JP2940877B2 - Expression vector incorporating secretory human thyroid peroxidase gene, method for preparing the same, transformed cells and anti-microsomal antibody assay kit - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は分泌型のヒト甲状腺パーオキシダーゼ（Huma
n Thyroid Peroxidase、以下「hTPO」と略記する場合が
ある）遺伝子の組み込まれた発現用ベクター、その作成
法、形質転換細胞及び抗マイクロソーム抗体測定キット
に係る。The present invention relates to secretory human thyroid peroxidase (Huma).
n Thyroid Peroxidase (hereinafter may be abbreviated as “hTPO”). The present invention relates to an expression vector incorporating a gene, a method for preparing the same, a transformed cell, and an anti-microsomal antibody measurement kit.

本発明により得られるヒト甲状腺パーオキシダーゼ
は、自己免疫性甲状腺疾患、重症筋無力症、ルポイド肝
炎、インシュリン依存性小児糖尿病等の疾患の診断に際
して指針となる抗マイクロソーム抗体測定用の抗原とし
て、即ち上記の各種疾患に関する診断試薬として利用す
ることができる。Human thyroid peroxidase obtained according to the present invention is an antigen for measuring anti-microsomal antibodies, which serves as a guide in diagnosing diseases such as autoimmune thyroid disease, myasthenia gravis, lupoid hepatitis, and insulin-dependent pediatric diabetes, that is, It can be used as a diagnostic reagent for the above various diseases.

（従来及び関連技術と、これらの技術における課題） 甲状腺疾患患者の血清中には、殆どの場合に、サイロ
グロブリン、マイクロソーム抗原及び甲状腺刺激ホルモ
ンレセプタと反応する自己抗体が存在している。これら
の自己抗体の内で、殊に抗マイクロソーム抗体は自己免
疫性甲状腺疾患の診断に極めて有用であり、甲状腺のリ
ンパ球浸潤と良好な相関を有することが判明している。(Conventional and Related Techniques and Problems in These Techniques) In most cases, sera of patients with thyroid disease contain autoantibodies that react with thyroglobulin, microsomal antigens, and thyroid stimulating hormone receptors. Of these autoantibodies, in particular, anti-microsomal antibodies have been shown to be extremely useful in the diagnosis of autoimmune thyroid disease and have a good correlation with thyroid lymphocyte infiltration.

尚、抗マイクロソーム抗体は自己免疫性甲状腺疾患の
みならず、重症筋無力症、ルポイド肝炎、インシュリン
依存性小児糖尿病等の疾患においても産生量の上昇する
ことが報告されている。It has been reported that the production of anti-microsomal antibodies is increased not only in autoimmune thyroid diseases but also in diseases such as myasthenia gravis, lupus hepatitis, and insulin-dependent pediatric diabetes.

従って、抗マイクロソーム抗体の測定は、上記の各種
疾患の臨床診断に利用することができる。Therefore, measurement of anti-microsomal antibodies can be used for clinical diagnosis of the above-mentioned various diseases.

従来、抗マイクロソーム抗体の測定は種々の方法を用
いて実施されており、検査法として汎用されているのは
下記の５種類の方法である。Conventionally, measurement of anti-microsomal antibodies has been carried out using various methods, and the following five methods are widely used as test methods.

ａ）補体結合反応法、 ｂ）蛍光抗体法、 Ｃ）受身赤血球凝集反応法、 ｄ）沈降反応法、及び ｅ）EIA法。a) complement fixation, b) fluorescent antibody, C) passive hemagglutination, d) sedimentation, and e) EIA.

従来、マイクロソーム抗原の本体が明確ではなかった
ために、上記の従来法を実施する場合には、ヒト甲状腺
組織自体を使用抗原とし或は又該組織を粗精製したマイ
クロソーム分画を使用抗原としており、従って上記の従
来法は下記の点等において本質的な課題を有していた。Conventionally, since the body of the microsomal antigen was not clear, when the above conventional method was carried out, the human thyroid tissue itself was used as the antigen to be used, or the microsomal fraction obtained by roughly purifying the tissue was used as the antigen to be used. Therefore, the above-mentioned conventional method has an essential problem in the following points.

１）甲状腺組織の由来に起因する差に関する課題、 ２）ヒトの組織を試薬又はその原料として用いることに
起因する人道上及び入手上の課題、及び ３）ヒトの組織又はその粗製分画を用いることに起因す
る非特異反応の発生及びこれに伴う感度不安定。1) issues relating to differences arising from the origin of thyroid tissue; 2) humane and access issues arising from the use of human tissues as reagents or raw materials; and 3) using human tissues or crude fractions thereof. Is caused by non-specific reaction and sensitivity instability.

最近に至り、甲状腺疾患患者が血液中に多量に産生す
る自己抗体に対する抗原の本体がhTPOであろうことが解
明され、更に、このhTPOのcDNAについてのクローニング
が行われ、そのヌクレオチド配列が明らかにされ（構成
ヌクレオチド数:3048、分子量:107000）、アミノ酸の一
次構造についても明かとなるに至っている（S.KIMURA e
t．al．“Proc.Natl.Acad.Sci.USA",Vol.84,pages 5555
−5559,Aug.1987,Biochemistry）。Recently, it was elucidated that the main body of the antigen against autoantibodies produced in blood by thyroid disease patients may be hTPO, and furthermore, the cDNA of this hTPO cDNA was cloned, and its nucleotide sequence was revealed. (Number of constituent nucleotides: 3048, molecular weight: 107,000), and the primary structure of amino acids has also been elucidated (S. KIMURA e
t . al . “Proc.Natl.Acad.Sci.USA”, Vol.84, pages 5555
-5559, Aug. 1987, Biochemistry).

そこで、本発明者等は、このクローン化hTPO遺伝子を
利用し、発現ベクターに組み込み、該発現ベクターを動
物細胞又は大腸菌に取り込ませてhTPOを産生させ、この
産生されたhTPOを使用抗原として検体血清中での反応性
を調べることにより抗マイクロソーム抗体の測定を行う
ことを試みて、これに成功した［特願平１−228334明細
書（特開平３−91487公報）］。Therefore, the present inventors utilized the cloned hTPO gene, incorporated it into an expression vector, incorporated the expression vector into animal cells or Escherichia coli to produce hTPO, and used the produced hTPO as an antigen to be used as a sample serum. An attempt was made to measure an anti-microsomal antibody by examining the reactivity in the medium, which was successful [Japanese Patent Application No. 1-2228334 (JP-A-3-91487)].

この公開特許公報には、hTPO発現用ベクター、その作
成法、該ベクターが組み込まれたhTPO産生用動物細胞並
びにこれが産生するhTPOを使用抗原とし検体血清との反
応性から抗マイクロソーム抗体を測定する方法が開示さ
れており、この公開特許公報に開示されている技術を利
用することによりヒト組織に依存しない抗マイクロソー
ム抗体測定用試薬の安定且つ大量供給がもたらされ、斯
くて従来技術における最大のネックであった人道上や入
手性に関する課題を排除する途が開かれるに至った。This publication discloses a vector for expressing hTPO, a method for preparing the same, an animal cell for producing hTPO in which the vector is incorporated, and an anti-microsomal antibody which is determined from the reactivity with a sample serum using hTPO produced by the vector as an antigen. A method is disclosed, and the use of the technology disclosed in this patent publication provides a stable and large-scale supply of a reagent for measuring anti-microsomal antibodies independent of human tissues, and thus has the largest potential in the prior art. A way has been opened to eliminate the humanitarian and accessibility issues that were bottlenecks in the country.

しかしながら、hTPO蛋白質は、元来、膜結合型の蛋白
質であり、上記の公開特許公報における開示に従い遺伝
子組換え動物細胞を培養すると、産生されたhTPOは細胞
膜に結合した状態で発現することになる。However, the hTPO protein is originally a membrane-bound protein, and when the transgenic animal cells are cultured according to the disclosure in the above-mentioned patent publication, the produced hTPO will be expressed in a state bound to the cell membrane. .

従って、個々の細胞において産生量には自ずから制限
があり、又産生されたhTPOを抗マイクロソーム抗体の測
定に利用し得る形で取得するためには、hTPOを産生して
いる成熟細胞を破壊せねばならず、その後の分離精製が
常法により行われると云えども面倒である点に課題を有
している。Therefore, the amount of production of each cell is naturally limited, and in order to obtain the produced hTPO in a form that can be used for the measurement of anti-microsomal antibodies, the mature cells producing hTPO must be destroyed. However, there is a problem in that the subsequent separation and purification is performed by a conventional method, but is troublesome.

（発明の目的） 従って、本発明の基本的な目的は、hTPOが細胞膜に結
合した状態ではなく、細胞の外部に分泌されるようにな
し、これによって産生されたhTPOの分離精製を容易なら
しめると共に生産性の向上をもたらし、斯くてhTPOの大
規模な工業的製造を可能にすることである。(Object of the Invention) Accordingly, a basic object of the present invention is to allow hTPO not to be bound to the cell membrane but to be secreted outside the cell, thereby facilitating the separation and purification of the hTPO produced thereby. Together with the increase in productivity, thus enabling large-scale industrial production of hTPO.

本発明の第１の具体的な目的は、動物細胞によるhTPO
の分泌的な発現に適するhTPO発現用ベクターを提供する
ことにある。A first specific object of the present invention is to provide hTPO by animal cells.
An object of the present invention is to provide an hTPO expression vector suitable for secretory expression of HTPO.

本発明の第２の具体的な目的は、このような発現用ベ
クターの作成法を提供することにある。A second specific object of the present invention is to provide a method for producing such an expression vector.

本発明の第３の具体的な目的は、上記の発現用ベクタ
ーにより形質転換されたCHO細胞を提供することであ
る。A third specific object of the present invention is to provide a CHO cell transformed with the above expression vector.

