゲンは、分子量が１０万のペプチド
鎖３本から構成され、三重らせんの構造を持つ。この三
重らせん構造の両側には、数十個のアミノ酸からなるテ
ロペプチドが存在する。抗原の原因となるこのテロペプ
チドを蛋白質分解酵素などにより除去したものが、アテ
ロコラーゲンである。

【０００６】このように、昆虫生体高分子の絹蛋白質と
動物由来のコラーゲンとは、それぞれが優れた生体機能
を持つため、医用分野の先端領域で付加価値の高い利用
が可能であるが、絹蛋白質とコラーゲンとの均一な複合
体はいままで得られていない。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】したがって、上記した
絹蛋白質およびコラーゲンのような天然素材を複合化さ
せることにより、各成分が持つそれぞれの優れた機能を
兼ね備えた、またはそれぞれの単独の機能を相乗的に兼
ね備えた新規な生化学素材を得るための製造技術の開発
が望まれてきた。

【０００８】例えば、絹フィブロイン水溶液は中性（ｐ
Ｈ６〜７付近）であるが、この絹フィブロイン水溶液に
コラーゲンの水溶液を混合すると、コラーゲン水溶液が
酸性であるため、混合水溶液のｐＨが絹フィブロインの
等電点３．８〜４．０以下となり、絹フィブロインが沈
殿してしまう。このように、従来技術では、絹フィブロ
イン水溶液とコラーゲン水溶液とは均一に混合できない
という問題点があった。すなわち、従来法により絹フィ
ブロイン水溶液とコラーゲン水溶液とを混合すると、コ
ラーゲン酸性水溶液が混合水溶液のｐＨを低下させ、そ
の結果絹フィブロインのｐＨが等電点以下となるため、
絹フィブロインは沈殿してしまう。かくして、絹フィブ
ロイン水溶液とコラーゲン水溶液とを均一に混合できな
いので、物理的に均一な複合膜を製造することは甚だし
く困難であった。従って、絹フィブロイン水溶液とコラ
ーゲン水溶液とを混合する際に、収率、効率、経済面で
優れ、取り扱いが容易な調製技術であって、かつ絹フィ
ブロインとコラーゲンとを分子レベルで混合させる技術
の開発が望まれている。

【０００９】本発明の目的は、コラーゲンと絹蛋白質と
を水性溶液または水性分散液状態で均一に混合させ、こ
の混合液体から絹蛋白質／コラーゲン複合体を効率的に
且つ経済的に製造することにある。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明の絹蛋白質／コラ
ーゲン複合体は、昆虫由来、例えばカイコ由来の絹蛋白
質繊維から得られる絹蛋白質とコラーゲンとの水性溶液
または水性分散液から得られるものである。

【００１１】前記絹蛋白質としては、カイコが吐糸して
作る繭繊維の外側を膠着するセリシン、または該セリシ
ンを除去して得た絹フィブロイン繊維を中性塩水溶液中
に溶解し、セルロース製の透析膜を用いて透析して得た
水溶性絹フィブロイン、またはカイコ体内より取り出し
た絹糸腺内の水溶性絹セリシンまたは水溶性絹フィブロ
インを用いることができる。

【００１２】前記コラーゲンとしては、分子量１０万の
ペプチド鎖３本から構成されるコラーゲン分子側鎖もし
くはアテロコラーゲン（該コラーゲンの三重らせん構造
の両側にある数十個のアミノ酸からなるテロペプチドを
除去したもの）の分子側鎖の塩基性アミノ基あるいはセ
リン、チロシンの分子側鎖の水酸基にアシル化剤を反応
させて得た水溶性もしくは水分散性のアシル化コラーゲ
ンまたはアシル化アテロコラーゲン（中性ｐＨ域で水に
可溶となる）を用いることができる。このアシル化剤と
して、Ｃ₁〜Ｃ₄の二塩基酸の無水物またはＣ₁〜Ｃ₅の一
塩基酸の無水物を用いることが好ましい。また、アシル
化アテロコラーゲンは、サクシニル化アテロコラーゲ
ン、ミリスチル化アテロコラーゲン、または両者の混合
物であることが好ましい。

【００１３】前記コラーゲンとして、動物皮革由来のコ
ラーゲンからテロペプチドを蛋白質分解酵素で除去して
得られるアテロコラーゲンを使用してもよい。

【００１４】本発明の絹蛋白質／コラーゲン複合体の製
造法は、コラーゲンもしくはアテロコラーゲンをアシル
化して得たアシル化コラーゲンまたはアシル化アテロコ
ラーゲンと絹蛋白質との水性溶液または水性分散液から
膜状、ゲル状、粉末状または繊維状の絹蛋白質／コラー
ゲン複合体を得ることを特徴とする。

【００１５】前記絹蛋白質／コラーゲン複合体は、生理
活性物質、抗生物質、酵素、ホルモン、生体細胞、また
は微生物などを固定させるために使用できる。

【００１６】

【発明の実施の形態】本発明の絹蛋白質／コラーゲン複
合体は、化学反応性に富むリジン、アルギニン、ヒスチ
ジンなどの塩基性アミノ基を多く含んだ絹蛋白質と化学
修飾したコラーゲンまたはアテロコラーゲンとから構成
されるものであり、両者の試料から複合体を調製した
後、所望により、常法にしたがって化学架橋剤、例え
ば、エポキシ化合物と反応させることにより任意の架橋
度とすることができるので、水に対する溶解度を所望に
応じて制御できる。

【００１７】本発明で用いる絹蛋白質繊維としては、家
蚕（Bombyx mori）幼虫から得られる家蚕絹糸の他に、
野蚕に属する柞蚕、天蚕、エリ蚕、ムガ蚕、シンジュ蚕
の幼虫から得られる野蚕絹糸またはこれらの繊維製品の
何れであっても使用できる。

