JP2927927B2 - Methods for refolding secretory proteins - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、組換えDNA技術により分泌生産される異種
蛋白質の生産系における、目的とする正しい構造を有す
る蛋白質を得るためのリフォールディングによる製法に
関するものである。DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION [Industrial Application Field] The present invention relates to a production method by refolding to obtain a protein having a desired correct structure in a production system of a heterologous protein secreted and produced by recombinant DNA technology. It is about.

〔従来の技術〕[Conventional technology]

今日、組換えDNA技術により微生物を宿主として異種
遺伝子を発現させ、所望の異種遺伝子産物を生産するこ
とが可能となった。Today, recombinant DNA technology has made it possible to express a heterologous gene using a microorganism as a host to produce a desired heterologous gene product.

組換えによる蛋白質の生産法は、菌体内に蓄積させる
方法または培養液上清中に分泌させる方法の二つに大別
される。前者においては、異種遺伝子産物量の増加にと
もないそれらはインクルージョンボディと言われる封入
体の形で菌体内に蓄積する（参考文献１）。後者では、
菌体内で合成された蛋白質は菌体膜を通過し培養液中に
分泌され蓄積される。従って物質生産の観点からは、生
産された蛋白質の精製時における経済性から分泌系が有
利である。しかしながら両者とも、特に前者において、
蛋白合成時あるいは蛋白質合成後における目的蛋白の正
しい立体構造の構築がなされないことによる、蛋白質の
不活性化が大きな問題である（参考文献２）。この不活
性化の原因として最高も一般的で最大のものとして認め
られていることは、蛋白分子内でシステイン残基間にお
ける正しいＳ−Ｓ架橋（ジスルフィド結合）が形成され
ないために、アミノ酸配列は正常であるものの、立体構
造が望ましくない蛋白が生産されることである（参考文
献３）。Methods for producing proteins by recombination can be broadly classified into two methods: a method of accumulating them in cells and a method of secreting them into the culture supernatant. In the former, as the amount of heterologous gene products increases, they accumulate in the cells in the form of inclusion bodies called inclusion bodies (Reference Document 1). In the latter,
The protein synthesized in the cells passes through the cell membrane and is secreted and accumulated in the culture solution. Therefore, from the viewpoint of substance production, the secretion system is advantageous from the economical point of purification of the produced protein. However, both, especially in the former,
A major problem is inactivation of a protein due to failure to construct a correct three-dimensional structure of a target protein during or after protein synthesis (Ref. 2). The most common and most recognized cause of this inactivation is that the correct amino acid sequence is not formed because the correct SS bridge (disulfide bond) between cysteine residues is not formed in the protein molecule. A protein that is normal but has an undesired three-dimensional structure is produced (Ref. 3).

従来、このような不活性蛋白は精製時に不純物として
廃棄されるか、、もしくは煩雑で効率の悪い方法による
Ｓ−Ｓ結合の再構成処理、いわゆるリフォールディング
によって活性型に変換されていた。Heretofore, such an inactive protein has been discarded as an impurity during purification, or has been converted to an active form by reconstitution of an S—S bond by a complicated and inefficient method, so-called refolding.

これまで行われていたリフォールディング方法を簡単
に述べると、まず不活性化した目的蛋白を精製もしくは
部分精製する。この操作は、異種遺伝子産物の菌体内生
産系では菌体の破砕処理ならびにインクルージョンボデ
ィーの可溶化を必要とするため、分泌生産系に比べてよ
り煩雑である。次に、変性剤および還元剤により蛋白質
分子内の誤ったＳ−Ｓ結合の開裂を行い、還元剤、酸化
剤および変成剤を組合せて添加し最適条件下にて正常な
蛋白質の生成に向けてＳ−Ｓ結合の再構成を行う。さら
に変性剤、還元剤および酸化剤を除去するためのカラム
クロマト等の処理がなされる（参考文献４）。Briefly, a refolding method that has been performed so far is as follows. First, an inactivated target protein is purified or partially purified. This operation is more complicated than the secretory production system, because the intracellular production system for the heterologous gene product requires disruption of the cells and solubilization of the inclusion body. Next, a denaturing agent and a reducing agent are used to cleave the erroneous S—S bond in the protein molecule, and a reducing agent, an oxidizing agent, and a denaturing agent are added in combination to produce a normal protein under optimal conditions. The SS connection is reconstructed. Further, a treatment such as column chromatography for removing a denaturing agent, a reducing agent, and an oxidizing agent is performed (Reference Document 4).

