JP2905595B2 - リウマチ因子の検出用の混合免疫グロブリン - Google Patents
リウマチ因子の検出用の混合免疫グロブリンInfo
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- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
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Description
【発明の詳細な説明】 技術分野 本発明の分野はリウマチ因子の検出である。
背景 リウマチ因子は、IgG免疫グロブリンの結晶性断片（F
c）上の不均質の決定基に結合する抗グロブリン抗体で
あり、そしてほとんどの慢性関節リウマチ患者の血清お
よび滑液中に認められる。慢性関節リウマチの病原論に
おけるリウマチ因子の役割は、それらが様々な他の慢性
病患者においても存在しその存在が非特異的であること
を示唆するので、疑問である。しかしながら、リウマチ
因子の結合特異性は多様であり、ヒトIgG上のアロタイ
プ抗原（Gm）、免疫複合体の形成によりIgG内で造成さ
れる新抗原、および他の哺乳類IgG免疫グロブリンと共
有する交差反応性抗原を包含する。
c）上の不均質の決定基に結合する抗グロブリン抗体で
あり、そしてほとんどの慢性関節リウマチ患者の血清お
よび滑液中に認められる。慢性関節リウマチの病原論に
おけるリウマチ因子の役割は、それらが様々な他の慢性
病患者においても存在しその存在が非特異的であること
を示唆するので、疑問である。しかしながら、リウマチ
因子の結合特異性は多様であり、ヒトIgG上のアロタイ
プ抗原（Gm）、免疫複合体の形成によりIgG内で造成さ
れる新抗原、および他の哺乳類IgG免疫グロブリンと共
有する交差反応性抗原を包含する。
同種抗原に結合するリウマチ因子は輸血や妊娠の結果
として生じ得るが、それらが自己の決定基に結合しない
限り、それらは真の自己抗体ではない。新抗原に結合す
るリウマチ因子もまた、免疫複合体中に形成される新規
決定基に対して向けられるので真の自己抗体ではない。
対照的に、リウマチ血清において、自己反応性リウマチ
因子特異性Ga′の存在が証明されている。
として生じ得るが、それらが自己の決定基に結合しない
限り、それらは真の自己抗体ではない。新抗原に結合す
るリウマチ因子もまた、免疫複合体中に形成される新規
決定基に対して向けられるので真の自己抗体ではない。
対照的に、リウマチ血清において、自己反応性リウマチ
因子特異性Ga′の存在が証明されている。
慢性関節リウマチ患者からの循環している免疫複合体
中の自己反応性リウマチ因子の存在は、それらの自己抗
体に対する潜在的な病原的役割を暗示する。しかしなが
ら、リウマチ因子を検出するための現在使用されている
方法は、自己反応性抗体の存在のみを同定するものでは
ない。更に、病気に関連するリウマチ因子自己抗体を測
定する技術は、複雑すぎて慢性関節リウマチに対するそ
れらの特異性を評価することが不可能である。従って、
慢性関節リウマチに有意な特異性を有する技術を開発で
きることは非常に興味深い。
中の自己反応性リウマチ因子の存在は、それらの自己抗
体に対する潜在的な病原的役割を暗示する。しかしなが
ら、リウマチ因子を検出するための現在使用されている
方法は、自己反応性抗体の存在のみを同定するものでは
ない。更に、病気に関連するリウマチ因子自己抗体を測
定する技術は、複雑すぎて慢性関節リウマチに対するそ
れらの特異性を評価することが不可能である。従って、
慢性関節リウマチに有意な特異性を有する技術を開発で
きることは非常に興味深い。
関連文献 リウマチ様関節炎を有する患者の滑液組織から単離さ
れた、多数の哺乳類IgG免疫グロブリンと結合するモノ
クローナル抗体hRF−１がWeisbartら、J.Immunol.1987;
139:2925−2928により記載されている。リウマチ血清中
の自己反応性リウマチ因子特異性Gaの存在は、Allenお
よびKunkel,Arth.Rheumatism 1966;9:758−768により報
告されている。リウマチ因子の一般的記載は、Waller.A
cta Pathl.Microbiol.Scand.1940;17:172−188;Rose
ら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1948;68:1−６およびNatvi
gら、Clin.Exp.Immunol.1972;12:177−183において見つ
けることができる。Cohenら、J.Immunology 1987;139:1
466は、IgG RFがRA患者におけるIgG4抗体優勢を示すこ
とを報告している。Carsen,“Rheumatoid Factor"Textb
ook of Rheumatology（Kellyら編）W.B.Saunders Co.,P
hiladelphia,PA,1981,685頁；並びにPopeおよびMcDuff
y,J.Lab.Clin.Med.1981;97:842−853は、異種哺乳類IgG
へのRA血清中のRFの結合を論じている。後者の文献は、
ウマIgGが慢性関節リウマチ患者の血清中のRFを検出す
るためのより高感度のアッセイを提供することも報告し
ている。ButlerおよびVaughanはImmunology 1965;8:144
−159において動物のガンマグロブリンとリウマチ因子
との反応を記載している。
れた、多数の哺乳類IgG免疫グロブリンと結合するモノ
クローナル抗体hRF−１がWeisbartら、J.Immunol.1987;
139:2925−2928により記載されている。リウマチ血清中
の自己反応性リウマチ因子特異性Gaの存在は、Allenお
よびKunkel,Arth.Rheumatism 1966;9:758−768により報
告されている。リウマチ因子の一般的記載は、Waller.A
cta Pathl.Microbiol.Scand.1940;17:172−188;Rose
ら、Proc.Soc.Exp.Biol.Med.1948;68:1−６およびNatvi
gら、Clin.Exp.Immunol.1972;12:177−183において見つ
けることができる。Cohenら、J.Immunology 1987;139:1
466は、IgG RFがRA患者におけるIgG4抗体優勢を示すこ
とを報告している。Carsen,“Rheumatoid Factor"Textb
ook of Rheumatology（Kellyら編）W.B.Saunders Co.,P