【００１８】絹蛋白質繊維（絹糸）を溶解するために
は、塩化カルシウム、硝酸カルシウム、臭化リチウム、
チオシアン酸リチウムなどの中性塩の濃厚溶液中に絹糸
を入れ加熱する方法が用いられる。溶解条件は、絹蛋白
質の分子量を著しく低下させないことを基本とする。中
性塩濃度は８．０〜９．８重量％程度であればよく（濃
い程良好）、溶解温度は２５〜７０℃程度であればよ
い。溶解温度は６０℃以下が好ましい。溶解温度が高温
になると絹蛋白質の分子量が低下し、素材の高分子性が
失われてしまう危険性がある。また、溶解時間は１〜２
０分程度に設定することが好ましい。中性塩の中でも絹
蛋白質繊維を良好に溶解するのは、絹フィブロイン繊維
の溶解力に優れたリチウム塩であり、通常は臭化リチウ
ムが好ましい。８Ｍ以上、好ましくは８．５Ｍ以上の臭
化リチウムであれば、５５℃以上で１５分で絹蛋白質繊
維は溶解する。

【００１９】絹蛋白質繊維を溶解した中性塩溶液から純
粋な絹蛋白質水溶液を得るには、絹蛋白質の中性塩水溶
液をセルロース製の透析膜にいれ、両端を縫糸でくくっ
て室温の水道水または純水に４−５日間入れ、リチウム
イオンを完全に除くことが必要である。

【００２０】本発明で用いるコラーゲンは、例えば、次
のようにして得られる。仔牛皮膚の真皮を細かく切断
し、クエン酸緩衝液を用い抽出する。抽出液を分離し、
新しいクエン酸緩衝液で２回目の抽出を行う。これをガ
ラスフィルターなどを用いて濾過した後、Ｎａ₂ＨＰＯ₄
を用いて透析する。コラーゲンの沈殿を遠心分離で集め
る。水洗い後、クエン酸緩衝液での再溶解、Ｎａ₂ＨＰ
Ｏ₄透析を繰り返す。可溶性コラーゲンはこのように沈
殿、再溶解を繰り返すことで得られる。

【００２１】コラーゲンまたはアテロコラーゲンをアシ
ル化、例えば、サクシニル化したり、またはミリスチル
化したりすることで製造できる化学修飾コラーゲンおよ
びアテロコラーゲンは、中性のｐＨ領域で水に可溶にな
るという特性がある。そのため、この化学修飾コラーゲ
ンまたはアテロコラーゲンを絹蛋白質水溶液と混合して
も絹蛋白質が凝固しない。

【００２２】以下、コラーゲンを例にとり説明するが、
アテロコラーゲンの場合も同じである。化学修飾を施し
てない未変性状態のコラーゲンは、その等電点（ｐＨ）
が９．１であり、等電点を５以下にすると水溶性とな
る。コラーゲン分子のリジン側鎖を、例えば、サクシニ
ル化すると、等電点が４．５７となり、中性領域のｐＨ
で沈殿を生ずることなく可溶化する。すなわち、可溶性
コラーゲンは、酸性水溶液中で可溶であるが、この水溶
液のｐＨを上げるとｐＨ５以上で繊維再生が起こり沈殿
してしまう。しかし、サクシニル化、ミリスチル化など
のアシル化により化学修飾したコラーゲンにはサクシニ
ル基やミリスチル基などのアシル基が十分に導入され、
または導入された分子中にＣＯＯＨ基が付加するため負
電荷リッチな分子環境にあり、中性ｐＨ領域においても
水溶性を示すので、絹蛋白質水溶液と、化学修飾した、
中性領域で可溶性のコラーゲンの水溶液とを均一に混合
でき、または絹蛋白質水溶液中に化学修飾したコラーゲ
ンをもしくは化学修飾したコラーゲンの水溶液中に絹蛋
白質を均一に添加・混合できる。

【００２３】コラーゲンを水に溶解させるようにするた
めの化学修飾方法としては、例えば、コラーゲンと二塩
基酸無水物としてのコハク酸無水物とを反応させるサク
シニル化反応、コラーゲンと一塩基酸無水物としてのミ
リスチン酸無水物とを反応させるミリスチル化反応など
の従来の反応を利用できる。コラーゲンは、こうした反
応により化学修飾されると、中性ｐＨ領域で水に可溶と
なり、絹蛋白質水溶液と複合化できるようになる。ま
た、コラーゲンの電荷状態が変わることから、血液との
反応性、細胞との相互作用、コラーゲンのＨＬＢ(hydro
philic-lipophilic balance)を容易に制御できる。さら
に、血小板の粘着凝集反応を制御できることから、抗血
栓表面を容易に形成せしめることが可能になる。

【００２４】本発明で用いる、例えば、スクシニル化処
理、ミリスチル化処理などのアシル化処理は次のように
して行われる。コラーゲンを処理するためのアシル化
剤、例えば、スクシニル化剤およびミルスチル化剤など
の溶解可能な有機溶媒としては、ジメチルホルムアミ
ド、ジメチルスルホキシドの他、ピリジン、氷酢酸／酢
酸混合溶媒などの使用も可能である。これらの有機溶媒
の中で触媒効果を持つピリジンは特に優れた効果を発揮
する。ジメチルホルムアミドなどの溶媒に反応触媒であ
るピリジンを添加した混合溶液系の使用も可能である。
処理溶媒中の無水物の濃度は５〜３０重量％、望ましく
は１０〜２０重量％の範囲に設定するのがよい。処理条
件としては処理溶媒中で３０℃以上で１時間以上処理す
ることが望ましい。

