JP2911544B2

JP2911544B2 - 新規アシネトバクター・カルコアセティカス及び新規バイオサーファクタント

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Publication number: JP2911544B2
Application number: JP2140579A
Authority: JP
Inventors: 良昌田中; 知子福井; 太兵衛祢宜
Original assignee: Lion Corp
Current assignee: Lion Corp
Priority date: 1989-06-05
Filing date: 1990-05-30
Publication date: 1999-06-23
Anticipated expiration: 2014-06-23
Also published as: JPH03130073A; EP0401700A3; EP0401700A2

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、油などに対してすぐれた乳化性能を有する
高分子界面活性剤（バイオサーファクタント、以下、BS
Fという）および該界面活性剤を産生する新規な微生物
に関するものである。

〔従来の技術〕

天然油脂系や石油化学系の界面活性剤は石鹸や合成洗
剤、乳化剤として幅広く活用されているが、近年従前の
機能や性能を越える新しい機能性界面活性剤の出現が待
たれており、微生物が産生する界面活性能を有する物質
が着目されている。

例えば、アシネトバクター属の微生物がBSFを産生す
ることが特開昭55−112201号公報に開示されており、こ
こに記載されたアシネトバクター・カルコアセティカス
RAG−１（ATCC31012）の産生するBSFであるエマルサン
（ペトロリウムファーメンテイションズ社）が、タン
カー油槽の洗浄剤として工業化されはじめた。またトル
ロプシス・ボンビコーラが産生するソホロリピッド（花
王（株））も新規界面活性剤としてある製品に一部活用
されている。その他、ペニシリウム・スピクリスポラム
が産生するスピクリスポール酸（磐田化学）も工業化に
入っている。

これらのほかにも種々の微生物が産生するBSFが知ら
れており、例えば、糖脂質系のBSFとしては、ロドコッ
カス・エリスロポリス（Rhodococcus erythropolis）及
びノカルディア属（Nocardia sp.）が産生するトレハロ
ースリピド、トルロピシス・ボンビコーラ（Torulopsis
bombicola）が産生するソホロリピドやウスチラゴ・メ
イディス（Ustilago maydis）が産生するウスチラジン
酸；脂肪酸系のBSFとしては、ペニシリウム・スピクリ
スポラム（Penicillium spiculisporum）が産生するス
ピクリスポール酸；バイオポリマー系のBSFとしては、
カンジダ・トロピカリス（Candida tropicalis）やコリ
ネバクテリウム・ハイドロカルボクラスタス（Coryneba
cterium hydrocarboclastus）が産生する多糖脂質複合
体やタンパク質−脂質−多糖複合体があげられる。

しかし現時点ではコスト面で合成系活性剤との競争力
は乏しく、実用的展開は期待されるほど図られていな
い。

〔発明が解決しようとする課題〕

従って、本発明は、新しい機能性界面活性剤を産生す
る新規微生物及び新しいバイオサーファクタントを提供
することを目的とする。

〔課題を解決するための手段〕

本発明者らは、乳化性能が幅広く、尚且つ産生能の優
れた多糖系BSFを産生する菌を広く自然界より検索した
結果、アシネトバクター・カルコアセティカスに属する
株が公知のエマルサンより性能の優れた多糖系BSFを培
地中に多量産生することを見いだし、本発明を完成し
た。

すなわち、本発明は、リトマスを還元し、オキシダー
ゼに対して陰性を示し、寒天培地培養で薄茶色の着色物
質を産生し、硝酸塩還元能及び脱窒素能を有し、かつ乳
化性を有する多糖類を産生することを特徴とするアシネ
トバクター・カルコアセティカスを提供する。

この、アシネトバクター属に属し、幅広い範囲にわた
る優れた乳化力を有し、高いBSF産生能力を持つ新規な
微生物は、アシネトバクター・カルコアセティカス217
株（FERM BP−2905）であり、本菌株の菌学的性質を次
に詳述する。

尚、菌学的性質および分類方法は、Bergey′s Manual
of Determinative Bacteriology第８版（1974）、R.E.
Gordonの検索表（1987）に準じて行なった。温度および
pHに関する生育最適温度範囲の測定は、温度勾配バイオ
フォトレコーダーで実施した。