hiladelphia,PA,1981,685頁；並びにPopeおよびMcDuff
y,J.Lab.Clin.Med.1981;97:842−853は、異種哺乳類IgG
へのRA血清中のRFの結合を論じている。後者の文献は、
ウマIgGが慢性関節リウマチ患者の血清中のRFを検出す
るためのより高感度のアッセイを提供することも報告し
ている。ButlerおよびVaughanはImmunology 1965;8:144
−159において動物のガンマグロブリンとリウマチ因子
との反応を記載している。
発明の要約 リウマチ因子に対するリガンドとしてヒトIgGおおび
ヒツジIgGを使用するサンドイッチアッセイにおいてリ
ウマチ因子をアッセイする。特に、活性疾患を有する慢
性関節リウマチ患者と関係づけられるリウマチ因子の検
出にELISAを使用する。
ヒツジIgGを使用するサンドイッチアッセイにおいてリ
ウマチ因子をアッセイする。特に、活性疾患を有する慢
性関節リウマチ患者と関係づけられるリウマチ因子の検
出にELISAを使用する。
特定の実施態様の記載 特に活性形態の疾患を有するヒト患者におけるリウマ
チ因子の検出のための改良された感受性アッセイが提供
される。この方法は、ヒトIgGとヒツジ様IgG特にはヒツ
ジIgGとの間に架橋を提供するヒト血清中の成分の存在
の検出を提供する。前記IgGリガンドのうちの一方が固
体支持体に結合されており、そして他方のリガンドが溶
液中遊離状態であるように用意することにより、特に支
持体に結合しているヒツジIgGを用意することにより、
感受性アッセイが達成される。特に、該アッセイは偽陽
性を有する発生率が低く、一方で活性形態の慢性関節リ
ウマチと陽性結果との間に高い相関関係がある。
チ因子の検出のための改良された感受性アッセイが提供
される。この方法は、ヒトIgGとヒツジ様IgG特にはヒツ
ジIgGとの間に架橋を提供するヒト血清中の成分の存在
の検出を提供する。前記IgGリガンドのうちの一方が固
体支持体に結合されており、そして他方のリガンドが溶
液中遊離状態であるように用意することにより、特に支
持体に結合しているヒツジIgGを用意することにより、
感受性アッセイが達成される。特に、該アッセイは偽陽
性を有する発生率が低く、一方で活性形態の慢性関節リ
ウマチと陽性結果との間に高い相関関係がある。
ヒツジ様IgGはいずれの便利な源から入手してもよ
く、市販されている。哺乳類の血液からIgGを単離する
常法は文献中に詳細に記載されている。ヒツジ様IgG
は、例えばOrganon Teknika,West Chester.PAから入手
することができる。ヒトIgGは任意の便利な手段によ
り、商業源からまたはIgG単離の常法を使うことにより
得ることができる。
く、市販されている。哺乳類の血液からIgGを単離する
常法は文献中に詳細に記載されている。ヒツジ様IgG
は、例えばOrganon Teknika,West Chester.PAから入手
することができる。ヒトIgGは任意の便利な手段によ
り、商業源からまたはIgG単離の常法を使うことにより
得ることができる。
試料として使用する血清は、少なくとも1:20、より普
通には少なくとも約1:80であって少なくとも1:100であ
ってもよい希釈度で単に希釈されるだろう。望ましく
は、陽性結果のカットオフは少なくとも約1:100、また
は少なくとも約1:150の希釈度においてであろう。
通には少なくとも約1:80であって少なくとも1:100であ
ってもよい希釈度で単に希釈されるだろう。望ましく
は、陽性結果のカットオフは少なくとも約1:100、また
は少なくとも約1:150の希釈度においてであろう。
非結合形のリガンドIgGは、検出可能なシグナルに備
える標識で直接的にまたは間接的のいずれかで標識され
るだろう。種々様々な標識、例えば酵素、放射性同位
体、蛍光団、化学発光団、粒子当が既知である。それら
の標識は、IgGリガンドまたはIgGリガンドに結合するで
あろう別の分子に共有結合により結合され得る。例え
ば、非結合形のIgGはビオチンのような小分子、および
ストレプトアビジンまたはアビジン（以後アビジンと称
する）に結合した検出可能な標識と接合することができ
る。試料を２つの異なるIgGリガンドと混合し、次いで
標識アビジンを添加する２段階アッセイを行うことによ
り、支持体へのヒトまたはヒツジIgGリガンドの特異的
結合の存在を決定することができる。
える標識で直接的にまたは間接的のいずれかで標識され
るだろう。種々様々な標識、例えば酵素、放射性同位
体、蛍光団、化学発光団、粒子当が既知である。それら
の標識は、IgGリガンドまたはIgGリガンドに結合するで
あろう別の分子に共有結合により結合され得る。例え
ば、非結合形のIgGはビオチンのような小分子、および
ストレプトアビジンまたはアビジン（以後アビジンと称
する）に結合した検出可能な標識と接合することができ
る。試料を２つの異なるIgGリガンドと混合し、次いで
標識アビジンを添加する２段階アッセイを行うことによ
り、支持体へのヒトまたはヒツジIgGリガンドの特異的
結合の存在を決定することができる。
該アッセイは、サンドイッチアッセイのような任意の
便利な形態で実施することができる。即ち、結合形リガ
ンドは表面（これは容器の壁であることができる）、例
えばミクロタイタープレートウエル、ビーズ、例えば同
一孔ガラスビーズ、パイレックスビーズ等、毛完壁など
に共有的または非共有的に結合させることができる。タ
ンパク質を表面に結合させる方法は周知であり、本明細
書に記載する必要はない。表面は、該表面上の官能基と
タンパク質との間で共有結合反応が起こるような活性表
面であることができ、または特に加熱後にタンパク質が
非特異的に結合しそしてアッセイの過程中保持されるよ
うな表面であることができる。タンパク質に結合するで
あろう官能基を有する様々な活性化表面が利用可能であ
る。官能基としては、活性化カルボキシル基、イミノ
基、アルデヒド基等が挙げられる。
便利な形態で実施することができる。即ち、結合形リガ
ンドは表面（これは容器の壁であることができる）、例
えばミクロタイタープレートウエル、ビーズ、例えば同
一孔ガラスビーズ、パイレックスビーズ等、毛完壁など
に共有的または非共有的に結合させることができる。タ
ンパク質を表面に結合させる方法は周知であり、本明細
書に記載する必要はない。表面は、該表面上の官能基と
タンパク質との間で共有結合反応が起こるような活性表
面であることができ、または特に加熱後にタンパク質が