具体例を述べると、Anfinsenによる精製されたウシの
リボヌクレアーゼを用いたリフォールディング実験に代
表されるように、間違ったＳ−Ｓ結合をもつ精製した蛋
白質溶液にチオール化合物を添加することにより、正し
い製造を有する蛋白質が得られる。すなわちこれは、蛋
白質のＳ−Ｓ結合がチオール化合物により還元され、次
に空気酸化によりＳ−Ｓ結合の再構成が行われ、自由エ
ネルギー減少の法則に従って間違った構造が正しい安定
な構造にもどったと考えられる（参考文献６）。しかし
ながら、リフォールディングに要する時間が非常に長く
かかること、また精製蛋白質に対して処理を行うため処
理後に再度精製のための操作が必要であること等の理由
により、遺伝子組換えによる蛋白質の実際的な生産への
応用は難しいものであった。To give a specific example, as shown in the refolding experiment using purified bovine ribonuclease by Anfinsen, correct production was achieved by adding a thiol compound to a purified protein solution having an incorrect SS bond. Is obtained. That is, this means that the S—S bond of the protein is reduced by the thiol compound, then the S—S bond is reconstituted by air oxidation, and the wrong structure returns to the correct stable structure according to the law of decreasing free energy. Possible (Ref. 6). However, due to the fact that the time required for refolding is very long, and that the purified protein must be treated again after the treatment, purification of the protein by genetic recombination is not practical. It was difficult to apply it to production.

このように、従来の蛋白質のリフォールディングには
数段階にわたる煩雑な操作が必要とされ、そのために操
作途中における蛋白質の損失も多く、またリフォールデ
ィングの効率も条件により変動し、目的とする活性型蛋
白の収率はさほど高いとはいえない状況であった（参考
文献５）。As described above, conventional protein refolding requires several steps of complicated operations, which results in a large loss of protein during the operation, and the efficiency of refolding varies depending on conditions. The protein yield was not so high (Ref. 5).

〔発明が解決しようとする課題〕[Problems to be solved by the invention]

本発明は組換えDNA技術により分泌生産される異種蛋
白質における、目的とする正しい構造を有する蛋白質を
得るための極めて簡単なリフォールディング法を提供す
ることを目的とする。An object of the present invention is to provide a very simple refolding method for obtaining a protein having a desired correct structure in a heterologous protein secreted and produced by recombinant DNA technology.

〔課題を解決するための手段〕[Means for solving the problem]

以上のような点に鑑み本発明者らは検討を重ねた結
果、驚くべきことに異種蛋白質の分泌生産系においては
分泌されたタンパク質の精製もしくは部分精製をするこ
となしに、培養液もしくは培養液上清中のタンパク質を
直接還元、酸化することにより再架橋させ得ることを見
出し本発明に到達した。In view of the above, the present inventors have made repeated studies and, surprisingly, in a secretory production system for a heterologous protein, without purifying or partially purifying a secreted protein, a culture solution or a culture solution. The present inventors have found that the protein in the supernatant can be recrosslinked by directly reducing and oxidizing the protein, and arrived at the present invention.

