JP2943271B2 - Capillary electrophoresis device - Google Patents
Capillary electrophoresis deviceInfo
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- Investigating, Analyzing Materials By Fluorescence Or Luminescence (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、タンパク質や核酸などの生体高分子の高分
離分析や精製法に用いられ、例えば構造や性質が接近し
た成分の分離に適するキャピラリ電気泳動装置に関し、
特に、キャピラリの内径が例えば100μｍ以下というよ
うに細くなって電気浸透流が電気泳動によるイオンの移
動速度より大きくなるようなキャピラリ電気泳動装置に
関するものである。The present invention is used for high-resolution analysis and purification of biological macromolecules such as proteins and nucleic acids, and is suitable for, for example, separation of components having similar structures and properties. Regarding the electrophoresis device,
In particular, the present invention relates to a capillary electrophoresis apparatus in which the inner diameter of a capillary is reduced to, for example, 100 μm or less so that the electroosmotic flow becomes faster than the moving speed of ions by electrophoresis.
（従来の技術） 電気泳動の高性能化技術としてキャピラリ電気泳動法
が注目されている。キャピラリ電気泳動法では、キャピ
ラリから効果的にジュール熱を除去することによって高
圧で泳動させることができるため、原理的に高分離能で
迅速な分析が可能になる。また、キャピラリ電気泳動法
はオンカラム検出器によって装置の自動化が可能になる
などの利点を有し、ペプチド、タンパク質、核酸の分離
分析や精製を初めとして、光学分割や同位体の分離その
他極めて酷似した成分間の分離に適している。(Prior Art) Capillary electrophoresis has attracted attention as a technique for improving the performance of electrophoresis. In the capillary electrophoresis method, since the capillary can be electrophoresed at high pressure by effectively removing Joule heat from the capillary, rapid analysis with high resolution is possible in principle. In addition, capillary electrophoresis has the advantage that the on-column detector enables automation of the device, and it has very similar characteristics including separation analysis and purification of peptides, proteins and nucleic acids, as well as optical resolution and isotope separation. Suitable for separation between components.
（発明が解決しようとする課題） キャピラリが内径100μｍ以下というように細くなっ
てくると、分離能が高くなり、試料も微量ですむことか
らマス感度の高い分析法となるが、光路長が短かくなる
ことから通常のUV検出器では濃度感度が悪くなる問題が
ある。(Problems to be Solved by the Invention) When the capillary becomes thinner with an inner diameter of 100 μm or less, the resolution becomes higher, and the amount of the sample is small. Therefore, the analysis method has high mass sensitivity, but the optical path length is short. Therefore, there is a problem that the concentration sensitivity is deteriorated in a normal UV detector.
本発明はキャピラリの内径が細くなって電気浸透流が
イオンの速度よりも大きくなった場合において、希薄な
試料の場合に電気泳動による濃縮を行なわせて検出器で
の感度を高めることのできるキャピラリ電気泳動装置を
提供することを目的とするものである。The present invention provides a capillary capable of increasing the sensitivity of a detector by performing electrophoretic enrichment for a dilute sample when the inner diameter of the capillary becomes narrower and the electroosmotic flow becomes larger than the ion velocity. An object of the present invention is to provide an electrophoresis apparatus.
（課題を解決するための手段） 本発明は、電気泳動用バッファ溶液が満たされ、電気
浸透流が電気泳動によるイオンの移動速度より大きいキ
ャピラリと、その両端間に泳動電圧を印加する電源装置
と、陽極側に試料の入った溶器及び電気泳動用バッファ
溶液の入った容器の他に電気泳動用バッファ溶液の主成
分のアニオンイオン及び測定するアニオンイオンよりも
移動度の大きいアニオンイオンを主成分とする電解液の
入った容器を保持し、キャピラリの陽極側の端部（キャ
ピラリ陽極端という）を前記試料の入った容器、前記電
解液の入った容器及び前記電気泳動用バッファ溶液の入
った容器の順に前記容器に挿入する交換機構とを備えて
いる。(Means for Solving the Problems) The present invention relates to a capillary filled with an electrophoresis buffer solution and having an electroosmotic flow higher than the moving speed of ions by electrophoresis, and a power supply device for applying an electrophoresis voltage between both ends. In addition to the solution vessel containing the sample on the anode side and the vessel containing the buffer solution for electrophoresis, the main component also contains the anion ion as the main component of the buffer solution for electrophoresis and the anion ion having a higher mobility than the anion ion to be measured. And holding the end of the capillary on the anode side (referred to as the capillary anode end) with the container containing the sample, the container containing the electrolyte, and the buffer solution for electrophoresis. An exchange mechanism for inserting the containers in the order of the containers.