非特異的に結合しそしてアッセイの過程中保持されるよ
うな表面であることができる。タンパク質に結合するで
あろう官能基を有する様々な活性化表面が利用可能であ
る。官能基としては、活性化カルボキシル基、イミノ
基、アルデヒド基等が挙げられる。
着目の特異的標識としては、酵素、例えばヒドロラー
ゼおよびオキシドレダクターゼ、例えばアルカリホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリセリル−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ウリカー
ゼ、キサンチンオキシダーゼ等が挙げられる。使用する
ことができる蛍光団としては、藻類色素タンパク質、フ
ルオレセイン、ダンシル、ローダミン、ブムベリフェロ
ン等が挙げられる。
ゼおよびオキシドレダクターゼ、例えばアルカリホスフ
ァターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グリセリル−３−リ
ン酸デヒドロゲナーゼ、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、グ
ルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、西洋ワサビペ
ルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、ウリカー
ゼ、キサンチンオキシダーゼ等が挙げられる。使用する
ことができる蛍光団としては、藻類色素タンパク質、フ
ルオレセイン、ダンシル、ローダミン、ブムベリフェロ
ン等が挙げられる。
アッセイを行う際、試料は支持体に結合されたIgGリ
ガンドと接触される。血液試料は前処理、例えば血清も
しくは血漿を用意するための赤血球の除去、クエン酸処
理、特に緩衝液での希釈等を行うことができる。通常、
血清は偽陽性が実質的に無であることを保証する適当な
カットオフ値を与えるように希釈されるだろう。
ガンドと接触される。血液試料は前処理、例えば血清も
しくは血漿を用意するための赤血球の除去、クエン酸処
理、特に緩衝液での希釈等を行うことができる。通常、
血清は偽陽性が実質的に無であることを保証する適当な
カットオフ値を与えるように希釈されるだろう。
様々な緩衝液を使用することができ、それはアッセイ
と適合できるように選択される。緩衝剤としては、Tri
s、MOPS、HEPES、リン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩等が挙げ
られる。特定の緩衝液は本来任意選択できるが、特定の
標識に関係する特定のアッセイプロトコールにおいて或
る緩衝液が他のものに比べて好ましいことがあるけれど
も、特定の緩衝液は主として自由選択されるだろう。一
般に、緩衝液濃度は約10〜400mMの範囲であり、そしてp
Hは普通約５〜11、より普通には約６〜10の範囲であろ
う。非特異的結合を減らすために他の成分、例えば、不
活性タンパク質、例えばウシ血清アルブミンまたはオボ
アルブミンを含めることができ、追加のタンパク質は通
常約２％以下で存在するだろう。
と適合できるように選択される。緩衝剤としては、Tri
s、MOPS、HEPES、リン酸塩、ホウ酸塩、炭酸塩等が挙げ
られる。特定の緩衝液は本来任意選択できるが、特定の
標識に関係する特定のアッセイプロトコールにおいて或
る緩衝液が他のものに比べて好ましいことがあるけれど
も、特定の緩衝液は主として自由選択されるだろう。一
般に、緩衝液濃度は約10〜400mMの範囲であり、そしてp
Hは普通約５〜11、より普通には約６〜10の範囲であろ
う。非特異的結合を減らすために他の成分、例えば、不
活性タンパク質、例えばウシ血清アルブミンまたはオボ
アルブミンを含めることができ、追加のタンパク質は通
常約２％以下で存在するだろう。
試料と非結合形IgGリガンドの添加の順序は重要でな
いが、好ましくは試料と標識IgGリガンドが同時に結合
形IgGリガンドに添加される。次いでアッセイ混合物は
少なくとも30分間、好ましくは少なくとも１時間、より
好ましくは少なくとも約６時間インキュベートされ、標
識IgGリガンドが検出可能な標識を有するかまたは検出
可能な標識の結合を必要とするかに応じて、適宜に決定
される。血清中のRFの利用可能な部位の飽和までの最適
結合を保証するために、実質的に過剰な標識リガンドを
使用することができる。
いが、好ましくは試料と標識IgGリガンドが同時に結合
形IgGリガンドに添加される。次いでアッセイ混合物は
少なくとも30分間、好ましくは少なくとも１時間、より
好ましくは少なくとも約６時間インキュベートされ、標
識IgGリガンドが検出可能な標識を有するかまたは検出
可能な標識の結合を必要とするかに応じて、適宜に決定
される。血清中のRFの利用可能な部位の飽和までの最適
結合を保証するために、実質的に過剰な標識リガンドを
使用することができる。
インキュベーション後、上清を除去し、緩衝溶液、例
えば試料を希釈するのに使用した緩衝液で表面を徹底的
に洗浄し、そして適当な時、特異的に結合した標識の存
在を検出する。標識がIgGリガンドに結合している場
合、直接読み取ることができる標識、例えば放射性同位
体または蛍光物質を測定することができる。検出可能な
標識物、例えば標識アビジンが必要とされる場合、表面
上に存在する相補的特異的結合メンバーのいずれかへの
完全な結合を保証するように標識物が添加される。適当
な時、該標識を直接的にまたは酵素を使って検出し、基
質を添加し、そして検出可能な分子の存在を測定するこ
とができる。大部分については、酵素基質は、着色色素
または蛍光物質を生じるロイコ色素を含むだろう。
えば試料を希釈するのに使用した緩衝液で表面を徹底的
に洗浄し、そして適当な時、特異的に結合した標識の存
在を検出する。標識がIgGリガンドに結合している場
合、直接読み取ることができる標識、例えば放射性同位
体または蛍光物質を測定することができる。検出可能な
標識物、例えば標識アビジンが必要とされる場合、表面
上に存在する相補的特異的結合メンバーのいずれかへの
完全な結合を保証するように標識物が添加される。適当
な時、該標識を直接的にまたは酵素を使って検出し、基
質を添加し、そして検出可能な分子の存在を測定するこ
とができる。大部分については、酵素基質は、着色色素
または蛍光物質を生じるロイコ色素を含むだろう。
当該方法論は容易に自動化することができ、この場
合、添加、インキュベーション等を制御し、洗浄を提供
しそして結果を読み取ることができる。