本発明の第４の具体的な目的は、分泌型hTPOと、検体
中の抗TPO抗体と結合することができる酵素標識抗体を
含む抗マイクロソーム抗体測定キットを提供することに
ある。A fourth specific object of the present invention is to provide an anti-microsomal antibody assay kit comprising secreted hTPO and an enzyme-labeled antibody capable of binding to an anti-TPO antibody in a sample.

（目的を達成する手段及び作用） 本発明によれば、上記の基本的目的は、hTPO遺伝子に
おける膜結合領域を切り離し、次いで合成リンカーを用
いて終止コドンを付与することにより分泌型hTPO産生用
遺伝子となし、この改変遺伝子を利用することにより達
成される。(Means and Actions to Achieve the Object) According to the present invention, the above-described basic object is to cut off the membrane-bound region in the hTPO gene and then add a stop codon using a synthetic linker to thereby produce a gene for secretory hTPO production. And by using this modified gene.

上記第１の具体的目的は、次の（ａ）〜（ｅ）の要件
を含む、分泌蛋白質であるヒト甲状腺パーオキシダーゼ
部分のCHO細胞における発現に適したプラスミドにより
達成される： （ａ）抗原活性が保持されている第１番目の蛋白質であ
るヒト甲状腺パーオキシダーゼ領域部分をコードし、Ｃ
末端付近にAccI切断サイトを有していて実質的に膜結合
領域をコードする配列がないDNA配列、 （ｂ）前記第１番目の蛋白質をコードするDNA配列の発
現を制御する第１番目のプロモータ配列、 （ｃ）第２番目の蛋白質であるジヒドロ葉酸レダクダー
ゼをコードするDNA配列、 （ｄ）前記第２番目の蛋白質をコードするDNA配列の発
現を制御する第２番目のプロモータ配列であって、該配
列において前記第１番目の蛋白質をコードするDNA配列
と前記第２番目の蛋白質をコードするDNA配列は、第１
番目のプロモータ配列と第２番目のプロモータ配列との
間に位置しており、且つ前記両プロモータ配列は互いに
逆向きになっている配列、及び （ｅ）前記第１番目の蛋白質をコードするDNA配列と前
記第２番目の蛋白質をコードするDNA配列との間に位置
する、前記２種類の蛋白質をコードする各DNAに共通な
１つのターミネータ配列。The first specific object is achieved by a plasmid suitable for the expression in CHO cells of a secreted protein, human thyroid peroxidase, including the following requirements (a) to (e): (a) antigen Coding for the human thyroid peroxidase region, the first protein of which activity is retained;
A DNA sequence having an AccI cleavage site near the end and substantially no sequence encoding a membrane-bound region; (b) a first promoter that controls the expression of the DNA sequence encoding the first protein (C) a DNA sequence encoding a second protein, dihydrofolate reductase, (d) a second promoter sequence controlling expression of the DNA sequence encoding the second protein, In the sequence, the DNA sequence encoding the first protein and the DNA sequence encoding the second protein are the first
A sequence located between the second promoter sequence and the second promoter sequence, and the two promoter sequences are opposite to each other; and (e) a DNA sequence encoding the first protein. A terminator sequence common to the DNAs encoding the two proteins, located between the DNA sequence encoding the second protein and the DNA sequence encoding the second protein.

既述の合成リンカーは、 にて示されるヌクレオチド配列を有しているものである
ことができる。The synthetic linker described above is May have the nucleotide sequence represented by

上記の第２の具体的目的は、抗原活性が保持されてい
る、分泌蛋白質であるヒト甲状腺パーオキシダーゼ領域
部分のCHO細胞における発現に適した、次の工程（ａ）
〜（ｒ）を含むプラスミドの調製方法により達成され
る： （ａ）制限酵素AccIでプラスミドphTPO−１を開裂し
て、抗原活性が保持されているヒト甲状腺パーオキシダ
ーゼ領域部分をコードする配列を含有し、且つ膜結合領
域をコードする配列を含有しないDNA配列を含む約5.7kb
のDNA断片を得ること、 （ｂ）前記工程（ａ）で得られたDNA断片に合成リンカ
ーを結合させて、リンカー結合DNA断片を得ること、 （ｃ）前記工程（ｂ）で得られたリンカー結合DNA断片
を制限酵素EcoRIで開裂させて、ヒト甲状腺パーオキシ
ダーゼ領域部分をコードするDNA配列を含有し、且つ膜
結合領域を含有しない配列を含む約2.8kbのDNA断片を得
ること、 （ｄ）前記工程（ｃ）で得られたDNA断片を、T4DNAリガ
ーゼの存在下で、制限酵素EcoRIで消化されたプラスミ
ドpUC19と反応させて、DNA結合体反応液を得ること、 （ｅ）前記工程（ｄ）で得られたDNA結合体反応液を用
いて大腸菌を形質転換させて形質転換体を得ること、 （ｆ）前記工程（ｅ）で得られた形質転換体からプラス
ミドphTPO−EALを回収すること、 （ｇ）前記工程（ｆ）で得られたプラスミドphTPO−EAL
を制限酵素EcoRIで切断し、抗原活性が保持されている
ヒト甲状腺パーオキシダーゼ領域部分をコードするDNA
配列を含有し、且つ実質的に膜結合領域をコードするDN
A配列を含有しない2.8kbのDNA断片を得ること、 （ｈ）別のプラスミドpSV2−dhfrを制限酵素HindIII及
びBglIIで開裂して、SV40プロモータ配列、ターミネー
タ配列及びE.coliにおける複製開始点配列を含む約4kb
のDNA断片を得ること、 （ｉ）前記工程（ｇ）で得られたDNA断片、及び前記工
程（ｈ）で得られたDNA断片を、DNAポリメラーゼＩの存
在下で、各々E.coliのクレノー断片と反応させて、各々
のDNAの断片にブラント末端を形成すること、 （ｊ）前記工程（ｉ）で得られたブラント末端が形成さ
れた２種類のDNA断片をT4DNAリガーゼと反応させて反応
液を得ること、 （ｋ）前記工程（ｊ）で得られた反応液でE.coliを形質
転換して、アンピシリン耐性の形質転換体を得ること、 （ｌ）前記工程（ｋ）で得られた形質転換体からプラス
ミドpSV2−hTPO−EALを回収すること、 （ｍ）別のプラスミドpSV2−dhfrを制限酵素PvuII及びB
glIIで開裂して、SV40プロモータ配列及びジヒドロ葉酸
レダクダーゼをコードするDNA配列を含む約1.1kbのDNA
断片を得ること、 （ｎ）前記工程（ｌ）で得られたプラスミドpSV2−hTPO
−EALを制限酵素EcoRIで開裂させて、DNA断片を得るこ
と、 （ｏ）前記工程（ｍ）で得られたDNA断片、及び前記工
程（ｎ）で得られたDNA断片を、DNAポリメラーゼＩの存
在下で、各々E.coliのクレノー断片と反応させて、各々
のDNA断片にブラント末端を形成すること、 （ｐ）前記工程（ｏ）で得られた２種類のDNA断片をT4D
NAリガーゼと反応させて反応液を得ること、 （ｑ）前記工程（ｐ）で得られた反応液でE.coliを形質
転換して、アンピシリン耐性の形質転換体を得ること、
及び （ｒ）前記工程（ｑ）で得られた形質転換体から7.8kb
のプラスミドpSV2−hTPO−EAL−dhfrを回収すること。The second specific object is that the following step (a) suitable for the expression in CHO cells of the human thyroid peroxidase region, which is a secreted protein, which retains the antigen activity.
(A) Cleavage of the plasmid phTPO-1 with the restriction enzyme AccI, containing a sequence encoding the human thyroid peroxidase region where the antigen activity is retained. About 5.7 kb, including the DNA sequence that does not contain the sequence encoding the membrane binding region
(B) binding a synthetic linker to the DNA fragment obtained in the step (a) to obtain a linker-bonded DNA fragment; (c) linker obtained in the step (b) Cleaving the ligated DNA fragment with the restriction enzyme EcoRI to obtain a DNA fragment of about 2.8 kb containing a DNA sequence encoding a human thyroid peroxidase region and containing a sequence not containing a membrane-bound region; (d) Reacting the DNA fragment obtained in the step (c) with the plasmid pUC19 digested with the restriction enzyme EcoRI in the presence of T4 DNA ligase to obtain a DNA conjugate reaction solution; Transforming Escherichia coli using the DNA conjugate reaction solution obtained in the above step) to obtain a transformant; and (f) recovering the plasmid phTPO-EAL from the transformant obtained in the step (e). (G) the plus obtained in the step (f). De phTPO-EAL
Encoding the human thyroid peroxidase region that retains antigenic activity by digestion with EcoRI
A DN containing a sequence and substantially encoding a membrane-bound region
Obtaining a 2.8 kb DNA fragment containing no A sequence; (h) cleaving another plasmid pSV2-dhfr with restriction enzymes HindIII and BglII to obtain an SV40 promoter sequence, a terminator sequence and a replication origin sequence in E. coli; About 4kb including
(I) ligating the DNA fragment obtained in the step (g) and the DNA fragment obtained in the step (h) in the presence of DNA polymerase I in the Klenow of E. coli, respectively. Reacting with the fragments to form blunt ends in each DNA fragment; (j) reacting the two types of blunt-end formed DNA fragments obtained in step (i) with T4 DNA ligase; (K) transforming E. coli with the reaction solution obtained in the step (j) to obtain an ampicillin-resistant transformant; (l) obtaining the transformant obtained in the step (k). Recovering the plasmid pSV2-hTPO-EAL from the transformed transformant, (m) replacing the other plasmid pSV2-dhfr with the restriction enzymes PvuII and Bv
Approximately 1.1 kb of DNA cleaved with glII and containing the SV40 promoter sequence and the DNA sequence encoding dihydrofolate reductase
(N) plasmid pSV2-hTPO obtained in step (l)
-Obtaining a DNA fragment by cleaving the EAL with a restriction enzyme EcoRI; (o) converting the DNA fragment obtained in the step (m) and the DNA fragment obtained in the step (n) into a DNA polymerase I; In the presence, each is reacted with a Klenow fragment of E. coli to form a blunt end in each DNA fragment. (P) The two types of DNA fragments obtained in the step (o) are subjected to T4D
Reacting with NA ligase to obtain a reaction solution; (q) transforming E. coli with the reaction solution obtained in the step (p) to obtain an ampicillin-resistant transformant;
And (r) 7.8 kb from the transformant obtained in the step (q).
The plasmid pSV2-hTPO-EAL-dhfr.