A.形態的性質肉汁寒天培地上で30℃にて２日間培養したとき、以下
の形態的特徴が観察される。

１）細胞の形および大きさ：短桿菌、大きさは、 1.7−1.9×2.6−2.7μｍ２）多形性：あり（球から棹へ）３）運動性：なし４）胞子：なし５）グラム染色：陰性６）抗酸性：陰性 B.培養的性質１）pH7.0にて成育して、円形、偏平状、全縁のコロニ
ーを形成する。該コロニーの表面は滑らかで光沢あり、
該周辺部は淡褐色、該中心部は半透明の淡褐色。

２）肉汁寒天斜面培地： pH7.0にて帯状に成育し、光沢あるクリーム色ないし
淡褐色のコロニーを形成する。一週間前後に培地を薄茶
色に着色する。

３）肉汁液体培養： pH7.0にて成育するが、菌膜は形成しない。

４）肉汁ゼラチン穿刺培養： pH7.0にて僅かに液化。

５）リトマス・ミルク：リトマスを弱く還元。カゼイノーゲン凝固せず。

C.生理的性質１）硝酸塩の還元：陽性２）脱窒反応：陽性３）MRテスト：陰性４）VPテスト：陽性５）インドールの生成：陽性６）硫化水素の生成：陽性７）デンプンの加水分解：陰性８）クエン酸の利用：クリステンセンの培地では利用す
る。

９）無機窒素の利用：硝酸塩は利用する。

アンモニウム塩は利用しない。

10）色素の生成：色素は産生しない。

11）ウレアーゼ：陽性 12）オキシダーゼ：陰性 13）カタラーゼ：陽性 14）成育の温度範囲:20ないし37℃付近（28ないし30℃
が良好） 15）成育のpH範囲:6.0ないし9.6（6.8付近が良好） 16）酸素に対する態度：好気性 17）Ｏ−Ｆテスト：発酵 18）オルニチン脱炭酸：陰性 19）アルギニンジヒドロラーゼ：陰性 20）リジン脱炭酸：陽性 21）細胞外DNaseテスト：陰性 22）炭化水素の資化性：（ツィーン系）ツィーン40:陽性ツィーン60:陽性ツィーン80:陰性 23）糖類から酸およびガスの生成：（＋；生成する −；生成しない）糖酸ガスＬ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース＋＋Ｄ−マンノース − − Ｄ−フラクトース＋ − Ｄ−ガラクトース − − 麦芽糖＋ − ショ糖＋ − トレハロース＋ − Ｄ−ソルビット − − Ｄ−マンニット＋ − イノシット − − グリセリン − − 澱粉 − − D.その他の性質１）217株より分離する多糖系高分子は、良好な乳化性
能を示す新規なバイオサーファクタントである。

２）本物質は水もしくは水−アルコールの溶液（懸濁
液）から溶媒を除去することにより、薄膜を形成する。

以上の性質を総括すると、まず本菌株はカタラーゼ陽
性、好気性でグラム陰性の多形性を示す短棹菌であるこ
とにより、アシネトバクター属の細菌であると判定し
た。

217株の形態を示す光学顕微鏡写真を第１図に示す。

尚、本菌株はアシネトバクター・カルコアセティカス
に属すると思われるため、E.Rosenberg等のアシネトバ
クター・カルコアセティカスRAG−１（ATCC 31012）と
菌学的性質を比較した。本菌株とRAG−１菌とは成育温
度の面でよく一致するが、本菌株はリトマスを還元する
のに対し、上記公知菌株は還元できない。オキシダーゼ
も本菌株が陰性であるのに対し、公知菌株では陽性を示
すことや、普通寒天培地上で本菌株が薄茶色の着色物質
を産生するのに対し公知菌株では産生しない点も異な
る。また本菌株は高い硝酸塩の還元能や脱窒能を有する
が、公知菌株は陰性であることから、上記公知の菌株と
は区別される。