【００２５】本発明においては、サクシニル化剤、ミリ
スチル化剤のようなアシル化剤は、コラーゲンに対し
て、乾燥物基準で、３〜２０重量％、好ましくは５〜１
５重量％が導入されるような量で反応させると良い。ア
シル化剤としては、Ｃ₁〜Ｃ₄二塩基酸の無水物、例え
ば、Ｃ₁：ジクリコール酸、Ｃ₂：コハク酸、Ｃ₃：グル
タル酸、またはＣ₄：アジビン酸が含まれ、また、Ｃ₁〜
Ｃ₁₅一塩基酸の無水物、例えば、Ｃ₁：酢酸、Ｃ₂：プロ
ピオン酸、Ｃ₅：カプロン酸、Ｃ₈：カプリル酸、Ｃ₁₁：
ラウリル酸、Ｃ₉：ミリスチン酸、またはＣ₁₅：パルミ
チン酸を使用することができる。

【００２６】本発明において化学修飾剤（アシル化剤）
を反応させる場合、コラーゲンの反応活性部位の中で、
リジン、アルギニン、ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸
残基はサクシニル化剤、ミリスチル化剤のようなアシル
化剤に対して強い反応性を持つ。また、これらのアシル
化剤はセリン、チロシンの分子側鎖の水酸基とも反応す
る。しかし、結合の化学安定度がより高いのは、これら
の薬剤とコラーゲンの塩基性の分子側鎖であるリジン、
アルギニン、ヒスチジンなどとが結合した場合である。

【００２７】本発明の絹蛋白質／コラーゲン複合体に抗
生物質などの有効成分を固定化させるには、例えば、複
合体を調製する前の絹蛋白質水溶液とコラーゲン水溶液
とを混合した水溶液に有効成分を溶かし、注意深くゆる
やかに撹拌した後、ポリスチレン、ポリエチレンなどの
基質膜上に広げて水分を蒸発するとよい。有効成分を固
定化した絹蛋白質／コラーゲン複合体を調製するには、
任意濃度の絹蛋白質水溶液あるいはコラーゲン水溶液が
利用できる。しかし、これらの水溶液の取り扱い上、好
ましい絹蛋白質濃度は０．０１〜１０重量％、更に好ま
しくは０．１〜５重量％である。絹蛋白質濃度が１０重
量％を超えると、水溶液の凝固速度が制御し難くなり、
また、０．０１重量％未満だと、試料濃度が希薄すぎ、
試料水溶液量が逆に多過ぎてしまい、コラーゲン水溶液
を混合する際の効率が悪くなる。また、絹蛋白質の希薄
水溶液を用いるとコラーゲン水溶液との混合水溶液の蒸
発乾燥時間が長くなり試料調製上の効率が低下するため
好ましくない。コラーゲン水溶液濃度は０．１〜５重量
％であれば利用できる。好ましいコラーゲン水溶液は
０．１〜３重量％である。５重量％を超えるとコラーゲ
ン水溶液は室温においてゲル化しやすく、蒸発乾固の際
の取り扱いに不都合を生じる。

【００２８】絹蛋白質／コラーゲン複合体に固定できる
有効成分の種類および量は特に制約されるものでなく、
目的に合わせて任意に決めることができる。

【００２９】絹蛋白質水溶液とコラーゲン水溶液との混
合水溶液、または有効物質を含んだこれらの混合水溶液
を蒸発乾燥し、固化してできる複合体は水溶性である。
得られた複合体を水溶液系で使用すると溶解してしまう
ため、水不溶性に変えておくと良い。そのためには、
（１）ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなどのよ
うに蛋白質の分子間に架橋を形成する薬剤による処理、
（２）エチレングリコールジグリシジルエーテルのよ
うな２官能性のエポキシ化合物による化学処理、および
（３）ヘキサメチレンジイソシアネートなどの架橋剤に
よる処理をするとよい。水不溶化処理にあたっては、複
合体に固定した有効成分の活性を低下させないように十
分に配慮すれば、その他一般の試薬による不溶化処理あ
るいは紫外線による照射処理であってもよい。上記処理
（１）および（２）の場合、試薬量を加減し、反応程度
を変えることで複合体の不溶化程度を制御することがで
きる。

【００３０】コラーゲンのサクシニル化は、例えば、ジ
メチルホルムアミドなどの溶媒中に無水コハク酸を溶解
させて反応させるとコラーゲンのリジン残基がサクシニ
ル化され、その結果導入されたリジン残基の分子中にＣ
ＯＯ基が付加する。同様に有機溶媒中でコラーゲンにミ
リスチン酸無水物を反応させるとミリスチル基が導入さ
れてリジン残基に導入された分子中にＣＯＯＨ基が導入
される。こうした化学修飾により調製できる修飾コラー
ゲンの等電点（ｐＨ）は４〜５付近となり、中性付近で
コラーゲン水溶液は沈殿を起こさない。

【００３１】本発明の絹蛋白質／コラーゲン複合体の場
合、各成分の水性溶液もしくは水性分散液をそれぞれ別
個に作成して、その後両者を均一に混合した混合液を、
あるいは、両成分を一緒に均一に混合したもしくは一方
を溶解・分散せしめた液に他方を溶解・分散せしめて均
一に混合した一つの水性溶液または水性分散液を用い
て、これをポリエチレン膜、ポリスチレン膜などの基質
上に広げて水分を蒸発することによって複合膜が得ら
れ、また、これに既知のゲル化剤を添加することによっ
てゲル状複合体が得られ、また、既知の凍結乾燥法に従
って粉末状複合体が得られる。