前記合成リンカーは式 にて示されるヌクレオチド配列を有しているものである
ことができる。The synthetic linker has the formula May have the nucleotide sequence represented by

上記第３の具体的目的は、上記のようにして作成され
たhTPO発現用ベクターをCHO細胞に取り込ませて形質転
換させることにより達成される。この場合に、発現ベク
ターのCHO細胞への取り込みは自体周知の手法を用いて
行うことができる。The third specific object is achieved by incorporating the hTPO expression vector prepared as described above into a CHO cell for transformation. In this case, the incorporation of the expression vector into CHO cells can be performed using a method known per se.

上記第４の具体的目的は、上記のようにして作成され
た形質転換細胞から産生された分泌型hTPOと、検体中の
抗TPO抗体と結合することができる酵素標識抗体を含む
抗マイクロソーム抗体測定キットにより達成される。The fourth specific object is to provide a secreted hTPO produced from the transformed cells prepared as described above, and an anti-microsomal antibody containing an enzyme-labeled antibody capable of binding to an anti-TPO antibody in a sample. This is achieved by a measurement kit.

（実施例等） 次に、hTPO発現用ベクターの作成例、動物細胞への該
ベクターの組込み例、hTPOの取得例及び試験例により本
発明を更に詳細に且つ具体的に説明する。(Examples and the like) Next, the present invention will be described in more detail and specifically with reference to an example of preparing a vector for expressing hTPO, an example of integrating the vector into animal cells, an example of obtaining hTPO, and a test example.

実施例１ （発現用ベクターの作成） 本例については第１図及び第２図を参照しつつ説明す
る。Example 1 (Preparation of Expression Vector) This example will be described with reference to FIGS. 1 and 2.

第１図はhTPO遺伝子の構成アミノ酸を親水性−疎水性
の観点から調べたコンピュータ解析図であり、この図か
ら明らかなように、hTPOはＮ−末端にシグナル配列を有
し、Ｃ−末端に膜結合領域を有しており、これらの間は
主として疎水性の高いアミノ酸が占めている。FIG. 1 is a computer analysis diagram in which the constituent amino acids of the hTPO gene were examined from the viewpoint of hydrophilicity / hydrophobicity. As is apparent from this figure, hTPO has a signal sequence at the N-terminus and a C-terminus. It has a membrane-bound region between which is predominantly occupied by highly hydrophobic amino acids.

従って、この天然性の膜結合型hTPO遺伝子を分泌型hT
PO遺伝子に変ずるためには、Ｃ−末端側にある膜結合領
域を切り離すことが必要である。Therefore, this natural membrane-bound hTPO gene is
In order to change to the PO gene, it is necessary to cut off the membrane-bound region on the C-terminal side.

S.KIMURA et．al．（“Proc.Natl.Acad.Sci.USA",Vo
l.84,pages5555−5559,Aug.1987,Biochemistry）によっ
てクローン化された、hTPOインサートを有するプラスミ
ド（phTPO 1）５μｇを、10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）、7mM MgCl_２及び100mM NaCl含有溶液50μｌに溶解
させ、制限酵素AccIを10単位添加し、37℃で２時間消化
反応させた。アガロースゲル電気泳動によるDNA分離法
を用いて上記の反応液からhTPO遺伝子の翻訳領域とベク
ター領域の一部を含む約5.7KbのDNA断片（膜結合領域は
上記の消化処理によりhTPO遺伝子の翻訳領域から分離除
去される）を約３μｇ得た。S.KIMURA et . al . (“Proc.Natl.Acad.Sci.USA”, Vo
l.84, pages 5555-5559, Aug. 1987, Biochemistry), 5 μg of the plasmid with the hTPO insert (phTPO1) was cloned into 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
5), dissolved in 50 μl of a solution containing 7 mM MgCl ₂ and 100 mM NaCl, 10 units of AccI restriction enzyme was added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. Using the DNA separation method by agarose gel electrophoresis, a DNA fragment of about 5.7 Kb containing the translation region of the hTPO gene and a part of the vector region from the above reaction solution (the membrane binding region is the translation region of the hTPO gene by the above digestion treatment) ) Was obtained.

このDNA断片に終止コドンと制限酵素認識部位を付与
するために、下記の２種類のDNAリンカーを合成した
（それぞれ14base及び12baseのもの）。In order to add a termination codon and a restriction enzyme recognition site to this DNA fragment, the following two types of DNA linkers were synthesized (14 base and 12 base, respectively).

即ち、これらの各一本鎖DNAをDNA合成装置（ABI社
製）を用いて調製し、各一本鎖DNA 50pmolを50mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl_２、10mM DTT及び1mM
ATP含有溶液50μｌに溶解させ、T4ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（宝酒造株式会社製）５単位を添加し、37℃で１
時間燐酸化反応させた。 That is, each single-stranded DNA was prepared using a DNA synthesizer (manufactured by ABI), and 50 pmol of each single-stranded DNA was added to 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 10 mM DTT and 1 mM.
Dissolve in 50 µl of ATP-containing solution, add 5 units of T4 polynucleotide kinase (Takara Shuzo Co., Ltd.), and add 1 unit at 37 ° C.
The phosphorylation reaction was performed for hours.

既述のhTPO含有DNA断片１μｇを70mMトリス塩酸緩衝
液（pH7.5）、10mM MgCl_２,10mM DTT及び1mM ATP含有溶
液50μｌに溶解させ、次いで上記の合成DNAリンカーの
燐酸化反応液を各々１μｌ添加した。この混合液にT4 D
NAリガーゼを５単位添加し、16℃で18時間連結反応を行
った。反応後の溶液に10単位の制限酵素EcoRIを添加
し、次いで37℃で２時間消化反応を行った。未反応のリ
ンカーDNAとベクター領域を除くためにアガロースゲル
を用いるDNA分離法にて処理することによりhTPO翻訳領
域を含む2.8KbのDNA断片を0.5μｇ得た。このDNA断片と
プラスミドpUC19のEcoRI分解物0.1μｇとを70mMトリス
塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl_２、10mM DTT及び1mM
ATP含有溶液50μｌに溶解させた。この混合液にT4 DNA
リガーゼを５単位添加し、16℃で18時間連結反応を行っ
た。得られた反応液を用いて大腸菌（JM109）を形質転
換させ、アンピシリン耐性のコロニーを得た。この形質
転換体からhTPO遺伝子インサートを有するプラスミド
（phTPO−EALと命名）を回収した。1 μg of the above-described hTPO-containing DNA fragment was dissolved in 50 μl of a solution containing 70 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 10 mM DTT and 1 mM ATP, and then 1 μl of the above-mentioned phosphorylation reaction solution of the synthetic DNA linker was used. Was added. Add T4 D to this mixture
Five units of NA ligase were added, and a ligation reaction was performed at 16 ° C. for 18 hours. After the reaction, 10 units of a restriction enzyme EcoRI was added to the solution after the reaction, and then a digestion reaction was performed at 37 ° C. for 2 hours. The unreacted linker DNA and the vector region were treated by a DNA separation method using an agarose gel to remove 0.5 μg of a 2.8 Kb DNA fragment containing the hTPO translation region. This DNA fragment and 0.1 μg of the EcoRI digest of plasmid pUC19 were combined with 70 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 10 mM DTT and 1 mM.
It was dissolved in 50 μl of an ATP-containing solution. Add T4 DNA to this mixture
Five units of ligase were added, and a ligation reaction was performed at 16 ° C. for 18 hours. Escherichia coli (JM109) was transformed using the obtained reaction solution to obtain ampicillin-resistant colonies. A plasmid having the hTPO gene insert (designated as phTPO-EAL) was recovered from the transformant.

このようにして構築され且つ膜結合領域を有していな
いhTPO蛋白質をコ一ドしているプラスミド（phTPO−EA
L）５μｇを、10mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、7mM Mg
Cl_２及び100mM NaCl含有溶液50μｌに溶解させ、制限酵
素EcoRIを10単位添加して37℃で２時間消化反応させ
た。アガロースゲル電気泳動によるDNA分離法を用いて
上記の反応液からhTPO遺伝子の翻訳領域を含む約2.8Kb
のDNA断片（膜結合領域を有さず）を約１μｇ得た。A plasmid (phTPO-EA) encoding the hTPO protein constructed in this way and having no membrane-bound region.
L) 5 μg of 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 7 mM Mg
The solution was dissolved in 50 μl of a solution containing Cl ₂ and 100 mM NaCl, and 10 units of a restriction enzyme EcoRI was added thereto, followed by digestion at 37 ° C. for 2 hours. Approximately 2.8 Kb containing the hTPO gene translation region from the above reaction solution using the DNA separation method by agarose gel electrophoresis
Of the DNA fragment (having no membrane-bound region) was obtained in an amount of about 1 μg.