（作用） 電気泳動用バッファ溶液が満たされたキャピラリの陽
極端に試料を注入した後、そのキャピラリ陽極端を移動
度の大きいアニオンイオンを主成分とする電解液に浸
し、電気泳動を行なわせる。アニオンイオンは陰極から
陽極に向かって移動するが、イオンの移動速度よりも大
きい電気浸透流が陽極から陰極方向に向かって発生する
ため、移動度の大きいアニオンイオンを主成分とする電
解液がキャピラリ陽極端に注入される。このとき、等速
電気泳動の原理により希薄な試料は濃縮される。その
後、キャピラリ陽極端を電気泳動用バッファ溶液に浸
し、電気泳動を行なわせると、濃縮された試料がゾーン
電気泳動により分離される。(Action) After a sample is injected into the anode end of a capillary filled with an electrophoresis buffer solution, the capillary anode end is immersed in an electrolyte mainly containing anion ions having high mobility to perform electrophoresis. The anion ions move from the cathode to the anode, but an electroosmotic flow, which is faster than the ion movement speed, is generated from the anode to the cathode. Injected at the anode end. At this time, the dilute sample is concentrated by the principle of isotachophoresis. Then, when the capillary anode end is immersed in an electrophoresis buffer solution and electrophoresis is performed, the concentrated sample is separated by zone electrophoresis.
（実施例） 第１図は本発明を概略的に表わしたものである。FIG. 1 schematically illustrates the present invention.
１は溶融石英キャピラリであり、両端には高圧電源３
により電気泳動が印加されるようになっている。一例と
して、電源電圧３の電圧は約30KV、電流は約100μＡで
ある。キャピラリ１の陰極側には検出器２として例えば
UV検出器が設けられている。７は陽極、６は陰極であ
る。Reference numeral 1 denotes a fused silica capillary, and a high-voltage power supply 3 is provided at both ends.
To apply electrophoresis. As an example, the voltage of the power supply voltage 3 is about 30 KV, and the current is about 100 μA. On the cathode side of the capillary 1, for example, a detector 2 is provided.
A UV detector is provided. 7 is an anode and 6 is a cathode.
陽極側には主成分のアニオンイオンがa5である電気泳
動用バッファ溶液の入った容器８、電気泳動用バッファ
溶液の主成分のアニオンイオンa5及び試料のアニオンイ
オンasよりも移動度の大きいアニオンイオンa9を主成分
とする電解液の入った容器９及び試料容器４が配置され
ている。移動度の大きいアニオンイオンa9は例えば塩素
イオンである。容器８のバッファ溶液の主成分のアニオ
ンイオンa5は陰極側のバッファ溶液の主成分のアニオン
イオンと同じものである。５は陰極側バッファ溶液の入
った容器である。陽極側で容器8,9,4はキャピラリ１の
陽極端の位置に移動することができ、キャピラリ１の陽
極端をいずれの容器に浸すこともできる。Anode container 8 anions principal components containing a buffer solution for electrophoresis is a 5 to greater mobility than anions as the electrophoresis buffer solution composed mainly of anions a 5 and a sample anions a 9 containers 9 and sample container 4 containing the electrolytic solution mainly composed of are arranged. Mobility larger anions a 9 is, for example, chloride ions. Anions a 5 of the main component of the buffer solution in the container 8 is the same as the anions of the main component of the cathode side of the buffer solution. Reference numeral 5 denotes a container containing the buffer solution on the cathode side. On the anode side, the containers 8, 9, 4 can move to the position of the anode end of the capillary 1, and the anode end of the capillary 1 can be immersed in any container.
次に、このキャピラリ電気泳動装置で希薄な試料を濃
縮して等速電気泳動により分離する動作を説明する。Next, an operation of concentrating a dilute sample with this capillary electrophoresis apparatus and separating it by isotachophoresis will be described.
