JP2915970B2 - 蛋白質分析物の酸化的変性 - Google Patents
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Description
【発明の詳細な説明】 本発明は、免疫検定法で実施されているような蛋白質
を抗体試薬と結合させるための方法に関するものであ
る。より特に、本発明はジスルフィド−架橋結合されて
いる蛋白質を変性させて蛋白質と結合するためにそれに
向けられている抗体の能力を強化させる方法に関するも
のである。
を抗体試薬と結合させるための方法に関するものであ
る。より特に、本発明はジスルフィド−架橋結合されて
いる蛋白質を変性させて蛋白質と結合するためにそれに
向けられている抗体の能力を強化させる方法に関するも
のである。
本発明を要約すれば、蛋白質をジスルフィド結合を分
裂させるのに充分な酸化電位（本明細書において、「酸
化能力」という場合あり）を有する例えば過ヨウ素酸塩
の如き酸化剤で処理することによりジスルフィド−架橋
結合されている蛋白質の抗原性を与えるかまたは増加さ
せる方法である。過剰の酸化剤を次に還元剤の添加によ
り不活性化させる。生成した蛋白質は、蛋白質中の線状
ペプチドエピトープに向けられた選択抗体、特に単分枝
系抗体、によるそれの結合能力において増加を示す。
裂させるのに充分な酸化電位（本明細書において、「酸
化能力」という場合あり）を有する例えば過ヨウ素酸塩
の如き酸化剤で処理することによりジスルフィド−架橋
結合されている蛋白質の抗原性を与えるかまたは増加さ
せる方法である。過剰の酸化剤を次に還元剤の添加によ
り不活性化させる。生成した蛋白質は、蛋白質中の線状
ペプチドエピトープに向けられた選択抗体、特に単分枝
系抗体、によるそれの結合能力において増加を示す。
免疫検定法は、抗体試薬による分析対象物質（分析
物）の結合に基ずく該物質の検出または測定方法であ
る。最近の技術では、広範囲の分析物に対する抗体の開
発が可能になっている。免疫検定法は、臨床的に重要性
のある分析物がしばしば多数の構造的に同様な背景物質
の存在下で低濃度で存在しているような診断薬において
特に有用である。
物）の結合に基ずく該物質の検出または測定方法であ
る。最近の技術では、広範囲の分析物に対する抗体の開
発が可能になっている。免疫検定法は、臨床的に重要性
のある分析物がしばしば多数の構造的に同様な背景物質
の存在下で低濃度で存在しているような診断薬において
特に有用である。
蛋白質を抗体接触させる前に変性条件にかけることに
より、ある種の環境下では蛋白質の抗原性、すなわち蛋
白質に対して向けられている抗体により結合される蛋白
質の能力、が臨界的に必要であったりまたは増加させら
れるということを今見いだした。ある種の環境下では、
蛋白質上のエピトープは蛋白質の天然の三次元に折りた
たまれた構造中では立体的に障害を受けているか、内包
されているか、または埋め込まれていることがあり得
る。変性によりエピトープ上の立体的拘束が解かれ、そ
れにより抗体結合を利用できるようになりまたはより多
く利用できるようになる。従って、変性は利用可能な抗
体試薬が天然形の蛋白質と結合しないかまたは結合が検
出しようとする蛋白質の濃度に対して弱すぎるような免
疫検定法の開発において意義があり得るものである。
より、ある種の環境下では蛋白質の抗原性、すなわち蛋
白質に対して向けられている抗体により結合される蛋白
質の能力、が臨界的に必要であったりまたは増加させら
れるということを今見いだした。ある種の環境下では、
蛋白質上のエピトープは蛋白質の天然の三次元に折りた
たまれた構造中では立体的に障害を受けているか、内包
されているか、または埋め込まれていることがあり得
る。変性によりエピトープ上の立体的拘束が解かれ、そ
れにより抗体結合を利用できるようになりまたはより多
く利用できるようになる。従って、変性は利用可能な抗
体試薬が天然形の蛋白質と結合しないかまたは結合が検
出しようとする蛋白質の濃度に対して弱すぎるような免
疫検定法の開発において意義があり得るものである。
例えば、米国特許番号4,658,022は蛋白質の変性によ
り蛋白質中の線状ペプチドエピトープに向けられている
抗体の結合が得られたりまたは強化できることを記載し
ている。これは特に試験試料中に存在している他の蛋白
質に関してそれを同定するエピドープが天然形の蛋白質
中で立体的に障害を受けている蛋白質の場合に適用され
る。一例は、ヘモグロビンAlcとして知られているグリ
ケート（glycated）形のヘモグロビンである。該特許
は、抗原性を与えるかまたは強化させる目的の種々の蛋
白質変性手段、例えば加熱、音波処理、高もしくは低pH
における処理、並びに例えばグアニジン、尿素および洗
剤の如き化学的変性剤およびチャオトロピー剤（chanto
ropic agents）を用いる処理、を記している。ジスルフ
ィド結合を減少させる例えばメルカプトエタノールまた
はジチオトレイトールの如き試薬の含有が変性工程の有
効な促進剤であることも報告されている。
り蛋白質中の線状ペプチドエピトープに向けられている
抗体の結合が得られたりまたは強化できることを記載し
ている。これは特に試験試料中に存在している他の蛋白
質に関してそれを同定するエピドープが天然形の蛋白質
中で立体的に障害を受けている蛋白質の場合に適用され
る。一例は、ヘモグロビンAlcとして知られているグリ
ケート（glycated）形のヘモグロビンである。該特許
は、抗原性を与えるかまたは強化させる目的の種々の蛋
白質変性手段、例えば加熱、音波処理、高もしくは低pH
における処理、並びに例えばグアニジン、尿素および洗
剤の如き化学的変性剤およびチャオトロピー剤（chanto
ropic agents）を用いる処理、を記している。ジスルフ
ィド結合を減少させる例えばメルカプトエタノールまた
はジチオトレイトールの如き試薬の含有が変性工程の有
効な促進剤であることも報告されている。
多くの蛋白質の構造が隣接ペプチド鎖間にジスルフィ
ド結合を含有していることは知られている。そのような
結合は、該蛋白質の天然三次元構造の規定において重要
である。蛋白質構造の研究にはしばしばジスルフィド結