すなわち、本発明は組換えDNA技術により分泌生産さ
れた異種蛋白質のＳ−Ｓ結合の誤った架橋を正しいＳ−
Ｓ結合に再架橋させる蛋白質のリフォールディング法に
おいて、該蛋白質を含む培養液もしくは培養液上清中
に、還元剤を添加し、誤った架橋を開裂させ、しかる後
に酸化させる一連の処理により正しいＳ−Ｓ結合に再架
橋させることを特徴とするリフォールディング法であ
る。That is, the present invention corrects the incorrect cross-linking of the SS bond of a heterologous protein secreted and produced by recombinant DNA technology.
In a protein refolding method for re-crosslinking to S bond, a reducing agent is added to a culture solution or a supernatant of a culture solution containing the protein to cleave erroneous cross-links, followed by a series of treatments to oxidize the protein. This is a refolding method characterized by re-crosslinking into -S bonds.

以下本発明を詳細に説明する。 Hereinafter, the present invention will be described in detail.

本発明の対象とする蛋白質は組換えDNA技術により分
泌生産された異種蛋白質である。このような蛋白質とし
ては、例えば、ヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、
インターフェロン、ヒルジン等がある。これらの中でも
ヒルジンのような比較的低分子量の蛋白質が好ましい。The protein of the present invention is a heterologous protein secreted and produced by recombinant DNA technology. Such proteins include, for example, human growth hormone, bovine growth hormone,
Interferon, hirudin and the like. Among them, proteins having a relatively low molecular weight such as hirudin are preferable.

本発明の使用する還元剤としては、たとえばメルカプ
トエタノール、ジチオスライトール、グルタチオン、シ
ステイン、チオグリコール酸、メルカプトエタノールア
ミン、ジチオエリスリトールが挙げられる。還元剤の使
用量はとくに制限はないが、通常１〜100mMである。還
元の条件も特に制限はないが、10〜50℃好ましくは20〜
40℃で数分ら１時間である。Examples of the reducing agent used in the present invention include mercaptoethanol, dithiothreitol, glutathione, cysteine, thioglycolic acid, mercaptoethanolamine, and dithioerythritol. The use amount of the reducing agent is not particularly limited, but is usually 1 to 100 mM. The conditions for the reduction are not particularly limited, but are preferably 10 to 50 ° C, preferably 20 to 50 ° C.
At 40 ° C for several minutes to one hour.

還元剤の添加は培養上清を回収し、その回収した上清
へ添加してもよい。また、通気を停止した状態の培養中
の培養液へ直接行っても差し支えない。本発明における
酸化は、酸化型グルタチオン等の酸化剤を使用してもよ
いが、好ましくは培養上清または培養液に通気すること
により行われる。通気の条件は特に制限はないが、通常
は溶存酸素濃度が10％以上の条件にて10〜50℃好ましく
は20〜40℃で数分から１時間である。組換えDNA技術に
よる物質生産では、DNA配列に従って新しく合成された
ポリペプチド鎖が、正確に折りたたまれて天然型と同じ
機能を持つ三次構造をとることが必要である。そして、
ポリペプチド鎖が折りたたまれて三次構造を形づくるに
あたってアミノ酸配列によって規定される情報は蛋白質
内でのアミノ酸どうしの相互作用によって最終的に熱力
学的に安定な構造をとるための情報である。天然の蛋白
質内で熱力学的に安定な構造をとるためには、ファンデ
ルワールス力、ねじれ力、静電力、水素結合、疎水性結
合、そしてジスルフィド結合が関与し、これらのエネル
ギーの総和が最小になるようにα−ヘリックス、β−シ
ート、ターンなどの二次構造が三次元的に折りたたま
れ、最も安定な構造をもつ。そのためには分子内あるい
は分子間相互作用のうち唯一共有結合であるジスルフィ
ド結合すなわちＳ−Ｓ結合が重要であることは明らかで
ある。For the addition of the reducing agent, the culture supernatant may be collected and added to the collected supernatant. Further, it may be performed directly on the culture solution during the culture in a state where the aeration is stopped. Oxidation in the present invention may use an oxidizing agent such as oxidized glutathione, but is preferably performed by aerating the culture supernatant or culture solution. The condition of the ventilation is not particularly limited, but is usually 10 to 50 ° C., preferably 20 to 40 ° C. for several minutes to 1 hour under the condition that the dissolved oxygen concentration is 10% or more. Substance production by recombinant DNA technology requires that the newly synthesized polypeptide chain according to the DNA sequence be correctly folded and assume a tertiary structure having the same function as the natural form. And
When the polypeptide chain is folded to form a tertiary structure, the information defined by the amino acid sequence is information for finally obtaining a thermodynamically stable structure due to the interaction between amino acids in the protein. A thermodynamically stable structure in natural proteins involves van der Waals forces, torsional forces, electrostatic forces, hydrogen bonds, hydrophobic bonds, and disulfide bonds, and the sum of these energies is minimal. The secondary structure such as α-helix, β-sheet, turn, etc. is folded three-dimensionally to have the most stable structure. For this purpose, it is clear that a disulfide bond, which is the only covalent bond among intramolecular or intermolecular interactions, that is, an SS bond is important.