溶融石英キャピラリは特に内面処理などを施さない限
り、液と接した面が負に帯電するため、キャピラリの軸
長方向に電場をかけた場合に陽極から陰極へ向かって電
気浸透流が発生する。この電気浸透流の速度は、内径が
100μｍ以下、例えば50μｍ程度のキャピラリの場合に
は、各イオン成分の電気泳動による速度よりも大きいの
で、陽極側の液がキャピラリに注入される。Unless a fused silica capillary is particularly subjected to an inner surface treatment or the like, the surface in contact with the liquid is negatively charged. Therefore, when an electric field is applied in the axial direction of the capillary, an electroosmotic flow is generated from the anode to the cathode. The speed of this electroosmotic flow is
In the case of a capillary of 100 μm or less, for example, about 50 μm, the liquid on the anode side is injected into the capillary because the velocity of each ion component is higher than the speed of electrophoresis.
キャピラリ１に後で第６図に例示されるような装置を
用いて容器８のバッファ溶液を満たした後、キャピラリ
１の陽極端を試料容器４の試料に浸し、高圧電源３によ
り泳動電圧を印加して、電気浸透流によりキャピラリ１
の陽極端に数ｎ〜数10nの試料を注入する。After the capillary 1 is filled with the buffer solution in the container 8 using an apparatus as exemplified in FIG. 6 later, the anode end of the capillary 1 is immersed in the sample in the sample container 4, and the electrophoresis voltage is applied by the high voltage power supply 3. And the capillary 1 by electroosmotic flow
A few to several tens of samples are injected into the anode end of the sample.
次に、キャピラリ１の陽極端を容器９の電解液に浸
し、高圧電源３により泳動電圧を印加して、電気浸透流
によりキャピラリ１の陽極端にアニオンa9を含む電解液
を注入する。このとき、次の現象が起こる。Next, the anode end of the capillary 1 is immersed in the electrolytic solution of the container 9, a migration voltage is applied by the high-voltage power supply 3, and the electrolytic solution containing the anion a 9 is injected into the anode end of the capillary 1 by electroosmotic flow. At this time, the following phenomenon occurs.
バッファ溶液中のアニオンをa5、高移動度の電解液の
アニオンをa5、試料中のアニオンをasとし、asはa5とa9
の間の大きさの移動度をもつように、バッファ溶液と電
解液を設定しておく、電気浸透流の速度をVeとし、電気
泳動によるアニオンの速度をVma、電気泳動によるカチ
オンの速度をVmcとすると、アニオンの正味の速度Vaと
カチオンの正味の速度Vcはそれぞれ次のようになる。The anion of the buffer solution a 5, the anion of the high mobility of the electrolyte solution a 5, the anion in the sample and the as, the as is a 5 and a 9
The buffer solution and the electrolytic solution are set so as to have a mobility of a magnitude between Ve, the velocity of the electroosmotic flow is Ve, the velocity of the anion by electrophoresis is Vma, and the velocity of the cation by electrophoresis is Vmc. Then, the net velocity Va of the anion and the net velocity Vc of the cation are as follows.
Va＝Ve−Vma Vc＝Ve＋Vmc バッファ溶液中のアニオンa5の移動度Ma5、高移動度
の電解液のアニオンa9の移動度Ma9、試料中のアニオンa
sの移動度Masの間には Ma9＞Mas＞Ma5 の関係がある。また、電気浸透流を考慮に入れると、３
種のイオンが同一ゾーン中にあるときの速度は陽極から
陰極方向を正とすると、 Va9＜Vas＜Va5 となる。したがって、キャピラリ陽極端にアニオンa9の
電解液が注入されるときに、第２図に示されるように、
キャピラリ内の液は全体として陽極から陰極方向へ移動
しながら、陰極から陽極方向へ向けての等速電気泳動的
な濃縮が働く。これによって試料中のアニオン成分は選
択的に狭いゾーンに濃縮される。Va = Ve-Vma Vc = Ve + Vmc mobility Ma 5 anion a 5 buffer solution, the mobility Ma 9 anion a 9 higher mobility of the electrolyte, the anion a in the sample
There is a relationship Ma 9 >Mas> Ma 5 between the mobility Mas of s. Considering the electroosmotic flow,
The velocity of the species ions in the same zone is Va 9 <Vas <Va 5 when the direction from the anode to the cathode is positive. Therefore, when the electrolyte of the anion a 9 is injected into the capillary anode end, as shown in FIG.