合の***が含まれている。蛋白質の完全な変性にはその
ような***が必要であり、そしてそれは一般的には還元
剤（例えばメルカプトエタノールまたはジチオトレイト
ール）に対する露呈およびその後の被覆剤（例えばアイ
オド酢酸またはアイオドアセトアミド）の添加により行
われる。
ド結合を含有していることは知られている。そのような
結合は、該蛋白質の天然三次元構造の規定において重要
である。蛋白質構造の研究にはしばしばジスルフィド結
合の***が含まれている。蛋白質の完全な変性にはその
ような***が必要であり、そしてそれは一般的には還元
剤（例えばメルカプトエタノールまたはジチオトレイト
ール）に対する露呈およびその後の被覆剤（例えばアイ
オド酢酸またはアイオドアセトアミド）の添加により行
われる。
ジスルフィド架橋結合されている蛋白質の抗原性はジ
スルフィド結合の***により与えられるかまたは増加さ
せられること並びにそのような***は蛋白質を適当な酸
化能力を有する酸化剤で処理しそしてその後に残存して
いる酸化剤を適当な還元剤の添加により不活性化させる
ことにより行えることを今見いだした。この酸化的変性
がジスルフィド架橋結合されている蛋白質中のエピトー
プ、特に線状ペプチドエピトープ、を露呈させしかもそ
の露呈を増加させるということが見いだされた。酸化的
方法は、両者とも抗体結合に対して有害である高濃度の
チャオトロピー剤の使用またはスルフヒドリル被覆試薬
の使用を必要としない。酸化剤およびその後の還元剤を
用いる処理により、蛋白質中の露呈されたエピトープと
結合する抗体と相溶性である変性された蛋白質混合物を
生成する。さらに、この変性は急速でありしかも変性試
薬は一般的に安価である。
スルフィド結合の***により与えられるかまたは増加さ
せられること並びにそのような***は蛋白質を適当な酸
化能力を有する酸化剤で処理しそしてその後に残存して
いる酸化剤を適当な還元剤の添加により不活性化させる
ことにより行えることを今見いだした。この酸化的変性
がジスルフィド架橋結合されている蛋白質中のエピトー
プ、特に線状ペプチドエピトープ、を露呈させしかもそ
の露呈を増加させるということが見いだされた。酸化的
方法は、両者とも抗体結合に対して有害である高濃度の
チャオトロピー剤の使用またはスルフヒドリル被覆試薬
の使用を必要としない。酸化剤およびその後の還元剤を
用いる処理により、蛋白質中の露呈されたエピトープと
結合する抗体と相溶性である変性された蛋白質混合物を
生成する。さらに、この変性は急速でありしかも変性試
薬は一般的に安価である。
蛋白質中のジスルフィド結合が３個の共有結合、すな
わち２個の炭素：硫黄結合間の１個の硫黄：硫黄結合、
からなっていることは理解されよう。本発明の目的のた
めには、結合を***させるにはこれら３個の個々の結合
が破壊されることが重要であるとは考えられていない。
該結合のどれかの***が希望する変性効果を与えるであ
ろう。
わち２個の炭素：硫黄結合間の１個の硫黄：硫黄結合、
からなっていることは理解されよう。本発明の目的のた
めには、結合を***させるにはこれら３個の個々の結合
が破壊されることが重要であるとは考えられていない。
該結合のどれかの***が希望する変性効果を与えるであ
ろう。
ジスルフィド結合の***目的用には種々の酸化剤およ
び条件が適していることは明らかである。特定の酸化剤
および酸化条件の選択は、包含される特定蛋白質の条件
および耐性並びに蛋白質と結合させようとする抗−蛋白
質抗体の結合性質に従い行われる。一般的に、酸化剤の
酸化能力は意義ある***を生じるのに充分なほどの高さ
であることが必要である。今までの実験では、約1.3ボ
ルト以上の酸化能力を有する酸化剤が有効であると証明
されている。***剤の酸化能力を相当高めると、望まし
くない副反応や蛋白質の化学的改変を引き起こすことが
ある。これらを考慮に入れ、通常の熟練作業員が与えら
れた情況に対して適している酸化条件を設定または決定
することができる。
び条件が適していることは明らかである。特定の酸化剤
および酸化条件の選択は、包含される特定蛋白質の条件
および耐性並びに蛋白質と結合させようとする抗−蛋白
質抗体の結合性質に従い行われる。一般的に、酸化剤の
酸化能力は意義ある***を生じるのに充分なほどの高さ
であることが必要である。今までの実験では、約1.3ボ
ルト以上の酸化能力を有する酸化剤が有効であると証明
されている。***剤の酸化能力を相当高めると、望まし
くない副反応や蛋白質の化学的改変を引き起こすことが
ある。これらを考慮に入れ、通常の熟練作業員が与えら
れた情況に対して適している酸化条件を設定または決定
することができる。
本発明で使用できる酸化剤の代表例は、過ヨウ素酸塩
（IO4 -）、過オキソ二硫酸塩（S2O8 ＝）、次亜鉛素酸塩
（OCl-）、クロム酸塩（CrO4）、および過塩素酸塩（Cl
O4 -）であるが、それらに限定されるものではない。過
ヨウ素酸塩が特に約0.001〜約0.2モル（Ｍ）の間のそし
て好適には約0.01〜0.05Mの間の変性混合物中濃度で存
在している時に、特に有用な変性効果を示した。上記の
酸化剤中の対カチンオンは一般的に厳密なものではな
く、通常はカリウム、ナトリウム、リチウム、カルシウ
ム、マグネシウム、バリウム、およびアンモニウムから
選択できる。金属イオンの添加、例えば適当なイオン形
のコバルト、バナジウム、鉄、マンガン、銅、クロム、
錫、ルテニウム、鉛、セリウム、ニッケル、およびネプ
ツニウムの添加、により酸化を促進させることができ、
および／または温度条件を低下させることができる。
（IO4 -）、過オキソ二硫酸塩（S2O8 ＝）、次亜鉛素酸塩
（OCl-）、クロム酸塩（CrO4）、および過塩素酸塩（Cl
O4 -）であるが、それらに限定されるものではない。過
ヨウ素酸塩が特に約0.001〜約0.2モル（Ｍ）の間のそし
て好適には約0.01〜0.05Mの間の変性混合物中濃度で存
在している時に、特に有用な変性効果を示した。上記の
酸化剤中の対カチンオンは一般的に厳密なものではな
く、通常はカリウム、ナトリウム、リチウム、カルシウ
ム、マグネシウム、バリウム、およびアンモニウムから