合、添加、インキュベーション等を制御し、洗浄を提供
しそして結果を読み取ることができる。
当該試薬は便利にはキットとして提供することがで
き、キットには、表面結合形IgGリガンド、単独でまた
は標識された特異的結合性分子と組み合わされた標識リ
ガンドが、当該アッセイにおいて使用するのに適当な量
で提供される。便利には、酵素標識については、基質を
含めることができ、他の試薬、例えば緩衝液、不活性タ
ンパク質、例えばオボアルブミン等も含めることができ
る。
き、キットには、表面結合形IgGリガンド、単独でまた
は標識された特異的結合性分子と組み合わされた標識リ
ガンドが、当該アッセイにおいて使用するのに適当な量
で提供される。便利には、酵素標識については、基質を
含めることができ、他の試薬、例えば緩衝液、不活性タ
ンパク質、例えばオボアルブミン等も含めることができ
る。
次の実施例は例示目的で提供され、限定のためではな
い。
い。
実験 A.リウマチ因子アッセイ 96ウエルのミクロタイタープレートを精製ヒツジIgG
でコーティングした。0.06M炭酸塩緩衝液,pH 9.6中のIg
G（10μg/ml）を96ウエルプレート中で４℃にて一晩イ
ンキュベートした。血清を1:160の希釈度でアッセイ
し、NHS−LC−BIOTIN（Pierce,Rockford,IL）を使って
ビオチニル化されたヒトIgGを用いてIgGリウマチ因子を
検出した。インキュベーション溶液は0.625μｇのビオ
チニル化ヒトIgGを含んだ。インキュベーション後、過
剰の西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジ
ン（0.1μg/ml,100μｌ）を添加し、プレートをPBSTで
洗浄し、そして2,2′−アジノ−ジ−1,3−エチルベンズ
チアゾリンスルホネートから414nmに最大光学濃度（吸
光度）を有する発色団への変換をモニタリングした。各
アッセイにおいてオボアルブミンのみでコーティングさ
れたプレートへの結合を測定することにより、負の対照
を含めた。慢性関節リウマチ患者からの既知の陽性血清
を各アッセイにおいて正の対照として使用し、結果を正
の対照の百分率として表した。
でコーティングした。0.06M炭酸塩緩衝液,pH 9.6中のIg
G（10μg/ml）を96ウエルプレート中で４℃にて一晩イ
ンキュベートした。血清を1:160の希釈度でアッセイ
し、NHS−LC−BIOTIN（Pierce,Rockford,IL）を使って
ビオチニル化されたヒトIgGを用いてIgGリウマチ因子を
検出した。インキュベーション溶液は0.625μｇのビオ
チニル化ヒトIgGを含んだ。インキュベーション後、過
剰の西洋ワサビペルオキシダーゼ接合ストレプトアビジ
ン（0.1μg/ml,100μｌ）を添加し、プレートをPBSTで
洗浄し、そして2,2′−アジノ−ジ−1,3−エチルベンズ
チアゾリンスルホネートから414nmに最大光学濃度（吸
光度）を有する発色団への変換をモニタリングした。各
アッセイにおいてオボアルブミンのみでコーティングさ
れたプレートへの結合を測定することにより、負の対照
を含めた。慢性関節リウマチ患者からの既知の陽性血清
を各アッセイにおいて正の対照として使用し、結果を正
の対照の百分率として表した。
704人の被験者の血清を、自己由来結合および／また
はヒトIgGとヒツジIgGへの同時結合を有するリウマチ因
子についてアッセイした。PBS（リン酸塩緩衝化塩溶
液）中のオボアルブミンで1:100希釈したヒト血清を添
加した。
はヒトIgGとヒツジIgGへの同時結合を有するリウマチ因
子についてアッセイした。PBS（リン酸塩緩衝化塩溶
液）中のオボアルブミンで1:100希釈したヒト血清を添
加した。
実験材料および方法 実験材料 American Rheuatism Association（Arnettら、Arth.R
heumatism 1988;31:315−324）の修正基準により定義さ
れた典型的慢性関節リウマチを有する108人を含む、704
人の患者から血清を得た。全身性紅斑性狼瘡を有する19
0人、進行性全身性硬化症を有する31人、多発性筋炎を
有する３人、側頭動脈炎を有する４人および結節性多発
性動脈炎を有する３人を含む、慢性関節リウマチ以外の
結合組織疾患を有する231人の患者を実験した。また、
非リウマチ性疾患を有する317人の入院患者からの血清
に加えて、48人の健康個体からの血清に関しても実験を
行った。アッセイまで−20℃で血清を保存した。
heumatism 1988;31:315−324）の修正基準により定義さ
れた典型的慢性関節リウマチを有する108人を含む、704
人の患者から血清を得た。全身性紅斑性狼瘡を有する19
0人、進行性全身性硬化症を有する31人、多発性筋炎を
有する３人、側頭動脈炎を有する４人および結節性多発
性動脈炎を有する３人を含む、慢性関節リウマチ以外の
結合組織疾患を有する231人の患者を実験した。また、
非リウマチ性疾患を有する317人の入院患者からの血清
に加えて、48人の健康個体からの血清に関しても実験を
行った。アッセイまで−20℃で血清を保存した。
リウマチ因子と慢性関節リウマチとの関係を評価する
ため試実験を行った。40人の患者において血清の獲得時
に医者により慢性関節リウマチ病活性を評価した。病気
活性の指数は、腫大または敏感性関節の数、患者の痛み
の主観的評価、および朝のこわばりの持続期間の定量的
評価に基づいた。各パラメーターに０（不活性）〜５
（最も活性）の数値を与え、そして３つの値の合計とし
て活性指数を記録した。病気活性の追加の客観的尺度と
して、それら患者のうちの23人においてヴェステルグレ
ン赤血球沈降速度を得た。
ため試実験を行った。40人の患者において血清の獲得時
に医者により慢性関節リウマチ病活性を評価した。病気
活性の指数は、腫大または敏感性関節の数、患者の痛み
の主観的評価、および朝のこわばりの持続期間の定量的
評価に基づいた。各パラメーターに０（不活性）〜５
（最も活性）の数値を与え、そして３つの値の合計とし
て活性指数を記録した。病気活性の追加の客観的尺度と
して、それら患者のうちの23人においてヴェステルグレ
ン赤血球沈降速度を得た。
ラテックス粒子の凝集により測定されるリウマチ因子 熱凝集形ヒトIgGがコーティングされたラテックスビ
ーズの凝集によりリウマチ因子について全ての血清をア
ッセイした（RF試験,Difco,Detroit,MI）。1:20で始ま
る、倍々系列希釈において血清をアッセイし、1:160ま
たはそれ以上の力価を有するものとして陽性試験を希釈