【００３２】

【実施例】次に本発明を実施例および比較例によりさら
に詳細に説明するが、本発明はこれらの例に限定される
ものではない。なお、絹フィブロインには多くの種類が
あるが、特にことわらない限り、家蚕幼虫に由来する絹
フィブロインを用いた。

【００３３】以下の実施例では、植物性病原細菌とし
て、普遍的な植物性病原細菌の代表であって、耐性菌が
出現しやすく、多くの植物を犯す多犯性の腐敗病菌であ
り、植物性病原細菌の中でも数少ないグラム陽性菌とし
てトマトかいよう病菌（学術名：Corynebacterium mic
higanese pv.michiganese）を選んだ。

【００３４】実施例中の細菌および糸状菌に対する抗菌
活性評価は下記の方法により行った。Ａ．細菌に対す
る抗菌活性検定法：加熱溶解後５５℃に保持した半合成
脇本培地またはキングＢ培地２５ｍｌと、検定菌（濃度
１０^9-10個／ｍｌ）２ｍｌとを混合し、この混合物をシ
ャーレに流し込んで平板状に固めた。この菌液混合平板
培地上に約２ｃｍの長さに切断した検定試料を置き、ピ
ンセットで注意深く検定試料の両端を培地に埋め込み、
膜状の試料全体を培地に密着させた。これを２０〜２５
℃に保ち、所定の経過時間毎に検定試料付近の培地での
菌増殖阻害程度を下記の判定基準により４段階で評価し
た。但し、阻止帯の幅が大きいものについては、実測値
（ｍｍ）で表示した。

【００３５】＋＋：強い（明瞭で幅２ｍｍ以上の菌増殖
阻止帯を形成）＋：弱い（不明瞭な阻止帯、または幅１ｍｍ以下の明瞭
な阻止帯を形成） ±：軽微（わずかに阻害が認められる） −：抗菌活性は認められない。

【００３６】Ｂ．糸状菌に対する抗菌活性検定法：加熱
溶解後５５℃に保持したＰＳＡ培地と、検定菌の胞子液
（濃度１０^5-6個／ｍｌ）２ｍｌとを混合し、この混合
物をシャーレに流し込んで平板状に固め、上記抗菌活性
の評価の場合と同様に観察した。

【００３７】また、試料特性が、本発明のような複合体
とした場合に、どのように変化するかを調べる目的で次
の項目の試験を行った。

【００３８】Ｃ．吸湿性：２０℃、６５％ＲＨに調節し
た恒温恒湿槽中に試料を１週間放置して吸湿量が平衡状
態となったものの重量を計測し、この重量と、平衡状態
の試料を１０５℃で２時間乾燥した後の重量との差より
吸湿率（％）を求めた。

【００３９】Ｄ．機械的特性：絹蛋白質／コラーゲン複
合体の機械的性質（強度および伸度）を測定し、切断時
の試料の強度と伸度を評価した。測定条件は、試料の長
さ１０ｍｍおよび幅２ｍｍ、引張り速度１０ｍｍ／ｍｉ
ｎ、フルスケール２５０ｇであり、（株）島津製作所製
引張り試験機（オートグラフ、形式ＡＧＳ−５Ｄ）によ
り測定した。

【００４０】Ｅ．粘弾性挙動：（株）東洋精機製作所製
レオログラフ・ソリッドＳタイプを用い、昇温速度２℃
／分、測定温度範囲−３０〜２６０℃、測定周波数１０
Ｈｚ、初期張力３０ｇｆ、試料長１０ｍｍ、試料幅２ｍ
ｍで粘弾性挙動を評価した。この測定により試料の力学
的損失ピーク温度を求めた。

【００４１】Ｆ．熱分解温度：理学電機（株）製示差熱
走査測定装置（ＤＳＣ−１０Ａ）を用い、試料重量２．
２ｍｇ、ＤＳＣレンジ２．５ｍｃａｌ／ｓ、昇温速度１
０℃／分で、測定を２００ｃｃ／分の窒素気流中で行っ
た。この測定において２００℃以上に現れる吸熱ピーク
温度を試料の熱分解温度とした。

【００４２】Ｇ．熱分析安定度：理学電機（株）製熱重
量分析（ＴＧＡ）装置を用い、昇温加熱過程における試
料重量変化を窒素雰囲気下で測定した。試料重量３ｍ
ｇ、昇温速度１０℃／ｍｉｎ、ＴＧＡフルスケール５ｍ
ｇの条件で分析を行った。測定開始前の重量を１００と
して、昇温過程で重量残存率が何％かを測定した。

【００４３】Ｈ．熱形態安定度：理学電機（株）製熱機
械測定装置（ＴＭＡ）を用い、昇温過程における膜状の
試料の寸法変化を窒素雰囲気下で測定した。

【００４４】試料の長さ１５ｍｍおよび幅２ｍｍ、昇温
速度１０℃／ｍｉｎ、サンプリングタイム２ｓｅｃ、Ｔ
ＭＡレンジ±１０００μｍの条件で分析を行った。室温
から３５０℃までの間で測定したＴＭＡ結果に基づき、
１８０℃における複合膜の収縮量が測定前の試料長に比
べて何％収縮しているかを評価し、これを熱形態安定度
と呼ぶ。

【００４５】実施例１２．５ｇの家蚕絹糸を５５℃の８．５Ｍ臭化リチウム水
溶液２０ｍｌ中に完全に溶解せしめ、この水溶液をセル
ロース製透析膜にいれて、５℃で５日間純水と置換する
ことで不純物を除去し、純粋な絹フィブロイン水溶液を
調製した。かくして調製された絹フィブロイン水溶液に
蒸留水を加え、絶乾濃度が０．３％となるように絹フィ
ブロイン水溶液の原液を調製した。