選択できる。金属イオンの添加、例えば適当なイオン形
のコバルト、バナジウム、鉄、マンガン、銅、クロム、
錫、ルテニウム、鉛、セリウム、ニッケル、およびネプ
ツニウムの添加、により酸化を促進させることができ、
および／または温度条件を低下させることができる。
変性効果（denaturation effect）は一般的に、例え
ば温度、pH、培養時間などの如き他の要素にも依存して
いる。通常は、酸化反応は室温〜約70℃の間の温度にお
いて簡便に実施される。通常は室温における変性が好適
であるが、ある種の条件下ではわずかに高められた温
度、例えば約35℃〜約70℃の間、で酸化することが望ま
しかったりまたは必要であったりする。
ば温度、pH、培養時間などの如き他の要素にも依存して
いる。通常は、酸化反応は室温〜約70℃の間の温度にお
いて簡便に実施される。通常は室温における変性が好適
であるが、ある種の条件下ではわずかに高められた温
度、例えば約35℃〜約70℃の間、で酸化することが望ま
しかったりまたは必要であったりする。
含まれる酸化剤によるが、変性媒体のpHが酸化能力に
影響を与え、従って酸化反応の効果にも影響を与えるこ
とがある。より一般的に言えば、pHは蛋白質分子の化学
的改変を起こさないような通常の注意を払えば広い範囲
にわたり変えることができる。従って、変性反応のpHは
約３〜約11の間であることができ、より一般的にはpHは
約４〜約７の間に調節される。
影響を与え、従って酸化反応の効果にも影響を与えるこ
とがある。より一般的に言えば、pHは蛋白質分子の化学
的改変を起こさないような通常の注意を払えば広い範囲
にわたり変えることができる。従って、変性反応のpHは
約３〜約11の間であることができ、より一般的にはpHは
約４〜約７の間に調節される。
酸化反応の他の要素は培養時間を最短にするように一
般的に調節され、反応が数秒間〜数時間まで、例えば0.
1分間にわたり、進行できるように見込まれている。分
析場面は、約30秒間〜約10分間の培養時間になるように
一般的に条件が最適にされる。
般的に調節され、反応が数秒間〜数時間まで、例えば0.
1分間にわたり、進行できるように見込まれている。分
析場面は、約30秒間〜約10分間の培養時間になるように
一般的に条件が最適にされる。
希望する変性の完了後に残っている酸化剤を捕獲する
ために使用される還元剤は、酸化剤と同様に広範囲の物
質から選択できる。その選択は、酸化剤の酸化力を効果
的に変性させるために必要な還元能力並びに妨害的副反
応および蛋白質の改変を避ける必要性に依存する。この
目的のための代表的還元剤は、チオ硫酸塩（S2O3 ＝）、
ジチオン酸塩（S2O4 ＝）、ジチオトレイトール（dithio
threitol）、ジチオエリトリトール（dithioerythrito
l）、およびメルカプトエタノールであるが、それらに
限定されるものではない。
ために使用される還元剤は、酸化剤と同様に広範囲の物
質から選択できる。その選択は、酸化剤の酸化力を効果
的に変性させるために必要な還元能力並びに妨害的副反
応および蛋白質の改変を避ける必要性に依存する。この
目的のための代表的還元剤は、チオ硫酸塩（S2O3 ＝）、
ジチオン酸塩（S2O4 ＝）、ジチオトレイトール（dithio
threitol）、ジチオエリトリトール（dithioerythrito
l）、およびメルカプトエタノールであるが、それらに
限定されるものではない。
ここで使用されている抗体または抗体試薬という語
は、抗体結合位置を含んでいる得られた全ての物質を包
括するものである。従って、この語の意図する意味に含
まれるものは完全抗体並びにそれらの適当な断片または
多官能化された形である。完全抗体の形状の時は、それ
は公知の免疫グロブリン類、例えばIgG、IgMなど、のい
ずれかの種類および副種類に属することができる。抗体
結合位置を保有している該免疫グロブリンの断片、例え
ばFab、Fab′およびＦ（ab′）２として従来から知られ
ているIgGの断片、も使用できる。さらに、免疫グロブ
リンの集合体、重合体、誘導体、共役物、およびハイブ
リッドまたはそれらの断片も適宜使用できる。
は、抗体結合位置を含んでいる得られた全ての物質を包
括するものである。従って、この語の意図する意味に含
まれるものは完全抗体並びにそれらの適当な断片または
多官能化された形である。完全抗体の形状の時は、それ
は公知の免疫グロブリン類、例えばIgG、IgMなど、のい
ずれかの種類および副種類に属することができる。抗体
結合位置を保有している該免疫グロブリンの断片、例え
ばFab、Fab′およびＦ（ab′）２として従来から知られ
ているIgGの断片、も使用できる。さらに、免疫グロブ
リンの集合体、重合体、誘導体、共役物、およびハイブ
リッドまたはそれらの断片も適宜使用できる。
抗体試薬の免疫グロブリン原料は、例えば一般的な抗
血清製造または単分枝技術のような利用可能な技術によ
り誘導することができる。抗体世代中の適当な時点にお
いて、寄主の免疫系による希望する抗体の生成に刺激を
与えるために寄主動物にある種の物質（従来はイミュノ
ゲンと称されている）で免疫を与える。当技術の専門家
は希望する抗体の結合性質に適しているイミュノゲンを
選択するであろう。本発明は抗体試薬が向けられている
蛋白質上のエピトープが天然蛋白質中で利用できないか
または限定的にしか利用できない情況に関するものであ
るから、イミュノゲンは通常は非−天然形中のエピトー
プを示す構造を有している。このことは、エピトープが
線状エピトープである場合すなわち抗体が線状順番のア
ミノ酸残基からなっているた蛋白質上の区域に向けられ
ている場合に特に適用される。
血清製造または単分枝技術のような利用可能な技術によ
り誘導することができる。抗体世代中の適当な時点にお
いて、寄主の免疫系による希望する抗体の生成に刺激を
与えるために寄主動物にある種の物質（従来はイミュノ
ゲンと称されている）で免疫を与える。当技術の専門家
は希望する抗体の結合性質に適しているイミュノゲンを
選択するであろう。本発明は抗体試薬が向けられている
蛋白質上のエピトープが天然蛋白質中で利用できないか
または限定的にしか利用できない情況に関するものであ