一方、動物細胞での発現ベクターとして周知のプラス
ミド（pSV2−dhfr）を５μｇ採取し、10mMトリス塩酸緩
衝液（pH7.5）、7mM MgCl_２及び100mM NaCl含有溶液50
μｌに溶解させ、制限酵素HindIII及びBglIIを各々10単
位添加して37℃で２時間消化反応させた。得られた反応
液からアガロースゲル電気泳動によるDNA分離法を用い
てSV40プロモータ領域と、ターミネータ領域と、大腸菌
での複製開始点とを含む約4KbのDNA断片を得た。On the other hand, 5 μg of a well-known plasmid (pSV2-dhfr) as an expression vector in animal cells was collected, and a 50 mM solution containing 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 7 mM MgCl ₂ and 100 mM NaCl was collected.
μl, 10 units of each of restriction enzymes HindIII and BglII were added, and digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. A DNA fragment of about 4 Kb containing an SV40 promoter region, a terminator region, and a replication origin in Escherichia coli was obtained from the obtained reaction solution by a DNA separation method using agarose gel electrophoresis.

このDNA断片と既述のhTPO遺伝子含有DNA断片とを各々
１μｇ宛採取し、各DNA断片につき各々6.6mM MgCl_２、
6.6mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、50mM NaCl、6.6mMメ
ルカプトエタノール及び500μM dNTP含有溶液及びDNAポ
リメラーゼＩ（ラージフラグメント）を添加して、23℃
で60分間反応させた後に、フェノール抽出して酵素を失
活させ、エタノールを用いる沈澱法によりDNAを精製
し、末端の平滑化されたDNA断片を各々0.5μｇ宛得た。This DNA fragment and the above-described hTPO gene-containing DNA fragment were collected at 1 μg each, and 6.6 mM MgCl ₂ ,
A solution containing 6.6 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 50 mM NaCl, 6.6 mM mercaptoethanol and 500 μM dNTP and DNA polymerase I (large fragment) were added, and the mixture was added at 23 ° C.
After incubating for 60 minutes, the enzyme was inactivated by phenol extraction, the DNA was purified by a precipitation method using ethanol, and 0.5 μg of each blunt-ended DNA fragment was obtained.

次に、これらの両DNA断片を各々0.5μｇ宛採取し、70
mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、10mM MgCl_２、10mM DTT
及び1mM ATP含有溶液50μｌに溶解させた。この混合液
にT4 DNAリガーゼを５単位添加し、16℃で18時間連結反
応を行った。得られた反応液を用いて大腸菌（JM109）
を形質転換させ、アンピシリン耐性のコロニーを得た。
この形質転換体からhTPO遺伝子含有プラスミド（pSV2hT
PO−EALと命名）を回収した。Next, both of these DNA fragments were collected at 0.5 μg each,
mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 10 mM MgCl ₂ , 10 mM DTT
And 50 μl of a solution containing 1 mM ATP. Five units of T4 DNA ligase was added to this mixture, and a ligation reaction was performed at 16 ° C. for 18 hours. Escherichia coli (JM109) using the obtained reaction solution
Was transformed to obtain colonies resistant to ampicillin.
An hTPO gene-containing plasmid (pSV2hT
PO-EAL).

このプラスミド（pSV2hTPO−EAL）はプラスミド（pSV
2−dhfr）のdhfr（デヒドロ葉酸還元酵素）部分がhTPO
遺伝子に変換されたプラスミドに相当するものである。
しかしながら、この場合に除去されてしまうdhfr遺伝子
は薬剤耐性を賦与する作用を有しているので、このdhfr
遺伝子を上記のプラスミド（pSV2hTPO−EAL）に組み込
む操作を次に行う。This plasmid (pSV2hTPO-EAL) is a plasmid (pSV
Dhfr (dehydrofolate reductase) part of 2-dhfr) is hTPO
It corresponds to a plasmid converted into a gene.
However, since the dhfr gene which is deleted in this case has an action of conferring drug resistance,
Next, the operation of incorporating the gene into the above plasmid (pSV2hTPO-EAL) is performed.

プラスミド（pSV2−dhfr）５μｇを10mMトリス塩酸緩
衝液（pH7.5）、7mM MgCl_２及び100mM NaCl含有溶液50
μｌに溶解させ、制限酵素PvuII及びBglIIを10単位宛添
加して37℃で２時間消化反応させた。アガロースゲル電
気泳動によるDNA分離法を用いて上記の反応液からSV40
プロモータ領域とdhfr遺伝子領域とを含む約1.1KbのDNA
断片を約２μｇ得た。一方、上記の再構築プラスミド
（pSV2hTPO−EAL）を１μｇ採取し、10mMトリス塩酸緩
衝液（pH7.5）、7mM MgCl_２及び100mM NaCl含有溶液50
μｌに溶解させ、制限酵素EcoRIを10単位添加して37℃
で２時間消化反応させ、EcoRI認識部位において上記の
プラスミドpSV2hTPO−EALを切断してDNA断片となした。5 μg of the plasmid (pSV2-dhfr) was added to a 50 mM solution containing 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 7 mM MgCl ₂ and 100 mM NaCl.
Then, 10 units of restriction enzymes PvuII and BglII were added thereto, and a digestion reaction was carried out at 37 ° C. for 2 hours. SV40 from the above reaction solution using DNA separation method by agarose gel electrophoresis
Approximately 1.1 Kb DNA including promoter region and dhfr gene region
About 2 μg of the fragment was obtained. On the other hand, 1 μg of the above reconstructed plasmid (pSV2hTPO-EAL) was collected, and a 50 mM solution containing 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 7 mM MgCl ₂ and 100 mM NaCl was collected.
μl, add 10 units of restriction enzyme EcoRI, and add
For 2 hours to cut the above plasmid pSV2hTPO-EAL at the EcoRI recognition site to obtain a DNA fragment.

上記の両DNA断片を各々１μｇ宛採取し、各DNA断片に
つき各々6.6mM MgCl_２,6.6mMトリス塩酸緩衝液（pH7.
5）、50mM NaCl,6.6mMメルカプトエタノール及び500μM
dNTP含有溶液及びDNAポリメラーゼＩ（ラージフラグメ
ント）を添加して、23℃で60分間反応させた後に、フェ
ノール抽出して酵素活性を失活させ、エタノールを用い
る沈澱法によりDNAを精製し、末端の平滑化されたDNA断
片を各々0.5μｇ得た。1 μg of each of the above DNA fragments was collected, and 6.6 mM MgCl ₂ and 6.6 mM Tris-HCl buffer (pH 7.
5), 50 mM NaCl, 6.6 mM mercaptoethanol and 500 μM
After adding a dNTP-containing solution and DNA polymerase I (large fragment) and reacting at 23 ° C. for 60 minutes, phenol extraction was performed to inactivate the enzyme activity, and DNA was purified by a precipitation method using ethanol. 0.5 μg of each of the blunted DNA fragments was obtained.

次に、これらの両DNA断片を各々0.5μｇ宛採取し、70
mMトリス塩酸緩衝液（pH7.5）、1mM MgCl_２,10mM DTT及
び1mM ATP含有溶液50μｌに溶解させた。この混合液にT
4 DNAリガーゼを５単位添加し、16℃で18時間連結反応
を行った。得られた反応液を用いて大腸菌（JM109）を
形質転換させ、アンピシリン耐性のコロニーを得た。こ
の形質転換体から所望の発現ベクターであるプラスミド
（pSV2hTPO−EAL−dhfrと命名）を回収した。Next, both of these DNA fragments were collected at 0.5 μg each,
It was dissolved in 50 μl of a solution containing mM Tris-HCl buffer (pH 7.5), 1 mM MgCl ₂ , 10 mM DTT and 1 mM ATP. T
4 Five units of DNA ligase were added, and a ligation reaction was performed at 16 ° C. for 18 hours. Escherichia coli (JM109) was transformed using the obtained reaction solution to obtain ampicillin-resistant colonies. A plasmid (designated as pSV2hTPO-EAL-dhfr) as a desired expression vector was recovered from the transformant.

実施例２ （動物細胞への組込み） ａ）細胞の培養 動物細胞としては、真核生物細胞であるCHO−dhfr⁻
細胞であって、Lawrence A.Chasin et．al．が樹立した
DXB11株［“Proc.Natl.Acad.Sci.USA",Vol.77,No.7,pag
es 4126−4220（1980）］（以下、単に「CHO細胞」と称
する）が採択された。The Example 2 (incorporation into animal cells) a) culturing animal cells in a cell, CHO-dhfr is a eukaryotic cell ^-
Cells, Lawrence A. Chasin et . al . Was established
DXB11 strain [“Proc. Natl. Acad. Sci. USA”, Vol. 77, No. 7, pag
es 4126-4220 (1980)] (hereinafter simply referred to as "CHO cells").

培地としては、GIBCO社製のMEMアルファ培地、（No.4
10−1900）に、2.2g/lのNaHCO_３を添加したもの［以下
「α（＋）MEM培地」と称する］に、５％濃度の透析牛
胎児血清（以下「Ｄ−FCS」と称する）を加えたものを
使用した。この場合のＤ−FCSは、Flow社製の組織培養
用の牛胎児血清をPBS（8.0g/l NaCl、0.2g/l KCl、1.15
g/l Na_２HPO_４及び0.2g/l KH_２PO_４）に対して透析する
ことにより調製した。この透析は、透析チューブ（サイ
ズ:36/32）に200mlのFCSを添加し、10リットルのPBSに
対して、４℃の温度下で撹拌しながら行い約10時間毎に
PBSを３回にわたり全量交換して行った。この透析処理
後に、蛋白質低吸着フィルタ（ポアーサイズ:0.22μ
ｍ）を用いて濾過除菌を行い、次いで培地に添加した。As a medium, MEM alpha medium manufactured by GIBCO, (No. 4
10-1900) to which 2.2 g / l of NaHCO ₃ has been added [hereinafter referred to as “α (+) MEM medium”] to a 5% concentration of dialyzed fetal bovine serum (hereinafter referred to as “D-FCS”). Was used. In this case, D-FCS was prepared by using a fetal bovine serum for flow culture manufactured by Flow, Inc. in PBS (8.0 g / l NaCl, 0.2 g / l KCl, 1.15 g / l).
g / l Na ₂ HPO ₄ and 0.2 g / l KH ₂ PO ₄ ). In this dialysis, 200 ml of FCS is added to a dialysis tube (size: 36/32), and the mixture is stirred with 10 liters of PBS at a temperature of 4 ° C. every about 10 hours.
The total amount of PBS was changed three times. After this dialysis treatment, a protein low adsorption filter (pore size: 0.22μ
m) was filtered to remove bacteria and then added to the medium.