While the liquid in the capillary moves from the anode to the cathode as a whole, it is subjected to isokinetic electrophoretic concentration from the cathode to the anode. This selectively concentrates the anion component in the sample in a narrow zone.
その後、キャピラリ陽極端を容器８のバッファ溶液に
移し、泳動電圧を印加して次段のキャピラリ電気泳動を
起こさせる。これにより、濃縮された試料の高感度で、
かつ高理論段数の分離が行なわれる。Thereafter, the capillary anode end is transferred to the buffer solution in the container 8, and a migration voltage is applied to cause the next stage of capillary electrophoresis. This allows for high sensitivity of the concentrated sample,
In addition, separation of a high number of theoretical stages is performed.
一連の動作を第３図にまとめて示す。 FIG. 3 shows a series of operations.
（Ａ）初めにキャピラリにはバッファ溶液が満たされて
おり、主成分イオンはa5である。The capillary initially (A) is filled buffer solution, the main component ions is a 5.
（Ｂ）電気浸透流によりキャピラリの陽極端にアニオン
asの試料が注入される。(B) Anions at the anode end of the capillary by electroosmotic flow
As sample is injected.
（Ｃ）キャピラリ陽極端を高移動度アニオンの電解液に
浸して電気泳動を起こさせることにより、アニオンa9の
電解液が電気浸透流で注入されるとともに、試料asが等
速電気泳動により濃縮される。(C) by causing the electrophoresis capillary anode end is immersed in the electrolytic solution of high mobility anions concentrated, together with an electrolyte anion a 9 is injected by electroosmotic flow, the sample as is the isotachophoresis Is done.
（Ｄ）キャピラリ陽極端をバッファ溶液に移して電気泳
動を起こさせることにより、濃縮された試料で分離が始
まり、時間の経過にともなって（Ｅ）に示されるように
高移動度のアニオンa9は試料ゾーンから離れ、試料の分
離を妨げない。第４図は実施例においてキャピラリ陽極
端をバッファ溶液、電解液及び試料のいずれにも挿入で
きる交換機構の一例を表わしている。(D) By transferring the capillary anode end to a buffer solution to cause electrophoresis, separation starts in a concentrated sample, and as time passes, as shown in (E), a high mobility anion a 9 Moves away from the sample zone and does not interfere with the separation of the sample. FIG. 4 shows an example of an exchange mechanism in which the capillary anode end can be inserted into any of a buffer solution, an electrolytic solution and a sample in the embodiment.
キャピラリ１の陽極端と電極（陽極）７はホルダー11
に支持され、ホルダー11は支柱12によって上下方向に移
動可能に支持されている。ホルダー11を上下方向に移動
させるために、ホルダー11はパルスモータ13により駆動
されるベルト14に取りつけられている。ホルダー11の上
端と下端を検出するために、ホルダー11の側部に遮蔽板
15が設けられており、上端の位置で遮蔽板15により作動
する透過形フォトセンサ16と、下端の位置で遮蔽板15に
より作動する透過形フォトセンサ17が設けられている。The anode end of capillary 1 and electrode (anode) 7 are holder 11
, And the holder 11 is supported by a column 12 so as to be movable in the vertical direction. The holder 11 is attached to a belt 14 driven by a pulse motor 13 in order to move the holder 11 in the vertical direction. In order to detect the upper and lower ends of the holder 11, a shield plate is provided on the side of the holder 11.
A transmission type photosensor 16 operated by the shielding plate 15 at the upper end position and a transmission type photosensor 17 operated by the shielding plate 15 at the lower end position are provided.
18はスライド台19に沿って水平方向に移動するラック
であり、ラック18にはバッファ溶液の入った容器８、移
動度の大きいアニオンを主成分とする電解液の入った容
器９及びそれぞれ異なる試料の入った試料容器４−１〜
４−４が一列に配列されている。いずれかの容器をキャ
ピラリ１の陽極端の下部に位置決めするために、反射形
フォトセンサ20がスライド台19に取りつけられている。Reference numeral 18 denotes a rack which moves in a horizontal direction along a slide table 19. The rack 18 has a container 8 containing a buffer solution, a container 9 containing an electrolyte mainly containing an anion having high mobility, and different samples. 4-1 containing sample container
4-4 are arranged in a line. In order to position one of the containers below the anode end of the capillary 1, a reflective photosensor 20 is mounted on a slide base 19.