【００４６】ミリスチル化アテロコラーゲンは次のよう
にして調製した。仔牛皮膚の真皮を細かく切断し、０．
１５Ｍクエン酸緩衝液（ｐＨ３．６）を用い、１〜２日
間抽出した。抽出液を分離し、同じ濃度の新しいクエン
酸緩衝液で２回目の抽出を行った。これをガラスフィル
ターで濾過した後で、０．０２ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄を用い
て透析した。コラーゲンの沈殿を遠心分離で集め、水洗
い後、０．１５Ｍクエン酸緩衝液で再溶解、０．０２Ｍ
のＮａ₂ＨＰＯ₄透析を繰り返した。水溶性のコラーゲン
は、このような沈殿、再溶解を繰り返すことで得られ
た。このようにして得られた水溶性のコラーゲンの三重
らせん構造の両側には、数十個のアミノ酸からなり、抗
原の原因となるテロペプチドが存在する。コラーゲンの
テロペプチドを選択的に消化し、分子間架橋を切断する
作用を持つ蛋白質分解酵素であるペプシンをコラーゲン
分子に作用させることで水溶性のアテロコラーゲンを調
製した。

【００４７】次いで、ミリスチル化剤としてミリスチン
酸無水物をジメチルホルムアミドに溶解し、これに上記
の方法で調製したアテロコラーゲンを加え、７５℃で１
時間以上反応させることで水溶性のミリスチル化アテロ
コラーゲンを調製した。これを蒸留水に溶解することで
０．３％濃度のミリスチル化アテロコラーゲン水溶液を
調製した。

【００４８】また、スクシニル化アテロコラーゲン水溶
液も上記と同様にして調製した。

【００４９】上記のようにして得られたスクシニル化ま
たはミリスチル化したアテロコラーゲンの０．３％水溶
液に所定量の０．３％絹フィブロイン水溶液原液を加
え、ガラス棒で静かにかつ十分に攪拌したものを、ポリ
エチレン膜上に広げ、１２時間以上の時間をかけて水分
を蒸発させ、透明で、柔軟性のある絹フィブロイン／ア
テロコラーゲン複合膜を製造した。また、この複合膜の
各成分の水溶液についても同様に蒸発乾固せしめて膜を
製造した。上記蒸発乾固は、２５℃、６５％ＲＨ．で行
った。

【００５０】本実施例で得られた膜状試料は、次の通り
である。

【００５１】CSS: ０．３％スクシニル化アテロコラー
ゲン水溶液から得られた膜状試料。

【００５２】SMS: ０．３％ミリスチル化アテロコラー
ゲン水溶液から得られた膜状試料。

【００５３】SF/CMS(1:1): ０．３％家蚕絹フィブロイ
ン水溶液１容量部に０．３％ミリスチル化アテロコラー
ゲン水溶液１容量部を加えた混合水溶液から得られた膜
状試料。

【００５４】SF/CSS(1:1): ０．３％家蚕絹フィブロイ
ン水溶液１容量部に０．３％スクシニル化アテロコラー
ゲン水溶液１容量部を加えた混合水溶液から得られた膜
状試料。

【００５５】SF/CSS(1:2): ０．３％家蚕絹フィブロイ
ン水溶液１容量部に０．３％スクシニル化アテロコラー
ゲン水溶液２容量部を加えた混合水溶液から得られた膜
状試料。

【００５６】SF: ０．３％の絹フィブロイン水溶液から
得られた膜状試料。

【００５７】上記絹フィブロイン膜、アテロコラーゲン
膜、および絹フィブロイン／アテロコラーゲン複合膜の
吸湿率、強度、伸度、熱形態安定度を調べた。得られた
結果を表１に示す。

【００５８】表１ ─────────────────────────────────── 試料吸湿率(%) 強度(kg/mm²) 伸度(%) 熱形態安定度(%) ─────────────────────────────────── CSS 20.0 20.4 4.2 4.4 CMS 21.3 1.6 9.1 11.0 SF/CMS（1:1） 12.7 12.4 8.1 5.9 SF/CSS（1:1） 13 11.9 4.6 1.8 SF/CSS（1:2） 14.7 2.9 6.6 8.2 SF 9.3 3.3 0.8 2.6 ─────────────────────────────────── 表１から明らかなように、１８０℃におけるミリスチル
化アテロコラーゲンのＴＭＡ曲線上の１８０℃には１１
％の大きな収縮が見られるが、スクシニル化アテロコラ
ーゲンでは僅か４．４％の収縮が生ずるだけである。こ
れは、アシル化剤の炭化水素鎖が長くなるにつれて熱分
子運動性が増す事実と良く符合する。

【００５９】表１から見るとおり、絹フィブロイン含量
が増加すると１８０℃におけるＴＭＡ曲線から明らかな
ように試料の収縮量が減少する。本実験例は、本発明の
絹フィブロイン／アテロコラーゲン複合膜の熱形態安定
性の増加を意味するものである。

【００６０】ミリスチル化アテロコラーゲン膜の伸度は
スクシニル化アテロコラーゲン膜の伸度よりも２倍以上
の大きな値となった。スクシニル化アテロコラーゲンの
切断強度は、ミリスチル化アテロコラーゲンよりも高い
値を示す。絹フィブロイン膜は、伸度が小さく、乾燥状
態では僅か０．８％で切断してしまうため、極めて脆
い。ミリスチル化アテロコラーゲンやスクシニル化アテ
ロコラーゲンを複合化することで、脆い絹フィブロイン
の機械的特性の改善が可能となった。