培養は、CO_２インキュベータを用いて温度37℃、５％
CO_２添加大気下、水蒸気飽和下で行われた。継代は、PB
Sで洗浄し、0.05％トリプシン（DIFCO社製）及び0.02％
EDTAを添加したPBSを用いて細胞を回収することにより
行い、スプリット比1:10−1:20で３−４日毎に行った。Culture is performed at 37 ° C and 5% using a CO ₂ incubator.
The test was performed under a CO ₂ -added atmosphere under water vapor saturation. Passage is PB
Washed with S, 0.05% trypsin (DIFCO) and 0.02%
This was performed by recovering the cells using PBS to which EDTA was added, and performed every 3-4 days at a split ratio of 1: 10-1: 20.

ｂ）遺伝子の導入及び形質転換細胞の取得 上記の方法で培養し、次いで回収したCHO細胞を５％
Ｄ−FCS添加α（＋）MEM培地で洗浄した後に、導入バッ
ファ［0.25Mマンニトール、0.1M CaCl_２、0.1mM MgC
l_２、0.2mMトリス塩酸緩衝液（pH7.2）］により５×10
^７細胞/mlの密度に調整する。一方、実施例１で得たベ
クター（pSV2−hTPO−EAL−dhfr）を制限酵素EcoRIで消
化し、エタノール沈澱法により回収して上記の導入バッ
ファに400μg/mlの濃度で溶解させた。b) Introduction of Gene and Acquisition of Transformed Cells 5% of CHO cells cultured and then recovered by the above method
After washing with an α (+) MEM medium supplemented with D-FCS, an introduction buffer [0.25 M mannitol, 0.1 M CaCl ₂ , 0.1 mM MgC
l _2, 5 × 10 by 0.2mM Tris-HCl buffer (pH 7.2)]
Adjust to a density of ⁷ cells / ml. On the other hand, the vector (pSV2-hTPO-EAL-dhfr) obtained in Example 1 was digested with a restriction enzyme EcoRI, recovered by an ethanol precipitation method, and dissolved in the above introduction buffer at a concentration of 400 μg / ml.

このベクター溶解液と上記の細胞懸濁液とを等量宛混
合し、エレクトロポレーションに付した。このエレクト
ロポレーションは、島津製作所（株）製の細胞融合装置
（SSH−１）を用いて行い、条件はパルス強度3KV/cm、
パルス幅50μsec、パルス間隔1.0sec、パルス回数２回
に設定した。導入チャンバ（形式Ｃ−12）に上記の混合
液40μｌを添加し、パルス印加後に室温下で約10分間静
置し、8mlの５％Ｄ−FCS添加α（＋）MEM培地を添加し
たφ100mmのペトリ皿10枚に等分して移した。約48時間
培養した後に５％Ｄ−FCS添加α（−）MEM培地（GIBCO
社製、No.410−2000）に交換し、以降約３日毎にこの培
地を交換しながら培養を継続した。培養開始から約２週
間目に形質転換細胞のコロニーをペニシリンカップによ
り隔離し、トリプシン処理によりこのコロニーを回収し
た。これを12穴マルチデッシュで継代培養した後に、次
項で述べるスクリーニングに付した。This vector lysis solution and the above-mentioned cell suspension were mixed in equal amounts and subjected to electroporation. This electroporation was performed using a cell fusion device (SSH-1) manufactured by Shimadzu Corporation under the conditions of a pulse intensity of 3 KV / cm,
The pulse width was set to 50 μsec, the pulse interval was set to 1.0 sec, and the number of pulses was set to twice. 40 μl of the above mixture was added to the introduction chamber (type C-12), and after pulse application, the mixture was allowed to stand at room temperature for about 10 minutes, and 8 ml of α (+) MEM medium supplemented with 5% D-FCS was added. Aliquots were transferred to 10 Petri dishes. After culturing for about 48 hours, an α (-) MEM medium supplemented with 5% D-FCS (GIBCO
(No. 410-2000), and the culture was continued while changing the medium about every three days thereafter. About two weeks after the start of the culture, colonies of the transformed cells were isolated with a penicillin cup, and the colonies were recovered by trypsinization. This was subcultured in a 12-well multi-dish and then subjected to screening described in the next section.

ｃ）分泌型hTPO発現細胞株のスクリーニング 天然のhTPOは膜結合型蛋白質であり、従ってhTPO遺伝
子により形質転換されたCHO細胞を培養する場合に産生
されたhTPOは細胞膜上に発現する。c) Screening of secretory hTPO-expressing cell lines Natural hTPO is a membrane-bound protein, and thus hTPO produced when CHO cells transformed with the hTPO gene are cultured is expressed on the cell membrane.

しかしながら、前項で得た形質転換CHO細胞は、実施
例１から明らかなように、hTPO遺伝子から膜結合領域の
取り除かれた遺伝子で形質転換されており、従って所望
の産物であるhTPO蛋白質は培養上清中に分泌される筈で
ある。However, the transformed CHO cells obtained in the previous section were transformed with the gene in which the membrane-binding region was removed from the hTPO gene, as is clear from Example 1. Therefore, the desired product, hTPO protein, was not used in culture. It should be secreted during Qing.

そこで、培養上清中に分泌されるhTPOの量を以下に述
べるエンザイムイムノアッセイ法（EIA法）により測定
した。即ち、上記の12穴マルチデッシュで形質転換細胞
を培養し、培養上清を96穴タイタープレートにおける１
つの穴に移し、37℃で２時間放置した。培養上清を捨て
た後、PBSにて３度洗浄し、200μｌの４倍希釈ブロッキ
ング溶液（雪印乳業株式会社製）を添加し、37℃で１時
間放置した。PBSにて３度洗浄後、ラビット抗hTPO血清
をPBSにて1000倍に希釈した溶液100μｌを添加し、37℃
にて１時間放置した。ついで、PBSで３度洗浄後、アル
カリ性フォスファターゼ標識抗ラビットIgG溶液（TAGO
社製）を500倍に希釈した溶液100μｌを添加して37℃
で、１時間放置した。次いで、PBSにて３度洗浄後、基
質溶液（Na_２CO_３1.5g/l、NaHCO_３0.84g/l、フェニルホ
スフェート・2Na0.98g/l、４−アミノアンチピリン0.41
g/l）100μｌを添加し、室温にて30分間放置した。次
に、発色試薬（NalO_４8g/l）100μｌを添加し、得られ
た溶液の吸光度を測定波長490nmで測定した。この吸光
度が高い値を示す細胞株がhTP0産生能を有する所望の細
胞株である。Therefore, the amount of hTPO secreted into the culture supernatant was measured by the enzyme immunoassay (EIA method) described below. That is, the transformed cells were cultured in the above-described 12-well multi-dish, and the culture supernatant was collected in a 96-well titer plate.
And left at 37 ° C. for 2 hours. After discarding the culture supernatant, the plate was washed three times with PBS, 200 μl of a 4-fold diluted blocking solution (manufactured by Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) was added, and the mixture was left at 37 ° C. for 1 hour. After washing three times with PBS, 100 μl of a solution of rabbit anti-hTPO serum diluted 1000-fold with PBS was added, and the mixture was added at 37 ° C.
For 1 hour. Then, after washing three times with PBS, an alkaline phosphatase-labeled anti-rabbit IgG solution (TAGO
100 μl of a 500-fold diluted solution of
And left for 1 hour. Then, after washing three times with PBS, the substrate solution (Na ₂ CO ₃ 1.5 g / l, NaHCO ₃ 0.84 g / l, phenyl phosphate · 2Na 0.98 g / l, 4-aminoantipyrine 0.41
g / l) of 100 μl was added and left at room temperature for 30 minutes. Then, the coloring reagent (NalO ₄ 8g / l) 100μl was added, the absorbance of the resulting solution was measured at a measurement wavelength 490 nm. The cell line having a high absorbance is a desired cell line having hTP0 producing ability.

ｄ）hTPO高発現細胞株の取得 上記のｃ）項で得た細胞株の内で最も高い吸光度を示
した細胞株（STF−１と命名）を、8mlの培地に１×10^５
細胞懸濁させて100mm（φ）のペトリ皿に植え込んだ。
この場合の培地としては、５％FCS添加α（−）MEM培地
に0.02μＭメソトレキセート（MTX）を添加して用い
た。約３日毎に培地を新鮮培地に交換しながら、約２週
間培養し、出現したMTX耐性コロニーをペニシリンカッ
プ法で回収し、ｃ）項で述べたEIA法でhTPO高産生株を
スクリーニングした。d) Acquisition of hTPO high expression cell line The cell line showing the highest absorbance among the cell lines obtained in the above item c) (designated as STF-1) was placed in 8 ml of a medium at 1 × 10 ⁵ cells.
The cells were suspended and seeded in a 100 mm (φ) petri dish.
As a medium in this case, 0.02 μM methotrexate (MTX) was added to an α (−) MEM medium supplemented with 5% FCS. The culture was cultured for about 2 weeks while replacing the medium with a fresh medium about every three days. Appeared MTX-resistant colonies were collected by the penicillin cup method, and high hTPO-producing strains were screened by the EIA method described in c).