このように本菌株は公知のアシネトバクター・カルコ
アセティカスRAG−１株とは異なるが、上述の菌学的性
質からアシネトバクター・カルコアセティカス類縁菌と
判断するのが妥当である。以上の結果を総括して第一表
に示す。

次に本菌株より生産される界面活性物質は、例えば次
の方法で回収することができる。先ず、本菌株を炭素
源、窒素源、無機塩を含有する培地で培養した後、中
和、熱処理を行う。次いで、遠心分離により菌体を除去
し、上清を濃縮および／又は透析処理し、エタノールを
撹拌しながら0.5〜10倍量加えた後放置する。生じた沈
澱を回収して乾燥させた試料をBSF217Eと称する。この
際、加える溶媒はエタノールに限定されず、メタノー
ル、アセトン等の親水性有機溶媒を用いてもよい。ま
た、加える量も、充分沈澱を生じる量であればよく、特
定量に限定されるものではない。BSF217Eに除蛋白など
の精製を加えた試料をBSF217と称する。

本発明の微生物由来の高分子界面活性剤（BSF217）
は、下記の特徴を有するものである。

（ｉ）中性糖、ウロン酸、アミノ糖、蛋白質が構成成分
として結合して成る分子量100万〜500万、好ましくは28
0万〜370万（高速液体クロマトグラフ法）の高分子であ
り、（ii）該中性糖は、高分子中に60〜85wt％、好ましくは
65〜75wt％の比率で存在し、（iii）かつ、該中性糖は、グルコース：マンノース：
ガラクトースを100:（30〜100）：（40〜150）、好まし
くは100:（40〜60）：（50〜100）の重量比で含み、（iv）該ウロン酸は、高分子中に７〜25wt％、好ましく
は10〜18wt％の比率で存在し、（ｖ）かつ、該ウロン酸は、グルクロン酸：ガラクチュ
ロン酸を100:（60〜20）、好ましくは100:（50〜30）の
重量比で含み、（vi）アミノ糖および蛋白質が残部を構成し、（vii）下記測定法による流動パラフィンの乳化力は40
〜60％であり、乳化力測定法試料の0.5重量％水溶液10mlと、流動パラフィン10ml
を目盛付き試験管で激しく振り、室温静置して30分後に
水層の体積を読み取り、次の式にしたがって乳化力を求
める。

（10−水層の体積）/10×100（％）（viii）オイルイエローによる色素法によるc.m.c.が0.
1〜0.5重量％であり、（ix）25℃、0.5重量％水溶液、30r.m.p.、Ｂ型粘度計
により測定した粘度が10〜50cpsであり、（ｘ）0.5重量％水溶液、室温、吊板法で測定した表面
張力が50〜73dyne/cmである。

次に、本発明のBSF217と公知のBSFであるエマルサン
とを比較する。

エマルサンの代表的な化学組成Ｄ−ガラクトースアミン 20〜30（wt％）ヘキソースアミンウロン酸 33.3 Ｄ−グルコース 5.2 脂肪酸エステル 15.0 水 12.7 灰分 3.5 BSF217とエマルサンの構成成分の主な差異をまとめる
と、下記の通りである。

〔発明の効果〕本発明によれば公知のBSFであるアシネトバクター・
カルコアセティカスRAG−１よりも乳化特性のすぐれたB
SFを産生する新規微生物が提供される。また、公知のBS
Fよりも乳化特性のすぐれたBSFが提供される。

次に実施例により本発明を説明する。

〔実施例〕

実施例１本発明者らが自然界より、分離採取した本菌株のスク
リーニング方法を述べる。

１）多糖産生菌の分離イーストエキス20g、リン酸−カリウム1g、硫酸マグ
ネシウム1gを水道水１に溶かし、水酸化カリウムでpH
7.0とした。オートクレーブ滅菌後、別滅菌したグルコ
ース及びｎ−デカンを１％添加した。液体培地7mlを分
注した試験管（φ16.5×165mm）に各地の土壌約100mgを
入れ、30℃で５日間培養した。その後培養液を上記培地
に寒天1.5％含むプレートに接種後、30℃で３日間イン
キュベートし、プレート上に生育した菌株のうち、多糖
産生する菌株を109株得た。