るから、イミュノゲンは通常は非−天然形中のエピトー
プを示す構造を有している。このことは、エピトープが
線状エピトープである場合すなわち抗体が線状順番のア
ミノ酸残基からなっているた蛋白質上の区域に向けられ
ている場合に特に適用される。
例えば、イミュノゲンは変性された形状の完全蛋白質
またはそれらの消化もしくは合成された断片であること
ができる（後者の場合には、断片は従来のイミュノゲン
性担体物質と化学的に結合できる）。さらに、イミュノ
ゲンは合成ペプチドイミュノゲンすなわち例えば非定形
のイミュノゲン性担体（例えば牛血清アルブミン、キー
ホールリンペットヘモシアニンなど）と化学的に結合さ
れた少なくとも約４個のアミノ酸残基からなる合成的に
製造されたペプチドの共役物であってもよい。合成ペプ
チドイミュノゲンの使用は線状ペプチドエピトープに対
して免疫応答を向けさせるためである。天然のジスルフ
ィド−架橋結合されている蛋白質中のそのような線状エ
ピトープが刺激された抗体に対して受容不能であるかま
たは限定されて受容されることが知られている場合に、
本発明は変性によりエピトープを露呈させるかまたはそ
の露呈を増加させるための手段を提供するものである。
またはそれらの消化もしくは合成された断片であること
ができる（後者の場合には、断片は従来のイミュノゲン
性担体物質と化学的に結合できる）。さらに、イミュノ
ゲンは合成ペプチドイミュノゲンすなわち例えば非定形
のイミュノゲン性担体（例えば牛血清アルブミン、キー
ホールリンペットヘモシアニンなど）と化学的に結合さ
れた少なくとも約４個のアミノ酸残基からなる合成的に
製造されたペプチドの共役物であってもよい。合成ペプ
チドイミュノゲンの使用は線状ペプチドエピトープに対
して免疫応答を向けさせるためである。天然のジスルフ
ィド−架橋結合されている蛋白質中のそのような線状エ
ピトープが刺激された抗体に対して受容不能であるかま
たは限定されて受容されることが知られている場合に、
本発明は変性によりエピトープを露呈させるかまたはそ
の露呈を増加させるための手段を提供するものである。
本発明は１個以上のジスルフィド架橋を含有している
本質的に全ての蛋白質に適用可能であると思われる。本
発明の酸化的変性は蛋白質に向けられている各抗体に関
して全てのジスルフィド−架橋結合されている蛋白質の
抗原性を成功裡に与えるかまたは増加させるものでない
ことは明らかであり、その理由はそのようなことは蛋白
質の特定構造および折りたたみ並びに蛋白質の三次元天
然構造内のエピトープの位置に依存しているからであ
る。しかしながら、当技術の専門家は抗体がジスルフィ
ド−架橋結合されている蛋白質中で立体障害を受けてい
るまたは隠されているエピトープに対して向上されやす
い場合における本発明の方法の有用性を全く容易に決め
ることができるであろう。
本質的に全ての蛋白質に適用可能であると思われる。本
発明の酸化的変性は蛋白質に向けられている各抗体に関
して全てのジスルフィド−架橋結合されている蛋白質の
抗原性を成功裡に与えるかまたは増加させるものでない
ことは明らかであり、その理由はそのようなことは蛋白
質の特定構造および折りたたみ並びに蛋白質の三次元天
然構造内のエピトープの位置に依存しているからであ
る。しかしながら、当技術の専門家は抗体がジスルフィ
ド−架橋結合されている蛋白質中で立体障害を受けてい
るまたは隠されているエピトープに対して向上されやす
い場合における本発明の方法の有用性を全く容易に決め
ることができるであろう。
従って、本発明は例えば5000ダルトン以下の比較的低
い分子量を有するもの（ここで使用されている蛋白質と
いう語には他の概念ではそれらの分子量のためにポリペ
プチド類と称されているものも含まれている）並びに数
十万以上の分子量を有するものを含む希望するいずれの
蛋白質にも有効に適用することができる。代表的種類の
蛋白質には、プロタミン類、ムコ蛋白質類、グリコ蛋白
質類、グロブリン類、アルブミン類、ホスホ蛋白質類、
ヒストン類、リポ蛋白質類、クロモ蛋白質類、およびヌ
クレオ蛋白質類が包含される。
い分子量を有するもの（ここで使用されている蛋白質と
いう語には他の概念ではそれらの分子量のためにポリペ
プチド類と称されているものも含まれている）並びに数
十万以上の分子量を有するものを含む希望するいずれの
蛋白質にも有効に適用することができる。代表的種類の
蛋白質には、プロタミン類、ムコ蛋白質類、グリコ蛋白
質類、グロブリン類、アルブミン類、ホスホ蛋白質類、
ヒストン類、リポ蛋白質類、クロモ蛋白質類、およびヌ
クレオ蛋白質類が包含される。
本発明は、特定のジスルフィド−架橋結合されている
蛋白質分析物を特異的に測定するための免疫検定法およ
び試薬系に適用することができる。本発明は、新規で有
用な線状ペプチドエピトープを見いだしそして当該ジス
ルフィド−架橋結合されている蛋白質中での該エピトー
プの利用性を増加させる機会を与えるてあろう。本発明
の方法は、天然蛋白質中で結合している抗体に対する同
定用エピトープが入手できないかまたは限定的にしか入
手できないような場合に蛋白質を成功裡にまたは改良し
て特異的に検出できるような抗体試薬を設定しそして結
合条件を制定する手段を与えるものである。本発明の他
の用途は、蛋白質の通常に露呈された部分に対する抗体
の生成および結合用に利用できるものより特異的であり
および／またはそれより高い結合親和力を有するジスル
フィド−架橋結合されている蛋白質中のエピトープを見
いだす際の用途である。希望する寄主動物に適当に変性
された形の蛋白質またはそれの断片を用いて免疫を与え
ることにより、望ましく増加した特異性および／または
結合性を示す抗体に対して生じる免疫応答を試験するこ
とができる。この用途の応用は、例えば血液細胞、バク
テリアおよびウィルスなどの微生物、などの如き細胞状
分析物の特異的検出である。検出の特異性を表面蛋白質
抗原に結合している抗体により供されるものより改良さ
せようと希望する場合には、表面蛋白質および／または
細胞内蛋白質を変性させて改良された抗体応答を観察す
ることにより内部エピトープを試験することができる。
蛋白質分析物を特異的に測定するための免疫検定法およ