【００６１】実施例２２％のスクシニル化アテロコラーゲン水溶液４ｍｌと
５．１％再生絹フィブロイン水溶液４ｍｌとを等量宛混
合して合計８ｍｌの混合水溶液を調製した。この中に１
０ｍｇのテトラサイクリンを均一に溶解させ、全体が均
一になるまで２時間混合し、この混合水溶液をポリスチ
レン膜の上に広げて、２５℃で、１２時間かけて水分を
蒸発した。こうしてテトラサイクリンを含有する絹フィ
ブロイン／スクシニル化アテロコラーゲン複合膜を調製
した。この膜状試料を２％ホルマリン水溶液に１分間浸
漬して、室温で乾燥させて水不溶化試料（以下、試料
と略記）を調製した。

【００６２】また、２ｍｌの２％絹フィブロイン水溶液
と２ｍｌの２％スクシニル化アテロコラーゲン水溶液と
の混合水溶液を５０℃に加熱した。これとは別に、抗生
物質であるリファンピシン２０ｍｇを含む２０％エタノ
ール水溶液を調製し、このエタノール水溶液１ｍｌを上
記等量混合水溶液に加えた。こうして製造した混合水溶
液をポリエチレン膜上に広げて、室温で水分を蒸発乾燥
させ、絹フィブロイン／スクシニル化アテロコラーゲン
複合膜を調製した。この膜状試料を２％ホルマリン水溶
液に３０秒あるいは５分間の浸漬処理をして不溶化さ
せ、これを標準状態で乾燥させて、２種の膜状試料（以
下、試料、と略記）（試料が３０秒間、試料が
５分間浸漬処理したものである）を調製した。なお、ホ
ルムアルデヒド処理しないものを対照区として用いた
（以下、試料と略記）。

【００６３】このようにして調製した各種膜状の試料
（〜）を３ｍｌの蒸留水を入れた５ｍｌ容量のガラ
ス管に入れて一定時間（０分〜５日）振盪処理をした。
振盪処置後、試料を取り出し標準状態で風乾させ、各経
過時間に対応した試料の抗菌性を評価した。

【００６４】これら試料が植物性病原細菌の増殖に及ぼ
す阻止作用を上記方法にしたがって評価した。得られた
結果を表２に示す。表２中、数値の単位はｍｍである。

【００６５】表２ ─────────────────────────────────── 経過時間試料試料試料試料（浸漬：１分）（浸漬：なし）（浸漬：３０秒）（浸漬：５分） ─────────────────────────────────── ０分＋＋３４３５３４２０分＋＋４０分＋６０分 ± ２２２８２９１日１６２０２０３日１１１３１５５日 − ６７ ─────────────────────────────────── 表２から明らかなように、各試料とも徐放効果を持ち、
特に試料、、の場合、高い徐放効果がある。糸状
菌についても、上記方法にしたがって行われた試験の結
果、各試料とも上記植物性病原細菌の場合と同様糸状菌
の生長阻害効果ならびに徐放効果が得られた。さらに、
結核菌、グラム陽性菌あるいはグラム陰性菌の増殖阻害
効果を示した。

【００６６】実施例３実施例１で用いた絹フィブロイン／アテロコラーゲン複
合膜を２％グルタルアルデヒド水溶液に１５秒間浸漬
し、９８重量％の水分を長時間保持するハイドロゲル状
物質を得た。得られたゲル状物質をそのまま皮膚に塗布
して乾燥させると、本発明の複合体からなる人工皮膚素
材が得られた。

【００６７】０．３％家蚕絹フィブロイン水溶液と０．
３％スクシニル化アテロコラーゲン水溶液との等量混合
水溶液を静かに攪拌してポリスチレン膜上に広げて水分
を蒸発乾燥し、固化することで絹フィブロイン／スクシ
ニル化アテロコラーゲン（１：１）膜を調製した。この
試料膜を幅０．３ｍｍ、長さ２ｃｍに切断して東洋精機
（株）製のレオログラフ・ソリッドＳタイプで粘弾性挙
動（ＤＭＡ）を測定した。ＤＭＡによると、ＳＦ／ＣＳ
Ｓ（１：１）は８６℃と１８８℃に力学的損失ピークが
表れた。８６℃のピークはスクシニル化アテロコラーゲ
ンの熱分子運動に基づいて、また、１８８℃のピークは
絹フィブロインの熱分子運動に基づいて生ずることが分
かっている。このことから、ＳＦ／ＣＳＳ（１：１）に
はＣＳＳ（スクシニル化アテロコラーゲン）に基づく領
域とＳＦ（絹フィブロイン）に基づく領域とが存在して
おり、全体として均一な複合体となっていることが分か
る。

【００６８】実施例４実施例１と同様の方法で絹フィブロイン、アテロコラー
ゲン、および絹フィブロイン／スクシニル化アテロコラ
ーゲン複合膜を調製し、それらの分子構造特性を明らか
にするため、フーリエ変換赤外スペクトル（ＦＴ−Ｉ
Ｒ）を測定した。ＦＴ−ＩＲはパーキンエルマー社製の
測定装置を用いて測定し、試料は膜状試料を用いた。測
定波数領域は２０００〜４００ｃｍ^-1であり、測定繰り
返し数は２０回であった。吸収ピーク位置の数を求め、
ピーク強度を強（ｓ）、中（ｍ）、弱（ｗ）の３段階で
示した。得られた結果を表３に示す。

【００６９】本実施例で用いた膜状試料は、次の通りで
ある。

【００７０】SF : 実施例１の場合と同じ。

【００７１】CSS : 実施例１の場合と同じ。

【００７２】SF/CSS(8:2): ０．３％家蚕絹フィブロイ
ン水溶液８容量部に０．３％スクシニル化アテロコラー
ゲン水溶液２容量部を加えた混合水溶液から得られた膜
状試料。