した。1:160の力価を選択することにより、非−慢性関
節リウマチ患者において一層頻繁に起こる低力価応答を
除外した。更に、1:160またはそれ以上の力価では、非
−慢性関節リウマチ患者における陽性リウマチ因子試験
は慢性関節リウマチ患者において認められるものに匹敵
した。
ーズの凝集によりリウマチ因子について全ての血清をア
ッセイした（RF試験,Difco,Detroit,MI）。1:20で始ま
る、倍々系列希釈において血清をアッセイし、1:160ま
たはそれ以上の力価を有するものとして陽性試験を希釈
した。1:160の力価を選択することにより、非−慢性関
節リウマチ患者において一層頻繁に起こる低力価応答を
除外した。更に、1:160またはそれ以上の力価では、非
−慢性関節リウマチ患者における陽性リウマチ因子試験
は慢性関節リウマチ患者において認められるものに匹敵
した。
ELISAにより測定されるリウマチ因子 ラテックス粒子を凝集した血清を、10μg/mlの未変性
のヒトIgG、63℃に30分間加熱することにより凝集した
ヒトIgG、並びにヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス、モル
モットおよびヤギIgGを含む精製哺乳類IgG免疫グロブリ
ンにより４℃にて一晩コーティングした96ウエルのミク
ロタイタープレートを使ったELISAによってもアッセイ
した。該プレートを0.05％ Tween−２を含むリン酸塩緩
衝化塩溶液（PBST）で３回洗浄し、そして１％オボアル
ブミンで1:100希釈したヒト血清（0.1ml）をウエル中で
４℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSTで洗浄
し、そしてヒトIgG Fcに特異的なアフィニティー精製し
たアルカリホルファターゼ接合ヤギ抗体を添加し、室温
で１時間インキュベートした。予備試験は、使用した接
合抗血清がリウマチ因子アッセイを競合的に阻害しない
ことを示した。該ウエルをPBSTで洗浄した後、ｐ−ニト
ロフェニルホスフェートからｐ−ニトロフェノールへの
変換による405nmでの吸光度により、アルカリホスファ
ターゼを測定した。
のヒトIgG、63℃に30分間加熱することにより凝集した
ヒトIgG、並びにヒツジ、ウマ、ウサギ、マウス、モル
モットおよびヤギIgGを含む精製哺乳類IgG免疫グロブリ
ンにより４℃にて一晩コーティングした96ウエルのミク
ロタイタープレートを使ったELISAによってもアッセイ
した。該プレートを0.05％ Tween−２を含むリン酸塩緩
衝化塩溶液（PBST）で３回洗浄し、そして１％オボアル
ブミンで1:100希釈したヒト血清（0.1ml）をウエル中で
４℃で一晩インキュベートした。プレートをPBSTで洗浄
し、そしてヒトIgG Fcに特異的なアフィニティー精製し
たアルカリホルファターゼ接合ヤギ抗体を添加し、室温
で１時間インキュベートした。予備試験は、使用した接
合抗血清がリウマチ因子アッセイを競合的に阻害しない
ことを示した。該ウエルをPBSTで洗浄した後、ｐ−ニト
ロフェニルホスフェートからｐ−ニトロフェノールへの
変換による405nmでの吸光度により、アルカリホスファ
ターゼを測定した。
統計的分析 バッチ内およびバッチ間比較によりリウマチ因子につ
いての二重結合試験の精度を評価し、そして変動係数Ｖ
〔ここでＶ＝標準偏差（σ）／平均（μ）〕として表し
た。
いての二重結合試験の精度を評価し、そして変動係数Ｖ
〔ここでＶ＝標準偏差（σ）／平均（μ）〕として表し
た。
結果 ラテックス粒子の凝集により測定されるリウマチ因子 血清を1:20で始まる倍々系列希釈においてアッセイし
た。慢性関節リウマチを有するかまたは有しない患者に
おいて同等なレベルのリウマチ因子を有する血清を比較
するために、1:160の血清希釈度を陽性試験として包含
するために選択した。1:160の希釈度では、慢性関節リ
ウマチを有する患者の41/108人（38.0％）の血清が、Ig
Gがコーティングされたラテックス粒子を凝集した。対
比して、他の結合組織疾患、主として全身性紅斑性狼瘡
を有する患者の14/231人（6.1％）、および非リウマチ
性疾患を有する患者の19/317人（6.0％）が陽性リウマ
チ因子試験を有した（全陽性試験＝33/548;6.0％）。慢
性関節リウマチ患者および非−慢性関節リウマチ患者に
おける陽性反応のメジアン力価は1:320であった。従っ
て、ラテックス凝集試験は、血清を1:160またはそれ以
上の希釈度においてアッセイした時、慢性関節リウマチ
に38.0％感受性および94.0％特異的であった。
た。慢性関節リウマチを有するかまたは有しない患者に
おいて同等なレベルのリウマチ因子を有する血清を比較
するために、1:160の血清希釈度を陽性試験として包含
するために選択した。1:160の希釈度では、慢性関節リ
ウマチを有する患者の41/108人（38.0％）の血清が、Ig
Gがコーティングされたラテックス粒子を凝集した。対
比して、他の結合組織疾患、主として全身性紅斑性狼瘡
を有する患者の14/231人（6.1％）、および非リウマチ
性疾患を有する患者の19/317人（6.0％）が陽性リウマ
チ因子試験を有した（全陽性試験＝33/548;6.0％）。慢
性関節リウマチ患者および非−慢性関節リウマチ患者に
おける陽性反応のメジアン力価は1:320であった。従っ
て、ラテックス凝集試験は、血清を1:160またはそれ以
上の希釈度においてアッセイした時、慢性関節リウマチ
に38.0％感受性および94.0％特異的であった。
ヒトIgGとヒツジIgGを架橋する、ELISAにより測定され
るリウマチ因子 ヒトIgGとヒツジIgGを架橋するリウマチ因子を704人
の被験者からの血清においてアッセイした。陽性試験
は、標準的正の対照の28％より大きい結合として定義し
た。というのは、28％は慢性関節リウマチを持たない患
者548人の対照グループの平均応答よりも2 S.D.上に相
当するからである。架橋アッセイの結果は、それがラテ
ックス凝集試験（41/108,38.0％）と同等の感度（39.10
8,36.1％）であることを示した。ラテックス凝集試験と
は異なり、非リウマチ性疾患を有する患者のわずか2/31
7人（0.6％）、慢性関節リウマチ以外のリウマチ性疾患
を有する患者の3/231人（1.3％）、および健康な個体の
0/48人において陽性試験が起こったため、ヒトIgGとヒ
ツジIgGの架橋はかなり特異的であった。慢性関節リウ
マチを持たない被験者におけ陽性試験の総数は5/596、