び試薬系に適用することができる。本発明は、新規で有
用な線状ペプチドエピトープを見いだしそして当該ジス
ルフィド−架橋結合されている蛋白質中での該エピトー
プの利用性を増加させる機会を与えるてあろう。本発明
の方法は、天然蛋白質中で結合している抗体に対する同
定用エピトープが入手できないかまたは限定的にしか入
手できないような場合に蛋白質を成功裡にまたは改良し
て特異的に検出できるような抗体試薬を設定しそして結
合条件を制定する手段を与えるものである。本発明の他
の用途は、蛋白質の通常に露呈された部分に対する抗体
の生成および結合用に利用できるものより特異的であり
および／またはそれより高い結合親和力を有するジスル
フィド−架橋結合されている蛋白質中のエピトープを見
いだす際の用途である。希望する寄主動物に適当に変性
された形の蛋白質またはそれの断片を用いて免疫を与え
ることにより、望ましく増加した特異性および／または
結合性を示す抗体に対して生じる免疫応答を試験するこ
とができる。この用途の応用は、例えば血液細胞、バク
テリアおよびウィルスなどの微生物、などの如き細胞状
分析物の特異的検出である。検出の特異性を表面蛋白質
抗原に結合している抗体により供されるものより改良さ
せようと希望する場合には、表面蛋白質および／または
細胞内蛋白質を変性させて改良された抗体応答を観察す
ることにより内部エピトープを試験することができる。
本発明を用いる蛋白質分析物の免疫検定測定法は本質
的には従来技術に従うことができる。それには、比較的
古い技術、例えば免疫拡散、免疫電気泳動、凝着技術、
および補体固着、並びに比較的最近の技術、例えば放射
免疫検定および非放射性アイソトープ方法の如き特異的
に検出可能なラベルの使用など、が包含される。本発明
を使用する蛋白質分析物に対する免疫検定法の工程に
は、相当量の蛋白質を効果的に変性させて希望するエピ
トープを露呈させるために含まれている水性試験試料を
処理し、変性した試料を抗体試薬と接触させ、該蛋白質
に対する抗体試薬の結合を測定するという必須段階が包
含される。もちろん測定段階は包含されている基本的な
免疫検定技術に従い変えることができる。この測定を行
うための一般的技術は、分析物または抗体試薬と相互作
用しそして分析物および抗体の間の免疫複合体の生成を
指示するかまたは該生成と競合する方法で使用されるラ
ベルに付いた試薬を使用する。
的には従来技術に従うことができる。それには、比較的
古い技術、例えば免疫拡散、免疫電気泳動、凝着技術、
および補体固着、並びに比較的最近の技術、例えば放射
免疫検定および非放射性アイソトープ方法の如き特異的
に検出可能なラベルの使用など、が包含される。本発明
を使用する蛋白質分析物に対する免疫検定法の工程に
は、相当量の蛋白質を効果的に変性させて希望するエピ
トープを露呈させるために含まれている水性試験試料を
処理し、変性した試料を抗体試薬と接触させ、該蛋白質
に対する抗体試薬の結合を測定するという必須段階が包
含される。もちろん測定段階は包含されている基本的な
免疫検定技術に従い変えることができる。この測定を行
うための一般的技術は、分析物または抗体試薬と相互作
用しそして分析物および抗体の間の免疫複合体の生成を
指示するかまたは該生成と競合する方法で使用されるラ
ベルに付いた試薬を使用する。
後者の技術は例えばラベルの付いた試薬が抗体試薬と
の結合用の蛋白質生分析物と競合するようにされている
競合結合型式の如き種々の型式で実施することができ
る。抗体試薬と結合されたラベルの付いた試薬またはそ
のように結合されていないラベルの付いた試薬からなっ
ている遊離種の量を適当に測定し、そして試料中の蛋白
質分析物の量と機能的に関連させることができる。本発
明の抗体試薬を蛋白質分析物中の線状エピトープに向け
させる場合には、ラベルの付いた試薬はラベルの付いた
形の変性蛋白質またはそれの変性断片であることがで
き、或いは好適には線状エピトープ順序のアミノ酸類か
らなるラベルの付いた形のペプチド残基であることがで
きる。好適な試薬である後者は利用可能な合成ペプチド
方法および装置によって製造することができ、そして蛋
白質分子自身の単離、精製、および変性を必要としな
い。
の結合用の蛋白質生分析物と競合するようにされている
競合結合型式の如き種々の型式で実施することができ
る。抗体試薬と結合されたラベルの付いた試薬またはそ
のように結合されていないラベルの付いた試薬からなっ
ている遊離種の量を適当に測定し、そして試料中の蛋白
質分析物の量と機能的に関連させることができる。本発
明の抗体試薬を蛋白質分析物中の線状エピトープに向け
させる場合には、ラベルの付いた試薬はラベルの付いた
形の変性蛋白質またはそれの変性断片であることがで
き、或いは好適には線状エピトープ順序のアミノ酸類か
らなるラベルの付いた形のペプチド残基であることがで
きる。好適な試薬である後者は利用可能な合成ペプチド
方法および装置によって製造することができ、そして蛋
白質分子自身の単離、精製、および変性を必要としな
い。
蛋白質分析物を検出するための他の有用な免疫検定技
術は、サンドイッチ技術として知られているものであ
る。この方法では２種の抗体試薬が使用され、一方はラ
ベルが付けられておりそして他方は蛋白質分析物と結合
されている最終的にはラベルが付けられる第一抗体試薬
を結合されていないものと分離するために使用される。
ラベルと付いていない第二抗体試薬は典型的には当技術
で公知のように固定形であるかまたは固定不能形であ
る。
術は、サンドイッチ技術として知られているものであ
る。この方法では２種の抗体試薬が使用され、一方はラ
ベルが付けられておりそして他方は蛋白質分析物と結合
されている最終的にはラベルが付けられる第一抗体試薬
を結合されていないものと分離するために使用される。
ラベルと付いていない第二抗体試薬は典型的には当技術
で公知のように固定形であるかまたは固定不能形であ
る。
放射免疫検定法では、ラベルにより発生する信号両方
の種類において性質的に同一であるから、遊離種および
結合種が物理的に区別すなわち分離されなければならな
い。そのような技術は当技術では相分離条件の理由のた
めに不均質技術として知られている。時にはエリサ技術