【００７３】SF/CSS(6:4): ０．３％家蚕絹フィブロイ
ン水溶液６容量部に０．３％スクシニル化アテロコラー
ゲン水溶液４容量部を加えた混合水溶液から得られた膜
状試料。

【００７４】SF/CSS(4:6): ０．３％家蚕絹フィブロイ
ン水溶液４容量部に０．３％スクシニル化アテロコラー
ゲン水溶液６容量部を加えた混合水溶液から得られた膜
状試料。

【００７５】SF/CSS(2:8): ０．３％家蚕絹フィブロイ
ン水溶液２容量部に０．３％スクシニル化アテロコラー
ゲン水溶液８容量部を加えた混合水溶液から得られた膜
状試料。

【００７６】表３ ──────────────────────────────────── 試料吸収ピーク波数（ｃｍ^-1） ──────────────────────────────────── SF 1629(s),1530(s),1447(m),1409(w), 1263(w),1234(m),1070(m),690(m),643(m),554(s) SF/CSS(8/2) 1653(s),1545(s),1452(m),1279(w),1240(m), 1071(w),937(w),526(m) SF/CSS(6/4) 1658(s),1631(s),1547(m),1525(w), 1282(w),1239(w),1079(w),936(w),531(s) SF/CSS(4/6) 1660(s),1635(s),1548(m),1281(m),1242(m), 1078(m),936(w),530(s) SF/CSS(2/8) 1659(s),1639(m),1554(m),1282(m),1240(m), 1165(m),1078(w),938(m),525(m) CSS 1657(S),1555(m),1283(w),1240(w),1082(m), 929(m),534(m) ──────────────────────────────────── 表３から明らかなように、絹フィブロイン／スクシニル
化アテロコラーゲン複合膜のＦＴ−ＩＲスペクトルに
は、純粋な絹蛋白質に基づく吸収ピークと、純粋なコラ
ーゲンに由来するＩＲスペクトルピークとが重複して現
れている。従って分子形態的には絹蛋白質とコラーゲン
との相溶性の良い構造から構成されるものと結論でき
る。

【００７７】実施例５ＴＭＡレンジ±１０００μｍの条件で測定したＣＳＳ、
ＣＭＳのＴＭＡ曲線上、１００℃〜１８０℃の温度領域
におけるＴＭＡ曲線の接線と、急激に試料長が収縮する
１８０℃〜２００℃におけるＴＭＡ曲線の接線との交点
をＴｔ（℃）とし、各試料のＴｔ値を調べた。得られた
値を表４に示す。表４において、Ｔｄｓｃは、ＤＳＣ測
定の結果、２００℃以上に現れる主要な吸熱ピーク温度
を意味する。このＴｄｓｃは、試料の熱分解温度に相当
する。

【００７８】表４ ──────────────────────── 試料Ｔｔ（℃）Ｔｄｓｃ（℃） ──────────────────────── CSS 176 CMS 166 SF/CSS(1:1) 193 267 SF/CMS(1:1) 171 SF/CMS(1:2) 170 266 SF 284 ──────────────────────── 表４から明らかなように、スクシニル化アテロコラーゲ
ン（ＣＳＳ）の熱寸法安定性はミリスチル化アテロコラ
ーゲン（ＣＭＳ）よりも１０℃高い１７６℃である。絹
フィブロインとスクシニル化アテロコラーゲンとが複合
化したものは、熱寸法安定性が約３０℃程度高温に移行
し１９３℃になった。絹フィブロインとスクシニル化ア
テロコラーゲンとの分子相互作用が特異的に向上するこ
とが確かめられた。

【００７９】また、ミリスチル化反応によりコラーゲン
の熱分子運動性が高まり熱分解挙動が若干加速されると
の上記の実験事実は、化学反応の結果、コラーゲンのリ
ジン残基の分子側鎖に導入される炭化水素鎖の長さが、
ミリスチル化では(ＣＨ₂)₁₂であり、サクシニル化によ
る(ＣＨ₂)₂ の６倍となるためである。

【００８０】実施例６実施例１で用いた絹フィブロイン／アテロコラーゲン複
合膜（ＳＦ／ＣＭＳ（１：１）、ＳＦ／ＣＳＳ（１：
１）およびＳＦ／ＣＳＳ（１：２））について、耐熱分
解挙動をＴＧＡ装置を用い、窒素雰囲気下で測定した。
試料重量は３ｍｇ、測定温度範囲は０〜４００℃、ＴＧ
Ａフルスケールは５ｍｇ、サンプリングタイムは３秒で
あった。得られた結果を図１に示す。但し、縦軸は試料
重量残存率（％）、横軸は試料温度（℃）である。

【００８１】図１から明らかなように、絹フィブロイン
／アテロコラーゲン複合膜において、スクシニル化アテ
ロコラーゲン（ＳＦ／ＣＳＳ（１：１））の場合の方が
ミリスチル化アテロコラーゲン（ＳＦ／ＣＭＳ（１：
１））の場合よりも熱分解の進行程度が遅れており、熱
分解が阻害されることが明らかとなった。また、スクシ
ニル化アテロコラーゲンの含有率の高い複合膜（ＳＦ／
ＣＳＳ（１：２））は更に熱分解の進行程度が阻止され
る。これは絹フィブロインと相互作用を持つスクシニル
化部位の分子運動量がミリスチル化部位より低下し、そ
の結果、熱分解程度が抑制されたためである。