遺伝子組換え操作による微生物に異種遺伝子由来の蛋
白質を生産させる場合、分泌生産系を利用することは、
目的産物の精製過程における処理操作および経済性から
有利であることは明らかである。しかしながら分泌生産
系を用いた異種蛋白の生産過程で発明者らは、高通気条
件下で菌体の蛋白質の合成および分泌量が増加すると、
アミノ酸配列やアミノ酸組成が活性を有する天然蛋白と
同様であるにもかかわらず活性を持たず、またHPLC分析
において活性型と異なる分離溶出のパターンを示す蛋白
質が多量に培養液中に蓄積することを発見した。さらに
本発明者らは、この活性を持たない蛋白質を分取し、チ
オール化合物を添加した後空気酸化を行い得られる蛋白
質について活性およびHPLC溶出パターンを調べた。その
結果、このものの活性回復が認められ、HPLC分離溶出パ
ターンも天然の活性型蛋白と同様となることを見いだし
た。これらの発見は、異種遺伝子産物の分泌生産時に、
正しい立体構造を有する蛋白質と同時に、一次構造は正
しいがＳ−Ｓ結合のかけ違いにより活性を持たない蛋白
質が生じ、さらにこれらの不活性型蛋白はチオール化合
物の添加および再酸化により容易に活性型へリフォール
ディングされることを示すものである。When producing a protein derived from a heterologous gene in a microorganism by genetic recombination, utilizing a secretory production system
It is clear that the processing operation and the economical efficiency in the purification process of the target product are advantageous. However, during the process of producing a heterologous protein using a secretory production system, the inventors found that when the amount of protein synthesis and secretion of bacterial cells increased under high aeration conditions,
Although the amino acid sequence and amino acid composition are similar to those of the active natural protein, it has no activity, and a large amount of protein showing a separation and elution pattern different from the active form in HPLC analysis is accumulated in the culture solution. discovered. Furthermore, the present inventors fractionated the protein having no activity, added a thiol compound, and then air-oxidized the protein, and examined the activity and HPLC elution pattern of the resulting protein. As a result, the activity of this product was recovered, and it was found that the HPLC separation and elution pattern was similar to that of the natural active protein. These findings suggest that during the secretory production of heterologous gene products,
At the same time as the protein having the correct tertiary structure, a protein having the correct primary structure but having no activity due to an incorrect SS bond is generated, and these inactive proteins can be easily activated by addition of a thiol compound and reoxidation. This indicates that refolding is performed.

そこで本発明者らは、チオール化合物による蛋白質の
リフォールディング作用を、分泌生産系において生じる
Ｓ−Ｓ結合のかけ違いによる不活性型となった蛋白質の
リフォールディングに応用すべく、異種遺伝子産物の分
泌生産菌の培養中の培養液、あるいは培養上清中に直接
チオール化合物を添加するというこれまでにない蛋白質
のリフォールディング法の検討を行った。In order to apply the refolding action of a protein by a thiol compound to the refolding of an inactive protein due to an incorrect S—S bond occurring in a secretory production system, the present inventors have proposed the secretion of a heterologous gene product. An unprecedented protein refolding method in which a thiol compound was added directly to a culture solution or a culture supernatant during cultivation of a production bacterium was examined.