MTX濃度を上昇させて上記のスクリーニング操作を繰
り返すことによってhTPO産生率が更に高い株を得ること
ができる。By increasing the MTX concentration and repeating the above-mentioned screening operation, a strain with a higher hTPO production rate can be obtained.

最終的には、0.1μM MTX耐性株（STT−１と命名）を
得た。Finally, a 0.1 μM MTX-resistant strain (designated as STT-1) was obtained.

ｅ）STT−１株のスケールアップ培養 上記のｄ）項で得た細胞株STT−１を、30mlの培地に
４×10^５細胞懸濁させて150mm（φ）のペトリ皿２枚に
植え込んだ。この場合の培地としては、５％FCS添加α
（−）MEM培地に0.1μM MTXを添加して用いた。約３日
毎に培地を新鮮培地に交換しながら、約９日間培養し、
培養上清約150mlを得た。EIA法でhTPO量を検討した処、
得られた培養上清中1mlにhTPOが40ng含有されていた。
この培養上清からhTPOを精製するために、小谷等が開発
した抗hTPOモノクローナル抗体結合アフィニティーカラ
ム［“J.Clin.Endocinol.Metab.",Vol.63,page570（198
6）］に吸着させ且つ同誌に記載の方法で溶出させた。E
IA法でhTPO量を検討した処、得られた溶出液1ml中にhTP
Oが５μｇ含有されていた。e) Scale-up culture of STT-1 strain The cell line STT-1 obtained in the above item d) was suspended in 4 × 10 ⁵ cells in 30 ml of a medium, and was suspended in two 150 mm (φ) Petri dishes. . In this case, as a medium, 5% FCS added α
(-) 0.1 μM MTX was added to a MEM medium and used. Culture for about 9 days, replacing the medium with fresh medium about every 3 days,
About 150 ml of the culture supernatant was obtained. After examining the amount of hTPO by the EIA method,
1 ng of the obtained culture supernatant contained 40 ng of hTPO.
To purify hTPO from this culture supernatant, an anti-hTPO monoclonal antibody binding affinity column [“J. Clin. Endocinol. Metab.”, Vol. 63, page 570 (198
6)] and eluted by the method described in the same journal. E
When the amount of hTPO was examined by the IA method, hTP was contained in 1 ml of the obtained eluate.
5 μg of O was contained.

試験例１ （産生されたhTPOの分子量測定） アフィニティーカラムクロマトグラフィーにより精製
されたhTPO含有溶液（５μg/ml）を凍結乾燥後、再度水
に溶解させることにより100ng/μｌの濃度のhTPO含有溶
液50μｌを得た。このhTPO溶液10μｌに15μｌの試料緩
衝液［60mg/ml SDS、150mMトリス塩酸緩衝液（pH6.
8）、20％グリセロール、0.01％BPBを含有］を添加し、
８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた。泳動後
にニトロセルロース膜に転写し、このニトロセルロース
膜をブロッキング溶液（実施例２のｃ）項で言及したも
のと同じ）に一夜浸漬した。次いで、ラビット抗hTPO血
清をＴ−PBS溶液（0.05％Tween添加PBS）で500倍に希釈
した溶液に浸漬し、穏やかに１時間振盪した。次いで、
ニトロセルロース膜をＴ−PBS溶液に浸漬し、穏やかに
振盪させた（この場合にＴ−PBS溶液を15分間毎に３回
交換した）。更に、ビオチン化抗ラビットIgG溶液を500
倍に希釈した溶液中にニトロセルロース膜を浸漬させて
１時間穏やかに振盪する。次いで、３度PBSにて洗浄
後、ABC試薬中で30分間反応させ、PBS溶液で先と同様に
洗浄した。その後、基質溶液［ダイアニシジン5mg、H₂O
₂30μｌ、1Mトリス塩酸緩衝液（pH7.5）1ml/100ml］に
浸漬させ室温にて15分間放置しバンドを検出した（第４
図）。以上のABCを用いたウエスタン・ブロッティング
の実験（第４図参照）には、Vector Lab.社製のABCキッ
トを用いた。一方、先のhTPO溶液を、上記と同様の方法
で電気泳動した後に、クーマシー染色した結果を対照と
して第３図に示す。Test Example 1 (Measurement of Molecular Weight of Produced hTPO) An hTPO-containing solution (5 μg / ml) purified by affinity column chromatography was lyophilized, and then dissolved in water again to obtain 50 ng / h of an hTPO-containing solution having a concentration of 100 ng / μl. I got To 10 μl of this hTPO solution, 15 μl of a sample buffer [60 mg / ml SDS, 150 mM Tris-HCl buffer (pH 6.
8) containing 20% glycerol and 0.01% BPB]
The samples were subjected to 8% polyacrylamide gel electrophoresis. After electrophoresis, it was transferred to a nitrocellulose membrane, and the nitrocellulose membrane was immersed in a blocking solution (same as mentioned in item (c) of Example 2) overnight. Next, the rabbit anti-hTPO serum was immersed in a solution diluted 500-fold with a T-PBS solution (PBS containing 0.05% Tween) and gently shaken for 1 hour. Then
The nitrocellulose membrane was immersed in the T-PBS solution and gently shaken (in this case, the T-PBS solution was changed three times every 15 minutes). In addition, add 500 g of biotinylated anti-rabbit IgG solution.
The nitrocellulose membrane is immersed in the dilute solution and shaken gently for 1 hour. Next, the plate was washed three times with PBS, reacted in an ABC reagent for 30 minutes, and washed with a PBS solution in the same manner as above. Then, a substrate solution [5 mg of dianisidine, H ₂ O
₂ 30 μl, 1 M Tris-HCl buffer (pH 7.5) 1 ml / 100 ml] and left at room temperature for 15 minutes to detect the band (No. 4
Figure). In the above Western blotting experiment using ABC (see FIG. 4), an ABC kit manufactured by Vector Lab. Was used. On the other hand, the result of electrophoresis of the hTPO solution in the same manner as described above and then Coomassie staining is shown in FIG. 3 as a control.

尚、対照としては［“J.Clin.Endocinol.Metab.",Vo
l.63,page570（1986）］に記載の方法でヒト甲状腺組織
から精製した天然性の膜結合型hTPOを用いた。As a control, [“J. Clin. Endocinol. Metab.”, Vo
l, page 570 (1986)], natural membrane-bound hTPO purified from human thyroid tissue was used.

結果は、第３図及び第４図に示される通りである。天
然型hTPO分子は、107Kダルトンの分子量を示すのに対
し、分泌型hTPO分子は、膜結合領域の分だけ分子量が小
さくなり101Kダルトンの分子量を示した（pSV2hTPO−EA
L−dhfrを導入しなかったCHO細胞ではhTPOの発現が認め
られなかった）。The results are as shown in FIG. 3 and FIG. The natural hTPO molecule has a molecular weight of 107 K daltons, whereas the secretory hTPO molecule has a molecular weight of 101 K daltons, which is smaller by the membrane-bound region (pSV2hTPO-EA).
HTPO expression was not observed in CHO cells into which L-dhfr was not introduced).

試験例２ 本発明により得られた分泌型hTPO及び天然の膜結合型
hTPOと自己免疫性甲状腺疾患患者の血清との反応性を実
施例２のｃ）項で言及したEIA法と同様にして、但しラ
ビット抗hTPO血清の代わりに自己免疫性甲状腺疾患患者
の血清をPBSで10倍希釈した溶液を用い、又、ビオチン
化ラビット抗IgG溶液の代わりに、ビオチン化ヒト抗IgG
溶液を用い、測定波長492nmでの吸光度を測定し、hTPO
の抗原性力価の指標とした。対照としては健常人の血清
を用いた。結果は、第５図に示される通りであり、健常
人血清は、分泌型hTPOに対して殆ど反応性を示さないの
に対し、自己免疫性甲状腺疾患患者の血清は明かな反応
性を示した。Test Example 2 Secreted hTPO obtained according to the present invention and natural membrane-bound hTPO
The reactivity of hTPO with the serum of an autoimmune thyroid disease patient was determined in the same manner as in the EIA method mentioned in section c) of Example 2, except that the serum of the autoimmune thyroid disease patient was replaced with PBS instead of the rabbit anti-hTPO serum. Using a solution diluted 10 times with, and in place of the biotinylated rabbit anti-IgG solution, biotinylated human anti-IgG
Using the solution, measure the absorbance at the measurement wavelength of 492 nm, and
Was used as an index of the antigenic titer. Serum of a healthy person was used as a control. The results are as shown in FIG. 5. The serum of a healthy individual showed almost no reactivity to secretory hTPO, whereas the serum of a patient with autoimmune thyroid disease showed a clear reactivity. .

（発明の効果） 本発明によれば、膜結合領域の取り除かれたhTPO遺伝
子インサート部位を有する発現用プラスミド、該プラス
ミドの作成法、該プラスミドにより形質転換されてhTPO
産生能を獲得したCHO細胞及び該動物細胞を培養してhTP
Oを取得する方法が提供される。(Effects of the Invention) According to the present invention, an expression plasmid having an hTPO gene insert site from which a membrane-bound region has been removed, a method for preparing the plasmid, and hTPO transformed by the plasmid
CHO cells that have acquired the production ability and the animal cells are cultured to obtain hTP
A way to get O is provided.

従って、本発明によればhTPOが遺伝子工学的に生産さ
れるので、抗マイクロソーム抗体の使用抗原として用い
る場合に、現在使用されているヒト甲状腺組織やそのマ
イクロソーム分画と比較する場合に反応特異性が向上
し、測定感度の面において優れたものとなる。Therefore, since hTPO is produced by genetic engineering according to the present invention, when used as an antigen to be used for an anti-microsomal antibody, it reacts when compared with the currently used human thyroid tissue or its microsomal fraction. The specificity is improved, and the measurement sensitivity is improved.