即ちわずか0.8％であった。従って、ヒトIgGとヒツジIg
Gを架橋するリウマチ因子についてのこのELISAは、ラテ
ックス凝集試験での94.0％に比べて、99.2％慢性関節リ
ウマチに特異的であった（X2＝24.2,p＜0.001）。慢性
関節リウマチについての1.0％の有病率に基づいて、1:1
60希釈された血清についてのラテックス凝集試験の陽性
予想値は、ヒトIgGとヒツジIgGを架橋するリウマチ因子
についての31.3％に比べて6.0％である。架橋アッセイ
は、1:160より低いラテックス凝集力価を有する非−慢
性関節リウマチ患者のいずれにおいても陽性でなかっ
た。
るリウマチ因子 ヒトIgGとヒツジIgGを架橋するリウマチ因子を704人
の被験者からの血清においてアッセイした。陽性試験
は、標準的正の対照の28％より大きい結合として定義し
た。というのは、28％は慢性関節リウマチを持たない患
者548人の対照グループの平均応答よりも2 S.D.上に相
当するからである。架橋アッセイの結果は、それがラテ
ックス凝集試験（41/108,38.0％）と同等の感度（39.10
8,36.1％）であることを示した。ラテックス凝集試験と
は異なり、非リウマチ性疾患を有する患者のわずか2/31
7人（0.6％）、慢性関節リウマチ以外のリウマチ性疾患
を有する患者の3/231人（1.3％）、および健康な個体の
0/48人において陽性試験が起こったため、ヒトIgGとヒ
ツジIgGの架橋はかなり特異的であった。慢性関節リウ
マチを持たない被験者におけ陽性試験の総数は5/596、
即ちわずか0.8％であった。従って、ヒトIgGとヒツジIg
Gを架橋するリウマチ因子についてのこのELISAは、ラテ
ックス凝集試験での94.0％に比べて、99.2％慢性関節リ
ウマチに特異的であった（X2＝24.2,p＜0.001）。慢性
関節リウマチについての1.0％の有病率に基づいて、1:1
60希釈された血清についてのラテックス凝集試験の陽性
予想値は、ヒトIgGとヒツジIgGを架橋するリウマチ因子
についての31.3％に比べて6.0％である。架橋アッセイ
は、1:160より低いラテックス凝集力価を有する非−慢
性関節リウマチ患者のいずれにおいても陽性でなかっ
た。
リウマチ疾患を持たない患者におけるリウマチ因子 ラテックス凝集で陽性のリウマチ因子を有し且つ慢性
関節リウマチ患者と同等である力価を有する非−慢性関
節リウマチ患者の19/317人の血清を、ELISAによりIgMリ
ウマチ因子についてアッセイした。それらの患者の多く
（7/19人）は肝疾患を有した。熱凝集形のヒトIgG、未
変性のヒツジIgGおよびヒツジIgGへのそれらの結合、並
びにヒツジIgGとヒトIgGへの同時結合を比較することに
より、リウマチ因子の結合特異性を特徴づけた。ELISA
によりアッセイした時、18/19人の患者の血清がヒト熱
凝集形IgGを結合するIgM抗体を含んでいた。その結果
は、凝集形IgGを使ったラテックス凝集試験と同等であ
った。対照的に、未変性のヒトIgG（9/19,X2＝8.2,p＜
0.01）、ヒツジIgG（12/19,X2＝4.8,p＝0.028）および
ヒト／ヒツジIgG（2/19,X2＝23.8,p＜0.001）を使うと
陽性試験はより少なかった。更に、ヒツジIgGとヒトIgG
の架橋により測定されるリウマチ因子は、単独のヒトIg
GまたはヒツジIgG（それぞれX2＝4.6,p＝0.032およびX2
＝8.3,p＜0.01）よりも少ない陽性試験を生じた。架橋
アッセイは細菌性心内膜炎を有する１人の患者および肝
疾患を有する１人の患者において陽性であった。凝集形
IgGを使ったリウマチ因子ELISAと架橋アッセイとの間に
相関関係はなかった（ｒ＝0.39）。このことは、それら
の試験間の結果の違いが単にアッセイ感度の変化による
ものではないことを示す。
関節リウマチ患者と同等である力価を有する非−慢性関
節リウマチ患者の19/317人の血清を、ELISAによりIgMリ
ウマチ因子についてアッセイした。それらの患者の多く
（7/19人）は肝疾患を有した。熱凝集形のヒトIgG、未
変性のヒツジIgGおよびヒツジIgGへのそれらの結合、並
びにヒツジIgGとヒトIgGへの同時結合を比較することに
より、リウマチ因子の結合特異性を特徴づけた。ELISA
によりアッセイした時、18/19人の患者の血清がヒト熱
凝集形IgGを結合するIgM抗体を含んでいた。その結果
は、凝集形IgGを使ったラテックス凝集試験と同等であ
った。対照的に、未変性のヒトIgG（9/19,X2＝8.2,p＜
0.01）、ヒツジIgG（12/19,X2＝4.8,p＝0.028）および
ヒト／ヒツジIgG（2/19,X2＝23.8,p＜0.001）を使うと
陽性試験はより少なかった。更に、ヒツジIgGとヒトIgG
の架橋により測定されるリウマチ因子は、単独のヒトIg
GまたはヒツジIgG（それぞれX2＝4.6,p＝0.032およびX2
＝8.3,p＜0.01）よりも少ない陽性試験を生じた。架橋
アッセイは細菌性心内膜炎を有する１人の患者および肝
疾患を有する１人の患者において陽性であった。凝集形
IgGを使ったリウマチ因子ELISAと架橋アッセイとの間に
相関関係はなかった（ｒ＝0.39）。このことは、それら
の試験間の結果の違いが単にアッセイ感度の変化による
ものではないことを示す。
慢性関節リウマチ以外の結合組織疾患を有する患者にお
けるリウマチ因子 ラテックス凝集で陽性のリウマチ因子を有し且つ慢性
関節リウマチ患者に匹敵する力価の有する慢性関節リウ
マチ以外の結合組織疾患を有する患者の14/231人の血清
を、ELISAによりリウマチ因子について試験した。陽性
リウマチ因子試験のほとんどが全身性紅斑性狼瘡を有す
る患者において起こった（12/14）。結合組織疾患を持
たない患者とは異なり、それらのリウマチ性疾患を有す
る患者は熱凝集形ヒトIgG、未変性ヒトIgGおよびヒツジ
IgGに等しく良好に結合するIgM抗体を産生した。凝集形
IgGへのELISA応答（18/19陽性）は、凝集形IgGを使った
ラテックス凝集試験と同等であった。しかしながら、そ
れらの狼瘡患者におけるリウマチ因子は、ヒツジIgGと
ヒトIgGとを同時に結合および架橋することができない
こと、またはヒツジIgGに結合した自己由来のIgGを結合
できないことにより、慢性関節リウマチ患者のものと区
別することができる。例えば、架橋アッセイは凝集形Ig
G（13/14,X2＝11.8,p＜0.001）、未変性のヒトIgG（12/
14,X2＝9.2,p＜0.01）またはヒツジIgG（11/14,X2＝7.