その結果、培養液あるいは培養上清への通気を実質上
停止し、チオール化合物が直ちに空気酸化を受けないよ
うな条件下にてチオール化合物を直接溶媒液あるいは培
養上清に添加し、蛋白質の誤ったＳ−Ｓ結合の開裂のた
めしばらくの間撹拌した後、通気を再開し空気酸化によ
りリフォールディングを行う一連の操作により、Ｓ−Ｓ
結合の再構成が行われ目的とする正しい立体構造を有す
る蛋白質を大量に得ることに成功した。本発明における
リフォールディング法は、従来行われていたリフォール
ディング法に比べ格段に簡単かつ効果的であり、そのた
め経済的でもある。As a result, aeration of the culture solution or the culture supernatant is substantially stopped, and the thiol compound is directly added to the solvent solution or the culture supernatant under conditions such that the thiol compound is not immediately subjected to air oxidation. After stirring for a while for the cleavage of the S—S bond, the aeration is resumed, and a series of operations for refolding by air oxidation,
By reconstituting the bonds, we succeeded in obtaining a large amount of the protein having the desired correct tertiary structure. The refolding method of the present invention is much simpler and more effective than the conventional refolding method, and is therefore economical.

また、分泌生産された蛋白質を対象としているため分
泌生産のための宿主菌株は、一般に利用されている大腸
菌、枯草菌、酵母を問わない。Further, since the secretory production of the protein is targeted, the host strain for secretory production is not limited to commonly used Escherichia coli, Bacillus subtilis, and yeast.

本発明者らは、すでにトロンビンの阻害剤であるヒル
ジン分泌プラスミドを構築し、このプラスミドにより形
質転換された枯草菌菌株を造成している（FERM P−1002
8）。本菌株にて分泌生産されるヒルジンは、分子内に
３組のＳ−Ｓ結合を有するものであるが、高通気条件下
の高率発現、分泌においては誤った架橋による不活性型
のヒルジンが分泌蓄積することが認められた。しかしこ
のような培養条件下においても、本発明のリフォールデ
ィング法を適用することにより目的とする活性型ヒルジ
ンの生産量を飛躍的に増大させることに成功した。また
増大した量は、本発明の処理以前に存在する不活性型の
ものと同量であり、本発明の再架橋法が定量的に行われ
ることが見いだされた。このことは本発明の再架橋法に
より不活性型のものが、ほぼ100％の転換率で活性型に
変換されることを示すものである。The present inventors have already constructed a hirudin secretion plasmid which is an inhibitor of thrombin, and constructed a Bacillus subtilis strain transformed with this plasmid (FERM P-1002).
8). The hirudin secreted and produced by this strain has three sets of S—S bonds in the molecule. Secretory accumulation was observed. However, even under such culture conditions, by applying the refolding method of the present invention, it was possible to drastically increase the production of the target active hirudin. The increased amount was the same as that of the inactive type existing before the treatment of the present invention, and it was found that the recrosslinking method of the present invention was quantitatively performed. This indicates that the inactive form is converted to the active form with almost 100% conversion by the recrosslinking method of the present invention.

〔実施例〕〔Example〕

以下本発明を具体例で説明するが、本発明はこの例に
より何ら限定されるものではない。Hereinafter, the present invention will be described with reference to specific examples, but the present invention is not limited to these examples.