【００８２】

【発明の効果】本発明によれば、絹蛋白質とコラーゲン
とを複合化することにより、天然蛋白質の絹蛋白質とコ
ラーゲンとがそれぞれ持つ、血液適合性、抗血栓性、生
体細胞の付着増殖性、血小板との相互作用などの生化学
特性を相乗的に発現させるための素材が提供された。複
合化技術により両方の性質を兼ね備えた機能を持つ優れ
た素材となり、血液や細胞との相互作用の点で新たな機
能を持つ素材が調製できた。さらに、絹蛋白質、コラー
ゲン独自の実用機能性の欠点を補い、新たな可能性が発
現するようになる。

【００８３】本発明の絹蛋白質／コラーゲン複合体は、
止血剤、傷創カバー材、皮内注入用素材として、また、
医薬品、生理活性物質、抗生物質の固定化担体またはそ
の徐放担体として利用できる。

【００８４】また、本発明の絹蛋白質／コラーゲン複合
体は、昆虫由来の絹蛋白質と動物由来のコラーゲンから
なる複合体であるため、これを生理活性物質、抗生物
質、フェロモン、ホルモン、その他の医薬品の徐放担体
として用いた場合には、有用物質と複合体との間には強
い分子間相互作用が生ずるので、医薬品の徐放効果が長
時間持続する徐放担体として利用することができる。

【００８５】また、本発明の絹蛋白質／コラーゲン複合
体は、絹フィブロインの持つ抗血栓性、細胞付着増殖性
と共に、コラーゲンの持つ免疫原性の低い特性、血小板
との相互作用、細胞との相互作用の機能も兼ね備えてい
るので、細胞、酵素、ホルモンなどの生理活性を持つ物
質を組み込んで、より生体の機能に近い人工臓器材料と
しての利用が可能である。また、止血剤、臨床用試薬、
人工血管、コンタクトレンズ、医薬品を徐々に放出する
徐放担体（Drug delivery Device）、人工皮膚、傷創被
覆材、皮内注入用ゲル、細胞培養基質用コラーゲンなど
の生医学材料として活用できる。さらにまた、本発明の
複合体は、コラーゲンが生体内で分解されるため、体内
埋め込み材として種々の利用法があり、コラーゲンと同
様に吸収性縫合糸のカットガットとしても利用し得る。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の絹フィブロイン／アテロコラーゲン
複合膜の熱分解挙動を示すグラフ。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C08L 89/00 - 89/06 C08J 3/03 C01C 3/00

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】カイコが吐糸して作る繭繊維の外側を膠
着するセリシン、または該セリシンを除去して得た絹フ
ィブロイン繊維を中性塩水溶液中に溶解し、この水溶液
をセルロース製の透析膜を用いて透析して得た水溶性絹
フィブロイン、またはカイコ体内より取り出した絹糸腺
内の水溶性絹セリシンもしくは水溶性絹フィブロインか
らなる０．０１〜１０重量％の絹蛋白質水性溶液または
水性分散液と、コラーゲン分子側鎖もしくはアテロコラ
ーゲン分子側鎖の化学反応性活性部位にアシル化剤を反
応させて得た水溶性もしくは水分散性のアシル化コラー
ゲンまたはアシル化アテロコラーゲンからなる０．１〜
５重量％のコラーゲン水性溶液または水性分散液とから
得られる絹蛋白質／コラーゲン複合体。
【請求項２】前記アシル化剤がＣ ₁ 〜Ｃ ₄ の二塩基酸の
無水物またはＣ ₁ 〜Ｃ ₁₅ の一塩基酸の無水物であること
を特徴とする請求項１記載の絹蛋白質／コラーゲン複合
体。
【請求項３】前記アシル化アテロコラーゲンが、サク
シニル化アテロコラーゲンまたはミリスチル化アテロコ
ラーゲンまたは両者の混合物であることを特徴とする請
求項１または２記載の絹蛋白質／コラーゲン複合体。
【請求項４】前記コラーゲンとして、動物皮革由来の
コラーゲンから蛋白質分解酵素でテロペプチドを除去し
て得られるアテロコラーゲンを使用することを特徴とす
る請求項１−３のいずれかに記載の絹蛋白質／コラーゲ
ン複合体。
【請求項５】前記請求項１〜４のいずれかに記載の絹
蛋白質／コラーゲン複合体がさらに水不溶化処理された
ものであることを特徴とする水不溶化絹蛋白質／コラー
ゲン複合体。
【請求項６】カイコが吐糸して作る繭繊維の外側を膠
着するセリシン、または該セリシンを除去して得た絹フ
ィブロイン繊維を中性塩水溶液中に溶解し、この水溶液
をセルロース製の透析膜を用いて透析して得た水溶性絹
フィブロイン、またはカイコ体内より取り出した絹糸腺
内の水溶性絹セリシンもしくは水溶性絹フィブロインか
らなる０．０１〜１０重量％の絹蛋白質水性溶液または
水性分散液と、コラーゲン分子側鎖もしくはアテロコラ
ーゲン分子側鎖の化学反応性活性部位にアシル化剤を反
応させて得た水溶性もしくは水分散性のアシル化コラー
ゲンまたはアシル化アテロコラーゲンからなる０．１〜
５重量％のコラーゲン水性溶液または水性分散液とを均
一に混合し、この混合液体から膜状、ゲル状、粉末状ま
たは繊維状の絹蛋白質／コラーゲン複合体を得ることを
特徴とする絹蛋白質／コラーゲン複合体の製造方法。
【請求項７】前記請求項６に記載の絹蛋白質／コラー
ゲン複合体をさらに水不溶化処理することを特徴とする
水不溶化絹蛋白質／コラーゲン複合体の製造方法。