とも称されている酵素−ラベル付き免疫検定法（米国特
許番号3,654,090参照）および蛍光免疫検定法（米国特
許番号4,201,763、4,133,639および3,992,631参照）な
どの他の不均質免疫検定技術も知られている。均質技術
として知られている免疫検定技術を本発明に応用するこ
ともできる。
の種類において性質的に同一であるから、遊離種および
結合種が物理的に区別すなわち分離されなければならな
い。そのような技術は当技術では相分離条件の理由のた
めに不均質技術として知られている。時にはエリサ技術
とも称されている酵素−ラベル付き免疫検定法（米国特
許番号3,654,090参照）および蛍光免疫検定法（米国特
許番号4,201,763、4,133,639および3,992,631参照）な
どの他の不均質免疫検定技術も知られている。均質技術
として知られている免疫検定技術を本発明に応用するこ
ともできる。
本発明を下記の実施例により今説明するが、それらに
限定しようとするものではない。
限定しようとするものではない。
実施例 A.癌胎性抗原（carcinoembryonic Amtigen）（CEA）の
抗原性−過ヨウ素酸塩を用いる酸化の影響 この実施例では、サンドイッチ免疫検定法によるCEA
の検出性を天然CEA、本発明に従い過ヨウ素酸塩を用い
る酸化により変性されたCEA、および先行技術方法（還
元およびその後のアルキル化）により変性されたCEAに
関して比較した。
抗原性−過ヨウ素酸塩を用いる酸化の影響 この実施例では、サンドイッチ免疫検定法によるCEA
の検出性を天然CEA、本発明に従い過ヨウ素酸塩を用い
る酸化により変性されたCEA、および先行技術方法（還
元およびその後のアルキル化）により変性されたCEAに
関して比較した。
酸化されたCEA−１ミリグラム／ミリリットル（mg/mL）
のCEAを含有している６マイクロリットル（μＬ）の溶
液（米国、カリホルニア州、サンディエゴのスクリップ
ス・ラボラトリイス）を294μＬのpH5の燐酸塩−緩衝食
塩水（PBST−10mM燐酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウ
ム、0.05％ツイーン−20および0.01％チメロサル、水酸
化ナトリウムの添加によりpHが調節されている）中0.02
M過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）の中に溶解させ、そし
て密封試験管中で70℃に５分間加熱した。溶液を氷浴中
で冷却し、300μＬのPBST（pH5）中0.03Mチオ硫酸ナト
リウム（Na2S2O3）を加え、そして溶液を撹拌により混
合した。［酸化されたCEA混合物はここでは略字「OCE
A」と称される。天然CEAは「CEA」と称される。］ 還元されそしてアルキル化されたCEA−ブリュー（Bre
w）他、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジイ・アンド
・ケミストリイ（J.Biol.Chem.）、245:457、（1970）
の方法。［還元されそしてアルキル化されたCEA調合物
はここでは略字「RACEA」と称される。］ サンドイッチ免疫検定法−選択された抗原調合物をそれ
ぞれPBST（pH5）で1:3に殺菌的に10回希釈した。
のCEAを含有している６マイクロリットル（μＬ）の溶
液（米国、カリホルニア州、サンディエゴのスクリップ
ス・ラボラトリイス）を294μＬのpH5の燐酸塩−緩衝食
塩水（PBST−10mM燐酸ナトリウム、0.15M塩化ナトリウ
ム、0.05％ツイーン−20および0.01％チメロサル、水酸
化ナトリウムの添加によりpHが調節されている）中0.02
M過ヨウ素酸ナトリウム（NaIO4）の中に溶解させ、そし
て密封試験管中で70℃に５分間加熱した。溶液を氷浴中
で冷却し、300μＬのPBST（pH5）中0.03Mチオ硫酸ナト
リウム（Na2S2O3）を加え、そして溶液を撹拌により混
合した。［酸化されたCEA混合物はここでは略字「OCE
A」と称される。天然CEAは「CEA」と称される。］ 還元されそしてアルキル化されたCEA−ブリュー（Bre
w）他、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジイ・アンド
・ケミストリイ（J.Biol.Chem.）、245:457、（1970）
の方法。［還元されそしてアルキル化されたCEA調合物
はここでは略字「RACEA」と称される。］ サンドイッチ免疫検定法−選択された抗原調合物をそれ
ぞれPBST（pH5）で1:3に殺菌的に10回希釈した。
二抗体微量滴定板サンドイッチ免疫検定法を標準的工
程（ハーロー（Harolw）,E.およびレーン（Lane）,D.、
アンチボディーズ（Antibodies）：ラボラトリイ・マニ
ュアル、コールド・スプリング・ハーバー、1988）に従
い行った。微量滴定板をそれぞれ次の段階との間に板洗
浄機の上でPBSTで５回洗浄した。ハツカネズミ抗−CEA
単分枝状抗体を捕獲抗体として微量滴定板のウエルに吸
着させた。過剰の結合位置を牛血清アルブミン（BSA）
のPBST中１％溶液で遮蔽した。抗原（100μL/ウエルの
適当な希釈物）の添加後に、兎の多分枝状抗−CEA抗体
を検出抗体として加えた。兎の抗体の検出を、１％のBS
Aを含有しているPBST（pH8.2）中で希釈された100μL/
ウエルの山羊抗−（兎Ig）−（セウヨウワサビ過酸化酵
素（HRP）共役物の添加により行った。基質（テトラメ
チルベンジン／過酸化水素）の添加によい検定を現像さ
せ、そして光学的密度を450ナノメートル（nm）におい
て読み取ることにより定量化した。
程（ハーロー（Harolw）,E.およびレーン（Lane）,D.、
アンチボディーズ（Antibodies）：ラボラトリイ・マニ
ュアル、コールド・スプリング・ハーバー、1988）に従
い行った。微量滴定板をそれぞれ次の段階との間に板洗
浄機の上でPBSTで５回洗浄した。ハツカネズミ抗−CEA
単分枝状抗体を捕獲抗体として微量滴定板のウエルに吸
着させた。過剰の結合位置を牛血清アルブミン（BSA）