実施例１ （培養上清への還元剤添加によりリフォールディング） ヒルジン分泌枯草菌株（FERM P−10028）を、２倍濃
度のLB培地（0.2％グルコース）を用い30℃で一夜振盪
培養し、OD660が５〜６の培養液を得る。この培養液か
ら高速遠心分離により菌体を除き、培養上清を回収す
る。本培養上清を均等に分注し、各々にメルカプトエタ
ノールを終濃度にして０〜50mMになるように直接添加
し、軽く撹拌した後室温にて10分間静置した。次に30℃
にて30分間撹拌し、空気酸化を行う。一連の処理を行っ
た後、トロンビン阻害活性としてヒルジン量を定量した
（参考文献７）。結果を第１表に示す。なお、コントロ
ールには無処理の培養上清を用いた。また、第１表に示
されたメルカプトエタノールの効果は、ジチオスライト
ール、グルタチオン等のチオール化合物にて濃度により
効果の差があるものの、まったく代替えすることが可能
であった。Example 1 (Refolding by Addition of Reducing Agent to Culture Supernatant) Hirudin-secreting Bacillus subtilis strain (FERM P-10028) was cultured with shaking at 30 ° C. overnight in a double concentration LB medium (0.2% glucose), and OD660 was measured. Is obtained. The cells are removed from the culture by high-speed centrifugation, and the culture supernatant is recovered. The main culture supernatant was evenly dispensed, and mercaptoethanol was directly added to each to a final concentration of 0 to 50 mM. After light stirring, the mixture was allowed to stand at room temperature for 10 minutes. Then 30 ℃
Stir for 30 minutes at, and perform air oxidation. After a series of treatments, the amount of hirudin was determined as the thrombin inhibitory activity (Reference 7). The results are shown in Table 1. The untreated culture supernatant was used as a control. In addition, the effects of mercaptoethanol shown in Table 1 could be completely replaced with thiol compounds such as dithiothreitol and glutathione, although the effects differed depending on the concentration.

実施例２ （培養液中への還元剤の直接添加によるリフォールディ
ング） 溶存酸素センサーを装備した30容ジャーファーメン
ター（丸菱バイオエンジ（株）社勢MSJ−U3W型）2LB培
地（0.4％グルコース）を20仕込み、前培養したヒル
ジン分泌枯草菌株（EFRM P−10028）を植菌し、空気量
４/min、回転数250rpmにて30℃で培養を行う。17〜18
時間培養後OD660が７〜８の時点で、通気を停止する。
しばらく後溶存酸素濃度が０になったところで直ちに終
濃度1.5mMまでメルカプトエタノールをジャー中に直接
添加する。５分間撹拌を行った後通気を再開し、培養を
継続する。さらに培養開始後22時間において同様の操作
を行った。第２表に各々の時間における、メルカプトエ
タノール添加直前と添加後のトロンビン阻害活性により
測定した培養上清中のヒルジン量を測定した結果を示し
た。 Example 2 (Refolding by Direct Addition of Reducing Agent to Culture Solution) 30-volume jar fermenter (MSJ-U3W type, manufactured by Marubishi Bio-Engineering Co., Ltd.) equipped with a dissolved oxygen sensor 2LB medium (0.4% glucose) ), And inoculated with a precultured hirudin-secreting Bacillus subtilis strain (EFRM P-10028), followed by culturing at 30 ° C. at an air flow rate of 4 / min and a rotation speed of 250 rpm. 17-18
The aeration is stopped when the OD660 is 7 to 8 after culturing for a time.
After a while, when the dissolved oxygen concentration becomes 0, immediately add mercaptoethanol directly to the jar to a final concentration of 1.5 mM. After stirring for 5 minutes, aeration is resumed and the culture is continued. Further, the same operation was performed 22 hours after the start of the culture. Table 2 shows the results of measuring the amount of hirudin in the culture supernatant measured at each time by the thrombin inhibitory activity immediately before and after the addition of mercaptoethanol.