尚、本発明者等が先に開発した特開平３−91487公報
に開示されている発明と比較する場合にも、この先願発
明において発現産生されるhTPOは膜結合型のものであ
り、従って細胞膜に固着した形で発現するために個々の
細胞における産生量に自ずから制限があり且つ遺伝子組
換え動物細胞が産生したhTPOを取得するためには成熟し
た産生細胞の破壊が条件であり、後処理も面倒である
が、本発明によれば産生されたhTP0は細胞外に分泌され
るので、培養上清を採取し、これからhTPOを分離取得処
理することができ、一方成熟産生細胞については培養液
を補充することにより培養を継続できるので、hTPOの生
産性に格別の制限がない。In comparison with the invention disclosed in JP-A-3-91487, which was previously developed by the present inventors, hTPO expressed and produced in the prior application is a membrane-bound type, and In order to obtain hTPO produced by transgenic animal cells, it is necessary to destroy mature producing cells, and post-treatment is also required. Although it is troublesome, the hTP0 produced according to the present invention is secreted extracellularly, so that a culture supernatant can be collected and hTPO can be separated and obtained from the culture supernatant. There is no particular restriction on the productivity of hTPO since the culture can be continued by supplementation.

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図はヒト甲状腺パーオキシダーゼ遺伝子の構成アミ
ノ酸を親水性一疎水性の観点から調べたコンピュータ解
析図であり、 第２図は本発明による分泌型ヒト甲状腺パーオキシダー
ゼ発現用ベクダーの構築態様を示す図面であり、 第３図は本発明による分泌型ヒト甲状腺パーオキシダー
ゼ、天然性の膜結合型ヒト甲状腺パーオキシダーゼ及び
該膜結合型ヒト甲状腺パーオキシダーゼの分子量を各種
の分子量マーカと共にクーマシー染色法を利用して測定
した結果を模写した図面であり、 第４図は本発明による分泌型ヒト甲状腺パーオキシダー
ゼ、天然性の膜結合型ヒト甲状腺パーオキシダーゼ及び
該膜結合型ヒト甲状腺パーオキシダーゼの分子量をウエ
スタン・ブロッティング法を利用して測定した結果を模
写した図面である。 第５図は本発明による分泌型ヒト甲状腺パーオキシダー
ゼ及び天然性の膜結合型ヒト甲状腺パーオキシダーゼと
自己免疫性甲状腺疾患患者の血清及び健常人の血清との
反応性を調べた結果を示すグラフである。FIG. 1 is a computer analysis diagram in which the constituent amino acids of the human thyroid peroxidase gene are examined from the viewpoint of hydrophilicity and hydrophobicity, and FIG. 2 shows the construction of a vector for expressing secretory human thyroid peroxidase according to the present invention. FIG. 3 shows the secretory human thyroid peroxidase, natural membrane-bound human thyroid peroxidase according to the present invention, and the molecular weight of the membrane-bound human thyroid peroxidase using various molecular weight markers by Coomassie staining. FIG. 4 is a drawing mimicking the results of the measurements of the secretory human thyroid peroxidase, natural membrane-bound human thyroid peroxidase, and the molecular weight of the membrane-bound human thyroid peroxidase according to the present invention. It is the figure which copied the result measured using the blotting method. FIG. 5 is a graph showing the results obtained by examining the reactivity of secretory human thyroid peroxidase and natural membrane-bound human thyroid peroxidase according to the present invention with the sera of patients with autoimmune thyroid disease and the sera of healthy individuals. is there.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 9/08 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 秦 淳一郎 茨城県古河市雷電町８―24 ジユネスタ カダＡ102 (72)発明者 可部野 昌子 東京都小平市喜平町３丁目３―16―305 (72)発明者 松本 健 茨城県猿島郡総和町下辺見2120 (72)発明者 八木橋 悟 茨城県猿島郡総和町下辺見474―１ 日 本製薬寮 (72)発明者 加藤 英夫 埼玉県春日部市豊町５―16―７―202 (56)参考文献 Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐ ｙｓ．，Ｖｏｌ．278，Ｎｏ．２（1990. ５月１日）ｐ．333−341 ＥＭＢＯ Ｊ．，Ｖｏｌ．６，Ｎｏ. 13（1987）ｐ．4193−4196 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，Ｖｏｌ．84（1987) ｐ．5555−5559──────────────────────────────────────────────────の Continued on the front page (51) Int.Cl. ⁶ Identification symbol FI (C12N 9/08 C12R 1:91) (72) Inventor Junichiro Hata 8-24 Raidencho, Furukawa-shi, Ibaraki Pref. Inventor Masako Kabeno 3-3-16-1305, Kiheicho, Kodaira-shi, Tokyo 1 Nippon Pharmaceutical Dormitory (72) Inventor Hideo Kato 5-16-7-202 Toyocho, Kasukabe-shi, Saitama (56) References Arch. Biochem. Biopys. , Vol. 278, no. 2 (May 1, 1990) p. 333-341 EMBO J.C. , Vol. 6, No. 13 (1987) p. 4193-4196 Proc. Natl. Acad. Sc i. U. S. A. , Vol. 84 (1987) p. 5555-5559