のPBST中１％溶液で遮蔽した。抗原（100μL/ウエルの
適当な希釈物）の添加後に、兎の多分枝状抗−CEA抗体
を検出抗体として加えた。兎の抗体の検出を、１％のBS
Aを含有しているPBST（pH8.2）中で希釈された100μL/
ウエルの山羊抗−（兎Ig）−（セウヨウワサビ過酸化酵
素（HRP）共役物の添加により行った。基質（テトラメ
チルベンジン／過酸化水素）の添加によい検定を現像さ
せ、そして光学的密度を450ナノメートル（nm）におい
て読み取ることにより定量化した。
結果−上記の免疫検定法を一連の希釈系のCEA、OCEAお
よびRACEAに対して行った。結果を第１図のグラフに示
す。
よびRACEAに対して行った。結果を第１図のグラフに示
す。
B.癌胎性抗原（CEA）の抗原性−過オキソ二硫酸塩を用
いる酸化の影響 酸化剤として過オキソ二硫酸塩を用いて、CEAの酸化
を繰り返した。
いる酸化の影響 酸化剤として過オキソ二硫酸塩を用いて、CEAの酸化
を繰り返した。
酸化されたCEA−0.84mg/mLのCEAを含有している23.81μ
Ｌの溶液を976.2μＬのPBST（pH5）中0.02M過オキソ二
流酸アンモニウム（NH4S2O8）の中に溶解させた。溶液
をそれぞれ250μＬの４部分に分け、そして密封試験管
中でそれぞれ第２図に示されている温度に５−10分間に
わたり加熱した。溶液を次に氷浴中で冷却し、250μＬ
のPBST（pH5）中0.03Mチオ硫酸ナトリウムの中に溶解さ
せ、そして溶液を撹拌により混合した。
Ｌの溶液を976.2μＬのPBST（pH5）中0.02M過オキソ二
流酸アンモニウム（NH4S2O8）の中に溶解させた。溶液
をそれぞれ250μＬの４部分に分け、そして密封試験管
中でそれぞれ第２図に示されている温度に５−10分間に
わたり加熱した。溶液を次に氷浴中で冷却し、250μＬ
のPBST（pH5）中0.03Mチオ硫酸ナトリウムの中に溶解さ
せ、そして溶液を撹拌により混合した。
免疫検定法−上記の実施例Ａ中と同一。
結果−第２図のグラフ中に示されている。
C.癌胎性抗原（CEA）の抗原性−次亜塩素酸塩を用いる
酸化の影響 酸化剤として次亜塩素酸塩を用いて、CEAの酸化を繰
り返した。
酸化の影響 酸化剤として次亜塩素酸塩を用いて、CEAの酸化を繰
り返した。
酸化されたCEA−1mg/mLのCEAを含有している61μＬの溶
液を294μＬのPBST（pH5）中0.02M次亜塩素酸ナトリウ
ム（NaOCl）の中に溶解させ、そして試験管中で室温（2
2℃）に５分間保った。次に、300μＬのPBST（pH5）中
0.3Mチオ硫酸ナトリウムを加え、そして溶液を撹拌によ
り混合した。
液を294μＬのPBST（pH5）中0.02M次亜塩素酸ナトリウ
ム（NaOCl）の中に溶解させ、そして試験管中で室温（2
2℃）に５分間保った。次に、300μＬのPBST（pH5）中
0.3Mチオ硫酸ナトリウムを加え、そして溶液を撹拌によ
り混合した。
免疫検定法−上記の実施例Ａ中と同一。
結果−免疫検定を一連の希釈系CEAおよびOCEAに対し
て行った。結果は第３図のグラフ中に示されている。
て行った。結果は第３図のグラフ中に示されている。
D.pHの影響 試験試料の調合−1mg/mLのCEAを含有している６μＬの
溶液を第４図に示されている各pHにおいて294μＬのPBS
T中0.02M過ヨウ素酸ナトリウムの中に溶解させた。溶液
を密封試験管中で70℃に５分間加熱し、次に氷浴中で冷
却した。次に、300μＬのPBST中0.03Mチオ硫酸ナトリウ
ムを各酸化反応と同じpHにおいて加え、そして溶液を撹
拌により混合した。工程のいずれか段階でも無着物質の
沈澱は無視された。各組の試験試料に対して同一pHにお
いて順次希釈を行った。
溶液を第４図に示されている各pHにおいて294μＬのPBS
T中0.02M過ヨウ素酸ナトリウムの中に溶解させた。溶液
を密封試験管中で70℃に５分間加熱し、次に氷浴中で冷
却した。次に、300μＬのPBST中0.03Mチオ硫酸ナトリウ
ムを各酸化反応と同じpHにおいて加え、そして溶液を撹
拌により混合した。工程のいずれか段階でも無着物質の
沈澱は無視された。各組の試験試料に対して同一pHにお
いて順次希釈を行った。
免疫検定法−上記の実施例Ａ中と同一。
結果−第４図のグラフ中に示されている。
E.pHの影響 試験試料の調合−0.8mg/mLのCEAを含有している18.75μ
Ｌの溶液を731.2μＬのPBST中0.02M過ヨウ素酸ナトリウ
ムの中に溶解させた。この溶液をそれぞれ250μＬの３
部分に分けた。試験管を密封し、そして第５図に示され
ている各温度に５分間加熱した。次に溶液を氷浴名で冷
却し、それぞれに300μＬのPBST中0.03Mチオ硫酸ナトリ
ウムを加え、そして試験試料を撹拌により混合した。
Ｌの溶液を731.2μＬのPBST中0.02M過ヨウ素酸ナトリウ
ムの中に溶解させた。この溶液をそれぞれ250μＬの３
部分に分けた。試験管を密封し、そして第５図に示され
ている各温度に５分間加熱した。次に溶液を氷浴名で冷
却し、それぞれに300μＬのPBST中0.03Mチオ硫酸ナトリ
ウムを加え、そして試験試料を撹拌により混合した。
免疫検定法−上記の実施例Ａ中と同一。
結果−第５図のグラフ中に示されている。
F.試みたグアニジン変性との比較 試験試料の調合−0.61mg/mLのCEAを含有している26.2μ
Ｌの溶液を1572μＬのPBST中3Mグアニジン塩酸塩溶液の
中に溶解させた。３個のこの溶液の500μＬ試料を別々
の試験管中に入れ、そして第６図に示されている各温度
に５分間加熱した。溶液を氷浴中で冷却した。70℃試料
の１個を免疫検定法で直接使用した。他の２個はアミコ
ン濃縮器管（30,000ダルトンの膜除外寸法、50μＬに濃
縮、1mLに再希釈、および500xgにおける遠心）を用いて
PBSTに対して透析させた。この工程を３回繰り返した。
Ｌの溶液を1572μＬのPBST中3Mグアニジン塩酸塩溶液の
中に溶解させた。３個のこの溶液の500μＬ試料を別々
の試験管中に入れ、そして第６図に示されている各温度
に５分間加熱した。溶液を氷浴中で冷却した。70℃試料
の１個を免疫検定法で直接使用した。他の２個はアミコ