実施例３ （リフォールディング処理を行った培養液のHPLC検定） 実施例２で得られるメルカプトエタノール処理を行う
直前および処理直後の培養上清をそれぞれ塩酸を加える
ことによりpHを３に合わせ、生じる沈殿物を高速遠心分
離により除いた後、50mM酢酸アンモニウム−ギ酸緩衝液
（pH3.0）により平衡化したイオン交換樹脂SP−TRISACR
YL M（IBF社製）カラムに添加する。次に同緩衝液にて
カラムを洗浄した後、50mM酢酸アンモニウム−蟻酸緩衝
液（pH4.2）により溶出されるヒルジン活性画分を集め
部分精製を行う。このようにして得られたヒルジン画分
をHPLCに供試しその溶出パターンを調べた。用いたカラ
ムは、μBondasphere C−８（Waters社製）で、0.1％ト
リフルオロ酢酸と100％アセトニトリルの二液グラジエ
ント系により溶出を行った。メルカプトエタノール処理
を行う直前および処理直後の培養液中に含まれるヒルジ
ンの溶出パターンの比較を第１図に示す。ここで、双方
における29分のリテンションタイムのピークが活性型ヒ
ルジンのピークである。処理前に認められる40〜50分の
ピークは、それらを分取しアミノ酸組成分析およびＮ末
端アミノ酸配列の解析を行ったところ完全に活性型のヒ
ルジンと一致することからＳ−Ｓ結合のかけ違いにより
生じたヒルジンの不活性型分子種であることが判明し
た。さらにこれらの処理直前に見られた40〜50分のリテ
ンションタイムのピークは、処理後には完全に消失して
いることが認められた。さらに、処理後におけるヒルジ
ンの活性の増加分は、消失したピークの量と一致するも
のであった。 Example 3 (HPLC assay of culture solution subjected to refolding treatment) Immediately before and immediately after the treatment with mercaptoethanol obtained in Example 2, the pH of the culture supernatant was adjusted to 3 by adding hydrochloric acid, and the resulting precipitate was formed. After removing the substance by high-speed centrifugation, ion-exchange resin SP-TRISACR equilibrated with 50 mM ammonium acetate-formate buffer (pH 3.0)
Add to YL M (IBF) column. Next, after washing the column with the same buffer, a hirudin-active fraction eluted with a 50 mM ammonium acetate-formate buffer (pH 4.2) is collected and partially purified. The hirudin fraction thus obtained was subjected to HPLC and its elution pattern was examined. The column used was μBondasphere C-8 (manufactured by Waters) and eluted with a two-part gradient system of 0.1% trifluoroacetic acid and 100% acetonitrile. FIG. 1 shows a comparison of the elution patterns of hirudin contained in the culture solution immediately before and immediately after the mercaptoethanol treatment. Here, the peak of the retention time of 29 minutes in both cases is the peak of active hirudin. The peaks of 40 to 50 minutes observed before the treatment were separated and analyzed for amino acid composition and N-terminal amino acid sequence. The peaks completely matched the active form of hirudin. Was found to be an inactive molecular species of hirudin. Furthermore, it was recognized that the peak of the retention time of 40 to 50 minutes observed immediately before these treatments completely disappeared after the treatment. Furthermore, the increase in the activity of hirudin after the treatment was consistent with the amount of the disappeared peak.

（参考文献一覧） 1.Mitraki,A Et al.（1989）Bio/Technology.,7,690 2.Tsuji,T.et al.（1987）Biochem.,2,3129 3.安藤鋭郎ら（1973）タンパク質化学3 433 共立出版 4.池原森男ら（1988）タンパク質工学実験マニュアル
83 講談社サイエンティフィク 5.特開昭62−501262 6.Anfinsen,C.B（1964）in‘New Perspectives in Biol
ogy'Sela,M.,ed.,42,American Elsevier 7.Ogasawara,N.（1985）Gene,40,145(List of references) 1. Mitraki, A Et al. (1989) Bio / Technology., 7,690 2. Tsuji, T. et al. (1987) Biochem., 2, 3129 3. T. Ando et al. (1973) Protein Chemistry 3 433 Kyoritsu Publishing 4. Morio Ikehara et al. (1988) Manual for Protein Engineering Experiments
83 Kodansha Scientific 5. JP-A-62-501262 6. Anfinsen, CB (1964) in'New Perspectives in Biol
ogy'Sela, M., ed., 42, American Elsevier 7. Ogasawara, N. (1985) Gene, 40, 145