２）多糖系バイオサーファクタント（BSF）産生菌の分
離獲得した多糖産生菌の培養液で乳化力試験を行ない、
乳化力をエマルサンを基準にした指標を設けて評価し、
多糖系BSF産生菌として得た。

３）高生産多糖系BSF産生菌の分離乳化分散能に優れ、かつ実用上、最大のネックである
生産性においても現実的なBSF産生能から評価を行な
い、高生産多糖系BSF産生菌を選定した。

以上のスクリーニング工程よりふるいわけられた菌株
数を第二表に示す。

上記のスクリーニングにより、自然界から分離採取さ
れた微生物がアシネトバクター属に属し、乳化・分散力
に優れた多糖系バイオサーファクタント（BSF）を高生
産する新規なアシネトバクター・カルコアセティカス21
7株（FERM BP−2905）である。

尚、これらの菌の採取場所は熊本県荒尾市内の農地で
ある。採取は昭和62年度に実施した。

217株が産生するBSF217Eの乳化特性を次の方法により
測定した。

尚、BSF217Eは後述の実施例３に記載の培地、培養条
件を用い、かつ試料調製法に従って得たものである。

100ml容エプトン管にBSF217Eの0.5％水懸濁液30mlと
サラダ油20mlを加え、100回上下に激しく振盪、室温に
１日放置して、乳化力を調べた。結果を、公知の微生物
により産生されるBSFの乳化特性とともに第三表に示す
が、本発明の微生物により産生されるBSF217Eは、エマ
ルサンに比しはるかに強い乳化力を示す。尚、第三表
中、本発明の微生物により産生されたBSFをBSF217Eと略
称する。

実施例２アシネトバクター・カルコアセティカス217株を、後
述の実施例３に記載の培地及び培養条件を用いて培養
し、得られた培養上清を濃縮・透析した後、エタノール
を加えて沈澱させた。生じた沈澱物を遠心分離で回収
し、粗試料（BSF217E）とした。

混在する蛋白成分は、加水分解酵素処理、尿素等の蛋
白変性剤処理などを加えた後、ゲル濾過により除去し精
製して得た乾燥粉末を糖分析用の試料（BSF217）とし
た。

糖の定量法は下記の通りである。

中性糖：フェノール硫酸法ウロン酸：カルバゾール硫酸法アミノ糖:Elson−Morgan法試料BSF217を2N塩酸で水解後、イオンクロマトを通し
中性糖画分とアミノ糖画分に分け、中性糖はMopper糖の
方法で液体クロマト分析（カラム:DIAION COR−10、カ
ラム温度60℃、反応槽:110℃、測定波長:560nm）した。

上記検討結果からBSF217に含まれる中性糖はグルコー
ス：マンノース：ガラクトースが2:1:1の割合で存在し
ていることが判明した。またエマルサンには存在しない
マンノースを見いだしたこともまた本物質との明らかな
相違点の一つである。これらの分析結果を要約すると、
BSF217は中性糖を基準骨格とし、それにウロン酸、アミ
ノ酸、タンパク質等が結合した多糖高分子であり、BSF2
17の構成は、中性糖が約70％、ウロン酸が約13％、アミ
ノ糖が約１％、で残りが蛋白質と結論できる。なお、ウ
ロン酸は、グルクロン酸（約70％）とガラクチュロン酸
（約30％）であり、アミノ糖はその99％以上がグルコサ
ミンであることを確認した。

実施例３１）BSF217の分子量の測定実施例２により得た試料BSF217を用いて分子量を測定
した。

分子量の測定には高速液体ゲルクロマトグラフィー
（日立製作所製635A型）を用い、カラムはPW6000_XL、PW
3000_XL（東ソー（株））、展開溶剤は0.1Mリン酸緩衝液
（pH6.8）、標準物質にはポリエチレンオキシドを使用
した。

その結果、BSF277の分子量は約320万であった。

尚、エマルサンの分子量を同様にして求めたところ約
250万であった。

２）217株のBSF生産性下に示した培地、培養条件により培地１あたり10.3
gのBSFを回収した。尚、同様にしてRAG−１菌株を培養
した場合は、エマルサンを5.3g/l回収した。