第５図は第４図におけるラック18をＡ方向から見た側
面図である。FIG. 5 is a side view of the rack 18 in FIG.
ラック18をスライド台19に沿って移動させるために、
ラック18の下面にはギヤ溝21が取りつけられており、そ
のギヤ溝21にはパルスモータ22の回転軸に取りつけられ
たギヤ23が噛み合っている。To move the rack 18 along the slide 19,
A gear groove 21 is mounted on the lower surface of the rack 18, and the gear groove 21 is engaged with a gear 23 mounted on a rotation shaft of a pulse motor 22.
この交換機構で、所定の容器をキャピラリ１の陽極端
の下側に位置決めするために、パルスモータ22によりラ
ック18が移動し、フォトセンサ20の信号により位置決め
されて固定される。その後、パルスモータ13が作動し、
キャピラリ１の陽極端が電極７とともにその下の容器に
挿入される。In order to position a predetermined container below the anode end of the capillary 1 by this exchange mechanism, the rack 18 is moved by the pulse motor 22 and is positioned and fixed by the signal of the photosensor 20. After that, the pulse motor 13 operates,
The anode end of the capillary 1 is inserted together with the electrode 7 into the container below it.
第６図はキャピラリ１にバッファ溶液を満たすための
装置の一例である。FIG. 6 shows an example of an apparatus for filling the capillary 1 with a buffer solution.
キャピラリ１の陰極端と電極（陰極）６がチューブ25
とともにバッファ溶液の入った容器５に差し込まれ、シ
ール24で封止されている。チューブ25は四方バルブ26を
経てガスタイトシリンジ27又は開放口28へ接続されるよ
うになっている。シリンジ27は四方バルブ26を経てチュ
ーブ25又はドレイン29へ接続される。The cathode end of the capillary 1 and the electrode (cathode) 6 are tubes 25
Together with the buffer solution, and sealed with a seal 24. The tube 25 is connected to a gas tight syringe 27 or an opening 28 via a four-way valve 26. The syringe 27 is connected to the tube 25 or the drain 29 via a four-way valve 26.
シリンジ27を駆動するために、シリンジ27のプランジ
ャー30がベルト31に取りつけられ、ベルト31はパルスモ
ータ32で駆動されてシリンジ27を作動させる。In order to drive the syringe 27, the plunger 30 of the syringe 27 is attached to the belt 31, and the belt 31 is driven by the pulse motor 32 to operate the syringe 27.
第６図でキャピラリ１にバッファ溶液を満たすとき
は、四方バルブ26を実線の位置に設定し、シリンジ27で
吸引してキャピラリ１の陽極端からバッファ溶液を吸入
する。In FIG. 6, when the capillary 1 is filled with the buffer solution, the four-way valve 26 is set to the position indicated by the solid line, and the buffer solution is sucked from the anode end of the capillary 1 by suction with the syringe 27.
その後、四方バルブ26を破線の位置に切り換え、シリ
ンジ27を元の状態に戻す。Thereafter, the four-way valve 26 is switched to the position indicated by the broken line, and the syringe 27 is returned to the original state.
交換機構や、キャピラリにバッファ溶液を満たす装置
は第４図から第６図に例示されたものに限らない。The exchange mechanism and the device for filling the capillary with the buffer solution are not limited to those illustrated in FIGS.
（発明の効果） 本発明では電気泳動用バッファ溶液が満たされたキャ
ピラリ陽極端に試料を注入した後、キャピラリ陽極端を
移動度の大きいアニオンイオンを主成分とする電解液に
浸し、電気泳動を行なわせて希薄な試料を濃縮させた
後、キャピラリ陽極端をバッファ溶液に移して等速電気
泳動により分離を行なわせるようにしたので、電気浸透
流が電気泳動のイオン速度よりも大きくなるような細い
キャピラリの場合において、通常の等速電気泳動とは逆
向きの移動方向を有する等速電気泳動を起こさせること
により、そのような微細なキャピラリを用いて等速電気
泳動による高分離能の分離を行なうことができるように
なる。またその際、電気泳動による希薄試料の濃縮も行
なうことができ、検出器での感度を高めることができ
る。(Effect of the Invention) In the present invention, after a sample is injected into the capillary anode end filled with the buffer solution for electrophoresis, the capillary anode end is immersed in an electrolyte mainly containing anion ions having high mobility to perform electrophoresis. After concentrating the dilute sample, the capillary anode end was moved to a buffer solution and separated by isotachophoresis, so that the electroosmotic flow was larger than the ion velocity of electrophoresis. In the case of thin capillaries, by causing isotachophoresis with a moving direction opposite to that of normal isotachophoresis, high resolution separation by isotachophoresis using such fine capillaries Can be performed. At that time, the dilute sample can be concentrated by electrophoresis, and the sensitivity of the detector can be increased.