【図面の簡単な説明】[Brief description of the drawings]

第１図は、培養液中へのメルカプトエタノールの直接添
加によるリフォールディング処理を行った場合の、処理
直前と処理直後の培養上清のイオン交換カラムクロマト
グラフィーによる一段精製試料のHPLCの溶出パターンを
示したものである。図中の数字は、各ピークのリテンシ
ョンタイムを表わしている。記号Ａで示した不活性なピ
ークは、リフォールディング処理後には消失しており記
号Ｂで示される活性型のピークに変換されている。Fig. 1 shows the HPLC elution pattern of a one-step purified sample by ion exchange column chromatography of the culture supernatant immediately before and immediately after the refolding treatment by direct addition of mercaptoethanol to the culture solution. It is shown. The numbers in the figure represent the retention time of each peak. The inactive peak indicated by the symbol A disappeared after the refolding treatment and was converted into the active peak indicated by the symbol B.

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12P 21/00 - 21/06 C12N 15/00 - 15/90 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)────────────────────────────────────────────────── ─── Continued on the front page (58) Field surveyed (Int. Cl. ⁶ , DB name) C12P 21/00-21/06 C12N 15/00-15/90 BIOSIS (DIALOG) WPI (DIALOG)

Claims (5)

(57)【特許請求の範囲】(57) [Claims] 【請求項１】組換えDNA技術により分泌生産された異種
蛋白質のＳ−Ｓ結合の誤った架橋を、該蛋白質を含む培
養液もしくは培養液上清中に、還元剤を添加し、誤った
架橋を開裂させしかる後に酸化させる一連の処理により
正しいＳ−Ｓ結合に再架橋させる蛋白質のリフォールデ
ィング法。1. An erroneous crosslinking of the S--S bond of a heterologous protein secreted and produced by recombinant DNA technology is performed by adding a reducing agent to a culture solution or a culture supernatant containing the protein, and A method for refolding a protein in which a protein is cleaved and then oxidized to re-crosslink to a correct SS bond by a series of treatments. 【請求項２】還元剤がメルカプトエタノール、ジチオス
ライトール、グルタチオン、システイン、チオグリコー
ル酸、メルカプトエタノールアミン、ジチオエリスリト
ールより任意に選ばれた一つもしくは任意に選んだ組合
せで用いられることを特徴とする特許請求の範囲第１項
に記載する蛋白質のリフォールディング法。2. The method according to claim 1, wherein the reducing agent is one selected from mercaptoethanol, dithiothreitol, glutathione, cysteine, thioglycolic acid, mercaptoethanolamine, and dithioerythritol, or a combination thereof. The method for refolding a protein according to claim 1, wherein 【請求項３】還元剤の添加が、通気を停止した状態の培
養中の培養液へ直接行われることを特徴とする特許請求
の範囲第１項または第２項に記載の蛋白質のリフォール
ディング法。3. The method for refolding a protein according to claim 1, wherein the addition of the reducing agent is performed directly to the culture solution during the culture in a state in which aeration is stopped. . 【請求項４】還元剤により開裂されたＳ−Ｓ結合の酸化
および還元剤の酸化が、培養槽への通気により行われる
ことを特徴とする特許請求の範囲第１項ないし第３項の
いずれか１項に記載の蛋白質のリフォールディング法。4. The method according to claim 1, wherein the oxidation of the SS bond cleaved by the reducing agent and the oxidation of the reducing agent are carried out by ventilating the culture tank. 2. The method for refolding a protein according to claim 1. 【請求項５】分泌生産された異種蛋白質が、トロンビン
の阻害剤であるヒルジンであることを特徴とする特許請
求の範囲第１項ないし第４項のいずれか１項に記載の蛋
白質のリフォールディング法。5. The protein according to any one of claims 1 to 4, wherein the secreted and produced heterologous protein is hirudin, which is a thrombin inhibitor. Law.