0,p＜0.01）を使った試験よりも少数の狼瘡患者におい
て（3/14）陽性であった。それらの結果は、慢性関節リ
ウマチを持たない多くの患者がヒツジIgGに対する抗体
を産生するが、それらの抗体がヒトIgGと共有する決定
基と交差反応する決定基に結合しないことを指摘する。
けるリウマチ因子 ラテックス凝集で陽性のリウマチ因子を有し且つ慢性
関節リウマチ患者に匹敵する力価の有する慢性関節リウ
マチ以外の結合組織疾患を有する患者の14/231人の血清
を、ELISAによりリウマチ因子について試験した。陽性
リウマチ因子試験のほとんどが全身性紅斑性狼瘡を有す
る患者において起こった（12/14）。結合組織疾患を持
たない患者とは異なり、それらのリウマチ性疾患を有す
る患者は熱凝集形ヒトIgG、未変性ヒトIgGおよびヒツジ
IgGに等しく良好に結合するIgM抗体を産生した。凝集形
IgGへのELISA応答（18/19陽性）は、凝集形IgGを使った
ラテックス凝集試験と同等であった。しかしながら、そ
れらの狼瘡患者におけるリウマチ因子は、ヒツジIgGと
ヒトIgGとを同時に結合および架橋することができない
こと、またはヒツジIgGに結合した自己由来のIgGを結合
できないことにより、慢性関節リウマチ患者のものと区
別することができる。例えば、架橋アッセイは凝集形Ig
G（13/14,X2＝11.8,p＜0.001）、未変性のヒトIgG（12/
14,X2＝9.2,p＜0.01）またはヒツジIgG（11/14,X2＝7.
0,p＜0.01）を使った試験よりも少数の狼瘡患者におい
て（3/14）陽性であった。それらの結果は、慢性関節リ
ウマチを持たない多くの患者がヒツジIgGに対する抗体
を産生するが、それらの抗体がヒトIgGと共有する決定
基と交差反応する決定基に結合しないことを指摘する。
慢性関節リウマチ病活性とリウマチ因子との関係 慢性関節リウマチ病活性を40人の患者において評価
し、血清リウマチ因子レベルと比較した。広域スペクト
ルの病気活性を示す患者を選択した。男性優勢は、一部
は、退役軍人管理局（the Veterans Administration）
の集団を反映した。ラテックス凝集試験により系列希釈
において血清リウマチ因子力価をアッセイすると、それ
らのリウマチ因子力価はリウマチ病活性とよく相関しな
かった（ｒ＝0.31）。対照的に、架橋アッセイにおいて
ELISAにより測定されたリウマチ因子のレベルは、リウ
マチ病活性と良く相関した（ｒ＝0.68）。このことは、
ヒトIgGとヒツジIgGを架橋するリウマチ因子は主として
活性な病気を有する慢性関節リウマチ患者に存在するこ
とを示す。例えば、中〜重度の病気（活性指数６）を有
する患者の14/16人（87.5％）が陽性であったのに比べ
て、最低の病気活性（活性指数＜４）を有する患者の0/
11人が陽性であった。陽性試験は、正の対照の28％より
大きいものとして定義した。28％は慢性関節リウマチを
持たない患者548人の平均よりも2 S.D.上に相当する。
ヒトIgGとヒツジIgGとの架橋により測定されたリウマチ
因子は、沈降速度を測定した慢性関節リウマチ患者の23
人におけるヴェステルグレン赤血球沈降速度ともよく相
関した（ｒ＝0.70）。それらの結果は、ヒトIgGとヒツ
ジIgGの架橋により測定されるリウマチ因子と活性慢性
関節リウマチとの関連性を更に支持する。
し、血清リウマチ因子レベルと比較した。広域スペクト
ルの病気活性を示す患者を選択した。男性優勢は、一部
は、退役軍人管理局（the Veterans Administration）
の集団を反映した。ラテックス凝集試験により系列希釈
において血清リウマチ因子力価をアッセイすると、それ
らのリウマチ因子力価はリウマチ病活性とよく相関しな
かった（ｒ＝0.31）。対照的に、架橋アッセイにおいて
ELISAにより測定されたリウマチ因子のレベルは、リウ
マチ病活性と良く相関した（ｒ＝0.68）。このことは、
ヒトIgGとヒツジIgGを架橋するリウマチ因子は主として
活性な病気を有する慢性関節リウマチ患者に存在するこ
とを示す。例えば、中〜重度の病気（活性指数６）を有
する患者の14/16人（87.5％）が陽性であったのに比べ
て、最低の病気活性（活性指数＜４）を有する患者の0/
11人が陽性であった。陽性試験は、正の対照の28％より
大きいものとして定義した。28％は慢性関節リウマチを
持たない患者548人の平均よりも2 S.D.上に相当する。
ヒトIgGとヒツジIgGとの架橋により測定されたリウマチ
因子は、沈降速度を測定した慢性関節リウマチ患者の23
人におけるヴェステルグレン赤血球沈降速度ともよく相
関した（ｒ＝0.70）。それらの結果は、ヒトIgGとヒツ
ジIgGの架橋により測定されるリウマチ因子と活性慢性
関節リウマチとの関連性を更に支持する。
ヒトIgGとヒツジIgGを架橋するリウマチ因子に対するア
ッセイの精度 このELISA法の精度を評価するために、架橋アッセイ
を使ってリウマチ因子についての反復試験を行った。各
６つの複製物において低、中および高応答を有する血清
を試験することにより、バッチ内変動を測定した。１枚
の96ウエルプレート上で四重反復測定として試験を行
い、そして別々の96ウエルプレート上で２組の二重反復
測定を各々行った。高、中および低応答血清についての
６複製物の平均±S.D.（光学濃度として測定）は、それ
ぞれ1.56±0.13,1.38±0.09および0.77±0.10であっ
た。３グループの血清試料についての変動係数は、それ
ぞれ0.08,0.06および0.13であった。バッチ間変動は、
別々の５つの時点で陽性試料を試験することにより、バ
ッチ間変動を測定した。５つの測定値についての平均±
S.D.は1.38±0.14であった。それらのバッチ間比較につ
いての変動係数は0.10であった。
ッセイの精度 このELISA法の精度を評価するために、架橋アッセイ
を使ってリウマチ因子についての反復試験を行った。各
６つの複製物において低、中および高応答を有する血清
を試験することにより、バッチ内変動を測定した。１枚
の96ウエルプレート上で四重反復測定として試験を行