また、特定のアニオン成分のみを取り込み、他の成分
をここから排除することができることにより、高濃度な
不用成分を効果的に取り除くことができる。これは全て
の成分が低濃度である試料の場合には、その試料を多量
に注入する場合にサンプルゾーンの導電率を上げるため
特定のイオン種を加え、分析時に取り除くことができる
ことを意味しており、有用である。Further, since only a specific anion component can be taken in and other components can be excluded therefrom, high-concentration unnecessary components can be effectively removed. This means that for samples with low concentrations of all components, specific ionic species can be added to increase the conductivity of the sample zone when a large amount of the sample is injected and removed during analysis. And useful.
第１図は本発明を示す概略図、第２図は動作を示す各溶
液のゾーンの図、第３図は動作を示す図、第４図は一実
施例における交換機構を示す斜視図、第５図は第４図の
ラック部分を示す側面図、第６図はキャピラリにバッフ
ァ溶液を満たす装置の一例を示す構成図である。 １……キャピラリ、２……検出器、３……高圧電源、４
……試料容器、5,8……バッファ容器、６……陰極、７
……陽極、９……高移動度電解液容器。FIG. 1 is a schematic view showing the present invention, FIG. 2 is a view of each solution zone showing operation, FIG. 3 is a view showing operation, FIG. 4 is a perspective view showing an exchange mechanism in one embodiment, FIG. FIG. 5 is a side view showing the rack part of FIG. 4, and FIG. 6 is a configuration diagram showing an example of an apparatus for filling a capillary solution with a buffer solution. 1. Capillary 2. Detector 3. High voltage power supply 4.
…… Sample container, 5,8… Buffer container, 6 …… Cathode, 7
... Anode, 9 ... High mobility electrolyte container.
Claims (1)
浸透流が電気泳動によるイオンの移動速度より大きいキ
ャピラリと、その両端間に泳動電圧を印加する電源装置
と、陽極側に試料の入った容器及び電気泳動用バッファ
溶液の入った容器の他に電気泳動用バッファ溶液の主成
分のアニオンイオン及び測定するアニオンイオンよりも
移動度の大きいアニオンイオンを主成分とする電解液の
入った容器を保持し、キャピラリの陽極側の端部を前記
試料の入った容器、前記電解液の入った容器及び前記電
気泳動用バッファ溶液の入った容器の順に前記容器に挿
入する交換機構とを備えたキャピラリ電気泳動装置。1. A capillary filled with a buffer solution for electrophoresis, in which an electroosmotic flow is larger than the moving speed of ions by electrophoresis, a power supply device for applying an electrophoretic voltage between both ends, and a sample on the anode side. In addition to the container and the container containing the buffer solution for electrophoresis, the container containing the electrolyte solution containing the anion ion as the main component of the buffer solution for electrophoresis and the anion ion having a higher mobility than the anion ion to be measured is used. An exchange mechanism for holding and inserting an end of the capillary on the anode side into the container in the order of the container containing the sample, the container containing the electrolytic solution, and the container containing the buffer solution for electrophoresis. Electrophoresis device.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2199861A JP2943271B2 (en) | 1990-07-27 | 1990-07-27 | Capillary electrophoresis device |
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Families Citing this family (1)
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|---|---|---|---|---|
| US5994056A (en) | 1991-05-02 | 1999-11-30 | Roche Molecular Systems, Inc. | Homogeneous methods for nucleic acid amplification and detection |
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- 1990-07-27 JP JP2199861A patent/JP2943271B2/en not_active Expired - Lifetime
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| JPH0484752A (en) | 1992-03-18 |
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