Claims (14)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】次の（ａ）〜（ｅ）の要件を含む、分泌蛋
白質であるヒト甲状腺パーオキシダーゼ部分のCHO細胞
における発現に適したプラスミド： （ａ）抗原活性が保持されている第１番目の蛋白質であ
るヒト甲状腺パーオキシダーゼ領域部分をコードし、Ｃ
末端付近にAccI切断サイトを有していて実質的に膜結合
領域をコードする配列がないDNA配列、 （ｂ）前記第１番目の蛋白質をコードするDNA配列の発
現を制御する第１番目のプロモータ配列、 （ｃ）第２番目の蛋白質であるジヒドロ葉酸レダクター
ゼをコードするDNA配列、 （ｄ）前記第２番目の蛋白質をコードするDNA配列の発
現を制御する第２番目のプロモータ配列であって、該配
列において前記第１番目の蛋白質をコードするDNA配列
と前記第２番目の蛋白質をコードするDNA配列は、第１
番目のプロモータ配列と第２番目のプロモータ配列との
間に位置しており、且つ前記両プロモータ配列は互いに
逆向きになっている配列、及び （ｅ）前記第１番目の蛋白質をコードするDNA配列と前
記第２番目の蛋白質をコードするDNA配列との間に位置
する、前記２種類の蛋白質をコードする各DNAに共通な
１つのターミネータ配列。1. A plasmid suitable for the expression in CHO cells of a human thyroid peroxidase portion, which is a secreted protein, which includes the following requirements (a) to (e): (a) a first plasmid having antigen activity The third protein, the human thyroid peroxidase region,
A DNA sequence having an AccI cleavage site near the end and substantially no sequence encoding a membrane-bound region; (b) a first promoter that controls the expression of the DNA sequence encoding the first protein (C) a DNA sequence encoding a second protein, dihydrofolate reductase, (d) a second promoter sequence controlling expression of the DNA sequence encoding the second protein, In the sequence, the DNA sequence encoding the first protein and the DNA sequence encoding the second protein are the first
A sequence located between the second promoter sequence and the second promoter sequence, and the two promoter sequences are opposite to each other; and (e) a DNA sequence encoding the first protein. A terminator sequence common to the DNAs encoding the two proteins, located between the DNA sequence encoding the second protein and the DNA sequence encoding the second protein. 【請求項２】前記第１番目及び第２番目のプロモータは
各々SV40プロモータに由来したものであり、前記ターミ
ネータはSV40ターミネータに由来する請求項１に記載の
プラスミド。2. The plasmid according to claim 1, wherein said first and second promoters are each derived from an SV40 promoter, and said terminator is derived from an SV40 terminator. 【請求項３】CHO細胞での分泌蛋白質であるヒト甲状腺
パーオキシダーゼ部分の発現に適した7.8kbのpSV2−hTP
O−EAL−dhfrプラスミド。3. A 7.8 kb pSV2-hTP suitable for the expression of a human thyroid peroxidase moiety which is a secreted protein in CHO cells.
O-EAL-dhfr plasmid. 【請求項４】請求項１又は２に記載のプラスミドで形質
転換されたCHO細胞。4. A CHO cell transformed with the plasmid according to claim 1 or 2. 【請求項５】請求項３に記載のプラスミドで形質転換さ
れたCHO細胞。5. A CHO cell transformed with the plasmid according to claim 3. 【請求項６】請求項４に記載のCHO細胞によって細胞外
に産生された分泌型ヒト甲状腺パーオキシダーゼ。A secretory human thyroid peroxidase produced extracellularly by the CHO cell according to claim 4. 【請求項７】請求項５に記載のCHO細胞によって細胞外
に産生された分泌型ヒト甲状腺パーオキシダーゼ。7. A secreted human thyroid peroxidase produced extracellularly by the CHO cell according to claim 5. 【請求項８】請求項６に記載の分泌型ヒト甲状腺パーオ
キシダーゼと、検体中の抗TPO抗体と結合することがで
きる酵素標識抗体を含む抗マイクロソーム抗体測定キッ
ト。8. An anti-microsomal antibody assay kit comprising the secretory human thyroid peroxidase according to claim 6 and an enzyme-labeled antibody capable of binding to an anti-TPO antibody in a sample. 【請求項９】請求項７に記載の分泌型ヒト甲状腺パーオ
キシダーゼと、検体中の抗TPO抗体と結合することがで
きる酵素標識抗体を含む抗マイクロソーム抗体測定キッ
ト。9. An anti-microsomal antibody assay kit comprising the secretory human thyroid peroxidase according to claim 7 and an enzyme-labeled antibody capable of binding to an anti-TPO antibody in a sample. 【請求項１０】抗原活性が保持されている、分泌蛋白質
であるヒト甲状腺パーオキシダーゼ領域部分のCHO細胞
における発現に適した、次の工程（ａ）〜（ｒ）を含む
プラスミドの調製方法： （ａ）制限酵素AccIでプラスミドphTPO−１を開裂し
て、抗原活性が保持されているヒト甲状腺パーオキシダ
ーゼ領域部分をコードする配列を含有し、且つ膜結合領
域をコードする配列を含有しないDNA配列を含む約5.7kb
のDNA断片を得ること、 （ｂ）前記工程（ａ）で得られたDNA断片に合成リンカ
ーを結合させて、リンカー結合DNA断片を得ること、 （ｃ）前記工程（ｂ）で得られたリンカー結合DNA断片
を制限酵素EcoRIで開裂させて、ヒト甲状腺パーオキシ
ダーゼ領域部分をコードするDNA配列を含有し、且つ膜
結合領域を含有しない配列を含む約2.8kbのDNA断片を得
ること、 （ｄ）前記工程（ｃ）で得られたDNA断片を、T4 DNAリ
ガーゼの存在下で、制限酵素EcoRIで消化されたプラス
ミドpUC19と反応させて、DNA結合体反応液を得ること、 （ｅ）前記工程（ｄ）で得られたDNA結合体反応液を用
いて大腸菌を形質転換させて形質転換体を得ること、 （ｆ）前記工程（ｅ）で得られた形質転換体からプラス
ミドphTPO−EALを回収すること、 （ｇ）前記工程（ｆ）で得られたプラスミドphTPO−EAL
を制限酵素EcoRIで切断し、抗原活性が保持されている
ヒト甲状腺パーオキシダーゼ領域部分をコードするDNA
配列を含有し、且つ実質的に膜結合領域をコードするDN
A配列を含有しない2.8kbのDNA断片を得ること、 （ｈ）別のプラスミドpSV2−dhfrを制限酵素HindIII及
びBglIIで開裂して、SV40プロモータ配列、ターミネー
タ配列及びE．coliにおける複製開始点配列を含む約4kb
のDNA断片を得ること、 （ｉ）前記工程（ｇ）で得られたDNA断片、及び前記工
程（ｈ）で得られたDNA断片を、DNAポリメラーゼＩの存
在下で、各々E．coliのクレノー断片と反応させて、各
々のDNAの断片にブラント末端を形成すること、 （ｊ）前記工程（ｉ）で得られたブラント末端が形成さ
れた２種類のDNA断片をT4 DNAリガーゼと反応させて反
応液を得ること、 （ｋ）前記工程（ｊ）で得られた反応液でE．coliを形
質転換して、アンピシリン耐性の形質転換体を得るこ
と、 （ｌ）前記工程（ｋ）で得られた形質転換体からプラス
ミドpSV2−hTPO−EALを回収すること、 （ｍ）別のプラスミドpSV2−dhfrを制限酵素PvuII及びB
glIIで開裂して、SV40プロモータ配列及びジヒドロ葉酸
レダクターゼをコードするDNA配列を含む約1.1kbのDNA
断片を得ること、 （ｎ）前記工程（ｌ）で得られたプラスミドpSV2−hTPO
−EALを制限酵素EcoRIで開裂させて、DNA断片を得るこ
と、 （ｏ）前記工程（ｍ）で得られたDNA断片、及び前記工
程（ｎ）で得られたDNA断片を、DNAポリメラーゼＩの存
在下で、各々E．coliのクレノー断片と反応させて、各
々のDNA断片にブラント末端を形成すること、 （ｐ）前記工程（ｏ）で得られた２種類のDNA断片をT4
DNAリガーゼと反応させて反応液を得ること、 （ｑ）前記工程（ｐ）で得られた反応液でE．coliを形
質転換して、アンピシリン耐性の形質転換体を得るこ
と、及び （ｒ）前記工程（ｑ）で得られた形質転換体から7.8kb
のプラスミドpSV2−hTPO−EAL−dhfrを回収すること。10. A method for preparing a plasmid comprising the following steps (a) to (r), which is suitable for the expression in CHO cells of a human thyroid peroxidase region, which is a secreted protein, which retains antigenic activity: a) Cleavage of the plasmid phTPO-1 with the restriction enzyme AccI to obtain a DNA sequence containing the sequence encoding the human thyroid peroxidase region where the antigen activity is retained and not containing the sequence encoding the membrane binding region. About 5.7kb including
(B) binding a synthetic linker to the DNA fragment obtained in the step (a) to obtain a linker-bonded DNA fragment; (c) linker obtained in the step (b) Cleaving the ligated DNA fragment with the restriction enzyme EcoRI to obtain a DNA fragment of about 2.8 kb containing a DNA sequence encoding a human thyroid peroxidase region and containing a sequence not containing a membrane-bound region; (d) Reacting the DNA fragment obtained in the step (c) with the plasmid pUC19 digested with the restriction enzyme EcoRI in the presence of T4 DNA ligase to obtain a DNA conjugate reaction solution; (d) transforming Escherichia coli using the DNA conjugate reaction solution obtained in (d) to obtain a transformant; (f) recovering the plasmid phTPO-EAL from the transformant obtained in the step (e). (G) the plus obtained in the step (f) Mid phTPO-EAL
Encoding the human thyroid peroxidase region that retains antigenic activity by digestion with EcoRI
A DN containing a sequence and substantially encoding a membrane-bound region
To obtain a DNA fragment of 2.8kb containing no A sequence was cleaved with restriction enzymes HindIII and BglII to another plasmid pSV2-dhfr (h), SV40 promoter sequence, terminator sequence and E. About 4 kb including the origin of replication sequence in E. coli
To obtain a DNA fragment, (i) DNA fragment obtained in the step (g), and the DNA fragment obtained in the step (h), in the presence of DNA polymerase I, each E. reacting with the Klenow fragment of E. coli to form blunt ends in each DNA fragment; (j) combining the two types of blunt-ended DNA fragments obtained in step (i) with T4 DNA ligase; to obtain a reaction mixture is reacted, E in the reaction liquid obtained in (k) the step (j). transforming E. coli to obtain an ampicillin-resistant transformant; (l) recovering plasmid pSV2-hTPO-EAL from the transformant obtained in step (k); pSV2-dhfr by restriction enzymes PvuII and B
Approximately 1.1 kb of DNA cleaved with glII and containing the SV40 promoter sequence and the DNA sequence encoding dihydrofolate reductase
(N) plasmid pSV2-hTPO obtained in step (l)
-Obtaining a DNA fragment by cleaving the EAL with a restriction enzyme EcoRI; (o) converting the DNA fragment obtained in the step (m) and the DNA fragment obtained in the step (n) into a DNA polymerase I; In the presence, each E. reacting with the Klenow fragment of Escherichia coli to form blunt ends in each DNA fragment; (p) converting the two types of DNA fragments obtained in step (o) to T4
Reacting with DNA ligase to obtain a reaction solution; (q) using the reaction solution obtained in the above step (p) in E. coli . transforming E. coli to obtain an ampicillin-resistant transformant; and (r) 7.8 kb from the transformant obtained in the step (q).
The plasmid pSV2-hTPO-EAL-dhfr. 【請求項１１】前記合成リンカーが次のDNA配列を有し
ている請求項10に記載のプラスミドの調製方法。 11. The method for preparing a plasmid according to claim 10, wherein said synthetic linker has the following DNA sequence. 【請求項１２】抗原活性が保持されているヒト甲状腺パ
ーオキシダーゼ領域部分をコードする配列を含有し、且
つ膜結合領域をコードする配列を実質的に含有しないDN
A配列の末端に、AccI切断サイトが形成されたDNA断片。12. A DN containing a sequence encoding a human thyroid peroxidase region where antigen activity is maintained, and substantially not containing a sequence encoding a membrane-bound region.
A DNA fragment having an AccI cleavage site formed at the end of the A sequence. 【請求項１３】抗原活性が保持されているヒト甲状腺パ
ーオキシダーゼ領域部分をコードするDNA配列を含有
し、且つ膜結合領域を実質的に含有しないDNA断片であ
って、該DNA断片のDNA配列の一方の末端にAccI切断サイ
トが形成され、該AccI切断サイトには合成リンカーが結
合されており、該合成リンカーの他端はEcoRIの認識サ
イトとなっており、該合成リンカーは終止コドンをコー
ドするDNA配列を含むことを特徴とするDNA断片。13. A DNA fragment containing a DNA sequence encoding a human thyroid peroxidase region that retains antigenic activity and substantially not containing a membrane-bound region, wherein the DNA sequence of the DNA fragment An AccI cleavage site is formed at one end, a synthetic linker is bound to the AccI cleavage site, the other end of the synthetic linker is an EcoRI recognition site, and the synthetic linker encodes a stop codon A DNA fragment comprising a DNA sequence. 【請求項１４】抗原活性が保持されているヒト甲状腺パ
ーオキシダーゼ領域部分をコードするDNA配列を含有
し、且つ膜結合領域をコードするDNA配列を含有しないD
NA断片であって、該DNA断片のDNA配列の一方の末端にAc
cI切断サイトが形成され、該AccI切断サイトには次の合
成リンカーが結合されていることを特徴とするDNA断
片。 14. A DNA sequence containing a DNA sequence encoding a human thyroid peroxidase region that retains antigenic activity and containing no DNA sequence encoding a membrane-bound region.
An NA fragment, wherein one end of the DNA sequence of the DNA fragment is Ac
A DNA fragment, wherein a cI cleavage site is formed, and the following synthetic linker is bonded to the AccI cleavage site.