（培地、培養条件）リン酸二カリウム0.75％、リン酸−カリウム0.23％、
硫安0.08％：硫酸マグネシウム（７水塩）0.07％、酵母
エキス（オリエンタル酵母（株）製）0.1％を含む培地
（pH7.15）500mlを2l容の坂口フラスコで滅菌し、別滅
菌したグルコースとシェークロースを各々１％、３％に
なるように添加したものに、前培養した本菌の種菌を無
菌的に植菌し、30℃で３日間振盪培養した。

（試料調製法）３日後、培養液を中和したのち100℃30分で熱処理を
加え、遠心分離で菌体を分離した。分離した上清を濃縮
後、透析を行い低分子物質除去溶液にエタノールを加
え、４℃で放置したのちBSFの沈澱試料BSF217Eを回収し
た。

上記にて述べたように、本発明の菌株は、対照のRAG
−１菌株と比べて高い産生能を有する。

BSF217Eの分析上記のようにして得た試料BSF217Eを水抽出し、水溶
性画分と不溶性画分とに分け、それぞれ水溶性画分は35
％、不溶性画分は65％を占めた。これらの糖、タンパク
質の定量結果からBSF217Eは中性糖を主成分としウロン
酸やアミノ糖からなる構造を持ち、これにタンパク質が
結合した多糖構造物である。次に、これら画分の分析結
果を示す。

糖の総量ウロン酸タンパク質水溶性画分 665 131 100 不溶性画分＊ 280 62 500 単位はμg/mg 尚、両者とも約１％のアミノ糖を含む。

＊試料調製法において加えたエタノールによって変性、不溶化した、主に蛋白質が多糖類をとり込んで沈殿したものと推定される。

実施例４実施例３で得たBSF217E（又は、実施例２で得たBSF21
7）とエマルサンとの性能を比較した。結果を次に示
す。

乳化力測定試料の0.5重量％水溶液10mlと、流動パラフィン10ml
を目盛付き試験管で激しく振り、室温静置後（15分、30
分、60分後）水層の体積を読み取り、次に式にしたがっ
て乳化力を求めた。

（10−水層の体積）/10×100（％）結果を第四表に示す。

溶剤に対する溶解度 BSF217は、水に可溶でエタノール、エーテル、及びア
セトン等には不溶である。

粘度 25℃、0.5重量％水溶液、30rpmの回転数の条件で、Ｂ
型粘度計で測定した。

BSF217E 10cps BSF217 15cps エマルサン 20cps 表面張力試料の0.5重量％水溶液を、室温で吊板法で測定し
た。

BSF217E 72dyne/cm BSF217 65dyne/cm エマルサン 53dyne/cm

【図面の簡単な説明】

第１図は本発明に係る新規微生物であるアシネトバクタ
ー・カルコアセティカス217株の形態を示す光学顕微鏡
写真である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 21/00 Ｃ１２Ｒ 1:01） (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C11D 1/00 B01F 17/56 C12N 1/20 C12P 21/00 ＣＡ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】下記の特徴を有する微生物由来の高分子界
面活性剤。（ｉ）中性糖、ウロン酸、アミノ糖、蛋白質が構成成分
として結合して成る分子量100万〜500万の高分子であ
り、（ii）該中性糖は、高分子中に60〜85wt％の比率で存在
し、（iii）かつ、該中性糖は、グルコース：マンノース：
ガラクトースを100:（30〜100）：（40〜150）の重量比
で含み、（iv）該ウロン酸は、高分子中に７〜25wt％の比率で存
在し、（ｖ）かつ、該ウロン酸は、グルクロン酸：ガラクチュ
ロン酸を100:（60〜20）の重量比で含み、（vi）アミノ糖および蛋白質が残部を構成し、（vii）流動パラフィンの乳化力は40〜60％である。
【請求項２】リトマスを還元し、オキシダーゼに対して
陰性を示し、寒天培地培養で薄茶色の着色物質を産生
し、硝酸塩還元能及び脱窒素能を有し、かつ請求項１記
載の高分子界面活性剤を産生することを特徴とするアシ
ネトバクター・カルコアセティカス。