い、そして別々の96ウエルプレート上で２組の二重反復
測定を各々行った。高、中および低応答血清についての
６複製物の平均±S.D.（光学濃度として測定）は、それ
ぞれ1.56±0.13,1.38±0.09および0.77±0.10であっ
た。３グループの血清試料についての変動係数は、それ
ぞれ0.08,0.06および0.13であった。バッチ間変動は、
別々の５つの時点で陽性試料を試験することにより、バ
ッチ間変動を測定した。５つの測定値についての平均±
S.D.は1.38±0.14であった。それらのバッチ間比較につ
いての変動係数は0.10であった。
上記結果から、当該アッセイが、凝集アッセイと同じ
かまたはより優れた感度を有し、且つ実質的に少ない偽
陽性を有する点で、実質的に改良された結果を提供する
ことは明白である。更に、陽性結果は、最小の病気活
性、即ち４より小さい活性指数の病気に比べて、活性な
病気、即ち６より大きい活性指数の中〜重度の病気とよ
り一層正確に関連するようだ。加えて、当該アッセイ
は、免疫グロブリンへのリウマチ因子の結合と関係があ
るアミノ酸配列を同定するための、ヒツジとヒトに共通
である決定基の同定に備える。当該アッセイでは、陽性
結果は活性な慢性関節リウマチであって他の変性病では
ないことを指摘するずっと大きな確信を有する。かくし
て、病気が存在するという強い確信をもって慢性関節リ
ウマチの処置に治療を向けることができる。
かまたはより優れた感度を有し、且つ実質的に少ない偽
陽性を有する点で、実質的に改良された結果を提供する
ことは明白である。更に、陽性結果は、最小の病気活
性、即ち４より小さい活性指数の病気に比べて、活性な
病気、即ち６より大きい活性指数の中〜重度の病気とよ
り一層正確に関連するようだ。加えて、当該アッセイ
は、免疫グロブリンへのリウマチ因子の結合と関係があ
るアミノ酸配列を同定するための、ヒツジとヒトに共通
である決定基の同定に備える。当該アッセイでは、陽性
結果は活性な慢性関節リウマチであって他の変性病では
ないことを指摘するずっと大きな確信を有する。かくし
て、病気が存在するという強い確信をもって慢性関節リ
ウマチの処置に治療を向けることができる。
本明細書中に言及された全ての刊行物および特許出願
は、本発明が属する当業者の技術水準を示すものであ
る。全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊
行物または特許出願が明確に且つ個別的に参考として組
み込まれると指摘されたかのように参考として本明細書
中に組み込まれる。
は、本発明が属する当業者の技術水準を示すものであ
る。全ての刊行物および特許出願は、あたかも個々の刊
行物または特許出願が明確に且つ個別的に参考として組
み込まれると指摘されたかのように参考として本明細書
中に組み込まれる。
今まで本発明を詳細に記載してきたけれども、添付さ
れた請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく
多数の変更および改良を行い得ることは当業者にとって
容易に明らかであろう。
れた請求の範囲の精神または範囲から逸脱することなく
多数の変更および改良を行い得ることは当業者にとって
容易に明らかであろう。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) G01N 33/564,33/543
Claims (9)
- 【請求項１】慢性関節リウマチを有する疑いのあるヒト
宿主におけるリウマチ因子の存在を検出する方法であっ
て、 前記宿主からの生理学的試料をヒツジIgG免疫グロブリ
ンおよびヒトIgG免疫グロブリンと接触せしめ、ここで
前記免疫グロブリンのうちの一方が支持体に結合されて
おり、そして他方が溶液中に分散されており；そして 前記生理学的試料中のリウマチ因子の存在の指標とし
て、前記分散された免疫グロブリンの結合の存在を検出
する ことを含んで成る方法。 - 【請求項２】前記検出が酵素標識によるものであり、こ
こで前記酵素標識は前記ヒト免疫グロブリンまたは前記
ヒト免疫グロブリンに特異的に結合するタンパク質に接
合されている、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】前記ヒト免疫グロブリンが分散されており
且つビオチンに接合されており、そして前記検出が酵素
接合アビジンまたはストレプトアビジンによるものであ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】前記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼで
ある、請求項３に記載の方法。 - 【請求項５】前記試料が1:100より高い希釈度で希釈さ
れた血液である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項６】慢性関節リウマチを有する疑いのあるヒト
宿主におけるリウマチ因子の存在を検出する方法であっ
て、 前記宿主からの希釈血液試料をヒツジIgG免疫グロブリ
ンおよびヒトIgG免疫グロブリンと接触せしめ、ここで
前記ヒツジ免疫グロブリンが支持体に結合されており、
そして前記ヒト免疫グロブリンが検出可能なシグナルに
備える標識に接合されており；そして 前記血液試料中のリウマチ因子の存在の指標として、前
記支持体に結合した前記ヒト免疫グロブリンの結合の存
在を前記標識によって検出する ことを含んで成る方法。 - 【請求項７】前記試料が1:100より高い希釈度で希釈さ
れ、そして前記検出が酵素によるものである、請求項６
に記載の方法。 - 【請求項８】前記標識がビオチンであり、そして前記酵
素がアビジンまたはストレプトアビジンに接合されてい
る、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】前記酵素が西洋ワサビペルオキシダーゼで
ある、請求項８に記載の方法。
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