ン濃縮器管（30,000ダルトンの膜除外寸法、50μＬに濃
縮、1mLに再希釈、および500xgにおける遠心）を用いて
PBSTに対して透析させた。この工程を３回繰り返した。
免疫検定法−上記の実施例Ａ中と同一。
結果−第６図のグラフ中に示されている。未透析試料に
より得られた平らな応答は免疫検定抗体試薬の変性によ
るものと信じられる。
より得られた平らな応答は免疫検定抗体試薬の変性によ
るものと信じられる。
本発明を以上で特別に記載しそして例示してきた。明
らかに、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り本
発明の他の改変を行うことができる。
らかに、本発明の精神および範囲から逸脱しない限り本
発明の他の改変を行うことができる。
図面は上記の実施例で生じたデータのグラフ表示であ
る。第１−３図は、蛋白質抗原CEAの抗原性に対する過
ヨウ素酸塩、過オキソ二硫酸塩、および次亜塩素酸塩の
それぞれの影響に関するものである。第４および５図
は、本発明の酸化工程におけるpHおよび温度の影響に関
するものである。第６図は、ジスルフィド***なしのグ
アニジン塩酸塩を用いて試みられたCEAの変性からの結
果を示している。
る。第１−３図は、蛋白質抗原CEAの抗原性に対する過
ヨウ素酸塩、過オキソ二硫酸塩、および次亜塩素酸塩の
それぞれの影響に関するものである。第４および５図
は、本発明の酸化工程におけるpHおよび温度の影響に関
するものである。第６図は、ジスルフィド***なしのグ
アニジン塩酸塩を用いて試みられたCEAの変性からの結
果を示している。
フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/531 G01N 33/574
Claims (2)
- 【請求項１】ジスルフィド架橋結合を含有している蛋白
質の抗原性を与えるかまたは増加させる方法において、
蛋白質を蛋白質中のジスルフィド結合を***させるのに
充分な酸化電位を有する酸化剤で処理し、そしてあらか
じめ決められた反応時間後に、生成した混合物を残存し
ている酸化剤と反応しそして不活性化させるのに充分な
量の還元剤と接触させることからなる方法。 - 【請求項２】（１）蛋白質中の線状ペプチドエピトープ
に対して特異性の抗体試薬、 （２）蛋白質中のジスルフィド結合を***させるのに充
分な酸化電位を有する酸化剤、および （３）該酸化剤と反応しそして不活性化させることので
きる還元剤 を含んでなる、試験試料中でジスルフィド架橋結合を含
有している蛋白質を免疫検定検出するための試験用キッ
ト。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US377680 | 1989-07-10 | ||
| US07/377,680 US5061790A (en) | 1989-07-10 | 1989-07-10 | Oxidative denaturation of protein analytes |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH0368868A JPH0368868A (ja) | 1991-03-25 |
| JP2915970B2 true JP2915970B2 (ja) | 1999-07-05 |
Family
ID=23490110
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2180711A Expired - Fee Related JP2915970B2 (ja) | 1989-07-10 | 1990-07-10 | 蛋白質分析物の酸化的変性 |
Country Status (18)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5061790A (ja) |
| EP (1) | EP0407813B1 (ja) |
| JP (1) | JP2915970B2 (ja) |
| KR (1) | KR910003380A (ja) |
| AT (1) | ATE147167T1 (ja) |
| AU (1) | AU633115B2 (ja) |
| CA (1) | CA2019671C (ja) |
| DE (1) | DE69029540T2 (ja) |
| DK (1) | DK0407813T3 (ja) |
| ES (1) | ES2095847T3 (ja) |
| FI (1) | FI903464A0 (ja) |
| GR (1) | GR3022906T3 (ja) |
| IE (1) | IE902493A1 (ja) |
| IL (1) | IL94993A (ja) |
| NO (1) | NO902833L (ja) |
| NZ (1) | NZ234396A (ja) |
| PT (1) | PT94633B (ja) |
| ZA (1) | ZA905360B (ja) |
Families Citing this family (21)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2740223B1 (fr) * | 1995-10-19 | 1997-11-14 | Commissariat Energie Atomique | Procede de determination d'auto-anticorps revelateurs de complications pathologiques ; dans le serum sanguin, en particulier de diabetiques |
| US20030202980A1 (en) * | 1995-12-29 | 2003-10-30 | Caplan Michael J. | Methods and reagents for decreasing clinical reaction to allergy |
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